Summary
Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.
Abstract
In het verleden waren intestinale epitheliale modelsystemen beperkt tot getransformeerde cellijnen en primair weefsel. Deze modelsystemen hebben inherente beperkingen omdat de eerste de oorspronkelijke weefselfysiologie niet getrouw weergeven en de beschikbaarheid van de laatste beperkt is. Vandaar dat de toepassing ervan fundamenteel onderzoek en onderzoek naar geneesmiddelenontwikkeling belemmert. Volwassen op stamcellen gebaseerde organoïden (voortaan organoïden genoemd) zijn miniaturen van normaal of ziek epitheelweefsel waarvan ze zijn afgeleid. Ze kunnen zeer efficiënt worden vastgesteld vanuit verschillende gastro-intestinale (GI) tractusregio's, hebben langdurige uitbreidbaarheid en simuleren weefsel- en patiëntspecifieke reacties op behandelingen in vitro. Hier is de vestiging van intestinale organoïde-afgeleide epitheliale monolagen aangetoond, samen met methoden om de integriteit van de epitheliale barrière, permeabiliteit en transport, antimicrobiële eiwitsecretie en histologie te meten. Bovendien kunnen intestinale organoïde-afgeleide monolagen worden verrijkt met prolifererende stam- en transitversterkende cellen en met belangrijke gedifferentieerde epitheelcellen. Daarom vertegenwoordigen ze een modelsysteem dat kan worden aangepast om de effecten van verbindingen op doelcellen en hun werkingsmechanisme te bestuderen. Hoewel organoïde culturen technisch veeleisender zijn dan cellijnen, kunnen ze, eenmaal vastgesteld, storingen in de latere stadia van de ontwikkeling van geneesmiddelen verminderen, omdat ze echt in vivo epitheelcomplexiteit en interpatriotale heterogeniteit vertegenwoordigen.
Introduction
Het darmepitheel fungeert als een fysieke barrière tussen de luminale inhoud van de darmen en het onderliggende weefsel. Deze barrière bestaat uit een enkele epitheliale laag van voornamelijk absorberende enterocyten die verbonden zijn door tight junctions, die sterke intercellulaire verbindingen tussen aangrenzende cellen tot stand brengen. Deze cellen vormen een gepolariseerde epitheelvoering die de apicale (lumen) en basolaterale zijden van de darm scheidt, terwijl tegelijkertijd het paracellulaire transport van verteerde voedingsstoffen en metabolieten wordt gereguleerd. Naast enterocyten dragen andere belangrijke epitheelcellen zoals bokaal, Paneth en entero-endocriene cellen ook bij aan intestinale homeostase door respectievelijk slijm, antimicrobiële peptiden en hormonen te produceren. Het darmepitheel wordt voortdurend aangevuld door leucine-rijke repeat-bevattende G-eiwit-gekoppelde receptor 5-positieve (LGR5 +) stamcellen te delen in de bodem van darmcrypten die transit-versterkende (TA) cellen produceren die naar boven migreren en differentiëren naar andere celtypen1. Verstoring van intestinale epitheliale homeostase door genetische en omgevingsfactoren, zoals blootstelling aan voedselallergenen, medicinale verbindingen en microbiële pathogenen, leidt tot verstoring van de darmbarrièrefunctie. Deze aandoeningen veroorzaken verschillende darmziekten, waaronder inflammatoire darmaandoeningen (IBD), coeliakie en door geneesmiddelen geïnduceerde GI-toxiciteit2.
Studies naar het darmepitheel worden uitgevoerd met behulp van verschillende in vitro platformsystemen zoals membraaninzetstukken, organen-op-een-chip-systemen, Ussing-kamers en darmringen. Deze platforms zijn geschikt voor het vaststellen van gepolariseerde epitheliale monolagen met toegang tot zowel apicale als basolaterale zijden van het membraan, met behulp van getransformeerde cellijnen of primair weefsel als modellen. Hoewel getransformeerde cellijnen, zoals de colorectale (adeno)carcinoomcellijnen Caco-2, T84 en HT-29, tot op zekere hoogte kunnen differentiëren in gepolariseerde intestinale enterocyten of slijmproducerende cellen, zijn ze niet representatief voor het in vivo epitheel omdat verschillende celtypen ontbreken en verschillende receptoren en transporters afwijkend tot expressiekomen 3 . Bovendien, omdat cellijnen zijn afgeleid van een enkele donor, vertegenwoordigen ze geen interpatient heterogeniteit en lijden ze aan verminderde complexiteit en fysiologische relevantie. Hoewel primaire weefsels die worden gebruikt in Ussing-kamers en als darmringen representatiever zijn voor de in vivo situatie, maken hun beperkte beschikbaarheid, levensvatbaarheid op korte termijn en gebrek aan uitbreidbaarheid ze ongeschikt als medium voor high-throughput (HT) studies.
Organoïden zijn in vitro epitheliale culturen die zijn vastgesteld uit verschillende organen zoals de darm, nieren, lever, pancreas en longen. Het is bewezen dat ze langdurige, stabiele uitbreidbaarheid en genetische en fenotypische stabiliteit hebben en daarom representatieve biologische miniaturen zijn van het epitheel van het oorspronkelijke orgaan met getrouwe reacties op externe stimuli 4,5,6,7,8,9. Organoïden worden efficiënt vastgesteld uit gereseceerd of gebiopt normaal, ziek, ontstoken of kankerachtig weefsel, dat heterogene patiëntspecifieke responsen vertegenwoordigt 10,11,12,13,14,15,16. Dit artikel laat zien hoe intestinale epitheliale monolagen afgeleid van organoïde culturen kunnen worden vastgesteld. Monolagen zijn met succes vastgesteld uit dunne darm- en colon- en rectale organoïde culturen. Dit model creëert een mogelijkheid om het transport en de permeabiliteit van de epitheelcellen naar geneesmiddelen te bestuderen, evenals hun toxicologische effecten op het epitheel. Bovendien maakt het model co-kweek met immuuncellen en bacteriën mogelijk om hun interacties met het darmepitheel te bestuderen 17,18,19. Bovendien kan dit model worden gebruikt om reacties op therapieën op een patiëntspecifieke manier te bestuderen en screeningsinspanningen te initiëren om te zoeken naar de volgende golf van epitheliale barrièregerichte therapieën. Een dergelijke aanpak kan worden uitgebreid naar de kliniek en de weg vrijmaken voor gepersonaliseerde behandelingen.
Hoewel de epitheliale monolagen in dit protocol worden bereid uit menselijke normale intestinale organoïden, kan het protocol worden toegepast en geoptimaliseerd voor andere organoïde modellen. Epitheliale organoïde monolagen worden gekweekt in intestinale organoïde expansie medium dat Wnt bevat om stamcelproliferatie te ondersteunen en vertegenwoordigen intestinale crypte cellulaire samenstelling. Intestinale organoïden kunnen worden verrijkt om verschillende intestinale epitheliale lotgevallen te hebben, zoals enterocyten, Paneth, goblet en entero-endocriene cellen, door Wnt-, Notch- en epidermale groeifactor (EGF) -routes te moduleren. Hier, na de vestiging van monolagen in expansiemedium, worden ze naar meer gedifferentieerde darmepitheelcellen gedreven, zoals eerder beschreven 20,21,22,23,24,25. Voor screeningsdoeleinden, afhankelijk van het werkingsmechanisme van de samengestelde stof, de doelcellen en de experimentele omstandigheden, kunnen de monolagen naar de cellulaire samenstelling van keuze worden gedreven om de effecten van de verbinding te meten met relevante functionele uitlezingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van reagentia voor cultuur
OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast en volg de standaardrichtlijnen voor het werken met celculturen. Ultraviolet licht wordt gedurende 10 minuten gebruikt voordat de bioveiligheidskast wordt opgestart. Voor en na gebruik wordt het oppervlak van de bioveiligheidskast gereinigd met een tissuepapier gedrenkt in 70% ethanol. Om de vorming van driedimensionale druppels extracellulaire matrix (ECM) te vergemakkelijken, houdt u een voorgewarmde kolf van 96-, 24- en 6-well-platen klaar in de incubator bij 37 °C.
- Basale medium bereiding
- Bereid basaal medium (BM) in een 500 ml Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium met Ham's Nutrient Mixture F-12 (Ad-DF) medium fles door toevoeging van 5 ml 200 mM glutamine, 5 ml van 1 M 4-(2-hydroxyethil)-1piperazineethanesulfonzuur (HEPES) en 5 ml penicilline / streptomycine (pen / streptomycine) oplossingen (10.000 U / ml of 10.000 μg / ml). Dit kan minimaal 4 weken in de koelkast bij 4 °C bewaard worden.
- Wnt bronnen
- Bereid Wnt3a-geconditioneerd medium (Wnt3aCM) volgens de eerder beschreven methode26.
OPMERKING: Onlangs is een surrogaat Wnt (NGS-Wnt) van de volgende generatie gegenereerd, dat ook de uitbreiding van menselijke darmorganoïden ondersteunt,27.
- Bereid Wnt3a-geconditioneerd medium (Wnt3aCM) volgens de eerder beschreven methode26.
- Intestinale organoïde base medium voorbereiding
OPMERKING: Gebruik alle groeifactoren en reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik kleine aliquots en vermijd vries-dooi cycli; functionele groeifactoren zijn essentieel voor een succesvolle organoïde cultuur.- Bereid geconcentreerd 2x intestinaal organoïde base medium (2x IBM) voor door BM aan te vullen met 1 μM A83-01, 2,5 mM N-acetylcysteïne, 2x B27 supplement, 100 ng/ml human epidermale groeifactor (hEGF), 10 nM gastrine, 200 ng/ml hNoggin en 100 μg/ml van een antimicrobiële formulering voor primaire cellen (zie de Tabel met materialen).
- Vul de 2x IBM en vries tot 4 maanden in bij -20 °C. Ontdooi indien nodig een aliquot 's nachts bij 4 °C of gedurende enkele uren bij kamertemperatuur (RT).
- Om intestinale organoïde expansie medium (IEM) te bereiden, vul 2x IBM aan met 50% Wnt3aCM of 50% BM en 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng/ml humaan Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM nicotinamide en 10 μM SB202190.
- Intestinale organoïde differentiatie medium voorbereiding
- Bereid enterocytendifferentiatiemedium (eDM) voor door 2x IBM aan te vullen met 50% BM, 250 ng/ml hRspo3 en 1,5 μM Wnt-routeremmer (IWP-2). Bewaar eDM bij 4 °C gedurende maximaal 10 dagen.
- Bereid combinatiedifferentiatiemedium (cDM) voor door 2x IBM aan te vullen met 40% BM en 10% Wnt3aCM of 50% BM en 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng/ml hRspo3, 10 μM DAPT en 100 nM PD0325901. Bewaren van cDM bij 4 °C gedurende maximaal 10 dagen.
- Manipulatie van extracellulaire matrix (ECM)
OPMERKING: Bereid de extracellulaire matrix (ECM) (zie de tabel met materialen) voor volgens de aanbeveling van de fabrikant.- Ontdooi ECM een nacht op ijs; breng de ECU van de fles over in een conische buis van 15 ml met behulp van een pipet van 5 ml, beide voorgekoeld bij -20 °C. Vries aliquots slechts één keer opnieuw in bij -20 °C. Bewaar de ECU na ontdooien maximaal 7 dagen in een koelkast bij 4 °C. Incubeer minstens 30 minuten op ijs voor gebruik.
OPMERKING: Meng ECM goed en zorg ervoor dat het koud is voordat u crypten of organoïden insluit.
- Ontdooi ECM een nacht op ijs; breng de ECU van de fles over in een conische buis van 15 ml met behulp van een pipet van 5 ml, beide voorgekoeld bij -20 °C. Vries aliquots slechts één keer opnieuw in bij -20 °C. Bewaar de ECU na ontdooien maximaal 7 dagen in een koelkast bij 4 °C. Incubeer minstens 30 minuten op ijs voor gebruik.
2. Organoïde culturen
- Culturen vaststellen uit bevroren organoïden
OPMERKING: Laat BM RT bereiken en houd een aliquot van 12 ml, opgewarmd tot 37 °C, klaar voordat u begint met de procedure voor het ontdooien van een cryoviaal met bevroren organoïden.- Ontdooi de organoïde cryovial snel door te roeren in een waterbad van 37 °C totdat er slechts een stukje ijs overblijft. Voeg onmiddellijk 500 μL warme BM druppelsgewijs toe aan het cryoviaal en pipetteer een paar keer op en neer om het vriesmedium te verdunnen en de inhoud voorzichtig te mengen.
- Breng met behulp van een P1000-pipet de organoïden over naar een conische buis van 15 ml en voeg nog eens 1 ml warme BM druppelsgewijs toe terwijl u voorzichtig de bodem van de buis mengt. Pipetteer een paar keer op en neer om het vriesmedium te verdunnen en meng de inhoud voorzichtig.
- Voeg tot 12 ml warme BM druppelsgewijs toe aan de conische buis van 15 ml met de organoïden en pipetteer op en neer met een steriele pipet van 10 ml om de organoïden voorzichtig te resuspenderen.
- Centrifugeer de organoïde suspensie gedurende 5 minuten bij 85 × g en 8 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de pellet te verstoren en resuspend de organoïden in 30% v/v IEM aangevuld met 10 μM Y27632 of andere rho-geassocieerde coiled-coil-forming protein serine/threonine kinase inhibitor (ROCK inhibitor). Plaats de tube op ijs.
- Voeg 70% v/v ECM toe aan de conische buis van 15 ml die de organoïden bevat. Meng de organoïde suspensie die de conische buis van 15 ml op ijs houdt en zaad 5 μL van de suspensie om de dichtheid te controleren (figuur 1A). Ga door met beplating als de dichtheid geschikt is; als de dichtheid te hoog is, voeg dan meer IEM/ECM-oplossing toe in dezelfde verhouding van respectievelijk 30-70% v/v.
- Zaai in elke put van een voorgewarmde 24-putplaat 50 μL van de organoïde suspensie door 5 afzonderlijke druppels van 10 μL te pipetteren (figuur 1B). Draai de plaat ondersteboven en laat hem 5 minuten in de bioveiligheidskast staan. Breng de plaat nog ondersteboven over naar de incubator van 37 °C en laat deze nog 30 minuten staan.
- Voeg 500 μL IEM met 10 μM ROCK-remmer toe aan elke put en breng de plaat over naar de incubator. Stel regelmatig één druppel voor om de groei te controleren en ververs IEM elke 2-3 dagen door het oude medium op te zuigen en 500 μL verse IEM toe te voegen.
- Passeren de organoïden zodra ze goed hersteld zijn van het ontdooien en de juiste grootte hebben bereikt om te worden verwerkt (figuur 1C), zoals beschreven in rubriek 2.2.
- Passageing van intestinale organoïden
OPMERKING: Koel de ECU minstens 30 minuten op ijs en houd de IEM voor gebruik ten minste 1 uur op RT.- Gebruik het medium uit één kweekput om de organoïde koepels te breken met behulp van een filterpunt met lage retentie van 1250 μL en breng de inhoud van de put over naar een gelabelde conische buis van 15 ml. Was de put met 1 ml BM en breng deze over in dezelfde conische buis van 15 ml.
- Herhaal stap 2.2.1 en 2.2.2 met alle andere putten (maximaal een halve plaat of 600 μL ECM-druppels kan worden gewassen en toegevoegd aan één conische buis van 15 ml).
- Voeg BM toe om de buis tot 12 ml te vullen en pipetteer 10x op en neer met een pipet van 10 ml. Centrifugeer bij 85 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C.
- Controleer voordat u de BM verwijdert onder de microscoop of alle organoïden aan de onderkant van de conische buis van 15 ml zijn gepelletiseerd (figuur 1D). Als er geen ECM over de organoïde pellet ligt of als de ECM-laag schoon is of alleen puin, enkele cellen of zeer weinig organoïden bevat in vergelijking met de gepelletiseerde organoïden, anspirateer dan het supernatant en pipetteer de ECM die de organoïde pellet bedekt heel voorzichtig met behulp van een P200 pipet.
OPMERKING: Organoïden kunnen vast komen te zitten in de ECU en sedimenteren niet als een compacte pellet vanwege de lage centrifugatiekracht. Als de ECU organoïden bevat, centrifugeer de buis opnieuw bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C en verwijder voorzichtig het supernatant zoals beschreven in punt 2.2.4. Als er meerdere conische buizen van 15 ml zijn, kunnen deze na stap 2.2.4 worden samengevoegd. - Voeg 1 ml BM toe aan elke pellet (met een volume van 50-200 μL, afhankelijk van de organoïde cultuur en dichtheid) en resuspend voorzichtig. Pipetteer de organoïden minstens 5x op en neer om ze af te scheren, waardoor schuimvorming wordt vermeden. Controleer onder de microscoop of de organoïden verstoord zijn (figuur 2A). Als de organoïden verstoord zijn, gaat u verder met stap 2.2.7; als de organoïden niet verstoord zijn, pipetteer ze dan nog eens 5x. Raak deze keer de wand van de plastic buis aan met de pipetpunt om meer mechanische kracht uit te oefenen om de organoïden te verstoren.
OPMERKING: Mechanische afschuiving van cystische (figuur 1C) en ontluikende (figuur 1E) organoïden is mogelijk met een plastic pipetpunt van 200 μl of 10 μl op een filterpunt met lage retentie van 1250 μl (figuur 1F), afhankelijk van het volume dat nodig is voor het verstoren van de organoïden. Het gebruik van een vernauwde glazen pipet (figuur 1F) wordt aanbevolen wanneer meer dan 200 μL ECM met de organoïden wordt verwerkt (één put van een 6-putplaat of 4 putten van een 24-putplaat). - Controleer nogmaals onder de microscoop of de organoïden verstoord zijn. Als het wordt verstoord, gaat u verder met de volgende stap; zo niet, pipetteer de organoïden tot 20x en controleer de organoïden regelmatig onder de microscoop. Als de organoïden nog steeds niet verstoord zijn, voeg dan 25% v/v celdissociatiereagens 1 (zie de materiaaltabel) toe aan de suspensie, incubeer in het waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten en pipetteer de organoïden tot 20x, waarbij de organoïden regelmatig onder de microscoop worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat ze niet naar afzonderlijke cellen worden verteerd.
- Voeg tot 12 ml BM toe aan de conische buis van 15 ml en was de organoïde pellet door op en neer te pipetteren. Centrifugeer bij 85 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C. Gooi het supernatant weg en pas de eindconcentratie aan op 70% v/v ECM door IEM en ECM toe te voegen aan de organoïde pellet.
- Begin met het resuspenderen van de organoïde pellet met het dubbele volume IEM / ECM verzameld voor passageing en zaad 5 μL van de suspensie om de dichtheid te controleren. Ga door met beplating als de dichtheid geschikt is (figuur 2B); voeg meer IEM/ECM-oplossing toe als de dichtheid te hoog is. Voeg 200 μL van de suspensie toe aan elke put van een voorgewarmde 6-well plaat en maak afzonderlijke druppels van 10 μL volume.
- Draai de plaat ondersteboven en laat hem 5 minuten in de bioveiligheidskast staan. Breng de plaat nog ondersteboven over naar de incubator van 37 °C en laat deze nog 30 minuten staan. Voeg 2 ml IEM met 10 μM ROCK-remmer toe aan elke put en breng de plaat over naar de incubator.
- Stel regelmatig één druppel voor om de groei te controleren en ververs IEM elke 2-3 dagen door het oude medium op te zuigen en 2 ml verse IEM toe te voegen.
- Passaging van intestinale organoïden voor epitheliale monolaagpreparaat
- Passage organoïden 3 dagen voorafgaand aan het oogsten voor monolaagpreparaat door het volgen van hetzelfde passagingprotocol beschreven in rubriek 2.2, met één uitzondering. Resuspend de organoïden in stap 2.2.7 in 1-1,5x het beginvolume van IEM/ECM om een hogere dichtheid en expansiepotentiaal te hebben wanneer ze worden geoogst voor monolaagvoorbereiding (figuur 3A).
3. Epitheliale monolaagpreparaat
- Kweekepitheel monolagen op zowel 24-well als 96-well membraaninzetstukken met een verscheidenheid aan beschikbare plaattypen (tabel 1). Gebruik hts-membraaninzetstukken (high-throughput system) voor beide maten, omdat deze een geïntegreerde lade bevatten met de membraaninzetstukken en een ontvangerplaat. Voor het 24-well formaat is het gebruik van platen met aparte verwijderbare membraaninzetstukken ook mogelijk.
OPMERKING: Verschillende membraantypen (polyethyleentereftalaat (PET) of polycarbonaat) en poriegroottes (0,4-8,0 μm) zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt afhankelijk van de experimentele behoeften. Monolagen kunnen alleen door brightfield in beeld worden gebracht wanneer inserts met PET-membranen worden gebruikt. Lichtdichte membranen blokkeren fluorescerende lichtlekkage van de apicale naar het basolaterale compartiment en kunnen worden overwogen wanneer dynamisch transport of permeabiliteit van fluorescerend gelabelde substraten wordt bestudeerd. Het huidige protocol maakt gebruik van 24-well membraaninzetstukken; aanpassingen voor 96-well membraaninzetstukken worden beschreven in rubriek 5. Afhankelijk van de dichtheid, morfologie en grootte van de organoïden (figuur 3A) zijn 6 putten van een 6-putplaat (zoals gezaaid in sectie 2.3) voldoende voor het zaaien van een volledige 24-putplaat van membraaninzetstukken. - Coating membraan inzetstukken met ECM
OPMERKING: Als er twijfels zijn over het hebben van voldoende cellen, coat dan de inserts na het tellen van de cellen. Dit om onnodige coating en verlies van de dure membraaninzetstukken te voorkomen.- Plaats de membraaninzetstukken in de steunplaat in de bioveiligheidskast. Verdun de ECM 40x in ijskoude Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2+ en Mg2+, en pipetteer 150 μL van de verdunde ECM in het apicale compartiment van elke insert. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.
- Voorbereiding van cellen voor zaaien
- Voorwarm aliquots van het celdissociatiereagens 2 in het waterbad (37 °C). Bereid 2 ml van het reagens voor elke put van een 6-well plaat.
- Breng de kweekplaat met de organoïden (bereid in punt 2.3) over van de incubator naar de bioveiligheidskast. Verwerk de organoïden, zoals beschreven in stappen 2.2.1.-2.2.4. Bundel niet meerdere buizen in één buis.
- Vul de buis, die organoïden bevat uit maximaal 3 putten van een 6-wells plaat, tot 12 ml met DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+), en pipetteer 10x op en neer met een pipet van 10 ml. Centrifugeer bij 85 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C en zuig het supernatant aan zonder de organoïde pellet te verstoren.
- Voeg 2 ml van het voorgewarmde celdissociatiereagens 2 toe per put van een 6-putplaat die als uitgangsmateriaal wordt gebruikt en resuspend. Incubeer de buizen diagonaal of horizontaal gedurende 5 minuten in het waterbad bij 37 °C, om te voorkomen dat de organoïden naar de bodem van de buis zinken.
- Pipetteer 10x op en neer met behulp van een 5 ml steriele plastic pipet of een P1000 pipet, afhankelijk van het totale volume van het celdissociatiereagens. Controleer de organoïde suspensie onder de microscoop om te zien of zich een mengsel van enkele cellen en enkele celklonten bestaande uit 2-4 cellen heeft gevormd (figuur 3B). Zet indien nodig de vertering voort door stap 3.3.4-3.3.5 te herhalen (verhoog het volume celdissociatiereagens niet) totdat het mengsel lijkt op figuur 3B.
OPMERKING: Vermijd het volledig verteren van de organoïden tot afzonderlijke cellen. Het is noodzakelijk om enkele kleine groepen cellen te hebben (d.w.z. groepen van 2-4 cellen). - Stop de celdissociatie door maximaal 12 ml BM inclusief 10 μM ROCK-remmer toe te voegen aan de celsuspensie. Centrifugeer bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C en zuig het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren. Bij het hanteren van dezelfde organoïde cultuur in verschillende conische buizen van 15 ml, poolt u de celkorrels en resuspendeert u ze in 12 ml BM.
- Filtreer de celsuspensie door een zeef van 40 μm voorbevochtigd met BM en oogst de doorstroming in een conische buis van 50 ml. Was de zeef met 10 ml BM en oogst de doorstroming in dezelfde conische buis van 50 ml.
- Breng de gespannen celsuspensie over in twee nieuwe conische buizen van 15 ml. Centrifugeer bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C en zuig het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren. Resuspend de cellen in 4 ml IEM aangevuld met 10 μM ROCK-remmer per volledige kweekplaat die als uitgangsmateriaal wordt gebruikt.
- Meng een kleine hoeveelheid celsuspensie in een verhouding van 1:1 met trypan blauw om te tellen. Tel de levende, niet blauwe, cellen (figuur 3C) en bereken het totale aantal levende cellen. Tel in kleine klonten elke individuele cel.
- Bereid een celsuspensie voor met 3 × 106 levende cellen per ml IEM aangevuld met 10 μM ROCK-remmer.
- Zaaicellen op polyester membraaninzetstukken
- Zuig DPBS voorzichtig op uit de met ECM gecoate inzetstukken (stap 3.2.1), terwijl u de plaat horizontaal houdt. Pipetteer 800 μL IEM aangevuld met ROCK-remmer in elk basolateraal compartiment. Pipetteer 150 μL van de in stap 3.3.10 bereide celsuspensie op het met ECM beklede membraan in het apicale compartiment druppelsgewijs. Zorg er per bord voor dat je ten minste één "blanco" goed hebt met alleen BM.
- Zodra de cellen op het membraan zijn gesedimenteerd, meet u de transepitheliale elektrische weerstand (TEER), zoals beschreven in paragraaf 4.1, en stelt u de membraaninzetstukken in beeld met behulp van een microscoop. Plaats de plaat in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2. Meet elke dag TEER en verwerf regelmatig beelden om de vorming van monolagen te controleren (figuur 4A-D).
- Verfrissende monolagen
OPMERKING: Ververs het medium elke 2-3 dagen en houd u aan de volgende volgorde om een positieve hydrostatische druk boven de cellen te handhaven en te voorkomen dat cellen van het membraan worden geduwd. Zorg er tijdens het verversen van het medium voor dat de monolaag, die zichtbaar is bij het inademen van het medium, niet wordt beschadigd door de pipetpunt.- Verwijder het medium uit de basolaterale compartimenten van de plaat met de membraaninzetstukken. Zuig vervolgens voorzichtig het medium op uit de apicale compartimenten van de membraaninzetstukken.
- Voeg druppelsgewijs 150 μL verse IEM toe aan elk apicale compartiment en voeg vervolgens 800 μL verse IEM toe aan elk basolateraal compartiment.
- Verrijking van de monolaag voor gewenste intestinale epitheelceltypen
- Laat de monolaag confluent worden in IEM, wat overeenkomt met een TEER-waarde van ongeveer 100 Ω·cm² (zoals berekend in stap 4.1.1.4). Controleer onder de microscoop of de monolagen zich volledig hebben gevormd (figuur 4D) en op de afwezigheid van gaten (zoals te zien in figuur 4B,C).
- Verwijder de IEM voorzichtig uit de basolaterale en apicale compartimenten van de membraaninzetstukken en vervang deze door eDM of cDM zoals bereid in punt 1.4. Kweek de monolaag nog eens 3-4 dagen in het specifieke differentiatiemedium om de organoïde cellen verrijkt te krijgen met het gewenste specifieke celtype. Ververs het medium om de 2-3 dagen, zoals beschreven in rubriek 3.4.
- Meet TEER dagelijks en verkrijg indien gewenst regelmatig beelden (figuur 5A-C).
OPMERKING: De TEER-waarde die een volledig georganiseerde verrijkte monolaag aangeeft, verschilt per organoïdecultuur; doorgaans stijgen de TEER-waarden tot 600 en kunnen oplopen tot 1000 Ω·cm2 (zoals berekend in stap 4.1.1.4) na 3 dagen in differentiatiemedia en zijn stabiel gedurende 3-5 dagen.
4. Epitheliale monolaag assay uitlezingen
- Meting van transepitheliale elektrische weerstand (TEER)
OPMERKING: TEER-metingen worden algemeen aanvaard als een methode om tight junction-dynamiek en barrièrefunctie-integriteit te analyseren in biologische modellen van fysiologische barrières, zoals epitheliale monolagen28,29. Toename van TEER na differentiatie als gevolg van verhoogde cellulaire interactie op tight junctions kan worden gemeten met behulp van een handmatige TEER-meter of een geautomatiseerde TEER-meetrobot.- Meting van TEER met behulp van een handmatige TEER-meter
- Reinig de elektrode met 70% ethanol en laat deze aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast. Plaats de elektrode in een buis met BM. Sluit de elektrode aan op de handmatige TEER-meter. Draai de functieschakelaar om te meten in Ohm (Ω). Schakel de aan /uit-schakelaar in.
- Plaats de korte elektrode in het apicale compartiment van het inzetstuk, terwijl de lange elektrode in het basolaterale compartiment wordt geplaatst (figuur 6A). Raak de monolaag niet aan.
- Meet de weerstand in de lege put (R-blanco) en meet vervolgens de resterende monsters (R-monster) op dezelfde manier. Was de elektrode met BM tussen monsters met verschillende omstandigheden. Reinig de elektrode eerst met demi water en daarna met 70% ethanol en laat deze aan de lucht drogen.
- Bereken TEER (Ω·cm2): [R-monster (Ω) - Rblanco (Ω)] × membraanoppervlak (cm2) (tabel 1 en figuur 6B).
- Meting van TEER met behulp van een geautomatiseerde TEER-meetrobot (Tabel van materialen)
- Voer geautomatiseerde TEER-metingen uit bij gebruik van HTS-systemen voor 96-well en 24-well HTS-platen met membraaninzetstukken. Gebruik verschillende elektroden voor TEER-metingen voor beide typen (24- en 96- HTS-membraaninzetstukken). Volg de instructies van de fabrikant om TEER te meten met een geautomatiseerde TEER-meetrobot.
- Meting van TEER met behulp van een handmatige TEER-meter
- Meting van de integriteit en permeabiliteit van epitheliale barrières
OPMERKING: Dit protocol introduceert Lucifer Yellow permeabiliteit van het apicale naar basolaterale compartiment als een indicatie van monolaagintegriteit. Deze sectie beschrijft fluorescentiemeting in het basolaterale compartiment na een incubatiestap van 1 uur om de permeabiliteit van de monolaag en dus de integriteit van de barrière te evalueren. Deze meting is een eindpunttest en is vooral nuttig bij het testen van verbindingen op hun effect op de integriteit van de barrière.- Ontdooi Lucifer Yellow op ijs en laat BM in evenwicht brengen met RT. Bereid voor een 24-well plaat met membraaninzetstukken 5 ml werkoplossing van 60 μM Lucifer Yellow in BM.
OPMERKING: Lucifer Yellow is lichtgevoelig. Bereid verdunningen voor in donkere steriele buizen van 1,5 ml en voer alle stappen uit met het bioveiligheidskastlicht uitgeschakeld. - Verwijder het medium voorzichtig uit de basolaterale en apicale compartimenten van de membraaninzetstukken, zoals beschreven in stap 3.5.1. Kras indien gewenst een onbehandelde monolaag met behulp van een pipetpunt als positieve controle voor Lucifer Yellow-lekkage door een beschadigde barrière.
- Voeg 150 μL BM met 60 μM Lucifer Yellow toe aan elk apicale compartiment en voeg 800 μL BM zonder Lucifer Yellow toe aan elk basolateraal compartiment. Plaats de plaat op een shaker bij 37 °C, 50 rpm gedurende 60 min.
- Bereid ondertussen een standaardcurve van Lucifer Yellow in BM voor, te beginnen met de werkoplossing die in stap 4.2.1 is bereid. Verdun 1:3 in elke stap tot een concentratie van 3 nM is bereikt. Neem een negatieve controle op (alleen BM).
- Breng 100 μL van elke standaard in drievoud over op een transparante plaat met 96 putten. Verwijder na 60 minuten incubatie de membraaninzetstukken en breng 100 μL van elke basolaterale put (stap 4.2.3) in drievoud over naar de transparante plaat met 96 putten. Meet de fluorescentie van de plaat met behulp van een plaatlezer bij een excitatiegolflengte van 430 nm en een emissiegolflengte van 530 nm.
- Na correctie voor de negatieve controlewaarde (alleen BM), gebruikt u de standaardcurvewaarden om de Lucifer Yellow-concentratie in het basolaterale compartiment (eindontvangerconcentratie (μM)) te berekenen.
- Bereken de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (Papp) volgens de volgende formule (figuur 6C):
- Gebruik voor een 24-putplaat met membraaninzetstukken de volgende formule:
- Ontdooi Lucifer Yellow op ijs en laat BM in evenwicht brengen met RT. Bereid voor een 24-well plaat met membraaninzetstukken 5 ml werkoplossing van 60 μM Lucifer Yellow in BM.
- Monolagen fixeren en paraffineblokken voorbereiden voor histologie
OPMERKING: Epitheliale monolagen kunnen worden gebruikt voor histologische kleuring voor evaluatie van hun cellulaire samenstelling, polariteit en expressie van verschillende eiwitten van belang, zoals junctionele eiwitten, proliferatie of differentiatiemarkers. Deze sectie beschrijft paraffineblokvoorbereiding voor histologische kleuring.- Verwijder het medium voorzichtig uit de basolaterale en apicale compartimenten van de membraaninzetstukken, zoals beschreven in stap 3.5.1.
- Was de monolagen door 150 μL DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) toe te voegen aan elk apicale compartiment en 800 μL aan elk basolateraal compartiment. Aspiraleer de DPBS voorzichtig opnieuw, eerst vanuit het basolaterale compartiment en vervolgens vanuit het apicale compartiment.
OPMERKING: Het basolaterale compartiment blijft leeg vanaf deze stap. - Voeg in een zuurkast 150 μL 4% paraformaldehyde toe aan elk apicale compartiment en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
OPMERKING: Voer vanaf deze stap alle acties in deze sectie uit in een zuurkast, omdat paraformaldehyde giftig is. - Zuig het fixeermiddel voorzichtig op uit de apicale compartimenten van de membraaninzetstukken en gooi het weg als vloeibaar halogeenafval.
OPMERKING: Gooi vanaf deze stap al het vloeibare afval weg als vloeibaar halogeenafval. - Was de monolagen door 200 μL DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) toe te voegen aan elk apicale compartiment en zuig de DPBS voorzichtig opnieuw op. Herhaal deze stap nog een keer.
- Voeg 200 μL 25% ethylalcohol (EtOH) toe aan elk apicale compartiment en incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Aspirateer na 15 minuten voorzichtig de 25% EtOH uit de apicale compartimenten van de membraaninzetstukken. Herhaal dit met 50% EtOH-oplossing en vervolgens met 70% EtOH-oplossing.
- Voeg 200 μL van 70% EtOH toe aan elk apicale compartiment en wikkel de plaat met parafilm. Bewaren bij 4 °C tot verder gebruik.
- Zuig de 70% EtOH voorzichtig op en gebruik een scalpel om de monolaagmembranen voorzichtig uit de inzetstukken te snijden. Snijd vanaf de basolaterale kant, rond de rand van het inzetstuk.
- Bereid paraffineblokken voor volgens de standaardprocedure.
- Wanneer de paraffine nog warm is, neemt u de monolaag van de paraffine met een pincet en plaatst u deze op een voorgekoeld oppervlak.
- Pas op dat u de monolaag niet beschadigt. Snijd de monolaag doormidden met een mes met één rand.
- Wanneer de paraffine in de bodem van de cassette begint te stollen, gebruik dan een verwarmd pincet om de twee monolaagdelen in de paraffine te plaatsen, naast elkaar met de rechte kant naar beneden en in verticale richting om ervoor te zorgen dat de monolaag verticaal in de coupe zal zijn.
- Wanneer paraffineblokken klaar zijn, snijdt u de blokken met behulp van een microtoom en maakt u dia's van 4 μm dikke secties volgens de standaardprocedure. Zorg ervoor dat de monolagen verticaal in de coupé terechtkomen.
- Voer histologische vlekken uit zoals eerder beschreven 7,9. Gebruik hematoxyline en eosine (H & E), Ki67, mucine-2 (MUC2) en Alcian Blue om respectievelijk algemene morfologie, proliferatieve cellen, slijmproductie en bekercellen aan te tonen (figuur 6E).
OPMERKING: Aanvullende differentiatiemarkers, zoals lysozym voor Paneth-cellen, kunnen ook worden gebruikt. Deze marker wordt niet weergegeven in figuur 6E omdat Paneth-cellen aanwezig zijn in dunne darmepitheel in plaats van colonepitheel.
- Uitgescheiden eiwitmeting in medium supernatant
- Meet de lysozymniveaus in het apicale supernatant van ileale monolagen (zie figuur 6D) met behulp van de kit in de materiaaltabel. Meet desgewenst niveaus van verschillende cytokines en andere interessante eiwitten.
- Genexpressie analyse
- Kwantificeer de effecten van de differentiatiemedia op de expressie van epitheelcelmarkergenen met behulp van kwantitatieve omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (qRT-PCR).
- Lyse de monolagen in 350 μL RNA-lysisbuffer gevolgd door RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant. Voer cDNA-synthese en qPCRs uit, zoals eerder beschreven 7,9, met behulp van de cDNA-synthesekits, mastermix en oligonucleotiden die worden vermeld in de Tabel met materialen.
- Kwantificeer de effecten van de differentiatiemedia op de expressie van epitheelcelmarkergenen met behulp van kwantitatieve omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (qRT-PCR).
5. Opschaling naar 96-well platen met membraaninzetstukken
OPMERKING: Bereid epitheliale monolagen voor hogere doorvoeronderzoeken van geneesmiddelen of meerdere mediumomstandigheden met behulp van HTS 96-well-platen met membraaninzetstukken.
- Aanpassingen bij het voorbereiden van monolagen in 96-well formaat
- Volg alle stappen die in dit protocol worden beschreven voor 24-putplaten die membraaninzetstukken bevatten, waarbij volumes en celnummers worden gewijzigd ten opzichte van de in tabel 1 beschreven. Voor het bereiden van monolagen op 96-putplaten met membraaninzetstukken, gaat u verder zoals beschreven in sectie 3 met de volgende verschillen.
- Ongeveer 9 putten van een 6-put cultuurplaat met organoïde dichtheid weergegeven in figuur 3A zijn nodig om een volledige 96-putplaat met membraaninzetstukken te zaaien. In stap 3.2.1, voorcoat de membranen met 67 μL van 40x verdunde ECM in DPBS (met Ca2+ en Mg2+).
- Breng in punt 3.5 eerst de integrale plaat van membraaninzetstukken over op een andere 96-putplaat om een gemiddelde verfrissing van zowel apicale als basolaterale compartimenten mogelijk te maken.
- Volg alle stappen die in dit protocol worden beschreven voor 24-putplaten die membraaninzetstukken bevatten, waarbij volumes en celnummers worden gewijzigd ten opzichte van de in tabel 1 beschreven. Voor het bereiden van monolagen op 96-putplaten met membraaninzetstukken, gaat u verder zoals beschreven in sectie 3 met de volgende verschillen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een representatief brightfieldbeeld van intestinale organoïden na het ontdooien ervan uit een cryovial. Het is belangrijk om organoïden met een hoge dichtheid te ontdooien om een optimaal herstel te garanderen. Organoïden worden verguld in 24- of 6-putplaten in ECM-koepels van ongeveer 10 μL (figuur 1B). De meeste normale intestinale organoïden hebben een cystische morfologie. Na herstel van het ontdooiproces groeien de organoïden tot een grotere omvang en zijn ze na 3-7 dagen klaar om te worden gepasseerd, afhankelijk van de organoïdecultuur (figuur 1C). Na het oogsten van de organoïden en het wegspoelen van de ECU (figuur 1D), kunnen organoïden tot een klein formaat worden verstoord door mechanisch scheren. Afhankelijk van de morfologie van de organoïden (cystische figuur 1C, ontluikende figuur 1E) kunnen organoïden worden verstoord met behulp van plastic of glazen pipetten (figuur 1F). Organoïden worden verstoord in een suspensie (figuur 2A), die regelmatig onder de microscoop moet worden gecontroleerd. Het is belangrijk om ze niet te klein te maken, omdat groepen cellen bij elkaar moeten blijven om organoïde groei te garanderen. Figuur 2B toont de organoïden in ECM-druppels net na het passeren. Over het algemeen worden cystische organoïden met een relatief hoge dichtheid verguld, terwijl ontluikende organoïden in een lage dichtheid worden verguld; dit kan echter verschillen tussen verschillende organoïde culturen.
Bij het passeren van organoïden voor de bereiding van monolagen, zorg er dan voor dat je ze met een hoge dichtheid platen en laat ze drie dagen groeien, zodat ze zich in optimale expansieomstandigheden bevinden. Organoïden kunnen worden geoogst voor monolaagvoorbereiding wanneer ze qua grootte en dichtheid vergelijkbaar zijn met figuur 3A , waar 6 putten van een 6-putplaat, elk met 200 μL organoïde koepels, meestal voldoende zijn voor het zaaien van een volledige 24-putplaat van membraaninzetstukken. Na de bereiding van een eencellige suspensie met het celdissociatiereagens moeten enkele cellen en kleine klonten cellen zichtbaar zijn (figuur 3B) en kunnen levende cellen worden geteld (figuur 3C). De pijlen geven dode cellen aan die gekleurd zijn met trypanblauw, die moeten worden uitgesloten van tellen. De afzonderlijke cellen en kleine klonten worden vervolgens gezaaid in de membraaninzetstukken zoals te zien is in figuur 4A. Monolaagvorming is zichtbaar na 1-3 dagen (figuur 4B, C), en de monolagen zullen over het algemeen na 3-6 dagen confluent zijn, afhankelijk van de organoïde cultuur (figuur 4D). Monolagen blijven in expansiemedium totdat ze confluent zijn, waarna ze met behulp van verschillende verrijkingsmedia kunnen worden verrijkt met onder andere enterocyten of bokaalcellen. Figuur 5A toont een monolaag die gedurende 8 dagen werd gekweekt in expansiemedium (IEM). Bij verrijkt met enterocyten (eDM) wordt een structuur gezien, zoals in figuur 5B, terwijl monolagen blootgesteld aan combinatiemedium (cDM) een gladdere structuur vertonen (figuur 5C).
Monolaagvorming kan kwantitatief worden gevolgd door het meten van TEER (figuur 6A). Een volledig confluente monolaag heeft een TEER-waarde van ~100 Ω·cm2, die toeneemt tot ~1000 Ω·cm2 bij blootstelling aan een van beide differentiatiemedia (figuur 6B). Monolagen vertonen in alle medium omstandigheden een lage schijnbare permeabiliteit (Papp) tot Lucifer Yellow (0,45 kDa). De secretie van lysozymen door ileale monolagen gekweekt in IEM was hoger dan die van monolagen gekweekt in IEM tot confluent en gedurende nog eens 4 dagen in eDM of cDM (aangeduid als + daaropvolgende eDM of cDM) (Figuur 6D). Monolagen gekweekt in IEM, IEM + daaropvolgende eDM of IEM + daaropvolgende cDM vertonen een andere morfologie, zoals kan worden waargenomen bij H&E-kleuring (figuur 6E). Terwijl van colonorganoïden afgeleide epitheliale monolagen in IEM- en cDM-media een glad apicale oppervlak hebben, vertonen enterocyt-gedifferentieerde monolagen een invaginated apicale morfologie in afwezigheid van Wnt. Ki67-positieve proliferatieve cellen kunnen alleen in expansieomstandigheden worden gedetecteerd. Alcian Blue en MUC2 kleurenslijm geproduceerd door gobletcellen, dat wordt gevisualiseerd in de monolagen gedifferentieerd in eDM en prominenter in cDM wanneer Wnt, Notch en EGF-signalering respectievelijk worden geremd (figuur 6E). Na differentiatie nemen proliferatieve cellen af, terwijl de genexpressie van gobletcellen en enterocytmarkers toeneemt in vergelijking met die waargenomen onder IEM-omstandigheden, zoals aangetoond door lgr5,MUC2 en ALPI genexpressie kwantificering door qRT-PCR, respectievelijk (figuur 6F).
Figuur 1: Het vaststellen van een intestinale organoïde cultuur uit bevroren organoïden. (A) Representatief helderveldbeeld van een intestinale organoïde cultuur na ontdooien. (B) ECM-koepels (50 μL) gezaaid in elke put van een kweekplaat met 24 putten. (C) Representatief beeld van een normale intestinale organoïde cultuur die klaar is voor passaging. (D) Representatief beeld over hoe de aanwezigheid van ECM in een buis van 15 ml met organoïden onder een lichtmicroscoop kan worden gecontroleerd. (E) Representatief beeld van een ontluikende intestinale organoïde cultuur die klaar is om te passeren. (F) Een kunststof pipetpunt van 10 μL gemonteerd op een filterpunt van 1250 μL met lage retentie (links) en een vernauwde glazen pipet (rechts) voor het mechanisch afschuiven van organoïden. Schaalbalken = 100 μm. Afkorting: ECM = extracellulaire matrix. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verwerking van intestinale organoïden voor onderhoud of bereiding van monolagen. (A) Representatief beeld van intestinale organoïden na mechanische verstoring. (B) Representatief beeld van een intestinale organoïdecultuur die na passaging is gezaaid. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het bereiden van afzonderlijke cellen uit intestinale organoïden voor monolaagpreparaat. (A) Intestinale organoïden klaar om te oogsten voor monolaagpreparaat. (B) Enkelvoudige cellen en kleine klonten cellen na eencellige bereiding. (C) Zichtbare afzonderlijke cellen en kleine klonten tijdens het tellen in een rasterkamer. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Monolaagvorming na het zaaien van enkele cellen op membranen. (A) Enkele cellen net na het zaaien op membranen. Gemiddeld is (B) de monolaag ongeveer 50% confluent 1-3 dagen na het zaaien, (C) ~ 90% confluent op dag 3-5 en (D) de volledige monolaag heeft zich gevormd rond dag 4-7. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verrijking van specifieke celtypen in de monolaag. (A) Monolaag na 8 dagen in IEM. (B) Monolaag verrijkt met enterocyten na 4 dagen in IEM en nog eens 4 dagen in eDM. (C) Monolaag verrijkt met bokaalcellen en andere celtypen na 4 dagen in IEM en nog eens 4 dagen in cDM. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: IEM = intestinal organoid expansion medium; eDM = enterocytendifferentiatiemedium; cDM = combinatie differentiatie medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Een verscheidenheid aan mogelijke uitlezingen met behulp van epitheliale organoïde monolagen. (A) Elektrode in de membraaninzet om TEER te meten. (B) TEER-waarden nemen in de tijd toe met een waarde van ~100 Ω·cm2 wanneer de monolaag samenvloeiing bereikt. Na het verrijken van monolagen met enterocyten of een combinatie van verschillende epitheelcellen neemt TEER toe tot 1000 Ω·cm2 of hoger. (C) Monolagen in alle medium omstandigheden (IEM + 4 dagen IEM/eDM/cDM) zijn ondoordringbaar voor Lucifer Yellow. (D) De expressie van lysozym is hoger in ileum monolagen bij groei in expansiemedium dan in beide soorten differentiatiemedium (IEM + 4 dagen IEM/eDM/cDM). (E) Colon monolagen vertonen verschillende morfologieën bij blootstelling aan verschillende medium omstandigheden (IEM + 4 dagen IEM/eDM/cDM) zoals gevisualiseerd door H&E, Ki67, Alcian Blue en MUC2 vlekken. Zoals verwacht zijn monolagen gekweekt in expansiemedium zeer proliferatief, zoals blijkt uit Ki67-kleuring. Monolagen gedifferentieerd met eDM vertonen een kolomvormig epitheel zonder proliferatieve cellen. Monolagen blootgesteld aan cDM zijn ook niet proliferatief en ontwikkelen meer bokaalcellen. Schaalbalk = 100 μm. (F) Stamcel (LGR5), bekercel (MUC2) en enterocyten (ALPI) marker genexpressie in colon monolagen door qRT-PCR. Afkortingen: TEER = transepitheliale elektrische weerstand; IEM = intestinale organoïde expansie medium; eDM = enterocytendifferentiatiemedium; cDM = combinatiedifferentiatiemedium; Papp = schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt; LGR5 = leucine-rijke repeat-bevattende G-eiwit-gekoppelde receptor 5; H&E = hematoxyline en eosine; AB = Alcian Blauw; MUC2 = mucine-2; ALPI = intestinale alkalische fosfatase; qRT-PCR = kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Membraan inzetstukken | ||
| 24-well platen | 96-well platen | |
| Membraanoppervlak (cm2) | 0.33 | 0.143 |
| Apicale volume (μL) | 150 | 100 |
| Basolateraal volume (μL) | 800 | 300 |
| # Cellen om per put te zaaien | 450,000 | 200,000 |
| HTS-platen met membraaninzetstukken | HUISDIER | HUISDIER |
| Platen met aparte inzetstukken | HUISDIER | NA |
| Lichtdichte platen met membraaninzetstukken | ||
| Elektroden zijn verschillend voor de twee formaten | Raadpleeg de tabel met materialen | |
Tabel 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de algemene manipulatie en het onderhoud van intestinale organoïden, evenals de voorbereiding en mogelijke toepassingen van epitheliale monolagen afgeleid van deze organoïden. Tot op heden zijn monolagen met succes bereid uit de twaalfvingerige darm, het ileum en verschillende regio's van colonorganoïden afgeleid van normaal en eerder en actief ontstoken darmweefsel (ongepubliceerde gegevens). De toepassing van patiënt-afgeleide organoïde monolagen vergemakkelijkt de studie van de barrièrefunctie op een ziekte- en patiëntspecifieke manier, evenals de studie van patiëntspecifieke reacties op een verscheidenheid aan medicamenteuze behandelingen. Hoewel cellijnen gedifferentieerde en gepolariseerde monolagen kunnen vormen die intestinale enterocyten en bokaalachtige cellen bevatten, worden veel verschillende enzymen en transporters aberrant tot expressie gebracht in deze cellijnen, wat resulteert in verminderde complexiteit en fysiologische relevantie 3,30. Organoïde cultuur is technisch veeleisender en bewerkelijker dan celkweek; organoïden zijn echter meer representatief voor de in vivo situatie, terwijl cellijnen herhaaldelijk hebben gefaald om weefselresponsen in complexe opstellingen weer te geven.
Hoewel modellen op basis van primair weefsel representatief kunnen zijn voor de in vivo situatie, vereisen ze het gebruik van proefdieren of toegang tot menselijk materiaal, wat gepaard gaat met beperkte beschikbaarheid en ethische beperkingen. Bovendien heeft primair weefsel geen of beperkte uitbreidbaarheid en is het niet stabiel in langere experimentele tijdsbestekken. Organoïde technologie vereist een beperkte hoeveelheid primair weefsel om genetisch en fysiologisch stabiele expansieve culturen op lange termijn vast te stellen, terwijl het nog steeds epitheelweefselcomplexiteit en heterogeniteit van de patiënt vertegenwoordigt. Verschillende cellijnen, zoals Caco-2, worden vaak gebruikt om epitheliale monolagen te bereiden. Caco-2-cellen hebben 21 dagen nodig om een gepolariseerde epitheliale monolaag vast te stellen die voor elk experiment kan worden gebruikt30. Organoïde-afgeleide epitheliale monolagen worden bereid uit organoïde enkele cellen zoals beschreven in het huidige protocol, en vormen na 3-6 dagen een gepolariseerd epitheel dat verder kan worden gedifferentieerd om ze te verrijken met enterocyten of bekercellen.
Monolagen zijn een statisch model zonder een microfluïdische stroming of mechanische rek zoals te zien is in organen-op-een-chip. Wel bieden ze de mogelijkheid om samen te kweken met (autologe) immuuncellen, maar ook met bacteriën of parasieten 17,18,19,31. Organoïden zijn geschikt voor monolaagvoorbereiding wanneer ze zich in hun expansiefase bevinden; voor intestinale organoïden is dit meestal 3 dagen na het passeren. Dissociatie van organoïden naar afzonderlijke cellen moet snel worden uitgevoerd om langdurige blootstelling aan spijsverteringsenzymen te voorkomen. Om de overleving van stamcellen na de bereiding van een eencellige suspensie te verhogen, wordt de Rho-geassocieerde eiwitkinaseremmer (ROCK-remmer), Y27632, aan de cellen toegevoegd om anoikis-geïnduceerde celdood te voorkomen32. Bovendien is het van cruciaal belang om de monolagen te kweken op een membraan dat is voorgecoat met ECM om ervoor te zorgen dat ze hun organoïde kenmerken en polarisatie behouden. Voor functionele screeningstests die de epitheelcelresponsen van het maagdarmkanaal op externe stimuli kwantificeren, is het belangrijk dat organoïde culturen de vereiste cellulaire complexiteit vertegenwoordigen, afhankelijk van het type test dat moet worden ontwikkeld en eventuele uitlezingen.
Intestinale organoïden vertegenwoordigen verschillende epitheelceltypen die in vivo aanwezig zijn, zoals stam, TA, enterocyt, Paneth, goblet en entero-endocriene cellen 4,5, en worden bereid en onderhouden met behulp van een gedefinieerd organoïde medium bereid zoals beschreven in dit protocol. Enterocytendifferentiatie kan worden bevorderd door organoïden gedurende nog eens vier dagen te kweken met behulp van kweekomstandigheden die de Wnt-route dubbel remmen, door verwijdering van Wnt-moleculen / activatoren en de toevoeging van de porcupineremmer, IWP-2 (enterocyte colondifferentiatiemedium, eDM). Omdat slijmproducerende bokaalcellen ook essentieel zijn voor de homeostase van de barrièrefunctie, is een tweede kweekconditie gericht op het produceren van een meer heterogene celpopulatie met stam-, enterocyten- en bekercellen, waarin notch- en EGF-routes worden geremd terwijl Wnt-signalering gedeeltelijk actief wordt gehouden door Wnt3aCM te verminderen tot 10% (of 0,1 nM voor NGS-Wnt) in plaats van 50% (0,5 nM NGS-Wnt) gebruikt in IEM. In tegenstelling tot eDM, dat verrijkt voor enterocytendifferentiatie, ondersteunt deze tweede voorwaarde de aanwezigheid van verschillende celtypen en wordt daarom combinatiedifferentiatiemedium (cDM) genoemd.
Toepassingen van organoïde-afgeleide monolagen omvatten de monitoring van de integriteit van epitheliale barrières en het onderzoeken van tight junction en transporterexpressie. Barrière-integriteit, permeabiliteit en transport kunnen worden geanalyseerd met behulp van de uitlezingen die in dit protocol zijn geïntroduceerd. Terwijl TEER de ionische geleiding door tight junctions meet, meet de permeabiliteitstest de waterstroom en dus de paracellulaire permeabiliteit door de tight junctions28,29. Epitheliale barrière-integriteit, permeabiliteit en transportfunctionaliteit van de monolagen kunnen worden geëvalueerd door het meten van het verkeer van verschillende fluorescerende of radioactieve substraten over apicale en basolaterale compartimenten van de membraaninzetstukken. TEER-metingen maken de kwantificering van de barrière-integriteit mogelijk, waarbij een toename van waarden wordt aangetoond bij het differentiëren naar gepolariseerde enterocyten en gobletcellen, en een afname na het induceren van letsel aan de monolagen.
De Lucifer Yellow permeabiliteitstest kan worden gebruikt voor de initiële beoordeling van de barrière-integriteit en de bevestiging van verminderde integriteit na het veroorzaken van letsel aan de monolagen. Dit protocol introduceert Lucifer Yellow permeabiliteit van het apicale naar basolaterale compartiment als een indicatie van monolaagintegriteit. Evenzo kunnen andere fluorescerend gelabelde reagentia, zoals 4 of 40 kDa dextran, worden gebruikt om verhoogde paracellulaire permeabiliteit te evalueren als gevolg van barrièreschade-inducerende middelen. Fluorescerend gelabelde substraten, zoals Rhodamine 123, kunnen worden gebruikt voor het meten van de activiteit van verschillende transporters, zoals P-glycoproteïne-1. De fluorescentietest die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om de niveaus van eiwitten, zoals lysozym, te meten die in het apicale compartiment worden uitgescheiden. Reacties op letselinductie door pro-inflammatoire cytokines kunnen worden gemeten met deze uitlezingen, evenals de potentiële effecten van barrièreherstellende verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) publiek-private samenwerking (PPP) van de Nederlandse LSH-sector met projectnummer LSHM16021 Organoïden als nieuw instrument voor toxicologische modellering aan Hubrecht Organoid Technology (HUB) en HUB interne financiering aan de afdeling Disease Modeling and Toxicology. Wij danken de laboratoria van Sabine Middendorp (afdeling Kindergastro-enterologie, Wilhelmina Kinderziekenhuis, UMC, Utrecht) en Hugo R. de Jonge en Marcel J.C. Bijvelds (afdeling Maag-, Darm- en Leverziekten, Erasmus MC, Rotterdam) voor de eerste technische ondersteuning bij het opzetten van monolagen op membraaninzetstukken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
- Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C.
- Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
- Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
- Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
- Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
