Summary
Vi beskriver ingeniørien af en ny DNA-tøjret T7 RNA polymerase til regulering af in vitro transskription reaktioner. Vi diskuterer trinene til proteinsyntese og karakterisering, validere proof-of-concept transskriptionel regulering, og diskutere dens anvendelser i molekylær computing, diagnostik, og molekylær informationsbehandling.
Abstract
DNA nanoteknologi muliggør programmerbar selvmontering af nukleinsyrer i brugerordinerede former og dynamikker til forskellige applikationer. Dette arbejde viser, at begreber fra DNA nanoteknologi kan bruges til at programmere den enzymatiske aktivitet af phage-afledt T7 RNA polymerase (RNAP) og opbygge skalerbare syntetiske genregulerende netværk. For det første konstrueres en RNAP,der er bundet af RNAP med oliigonuleotid, via udtryk for en N-terminalt SNAP-mærket RNAP og efterfølgende kemisk kobling af SNAP-mærket med en benzylguanine (BG)-modificeret oligonukleotid. Dernæst bruges nukleinsyrestrengforskydning til at programmere polymerasetransskription on-demand. Derudover kan hjælpekernekernesyresamlinger bruges som "kunstige transskriptionsfaktorer" til at regulere samspillet mellem den DNA-programmerede T7 RNAP med sine DNA-skabeloner. Denne in vitro transskription reguleringsmekanisme kan gennemføre en række kredsløb adfærd såsom digital logik, feedback, kaskade, og multiplexing. Sammensætningen af denne genregulerende arkitektur letter design abstraktion, standardisering og skalering. Disse funktioner vil gøre det muligt hurtigt at prototyping af in vitro genetiske anordninger til applikationer såsom bio-sensing, sygdomsdetektering, og datalagring.
Introduction
DNA computing bruger et sæt designet oligonukleotider som medium til beregning. Disse oligonukleotider er programmeret med sekvenser til dynamisk at samle i henhold til brugerdefineret logik og reagere på specifikke nukleinsyreinput. I proof-of-concept-undersøgelser består beregningens output typisk af et sæt fluorescerende mærkede oligonuleotider, der kan påvises via gelelektroforese eller fluorescenspladelæsere. I løbet af de sidste 30 år er stadig mere komplekse DNA-beregningskredsløb blevet påvist, såsom forskellige digitale logiske kaskader, kemiske reaktionsnetværk og neurale netværk1,2,3. For at hjælpe med udarbejdelsen af disse DNA-kredsløb er matematiske modeller blevet brugt til at forudsige funktionaliteten af syntetiske genkredsløb4,5og beregningsværktøjer er udviklet til ortogonalt DNA-sekvensdesign6,7,8,9,10 . Sammenlignet med siliciumbaserede computere omfatter fordelene ved DNA-computere deres evne til at kommunikere direkte med biomolekyler, fungere i opløsning i mangel af en strømforsyning samt deres samlede kompakthed og stabilitet. Med fremkomsten af næste generations sekventering, omkostningerne ved at syntetisere DNA-computere har været faldende i de sidste to årtier med en hastighed hurtigere end Moores lov11. Anvendelser af sådanne DNA-baserede computere er nu begyndt at dukke op, såsom for sygdomsdiagnose12,13, til kraftoverførsel molekylær biofysik14,og som datalagring platforme15.
Figur 1: Mekanisme for toehold-medieret DNA-strengforskydning. Toehold, δ, er en gratis, ubundet sekvens på en delvis duplex. Når et supplerende domæne (δ*) introduceres på en anden streng, fungerer det frie δ domæne som et fodfæste for hybridisering, hvilket giver mulighed for, at resten af strengen (ɑ*) langsomt fortrænger sin konkurrent gennem en zippe / unzipping reversibel reaktion kendt som strengmigration. Efterhånden som længden af δ øges, falder ΔG for fremadrettede reaktioner, og forskydning sker lettere. Klik her for at se en større version af dette tal.
Til dato anvender de fleste DNA-computere et veletableret motiv inden for dynamisk DNA-nanoteknologi kendt som toehold-medieret DNA-strengforskydning (TMDSD, figur 1)16. Dette motiv består af en delvist dobbeltstrenget DNA (dsDNA) duplex, der viser korte "toehold" udhæng (dvs. 7- til 10 nukleotider (nt)). Nukleinsyre "input" tråde kan interagere med den delvise duplexes gennem fodfæste. Dette fører til forskydning af en af strengene fra den delvise duplex, og denne frigjorte streng kan derefter tjene som input til downstream delvise duplexes. Således muliggør TMDSD signalkascading og informationsbehandling. I princippet kan ortogonale TMDSD-motiver fungere uafhængigt i opløsning, hvilket muliggør parallel informationsbehandling. Der har været en række variationer over TMDSD-reaktionen, såsom toehold-medieret DNA-strengudveksling (TMDSE)17, "leakless" toeholds med dobbeltlange domæner18, sekvens-mismatched toeholds19og "handhold"-medieret strengforskydning20. Disse innovative designprincipper giver mulighed for mere finjusterede TMDSD-energiske og dynamikker til forbedring af DNA-databehandlingens ydeevne.
Syntetiske genkredsløb, såsom transskriptionsgenkredsløb, er også i stand til beregning21,22,23. Disse kredsløb er reguleret af protein transskription faktorer, som aktiverer eller undertrykke transskription af et gen ved at binde sig til specifikke regulatoriske DNA-elementer. Sammenlignet med DNA-baserede kredsløb har transskriptionskredsløb flere fordele. For det første har enzymatisk transskription en meget højere omsætningshastighed end eksisterende katalytiske DNA-kredsløb, hvilket genererer flere kopier af output pr. enkelt kopi af input og giver et mere effektivt middel til signalforstærkning. Derudover kan transskriptionskredsløb producere forskellige funktionelle molekyler, såsom aptamers eller messenger RNA (mRNA) kodning til terapeutiske proteiner, som beregningsoutput, som kan udnyttes til forskellige applikationer. Men en stor begrænsning af de nuværende transskriptionskredsløb er deres manglende skalerbarhed. Dette skyldes, at der er et meget begrænset sæt ortogonale proteinbaserede transskriptionsfaktorer, og de novo-design af nye proteintransskriptionsfaktorer er fortsat teknisk udfordrende og tidskrævende.
Figur 2: Abstraktion og mekanisme af "tether" og "bur" polymerase kompleks. (A og B) En oligonuleotid tether er enzymatisk mærket til en T7 polymerase gennem SNAP-tag reaktion. Et bur bestående af en "faux" T7 promotor med en tether-supplement udhæng gør det muligt at hybridisere til tøjre og blokere transskriptionelle aktivitet. (C) Når operatøren (a*b*) er til stede, binder den sig til fodfæste på oligonucleotidsbindingen(ab) og fortrænger burets b*-region, således at transskriptionen kan forekomme. Dette tal er blevet ændret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase. Klik her for at se en større version af dette tal.
Dette papir introducerer en ny byggesten til molekylær databehandling, der kombinerer funktionaliteterne i transskriptionskredsløb med skalerbarheden af DNA-baserede kredsløb. Denne byggesten er en T7 RNAP kovalent fastgjort med en enkeltstrenget DNA-tether (Figur 2A). For at syntetisere denne DNA-tøjrede T7 RNAP blev polymerase smeltet til en N-terminal SNAP-tag24 og rekombinant udtrykt i Escherichia coli. SNAP-mærket blev derefter reageret med et oligonuleotid, der blev funktionaliseret med BG-substratet. Oligonucleotid tether tillader positionering af molekylære gæster i nærheden af polymerase via DNA hybridisering. En sådan gæst var en konkurrencedygtig transskriptionsblokker kaldet et "bur", som består af en "faux" T7 promotor DNA-duplex uden gen nedstrøms (Figur 2B). Når buret er bundet til RNAP via sinoligonucleotid tether, bremser det polymeraseaktiviteten ved at udkonkurrere andre DNA-skabeloner til RNAP-binding, hvilket gør RNAP i en "OFF"-tilstand (figur 2C).
For at aktivere polymerase til en "ON" tilstand blev T7 DNA-skabeloner med enkeltstrengede "operatør" domæner opstrøms af T7-promotoren af genet designet. Operatøren domæne (dvs. domæne a * b * Figur 2C) kan være designet til at fortrænge buret fra RNAP via TMDSD og placere RNAP proksimale til T7 promotor af genet, og dermed indlede transskription. Alternativt blev DNA-skabeloner også designet, hvor operatørsekvensen var et supplement til hjælpekernekernesalve, der kaldes "kunstige transskriptionsfaktorer" (dvs. TFA- og TFB-strenge i figur 3A). Når begge tråde introduceres i reaktionen, samles de på operatørwebstedet og opretter et nyt pseudo-sammenhængende domæne a * b *. Dette domæne kan derefter fortrænge buret via TMDSD for at indlede transskription (Figur 3B). Disse tråde kan leveres enten eksogent eller produceres.
Figur 3: Selektiv programmering af polymeraseaktivitet gennem en trekomponent switch-aktivator. (A) Når transskriptionsfaktorerne (TFA og TFB) er til stede, binder de sig til operatordomænet opstrøms promotoren og danner en pseudostrenget sekvens (a*b*), der kan fortrænge buret gennem toehold medieret DNA-forskydning. (B) Dette a * b * domæne kan fortrænge buret via TMDSD at indlede transskription. Dette tal er blevet ændret fra Chou og Shih27. Forkortelser: TF = transskriptionsfaktor; RNAP = RNA polymerase; TMDSD = toehold-medieret DNA-strengforskydning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Brugen af nukleinsyre-baserede transskription faktorer for in vitro transskriptionion regulering tillader skalerbar gennemførelse af sofistikerede kredsløb adfærd såsom digital logik, feedback, og signal cascading. For eksempel kan man bygge logik gate kaskader ved at designe nukleinsyre sekvenser således, at udskrifter fra en opstrøms gen aktivere en downstream gen. Et program, der udnytter kaskade og multiplexing gjort i stand til af denne foreslåede teknologi er udviklingen af mere sofistikerede molekylære computing kredsløb til bærbare diagnostik og molekylær databehandling. Derudover kan integration af molekylær databehandling og de novo RNA-syntesefunktioner muliggøre nye applikationer. For eksempel kan et molekylært kredsløb være designet til at detektere en eller en kombination af brugerdefinerede RNA'er som input og output terapeutiske RNA'er eller mRNAs, der kodning funktionelle peptider eller proteiner til punkt-of-care medicinske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af buffer
BEMÆRK: Proteinrensningsbufferpræparat kan forekomme på enhver dag; her blev det gjort før eksperimenterne begyndte.
- Klargør lysis/ekvilibreringsbuffer indeholdende 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), 300 mM natriumchlorid (NaCl), 5% glycerol og 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Der tilsættes 1,5 mL 1M Tris, 1,8 mL 5M NaCl, 1,5 mL glycerol, 25,2 mL deioniseret vand (ddH2O) i et 50 mL centrifugerør, og tilsæt 10,5 μL på 14,2 M BME lige før brug.
BEMÆRK: Tris kan forårsage akut toksicitet; undgå derfor at indånde støvet og undgå hud- og øjenkontakt. BME er giftig og bør kun anvendes i en røghætte. Det er vigtigt at tilføje BME sidst, lige før resuspension og celle lysis. Se tabel 1 for lysis buffer formel. - Klargør vaskebuffer (pH 8), der indeholder 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glycerol, 5 mM BME og 20 mM imidazole. Der tilsættes 1,5 mL 1 M Tris, 4,8 mL på 5 M NaCl, 1,5 mL glycerol og 22,2 mL ddH2O i et 50 mL centrifugerør. Lige før brug tilsættes 7 μL på 14,2 M BME og 200 μL på 2 M imidazole til 20 mL af ovennævnte opløsning.
BEMÆRK: For at forhindre akut toksicitet på grund af imidazole skal du bruge personlige værnemidler. Det er vigtigt at tilføje BME og imidazole sidst, lige før du vasker proteinet ud af kolonnen. Se tabel 2 for vaskebufferformel. - Klargør elution buffer (pH8), der indeholder 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glycerol, 5 mM BME og 200 mM imidazole. Der tilsættes 0,5 mL 1 M Tris, 1,6 mL på 5 M NaCl, 0,5 mL glycerol og 6,4 mL ddH2O til et 15 mL centrifugerør. Lige før brug tilsættes 3,5 μL på 14,2 M BME og 1 mL 2 M imidazole til 10 mL af ovenstående opløsning.
BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje BME og imidazole sidst, lige før du udråber proteinet ud af kolonnen. Se tabel 3 for elution buffer formel. - 2x opbevaringsbuffer (blandes 1:1 med glycerol), der indeholder 100 mM Tris, 200 mM NaCl, 40 mM BME og 2 mM ethylendiamintetraacetic acid (EDTA), 0,2% af et ikke-ionisk overfladeaktivt middel (se materialetabellen). Opbevaringsbufferen forberedes 50 mL ved at tilsætte 5 mL 1 M Tris, 2 mL 5 M NaCl, 42,56 mL ddH2O, 200 μL på 0,5 M EDTA, 100 μL af det ikke-ioniske overfladeaktive middel til et 50 mL centrifugerør. Bland indtil opløsningen er homogen, filtrer opbevaringsbufferen gennem et 0,2 μm sprøjtefilter, og der tilsættes 140,8 μL BME til ovennævnte opløsning inden brug.
BEMÆRK: For at undgå akut toksicitet på grund af EDTA skal du undgå at indånde støvet og undgå hud- og øjenkontakt. Det er vigtigt at tilføje BME sidst og blande hele opbevaringsbufferen 1:1 med glycerol, lige før opbevaring af det rensede protein opbevares. Se tabel 4 for at få en storagebufferformel.
2. Overnight kultur vækst: Dag 1
- Forbered 1.000x kanamycin lager ved at opløse 500 mg kanamycin i 10 mL ddH2O.
BEMÆRK: Brug personlige værnemidler for at forhindre akut toksicitet på grund af kanamycin. - Tilsæt 20 μL af 1.000x kanamycin lager til 20 mL lysogeny bouillon. Ved hjælp af en steril pipettespids stikker du en transformeret BL21 E. coli glycerol-bestand og poder derefter kulturen ved at introducere spidsen i vækstmedie bouillon.
Figur 4: Plasmid kort for SNAP T7 RNAP. Den plasmid koder en T7 RNAP indeholder en N-terminal histidin tag (6x Hans) og SNAP-tag domæne (SNAP T7 RNAP) under en lac repressor (lacI) på en pQE-80L rygrad. Andre funktioner omfatter kanamycin resistens (KanR) og chloramphenicol resistens (CmR) gener. Forkortelse: RNAP = RNA polymerase. Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: Plasmid koder en T7 RNAP, der indeholder en N-terminal histidin tag og en SNAP-tag domæne (SNAP T7 RNAP), samt en kanamycin resistens gen under en pQE-80L rygrad (Figur 4)25.
- Igen tilsættes 20 μL af 1.000x kanamycin-bestanden til en separat kulturkolbe, der indeholder 20 mL lysogen bouillon, og inkuberes som en kontrol.
- De to prøver (fra trin 2.2 og 2.3) inkuberes natten over i 12-18 timer ved 37 °C, mens de roterer ved 10 × g.
3. Cellevækst og induktion: Dag 2
- Podning 400 mL lysogen bouillon indeholdende 400 μL kanamycin lager med 4 mL af natten vækst kultur fra trin 2.4. Inkuberes ved 37 °C, mens de roterer ved 10 × g.
- Når kulturen har nået en optisk tæthed (OD) ved 600 nm ~ 0,5, tage ud 1 mL prøve fra vækstkolbe som en kontrol. Kontrolprøven opbevares ved 4 °C.
- Fremkald cellerne med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ved at tilsætte 40 μL 1M IPTG pr. 100 mL kultur for at opnå en endelig koncentration på 0,4 mM IPTG. Prøven inkuberes i 3 timer ved 37 °C, roterer ved 10 × g, og spinde derefter den inducerede kultur ved 8.000 × g i 10 min for at pille cellerne. Fjern supernatanten, og opbevar pellet ved -20 °C, indtil den er yderligere brugt.
BEMÆRK: For at undgå akut toksicitet på grund af IPTG skal du undgå at indånde støvet og undgå hud- og øjenkontakt. Hvis det er nødvendigt, kan du sætte eksperimentet på pause her og fortsætte den næste dag.
4. Celle lysis, proteinrensning: Dag 3
- Brug den lagrede cellepille igen med 10 mL lysisbuffer på is, og hvirvl forsigtigt for at sikre, at hele pelleten er suspenderet igen. Derefter pipette 1 mL prøve i ti 1,5 ML rør, der holdes på is.
- Sonikere hver prøve på en amplitude indstilling af "1", pulserede for 2 s med en 50% arbejdscyklus over en periode på 30 s. Før og efter hver prøve rengøres sonikeringsspidsen med 70 % ethanol og ddH2O. Hold alle prøver på is under og efter sonikering.
BEMÆRK: Hold 70% ethanol væk fra varme og åben ild. - Ekvilibrere en nikkelladet nitrilotriacetisk syre (Ni-NTA) renselse spin kolonne til en arbejdstemperatur på 4 °C. Placer/opbevar kolonnen ved 4 °C, og hold den på is under brug.
- Centrifugere de ti 1 ML prøver ved 15.000 × g i 20 min ved 4 °C. Rør forsigtigt supernatanten, der indeholder rekombinanten RNAP, ud uden at forstyrre pellet. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge yderligere ækvilibreringsbuffer til at justere den samlede volumen til ≥ 6 mL.
- Fjern forsigtigt den nederste fane fra Spin-kolonnen Ni-NTA for at give mulighed for flow gennem kolonnen. Placer søjlen i et centrifugerør, og opbevar den på is.
BEMÆRK: Brug et 50 mL centrifugerør med 3 mL Ni-NTA spinsøjlerne. - Centrifugere kolonnen ved 700 × g og 4 °C i 2 min for at fjerne opbevaringsbufferen. Ekvilibrere kolonnen ved at føje 6 mL ekvilibreringsbuffer til kolonnen. Lad bufferen komme helt ind i harpiksbunden.
- Ækvilibreringsbufferen fjernes fra kolonnen ved centrifugering ved 700 × g og 4 °C i 2 min. Før du føjer det forberedte celleudtræk til kolonnen, skal du placere et bundstik på kolonnen for at undgå at miste noget produkt. Derefter tilsættes celleekstraktet til kolonnen og blandes på en orbital shaker mixer i 30 min ved 4 °C.
- Fjern bundstikket fra kolonnen , og placer kolonnen i et 50 mL centrifugerør med navnet flow gennem. Centrifugere kolonnen ved 700 × g i 2 min for at samle strømmen igennem.
- Tilsæt 6 mL vaskebuffer til kolonnen for at vaske harpiksen. Centrifuge kolonnen ved 700 × g i 2 min for at samle fraktionen i et nyt centrifugerør mærket vask 1. Gentag dette trin to gange mere for i alt 3 separate fraktioner, og saml fraktioner i separate centrifugerør (vask 2 og vask 3).
- Tilsæt 3 mL elution buffer for at elute de his-taggede proteiner fra harpiksen. Centrifuge kolonnen ved 700 × g i 2 min til at indsamle fraktion i en ny centrifuge rør mærket eluate 1. Gentag dette trin to gange mere for i alt 3 separate fraktioner, og opsamle fraktioner i separate centrifugerør (eluere 2 og eluere 3).
- Kombiner eluaterne og udfør afsaltning for at fjerne salte fra proteinopløsningen.
- Pipette 15 mL på 0,05 % w/v polysorbat 20 over en 100 kDa centrifugalfilterenhed. Centrifuge ved 4.000 × g i 40 min og kassér gennemstrømningen.
- Brug det coatede filter til at koncentrere eluaterne 1, 2 og 3 (9 mL af det samlede proteinopret + 6 mL lagerbuffer) til ~ 1.500 μL. Centrifuge filteret ved 3.220 × g i 20 min, og rør forsigtigt membranen for at forhindre nedbør.
- Udvand prøven til 15 mL med lagerbuffer. Udfør en bufferudveksling ved hjælp af lagerbuffer 1:1.000 ved at gentage trin 4.11.2 to gange mere.
- Kvantificer det rensede protein ved at måle fraktionens absorbans ved 280 nm. Spektrofotometeret tømmes med lagerbuffer (2x lagerbuffer ved 4 °C). Bland forsigtigt prøven af de kombinerede eluater og mål dens absorbans.
BEMÆRK: Udfør tre separate aflæsninger ved 1x, 10x og 50x fortyndinger af proteinprøven til at beregne og kvantificere proteinet. Fortynd prøver i opbevaringsbuffer. - Proteinprøverne justeres til 100 μM ved hjælp af 2x opbevaringsbuffer. Fortynd den justerede prøve 1:1 pr. volumen med 100 % glycerol. Opbevar den resulterende proteinopløsning ved -80 °C.
5. Natrium dodecyl sulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) analyse af proteinprodukt: Dag 3
- Kør en SDS-PAGE gel til proteinanalyse. Bland 9 μL af prøven med 3 μL 4x lithium dodecyl sulfat (LDS) proteinbelastningsfarvestof. Prøverne opvarmes ved 95 °C i 10 min.
- Læg prøverne på en 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel setup. Læg proteinstigen i godt 1, derefter med prøver (fra venstre mod højre): gennemstrømning, vask 1, vask 2, vask 3, elution 1, elution 2, elution 3 og total afsaltet elution.
BEMÆRK: Tabel 5 indeholder en prøveindlæsningstabel til SDS-PAGE gelen. - Kør de indlæste gelprøver i 2-(N-morpholino) ethanesulfonsyre (MES) buffer i 35 min ved 200 V. Skyl gelen i en ren bakke tre gange i 10 min hver ved hjælp af 200 mL ddH2O, med blid omrøring for at fjerne SDS fra gelmatrixen.
BEMÆRK: Brug personlige værnemidler for at undgå akut toksicitet på grund af MES. - Plette gelen med 20 mL Coomassie blå, og inkuber gelen natten over ved stuetemperatur med blid omrøring. De-plette gelen to gange i 1 time hver med 200 mL ddH2O med blid agitation på en orbital shaker.
BEMÆRK: Hvis gelen vaskes i længere tid eller ofte udskiftes af vandet, vil det øge følsomheden. Derudover vil placere en foldet delikat opgave tørre væv i beholderen til at absorbere overskydende farvestof fremskynde de-farvning proces.
6. Funktionel verifikation af SNAP T7 RNAP via in vitro transskription
BEMÆRK: Denne protokol bruger DNA-skabelon, som koder for fluorescerende Broccoli RNA aptamer og tillader brug af fluorescens til at overvåge kinetik af transskription på en fluorescens pladelæser.
- Konfigurer tre in vitro-transskription (IVT) reaktioner for at sammenligne aktiviteten af SNAP T7 RNAP med wild-type (WT) T7 RNAP fra en kommerciel kilde og en buffer-only kontrol. Volumen af hver reaktion justeres til 20 μL.
- Snap T7 RNAP IVT-reaktionen forberedes ved blanding af 2 μL 10x transskriptionsbuffer, 0,4 μL på 25 mM ribonucleoside triphosphat (rNTP) mix, 5 μL af 500 nM DNA-skabelon, 2 μL på 500 nM SNAP T7 RNAP og 10,6 μL ddH2O.
- WT RNAP IVT-reaktionen forberedes ved at blande 2 μL 10x transskriptionsbuffer, 0,4 μL på 25 mM rNTP-blanding, 5 μL 500 nM DNA-skabelon, 2 μL WT T7 RNAP og 10,6 μL ddH2O.
- Ivt-reaktionen, der kun er stødpude, forberedes ved at blande 2 μL 10x transskriptionsbuffer, 0,4 μL på 25 mM rNTP-blanding, 5 μL 500 nM DNA-skabelon og 12,6 μL ddH2O.
BEMÆRK: Tilsæt RNAP sidste, holde prøverne på is, indtil dens indførelse. Tabel 6, Tabel 7og tabel 8 indeholder IVT-reaktionsformlerne.
- Overvåg transskriptionskonetik på en fluorescenspladelæser i 2 timer ved 2 min intervaller ved 37 °C ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 470 nm og en emissionsbølgelængde på 512 nm.
7. Forberedelse af BG-modificerede oligonukleotider: Dag 1
- Oligonuleotid opløses med 3'-aminmodifikation i ddH2O til en endelig koncentration på 1 mM. Mærk denne S1.
- Bland 25 μL 1 M natriumbicarbonat (NaHCO3), 284 μL på 100 % dimethylsulfoxid (DMSO), 125 μL S1 (oligonukleotid) og 66 μL på 50 mM af BG-N-hydroxysuccinimiden (NHS) ester (BG-GLA-NHS), fortyndet med DMSO, juster volumenet til 500 μL og inkuberes natten over ved stuetemperatur ved 100 × g.
BEMÆRK: Hold DMSO væk fra varme og flamme, da det er en brændbar væske. Tabel 9 indeholder reaktionsformlen for BG-bøjningen til oligonuleotid.
- Bland 25 μL 1 M natriumbicarbonat (NaHCO3), 284 μL på 100 % dimethylsulfoxid (DMSO), 125 μL S1 (oligonukleotid) og 66 μL på 50 mM af BG-N-hydroxysuccinimiden (NHS) ester (BG-GLA-NHS), fortyndet med DMSO, juster volumenet til 500 μL og inkuberes natten over ved stuetemperatur ved 100 × g.
8. Ethanol/acetoneudfældning af BG-oligonukleotid konjugat: Dag 2
- Centrifuge produktet af trin 7.1.1. ved 13.000 × g i 5 min. Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt rør, og kassér eventuelle udfældede BG. Opdel reaktionen i to lige store 250 μL aliquots for at forhindre overløb, og udfør følgende trin på begge aliquots.
- Tilsættes 1/10af volumenet på 3 M natriumacetat (25 μL), efterfulgt af 2,5x volumen i 100% ethanol (625 μL). Inkuberes ved -80 °C i 1 time.
BEMÆRK: Brug personlige værnemidler ved håndtering af både natriumacetat (kan forårsage irritation af øjne, hud, fordøjelses- og luftveje) og ethanol (yderst brandfarlig, forårsager irritation ved kontakt). Hvis det er nødvendigt, sæt eksperimentet på pause her og fortsæt den næste dag. - Placer rørene i centrifugen, og marker den ydre kant. Centrifugere rørene ved 17.000 × g i 30 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Oligonuleotid pellet vises på den markerede kant af røret. - Uden at forstyrre pelleten skal du kassere supernatanten. Fyld op med 750 μL kølet 70% ethanol, og drej ved 17.000 × g i 10 min ved 4 °C.
- Uden at forstyrre pelleten skal du kassere supernatanten. Fyld op med 750 μL på 100% acetone, og drej ved 17.000 × g i 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Brug personlige værnemidler ved håndtering af acetone, da det er yderst brandfarligt og forårsager irritation ved kontakt. - Med rørlåget åbent, lufttørre i 5 min for at fjerne overskydende acetone gennem fordampning. Opløs oligonuleotid i 250 μL af 1x Tris-EDTA (TE) buffer for at producere en ~850 μM BG-oligonucleotidopløsning.
- Gentag trin 8.2 til 8.6, og opløs igen i 70 μL af 1x TE-buffer. Mærk denne S2.
9. BG-oligonucleotid oprydning via gelfiltrering kromatografi
- Afbryd matrixen ved kraftigt at invertere kolonnerne flere gange. fjerne den øverste hætte og fastgøre den nederste spids af kolonnen. Placer kolonnen i et 1,5 mL centrifugerør, og centrifuge røret ved 1.000 × g i 1 min ved stuetemperatur. Kassér den eluterede buffer og opsamlingsrøret.
BEMÆRK: Det er vigtigt at forhindre vakuumdannelse. Brug forberedte kolonner med det samme. - Placer de pakkede søjler i rene 1,5 mL centrifugerør. Tilsæt 300 μL 1x TE-buffer til midten af kolonnelejet, og centrifuge ved 1.000 × g i 2 min for at udskifte bufferopløsningen. Kassér igen den eluterede buffer og opsamlingsrøret.
- Anbring de buffer-udskiftede kolonner i rene 1,5 mL centrifugerør. Påfør op til 75 μL prøve til midten af sengen. Spin ved 1.000 × g i 4 min.
BEMÆRK: Forstyr ikke sengen eller rør ved siderne af kolonnen; det højeste punkt i gelmediet skal pege mod den udvendige rotor. - Saml eluate fra opsamlingsrøret, da det indeholder den rensede nukleinsyre. For at kvantificere prøven måles dens absorbans ved 260 nm. mærket denne S3.
BEMÆRK: Bemærk den stilængde, der bruges i målingen, og beregn koncentrationen ved hjælp af Beer-Lambert-loven.
10. Denaturering PAGE analyse af BG-oligonukleotid konjugat
- Støbt en 18% Tris-borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE gel. 4,8 g URINSTOF, 4,5 mL af 40% acrylamid (19:1) og 1 mL på 10x TBE i 2,8 mL ddH2O tilsæt 5 μL tetramethylethylendiamin (TEMED) og blandes grundigt. Gentag med 100 μL på 10% ammoniumpersulfat (APS). Hæld opløsningen i en tom gelkassette og lad polymerisering i 40 min.
BEMÆRK: Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af urinstof (forårsager irritation af øjne og hud), acrylamid (giftigt og kræftfremkaldende) og TEMED (giftigt, brandfarligt, ætsende). Tabel 10 indeholder reaktionsformlen for en 18% TBE-UREA polyacrylamidgel. - Mikrobølge 500 mL TBE-buffer (0,5x) i 2 min og 30 s eller indtil ~ 70 °C og hældes i et gelapparat. Tilbered formamid (denaturerende) læssefarve, der indeholder 95% formamid + 1 mM EDTA og bromophenolblå. Bland læssefarven med hver prøve, og læg blandingen på polyacrylamidgelen.
BEMÆRK: Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af formamid, da det er kræftfremkaldende. Tabel 11 indeholder et eksempel gelindlæsningsbord. - Kør gelen ved 270 V i 35 min, eller indtil farvestoffronten migrerer til slutningen. Placer gelen i en gelkasse og plet med cyaninfarve til nukleinsyrer i 15 min ved stuetemperatur før billeddannelse.
BEMÆRK: Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af cyaninfarve, da det er brændbart.
11. Bøjning af oligonukleotid til SNAP T7 RNAP og PAGE analyse
- Forbered reagenserne til den analytiske kobling af BG-oligoejmid til SNAP T7 RNAP: Lav 9 fortyndinger af enkeltstrenget DNA (ssDNA) oligo med ddH2O for at skabe oligo:RNAP-nøgletal fra 5:1 til 1:5. Fortynd proteinlageret til 50 μM.
BEMÆRK: Eksempelforhold findes i tabel 12; disse nøgletal beregnes ved hjælp af en RNAP-koncentration på 50 μM. - For hver fortynding af ssDNA-oligo skal der fremstilles 10 μL af reaktionsblandingen, der indeholder 2 μL SNAP-buffer, 4 μL BG-oligonucleotid og 4 μL snap T7 RNAP.
BEMÆRK: Tabel 13 indeholder reaktionsformler til SNAP-tagmærkningsreaktionen.- Forbered yderligere to kontrolprøver: 1) en RNAP-kontrol ved at erstatte BG-oligonukleotid med ddH2O; 2) en DNA-kontrol ved at erstatte SNAP T7 RNAP med ddH2O (for den laveste oligonukleotidkoncentration af SNAP T7 RNAP). Inkuber alle prøver ved stuetemperatur i 1 time, og hold på is, indtil det er nødvendigt.
- Der opstilles elleve 10 μL-reaktioner ved at tilsætte 2 μL af hver prøve til 4 μL SNAP-buffer og 2 μL proteinbelastningsfarvestof og varme ved 70 °C i 10 min. Læg 2 μL af hver prøve på proteingelen 4-12% Bis-Tris, og udfør gelelektroforese på is ved 200 V i 35 min.
BEMÆRK: Tabel 14 indeholder reaktionsformler til gellæsserprøverne.- Vask SDS ud via 3x vandudveksling på en shaker, hver vask, der varer 10 min hver. Plet med cyaninfarve til nukleinsyrer i 15 min før billeddannelse. Plette gelen igen ved hjælp af 20 mL Coomassie blå plet i 1 time. De-plet med ddH2O i 1 time (eller natten over) før billeddannelse.
BEMÆRK: I gelen vil en af reaktionerne producere den mest tøjrede polymerase sammen med den mindste mængde overskydende fri BG-oligonucleotid; dette er det optimale forhold.
- Vask SDS ud via 3x vandudveksling på en shaker, hver vask, der varer 10 min hver. Plet med cyaninfarve til nukleinsyrer i 15 min før billeddannelse. Plette gelen igen ved hjælp af 20 mL Coomassie blå plet i 1 time. De-plet med ddH2O i 1 time (eller natten over) før billeddannelse.
- Tilbered reagenser til den præparative skalakobling BG-oligonukleotid til SNAP T7 RNAP. Udfør koblingsreaktionen med det optimale forhold, der findes i analyseskalaen.
BEMÆRK: Minimer proteineksponeringen for stuetemperatur ved at placere proteinet på is, når det ikke er i brug.
12. Rensning af oligonukleotid-tøjret SNAP-T7 ved hjælp af ionbytningskolonner
- Følg producentens anvisninger til røropsætning, hvis den afviger fra de instruktioner, der er angivet her. Forbered en rensningsbuffer med pH højere end proteinets isoelektriske punkt.
BEMÆRK: For eksempelproteinet i denne protokol blev der anvendt en rensningsbuffer på 10 mM natriumphosphatbuffer (pH 7).- Der fremstilles 1.000 μL elutionbuffer med endelige koncentrationer på 50 mM Tris og 0,5 M NaCl. Bland 50 μL på 1 M Tris, 100 μL på 5 M NaCl og 850 μL ddH2O.
BEMÆRK: Tabel 15 indeholder reaktionsformlen for elutionbufferen.
- Der fremstilles 1.000 μL elutionbuffer med endelige koncentrationer på 50 mM Tris og 0,5 M NaCl. Bland 50 μL på 1 M Tris, 100 μL på 5 M NaCl og 850 μL ddH2O.
- Placer en kolonne i et 2 mL centrifugerør, og vask med rensningsbuffer ved 2.000 × g i 15 min, eller indtil hele bufferen er blevet eluted. Kassér den udråbte buffer.
- Hver prøve fortyndes med rensningsbuffer ved et 3:1 rensningsbuffer:prøveforhold, og prøven indlæses i kolonnen 400 μL ad gangen. Spin ved 2.000 × g i 10 min, eller indtil hele bufferen er blevet eluted. Saml flow-through og mærke det som flow-through.
- Der tilsættes 400 μL rensningsbuffer i midten af kolonnen. Spin ved 2.000 × g i 15 min, eller indtil hele bufferen er blevet eluted. Saml gennemstrømningen, og mærk den som vask 1. Gentag to gange mere for vask 2 og vask 3.
- Der tilsættes 50 μL elutionbuffer i midten af kolonnen. Spin ved 2.000 × g i 5 min, eller indtil hele bufferen er blevet eluted. Saml flow-through og mærke det som eluate 1. Gentag to gange mere for eluate 2 og eluere 3.
- Pool eluates 1, 2 og 3 (mærk denne samlede eluat),efterlader en lille brøkdel af hver eluat til gelen, og måle absorbans ved 260 nm (A260) og 280 nm (A280). Efter målingen tilsættes glycerol ved et 1:1-forhold og opbevares ved -20 °C, indtil den anvendes yderligere.
- Brug en centrifugalfilterenhed (0,5 mL; 30 kDa) til at bufferbytte total eluate med 2x lagerbuffer (~1:100) (mærk dette produkt). Mål A260/280 igen. Glycerol tilsættes ved et 1:1-forhold, og opbevares ved -20 °C, indtil den er yderligere udnyttet.
- Indlæs hver eluate: flow-through, vask 1-3, total eluate, og produkt i en 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel, sammen med en protein stige. Kør ved 200 V i 35 min, eller indtil farvestoffronten migrerer til slutningen.
13. Demonstration af on-demand kontrol af tøjret RNA polymerase aktivitet
- Klargør 5x udglødningsbuffer indeholdende 25 mM Tris, 5 mM EDTA og 25 mM magnesiumchlorid (MgCl2). Bland 2,4 μL af hver skabelon (1 μM) med 5 μL udglødningsbuffer og 14,2 μL ddH2O til 25 μL på 1 μM dsDNA-bur. Inkuberes ved 75 °C i 2 min. Tilsvarende anneal den forstand og antisense tråde af promotor og malakit grøn aptamer DNA skabelon. Forbered en 1mM opløsning af malakit grøn oxalat.
BEMÆRK: Tabel 16 indeholder reaktionsformlen for 5x udglødningsbuffer, tabel 17 indeholder reaktionsformlen til udglødning af to ssDNA-skabeloner. - Inkuberes den tøjrede SNAP T7 RNAP med dsDNA-buret i et 1:5 molarforhold ved stuetemperatur i 15 min til en endelig koncentration på 500 nM RNAP. Hold på is, indtil det er nødvendigt.
- Forvarm pladelæseren til 37 °C. Opsætning af tre 25 μL IVT-reaktioner på is
- Opsæt en reaktion, der indeholder snap T7RNAP i bur, med nukleinsyretransskriptionsfaktorer. Bland 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL af 25 mM rNTP-mix, 1 μL 1 mM malakitgrøn, 2,5 μL af RNAP-burblandingen, 2,5 μL hver af 1 μM transskriptionsfaktor A og B oligonucleotidstrenge og 3 μL på 1 mM malakit grøn aptamer skabelon i 10 μL ddH2O.
- Opsæt en reaktion, der indeholder SNAP T7RNAP i bur uden nukleinsyretransskriptionsfaktorer. Bland 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL af 25 mM rNTP mix, 1 μL 1 mM malakitgrøn, 2,5 μL af RNAP-burblandingen og 3 μL 1 mM malakitgrøn aptamer skabelon i 15 μL ddH2O.
- Konfigurer kun en reaktion, der indeholder buffer. Bland 2,5 μL 10x IVT buffer, 1 μL af 25 mM rNTP mix, 1 μL af 1 mM malakit grøn og 3 μL på 1 mM malakit grøn aptamer skabelon i 17,5 μL af ddH2O.
BEMÆRK: Tabel 18 indeholder en generel reference til in vitro-transskriptionens reaktioner.
- Overfør hver reaktion til en 384-brønd plade. Overvåg transskription af den malakitgrønne aptamer på en fluorescenspladelæser i 2 timer ved 37 °C og med 610 nm excitation og 655 nm emission. Når det er færdigt, skal du holde pladen på is, indtil det er nødvendigt.
- Mikrobølge 0,5x TBE buffer i 2 min 30 s eller indtil ~ 70 °C. Kør RNA-produkterne af hver brønd i en denaturerende 12% TBE-Urea polyacrylamidgel i den opvarmede 0,5x TBE buffer ved 280 V i 20 min, eller indtil farvefronten når slutningen. Plette gelen med cyanin farvestof nukleinsyre plet i 10 min på en orbital shaker før billeddannelse.
BEMÆRK: Tabel 19 indeholder reaktionsformlen for en denaturerende 12% TBE-Urea PAGE gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5: SDS-PAGE analyse af SNAP T7 RNAP udtryk og in vitro transskription assay. (A) SNAP T7 RNAP protein rensning analyse, SNAP T7 RNAP molekylvægt: 119.4kDa. FT = flow-through fra kolonnen, W1 = elution fraktioner af vaskebuffer indeholdende urenheder, E1-3 = elution fraktioner indeholdende renset produkt, og DE = 10x fortyndet total afsaltet elution. 4-12% præfabrikeret Bis-Tris proteingel, plet: Coomassie blå, løbende buffer: MES buffer, betingelser: 200 V i 35 min. (B) En in vitro transskription assay blev udført på SNAP T7 RNAP protein ved at måle produktionen af en fluorescerende aptamer over tid. Transskription kinetik blev overvåget på en fluorescens pladelæser i 2 timer ved 2 min intervaller ved 37 °C ved hjælp af excitation bølgelængde ved 470 nm og emission bølgelængde ved 512 nm. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase; MES = 2-(N-morpholino) ethanesulfonsyre; SDS-PAGE = natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgel elektroforese. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vellykket udtryk og rensning af rekombinanten SNAP T7 RNAP-protein blev bekræftet ved hjælp af SDS-PAGE (Figur 5A). Båndet til SNAP T7 RNAP forventes på ca. 119 kDa, i overensstemmelse med molekylvægtene af den vilde type T7 RNAP og SNAP-tag er henholdsvis 99 kDa og 20 kDa. Den His-tag rensning procedure, der er beskrevet her produceret i alt syv fraktioner, der består af en flow-through fraktion (FT), tre vask fraktioner (W1, W2 og W3), og tre elution fraktioner (E1, E2, og E3). Derudover er en aliquot af proteinet efter bufferudveksling og up-concentration (DE) også typisk inkluderet. Som det ses i figur 5A, den mest fremtrædende band dukkede op på ca 119 kDa i elution fraktioner, hvilket tyder på vellykket protein udtryk. Størstedelen af flow-through og vask fraktioner indeholdt rå celle lysater. En mindre del af cellelyset overføres til elutionfraktionerne, hvilket tyder på, at der skal udføres strengere vaske, selv om dette kan reducere udbyttet af proteinproduktet. Ud over de vigtigste SNAP T7 RNAP band, en anden, mindre fremtrædende band blev observeret på ca 20 kDa, som blev tilskrevet afkortet SNAP-tag protein. Baseret på båndintensiteten var dette biprodukt betydeligt lavere i koncentration sammenlignet med SNAP T7 RNAP. Det kan fjernes ved en ekstra runde af størrelse-udelukkelse kromatografi eller diafiltration med 100 kDa molekylvægt cut-off filtre. Efter SDS-PAGE blev den enzymatiske aktivitet valideret ved hjælp af en in vitro-transskriptionsreaktion (Figur 5B). En T7 DNA-skabelon kodning en fluorescerende RNA aptamer (f.eks malakit grøn26) blev brugt, som gør det muligt at overvåge RNA produktion kinetik ved hjælp af en fluorescens pladelæser, samt sammenligning af transskription kinetik mellem forskellige partier eller design af polymeraser.
Figur 6: SIDE analyse af BG-oligonukleotid bøjning og rensning. BG blev konjugeret på 3'-enden af oligonuleotid gennem standardaminkemi. BG-funktionaliserede oligonuleotidkonjugere blev renset for overskydende biprodukter ved hjælp af en størrelsesekskludografispinkolonne og analyseret på en denaturerende 18% TBE-Urea PAGE efter cyaninfarvenukleinsyreplet. En dna-stige med ultralav rækkevidde blev brugt i denne gel. S1 = oligonucleotid, S2 = forrensning BG-oligo, S3 = post-rensning BG-oligo. Forkortelser: PAGE = polyacrylamidgelelektroforese; BG = benzylguanine; TBE = Tris-borate-EDTA; EDTA = ethylendiamin tetraacetic syre. Klik her for at se en større version af dette tal.
BG-funktionaliserede oligonukleotider blev fremstillet ved hjælp af standard aminreaktiv krydslinkkemi (dvs. reagerende BG-GLA-NHS estere med amin-modificerede oligonukleotider). Vellykket kobling blev verificeret via 18% denaturering TBE-Urea PAGE (Figur 6). Sammenlignet med den uændrede oligoukleotid (S1) øger tilsætning af BG-moietietiet til oligoukleotid sin molekylvægt og får den BG-modificerede oligo (S3) til at rejse langsommere i gelen. Brugen af en høj procentdel denaturering gel er nødvendig for at observere denne enkelt-nukleotid forskel. Denaturering PAGE analyse er også nyttigt at karakterisere batch-til-batch variabilitet i bøjning effektivitet, som både konjugeret og ukonkret oligonukleotid kan løses som separate bånd på gelen. Hvis produktet indeholder en betydelig mængde ukonkret oligonukleotid, kan der anvendes en anden runde kemisk kobling til at drive reaktionen på færdiggørelsen.
Figur 7: SDS-PAGE analyse af T7 RNAP-oligonukleotid bøjning og rensning. En BG-modificeret oligonukleotid er konjugeret til en T7 RNAP via SNAP-tag. Konjugaterne blev renset for overskydende oligonuleotider ved hjælp af stærke kationsudvekslingsspinde kolonner, før de blev analyseret af SDS-PAGE farves med både(A)cyaninfarvenukleinsyreplet og (B) Coomassie blå plet. Både en protein stige og en 10-bp DNA stige blev brugt i denne gel. FT = gennemstrømning fra kolonnen, W1-W3 = elution fraktioner af rensningsbuffer indeholdende urenheder, E = poolede elution fraktioner indeholdende renset produkt, P = renset produkt efter filtrering buffer udveksling og up-koncentration, C = SNAP T7 RNAP kun som kontrol. Dette tal er blevet ændret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase; SDS-PAGE = natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgel elektroforese. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter produktionen af SNAP T7 RNAP og BG-modificeret oligonukleotid var syntesen af den DNA-tøjrede RNAP en simpel en potblandingsreaktion. Den resulterende DNA-tøjrede T7 RNAP blev renset for overskydende BG-oligonucleotider ved hjælp af en stærk kation udveksling spin kolonne og analyseret ved denaturering SDS-PAGE (Figur 7). Som med hans-tag rensning ordning beskrevet i et tidligere afsnit, i alt syv fraktioner blev analyseret, herunder den oprindelige flow-through (FT), tre vask fraktioner (W1 til W3), den samlede elution fraktioner (E), den up-koncentreret produkt (P), og en kontrol, der indeholder ukonkret T7 RNAP (C). For at verificere en vellykket bøjning blev gelen først farvet med cyaninfarvestof til nukleinsyre efterfulgt af Coomassie blå til proteinet. Som det kan ses i cyaninfarvestofstofgelen (figur 7A),indeholdt den oprindelige FT for det meste overskydende BG-oligonucleotid samt en lille del af den DNA-tøjrede polymerase (dvs. RNAP-oligo), der ikke binder sig til kationbytterharpiksen.
Vaskefraktionerne indeholdt en række svagere bånd af BG-oligonukleotider (W1-W3) i bunden af gelen. Dette tyder på en vellykket fjernelse af overskydende oligonukleotid. De samlede elutionfraktioner (E) indeholdt kun det enkelte bånd af RNAP-oligo forårsaget af bindingen af cyaninfarven til oliigoukleotidbindingen. Hvis vognbane E indeholder bånd af gratis oligonukleotid, kan der være behov for flere vasketrin for at fjerne dem fra prøven. Banen, der indeholdt det filtrerede og up-koncentrerede produkt (P), viste det samme bånd som E, men meget mørkere, hvilket betød, at opkoncentrationsproceduren var vellykket. Proteinkontrolkolonnen indeholdt kun protein, som udviste minimal ikke-specifik binding til cyaninfarve, der blev betragtet som et svagt bånd. De samme mønstre blev observeret i Coomassie blå-farvede gel (Figur 7B). Der blev observeret et lille gelmobilitetsskift ved sammenligning af den oligonucleotid-konjugerede RNAP med den ikke-konjugerede RNAP-kontrol.
Figur 8: In vitro transskription assay af ON og OFF tilstande af bur polymerase system. (A) Skematisk skildrer T7 RNAP i bur og uncaged stater. (B og C) En in vitro transskription assay blev udført på bur og uncaged tilstande af polymerase ved at måle produktionen af en fluorescerende aptamer. Vist i dette tal er en 336x stigning i transskription sats mellem ON og OFF stater. Fejllinjer angiver standardafvigelse (n=3). Dette tal er blevet ændret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase; TF = transskription faktor. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at demonstrere en metode til on-demand skift af transskriptionsevne i det tøjrede RNA-polymerasesystem blev der anvendt et DNA-skabelondesign, der reagerede på et par nukleinsyreinputstrenge TFA og TFB (Figur 8A). Transskriptionsaktiviteter blev overvåget ved at måle produktionen af den malakitgrønne fluorescerende aptamer i både OFF (dvs. bur) og ON (dvs. ikke-kalibreret) stater. Mængden af fluorescenssignal , der produceres i slutningen af in vitro-transskriptionen , er vist i figur 8B, og kinetik i realtid er vist i figur 8C. Her kan en 336-fold aktivering i fluorescenssignal observeres, hvilket viser robust kontrol af polymeraseaktivitet.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Lydstyrke | Enheder | Endelig koncentration | Enheder |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 1.8 | Ml | 300 | Mm |
| Glycerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 10.5 | μL | 5 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 25.2 | Ml | -- | -- |
| Slutvolumen | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabel 1: Lysis/ekvilibreringsbufferformel.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Lydstyrke | Enheder | Endelig koncentration | Enheder |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 4.8 | Ml | 800 | Mm |
| Glycerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 7.0 | μL | 5 | Mm |
| Imidazole | 2 | M | 200 | μL | 20 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 22.2 | Ml | -- | -- |
| Slutvolumen | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabel 2: Vask bufferformel.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Lydstyrke | Enheder | Endelig koncentration | Enheder |
| Tris | 1 | M | 0.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 1.6 | Ml | 800 | Mm |
| Glycerol | 100 | % | 0.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 3.5 | μL | 5 | Mm |
| Imidazole | 2 | M | 1 | Ml | 200 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 6.4 | Ml | -- | -- |
| Slutvolumen | -- | -- | 10 | Ml | -- | -- |
Tabel 3: Elution buffer formel.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Lydstyrke | Enheder | Endelig koncentration | Enheder |
| Tris | 1 | M | 5 | Ml | 100 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 2 | Ml | 200 | Mm |
| BME | 14.2 | M | 140.8 | μL | 40 | Mm |
| Triton X-100 | 100 | % | 100 | μL | 0.2 | % |
| EDTA | 0.5 | M | 200 | μL | 2 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 42.56 | Ml | -- | -- |
| Slutvolumen | -- | -- | 50 | Ml | -- | -- |
Tabel 4: Lagerbufferformel.
| Prøve | Beskrivelse | μL af prøven | μL af læssefarve |
| 1 | Protein stige | 9 | -- |
| 2 | FT: Flow-through | 9 | 3 |
| 3 | W1: Vask 1 | 9 | 3 |
| 4 | W2: Vask 2 | 9 | 3 |
| 5 | W3: Vask 3 | 9 | 3 |
| 6 | E1: Elution 1 | 9 | 3 |
| 7 | E2: Elution 2 | 9 | 3 |
| 8 | E3: Elution 3 | 9 | 3 |
| 9 | DE: Afsaltet elution | 9 | 3 |
Tabel 5: SDS-PAGE prøveindlæsning for baner fra venstre mod højre.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | Slutvolumen | Enheder |
| Transskriptionsbuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP mix | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μL |
| DNA-skabelon | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| SNAP T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Nucleasefrit vand | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Samlet volumen | 20 | μL |
Tabel 6: In vitro transskription reaktion formel med SNAP T7 RNAP (master mix).
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | Slutvolumen | Enheder |
| Transskriptionsbuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP mix | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μL |
| DNA-skabelon | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| WT T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Nucleasefrit vand | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Samlet volumen | 20 | μL |
Tabel 7: In vitro transskription reaktion formel med vilde-type (WT) T7 RNAP (master mix).
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | Slutvolumen | Enheder |
| Transskriptionsbuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP mix | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μL |
| DNA-skabelon | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| Nucleasefrit vand | -- | -- | -- | -- | 12.6 | μL |
| Samlet volumen | 20 | μL |
Tabel 8: In vitro transskription reaktion formel uden polymerase; kontrol, der kun er for buffer.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Lydstyrke | Enheder | Endegyldig | Enheder | Endegyldig | Enheder | Slutvolumen | Enheder |
| NaHCO3 | 1 | M | 25 | μL | 0.05 | Mm | 1.25E-05 | mol | 500 | μL |
| DMSO | 100 | % | 284 | μL | 56.8 | % | --- | --- | 500 | μL |
| Oligo | 1 | Mm | 125 | μL | 0.25 | μM | 6.25E-08 | mol | 500 | μL |
| BG-GLA-NHS i DMSO | 50 | Mm | 66 | μL | 6.6 | Mm | 1.65E-06 | mol | 500 | μL |
Tabel 9: Reaktionsformel for benzylguaninebøjning til oligonuleotid.
| Gelvolumen | 10 mL |
| Koncentration af acrylamid | 18% |
| g UREA | 4.8 |
| mL på 40% acrylamid (19:1) | 4.5 |
| mL af 10x TBE | 1 |
| mL af ddH2O | 2.8 |
| μL af TEMED | 5 |
| μL på 10% APS | 100 |
Tabel 10: Reaktionsformel for en 18% TBE-UREA denaturering PAGE.
| Prøve | Beskrivelse | μl-prøve | μl belastning farvestof |
| 1 | L: Ultra-low range stige | 3 | -- |
| 2 | S1: 100 nM oligo | 3 | 3 |
| 3 | S2: 100 nM oligo-BG | 3 | 3 |
| 4 | S3: 100 nM oligo-BG + Centri-Spin | 3 | 3 |
Tabel 11: Denaturering AF SIDE prøveindlæsning for baner fra venstre mod højre.
| Prøve | Koncentration (M) | oligo:RNAP |
| 1 | 2.50E-04 | 5:1 |
| 2 | 2.00E-04 | 4:1 |
| 3 | 1.50E-04 | 3:1 |
| 4 | 1.00E-04 | 2:1 |
| 5 | 5.00E-05 | 1:1 |
| 6 | 2.50E-05 | 1:2 |
| 7 | 1.68E-05 | 1:3 |
| 8 | 1.25E-05 | 1:4 |
| 9 | 1.00E-06 | 1:5 |
Tabel 12: Reagensforhold for analytisk skalakobling af BG-oligonukleotid til SNAP T7 RNAP.
| Reagens | Lydstyrke | Enhed |
| SNAP-buffer | 2 | μL |
| BG-Oligo | 4 | μL |
| SNAP-T7 RNAP | 4 | μL |
| Samlet volumen | 10 | μL |
Tabel 13: Reaktionsformel for SNAP-tag mærkningsreaktionen.
| Stræde | Beskrivelse af eksempel | Prøvevolumen (μL) | SNAP-buffervolumen (μL) | Belastning af farvestofvolumen (μL) |
| 1 | Eksempel 1 | 2 | 4 | 2 |
| 2 | Prøve 2 | 2 | 4 | 2 |
| 3 | Prøve 3 | 2 | 4 | 2 |
| 4 | Prøve 4 | 2 | 4 | 2 |
| 5 | Prøve 5 | 2 | 4 | 2 |
| 6 | Prøve 6 | 2 | 4 | 2 |
| 7 | Prøve 7 | 2 | 4 | 2 |
| 8 | Prøve 8 | 2 | 4 | 2 |
| 9 | Prøve 9 | 2 | 4 | 2 |
| 10 | RNAP-kontrol | 2 | 4 | 2 |
| 11 | Oligo kontrol | 2 | 4 | 2 |
| 12 | Stige | 4 | - |
Tabel 14: Bis-Tris PAGE (4%-12%) reaktion formler for gel lane loading prøver.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Lydstyrke | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | Slutvolumen | Enheder |
| Tris | 1 | M | 50 | μL | 50 | Mm | 1000 | μL |
| NaCl | 5 | M | 100 | μL | 0.5 | M | 1000 | μL |
| ddH2O | -- | -- | 850 | μL | -- | -- | 1000 | μL |
Tabel 15: Reaktionsformel for elutionbuffer (11.1).
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | lydstyrke til pipette | Enheder |
| Tris | 1000 | Mm | 25 | Mm | 25 | μL |
| EDTA | 500 | Mm | 5 | Mm | 10 | μL |
| MgCl | 1000 | Mm | 25 | Mm | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 940 | μL |
Tabel 16: Reaktionsformel for 5x udglødningsbuffer.
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | Lydstyrke til pipette | Enheder | Samlet reaktionsvolumen | Enheder |
| udglødningsbuffer | 5 | X | 1 | X | 5 | μL | 24 | μL |
| sans | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| antisense | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14.2 | μL | 24 | μL |
Tabel 17: Reaktion formel bruges til anneal to ssDNA skabeloner (sense og antisense tråde).
| Reagens | Indledende koncentration | Enheder | Endelig koncentration | Enheder | Lydstyrke til pipette | Enheder | Samlet reaktionsvolumen | Enheder |
| In vitro-transskription (IVT) buffer | 10 | X | 1 | X | 2.5 | μL | 25 | μL |
| rNTP mix | 25 | Mm | 1 | Mm | 1 | μL | 25 | μL |
| Malakit Grøn | 1 | Mm | 40 | μM | 1 | μL | 25 | μL |
| RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2.5 | μL | 25 | μL |
| DNA-skabelon | 1000 | Nm | 120 | Nm | 3 | μL | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14 | μL | 25 | μL |
Tabel 18: In vitro transskription reaktion formel (master mix); omfatter RNAP-koncentration.
| Gel volumen | 10 mL |
| Koncentration af acrylamid | 12% |
| g UREA | 4.8 |
| ml 40% acrylamid (29:1) | 3 |
| ml 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 4.3 |
| μl TEMED | 5 |
| μl 10% APS | 100 |
Tabel 19: Reaktionsformel for en 12% TBE-UREA denaturering PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser en DNA nanoteknologi-inspireret tilgang til at kontrollere aktiviteten af T7 RNA polymerase ved kovalent kobling en N-terminalt SNAP-tagged rekombinant T7 RNAP med en BG-funktionaliseret oligonukleotid, som efterfølgende blev brugt til at programmere TMDSD reaktioner. Ved design blev SNAP-tag placeret på N-terminus af polymerase, da C-endestationen for vild type T7 RNAP er begravet i proteinstrukturkernen og gør vigtige kontakter med DNA-skabelonen28. Tidligere forsøg på at ændre polymerase C-endestation har resulteret i fuldstændig tab af enzymatisk aktivitet, medmindre andre kompenserende mutationer indføres. 29,30 I modsætning hertil er N-terminalfusioner af T7 RNAP veltolereret, selv om valget af fusionsmærket kan påvirke polymeraseaktiviteten. Hvordan forskellige tags påvirker RNAP-aktiviteten, er ikke blevet systematisk bestemt. SNAP-mærket blev valgt, fordi det er effektivt og robust, hvilket muliggør kvantitativ mærkning for stoichiometriske forhold mellem proteinet og oligonuleotid. Alternativt kan andre koblingskemikalier bruges til at forbinde oligonuleotid med polymerase, såsom Ybbr31 tags, Sortase tags32, og SpyTags33, eller andet via indførelsen af unaturlige aminosyrer forsynet reaktive grupper. Forskellen i størrelse og rækkefølge mellem disse tags kan også påvirke aktiviteten af det resulterende fusionsprotein, og det optimale valg for stedspecifik RNAP-mærkning fortjener fremtidig undersøgelse. Endelig anbefales det at begrænse længden af det oligonuleotid, der er bundet til RNAP, til < 30 nt. Dette er designet til at reducere ikke-specifikke elektrostatiske interaktioner mellem oligonuleotid med DNA-bindende domæne af T7 RNAP og at lette rensningen af oligonuleotid tøjret RNAP ved ion udveksling kromatografi.
Den foreslåede teknologi, der er beskrevet her, kræver udtryk for en rekombinant SNAP T7 RNAP, og der er to kritiske trin under synteseprocessen, der påvirker proteinproduktets samlede udbytte. For det første kan brugen af sonikering til celle lysis opvarme prøven (afsnit 4). For at sikre effektiv celle lysis og proteinudvinding uden varmedenaturering af proteinet skal celleprøven opbevares på is under hele sonikering, og sonikeringssondens temperatur overvåges mellem hver prøve. Et andet kritisk skridt er bufferudvekslingen og up-koncentrationen af SNAP T7 RNAP efter hans tagrensning (trin 4.11.2). Det er vigtigt forsigtigt at pipette-vaske membranen i centrifugalfilterenheden for at forhindre proteinaggregation, hvilket ville reducere det samlede udbytte og proteinfunktionalitet.
I princippet er BG-oligonukleotidreaktionen med SNAP-tag kvantitativ ved et 1:1 molarforhold. En række oligonucleotid-til-polymerase stoichiometriske nøgletal bør dog testes, før der forberedes et større parti af materialet. Dette skyldes, at proteinkoncentrationsestimaterne kan være unøjagtige. Dette trin kan kræve, at der udføres SDS-PAGE af koblingsreaktionen ved forskellige fortyndinger af BG-oligonukleotid med hensyn til en konstant proteinkoncentration for at identificere det optimale koblingsforhold. Under PAGE-analyse kan den samme gel farves serielt med to pletter: en nukleinsyreplet efterfulgt af en Coomassie Blue proteinplet. Det er vigtigt at vaske SDS grundigt af gelen, før du pletter med nukleinsyrepletten. Dette skyldes, at SDS vil fange farvestoffet i gelen, hvilket fører til et højt baggrundssignal. Desuden skal nukleinsyrepletten udføres før Coomassie Blue proteinpletten.
Mens dette foreslåede system samler skalerbarheden af et DNA-kredsløb med funktionaliteten af et proteinbaseret transskriptionskredsløb, introducerer det også begrænsninger, der ses i transskriptionskredsløb. En af de mange fordele ved DNA-computere er stabiliteten af nukleinsyrer i en række forskellige miljøer. Ved tilsætning af polymeraser skal det tøjrede polymerasesystem opbevares under særlige forhold for at forhindre denaturering. Desuden skal databehandling forekomme i et miljø med specifikke bufferbetingelser, der giver mulighed for transskription. Selv om RNA-polymerase fra T7-bakteriofagen anvendes i denne demonstration, kan der anvendes en anden RNA-polymerase med mere anvendelsessvarende betingelser til at omgå denne begrænsning.
Resultaterne viser, at dette tøjrede polymerasesystem kan skiftes mellem OFF (f.eks. bur) og ON (dvs. ikke-kalibrerede) tilstande ved hjælp af nukleinsyre "transskriptionsfaktorer". Brug af DNA til at regulere transskription gør det muligt at designe transskriptionskredsløb i stor skala, herunder opbygning af signalkaskader og feedback med flere lag. En anden funktion er selvforstærkning af inputsignaler modtaget eller passeret gennem kredsløbet, som en aktiveret polymerase, der har hybridiseret til en skabelon vil fortsætte med at producere flere kopier af sin udskrift, indtil det er stoppet. Denne signalforstærkningsmekanisme kan udnyttes til at forstærke kredsløbsresponsen på lavkoncentrationsinput. Endelig kan denne byggesten bruges til at implementere en række digitale logikker. Denne undersøgelse viser aktivering af skabeloner via "OG logik" ved at designe skabeloner, der skal aktiveres af to nukleinsyrestrenge. På samme måde kan "OR logik" udformes ved at gøre en DNA-skabelon lydhør over for kun streng B og indføre et "adapter" mellemprodukt, der afholder streng A til gengæld for at producere endnu en kopi af streng B. I dette tilfælde vil indførelsen af enten streng A eller B som input i reaktionen udløse transskription af mål-DNA-skabelonen. Evnen til rationelt at designe en række kredsløbsadfærd i stor skala bør muliggøre implementering af komplekse molekylære computeralgoritmer til nye applikationer inden for sygdomsdetektering, bærbar bioproduktion samt molekylær databehandling og opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende finansielle interesser at erklære af nogen af forfatterne.
Acknowledgments
L.Y.T.C anerkender generøs støtte fra New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant og University of Toronto's Medicine by Design Initiative, som modtager støtte fra Canada First Research Excellence Fund (CFREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tablets used to make 10 mM buffer |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% ethanol (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x in vitro transcription (IVT) buffer | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M sodium bicarbonate buffer | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M sodium acetate | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS protein sample loading buffer | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B powder | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competent E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
| bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S11494 | |
| cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S33102 | |
| dry dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glycerol | Bio Basic | GB0232 | |
| kanamycin sulfate | BioShop | KAN201.5 | |
| lysogeny broth | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malachite green oxalate | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS running buffer (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotide (cage antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotide (cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotide (malachite green aptamer sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotide (Transcription Factor A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleotide (Transcription Factor B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
| plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
| protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini quick DNA spin column | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Ultra Low Range DNA ladder | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urea | BioShop | URE001.1 |
References
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
- Chen, Y. -J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
- di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V.
- Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
- Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
- MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
- Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
- Wetterstrand, K.
- Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
- Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).
- Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
- Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
- Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
- Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).
- Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
- Brophy, J. A. N., Voigt, C. A.
- Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
- Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
- Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).
- Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
- Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).
- Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
- Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).
- Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
- Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
- Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).
