Summary
ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。
Abstract
過去には、腸上皮モデル系は形質転換細胞株および初代組織に限定されていた。これらのモデル系は、前者が元の組織生理学を忠実に表していないため、固有の限界があり、後者の利用可能性は限られている。したがって、それらの適用は基礎的および医薬品開発研究を妨げる。成体幹細胞ベースのオルガノイド(以下、オルガノイドと呼ぶ)は、それらが由来する正常または罹患した上皮組織のミニチュアである。それらは、異なる胃腸(GI)管領域から非常に効率的に確立することができ、長期的な拡張性を有し、インビトロでの治療に対する組織および患者特異的応答をシミュレートすることができる。ここでは、腸管オルガノイド由来上皮単層の確立が、上皮バリアの完全性、透過性および輸送、抗菌タンパク質分泌、ならびに組織学を測定する方法とともに実証されている。さらに、腸管オルガノイド由来単層は、増殖する幹およびトランジット増幅細胞、ならびに重要な分化上皮細胞で富化することができる。したがって、それらは、標的細胞およびそれらの作用機序に対する化合物の効果を研究するために調整することができるモデル系を表す。オルガノイド培養は、いったん確立されると、細胞株よりも技術的に要求が厳しいですが、生体内上皮の複雑さと患者間の不均一性を真に表すため、医薬品開発の後期段階での失敗を減らすことができます。
Introduction
腸上皮は、腸の管腔内容物と下層組織との間の物理的障壁として作用する。この障壁は、タイトジャンクションによって接続された主に吸収性腸細胞の単一の上皮層を含み、隣接する細胞間の強力な細胞間接続を確立する。これらの細胞は、腸の頂端(管腔)側と側底側を分離する分極上皮ライニングを形成し、同時に消化された栄養素および代謝産物の傍細胞輸送を調節する。腸細胞に加えて、ゴブレット、パネス、および腸内分泌細胞などの他の重要な上皮細胞も、それぞれ粘液、抗菌ペプチド、およびホルモンを産生することによって腸の恒常性に寄与する。腸上皮は、ロイシンに富む反復含有Gタンパク質共役型受容体5陽性(LGR5+)幹細胞を腸陰窩の底部で分裂させることによって絶えず補充され、上方に移動して他の細胞型に分化するトランジット増幅(TA)細胞を産生する1。食物アレルゲン、薬効化合物、微生物病原体への曝露などの遺伝的および環境的要因による腸上皮恒常性の破壊は、腸のバリア機能の破壊につながる。これらの状態は、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病、および薬物誘発性GI毒性を含むいくつかの腸疾患を引き起こす2。
腸上皮に関する研究は、膜挿入物、臓器オンチップシステム、ウッシングチャンバー、腸リングなどのいくつかのin vitroプラットフォームシステムを使用して行われます。これらのプラットフォームは、形質転換細胞株または一次組織をモデルとして使用して、膜の頂端側および側底側の両方にアクセスする分極上皮単層を確立するのに適している。結腸直腸(アデノ)癌細胞株Caco-2、T84、HT-29などの形質転換細胞株は、分極腸腸細胞または粘液産生細胞にある程度分化することができるが、いくつかの細胞型が欠落しており、様々な受容体およびトランスポーターが異常に発現しているため、in vivo上皮を代表するものではない3.さらに、細胞株は単一のドナーに由来するため、患者間の不均一性を表すものではなく、複雑さと生理学的関連性の低下に苦しんでいます。Ussingチャンバーおよび腸管輪として使用される一次組織は、in vivo状況をより代表的ですが、それらの限られた可用性、短期的な生存率、および拡張性の欠如により、ハイスループット(HT)研究の媒体としては不適切です。
オルガノイドは、腸、腎臓、肝臓、膵臓、肺などの異なる器官から確立されたインビトロ上皮培養物である。それらは、長期的で安定した拡張性ならびに遺伝的および表現型の安定性を有することが証明されており、したがって、外部刺激に対する忠実な応答を有する元の器官の上皮の代表的な生物学的ミニチュアである4,5,6,7,8,9。オルガノイドは、切除または生検された正常、罹患、炎症、または癌組織のいずれかから効率的に確立され、不均一な患者特異的応答を表す10、11、12、13、14、15、16。本稿では、オルガノイド培養物由来の腸上皮単層を確立する方法を実証する。単層は、小腸ならびに結腸および直腸オルガノイド培養物から首尾よく確立されている。このモデルは、上皮細胞の薬物への輸送と透過性、ならびに上皮に対するそれらの毒物学的効果を研究する機会を作り出す。さらに、このモデルにより、免疫細胞および細菌との共培養が腸上皮との相互作用を研究することができる17、18、19。さらに、このモデルは、患者固有の方法で治療に対する応答を研究し、上皮バリアに焦点を当てた治療の次の波を探すためのスクリーニング努力を開始するために使用することができる。このようなアプローチは、クリニックに拡張され、パーソナライズされた治療への道を開くことができます。
このプロトコールにおける上皮単層はヒト正常腸管オルガノイドから調製されるが、このプロトコルは他のオルガノイドモデルに適用され、最適化され得る。上皮オルガノイド単層は、幹細胞増殖を支持するためにWntを含有する腸管オルガノイド増殖培地中で培養され、腸管陰窩細胞組成物を表す。腸オルガノイドは、Wnt、Notch、および上皮成長因子(EGF)経路を調節することによって、腸細胞、パネス、ゴブレット、および腸内分泌細胞などの異なる腸上皮脂肪を有するように富化することができる。ここで、膨張培地中で単層が樹立された後、それらは、先に説明したように、より分化した腸上皮細胞に向かって駆動される20、21、22、23、24、25。スクリーニング目的のために、目的の化合物、その標的細胞、および実験条件の作用様式に応じて、単層を選択した細胞組成物に向かって駆動して、関連する機能的読み出しを有する化合物の効果を測定することができる。
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Protocol
1. 培養用試薬の調製
注: バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行し、細胞培養の操作に関する標準ガイドラインに従ってください。紫外線は、バイオセーフティキャビネットを起動する前に10分間使用されます。使用前および使用後、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールに濡らしたティッシュペーパーで洗浄する。細胞外マトリックス(ECM)の三次元滴の形成を容易にするために、96、24、および6ウェルプレートの予温ストックを37°Cのインキュベーター内に準備しておく。
- 基礎培地調製
- 5 mL の 200 mM グルタミン、5 mL の 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、および 5 mL のペニシリン/ストレプトマイシン (pen/strep) 溶液 (10,000 U/mL または 10,000 μg/mL) を加えて、500 mL のアドバンストダルベッコ改変イーグル培地にハムの栄養混合物 F-12 (Ad-DF) 培地ボトルに基礎培地 (BM) を調製します。これは、少なくとも4週間、4°Cの冷蔵庫に保存することができる。
- Wnt ソース
- 先に説明した方法26に従ってWnt3a馴化培地(Wnt3aCM)を調製する。
注:最近、ヒト腸管オルガノイドの拡大もサポートする次世代の代理Wnt(NGS-Wnt)が生成された27。
- 先に説明した方法26に従ってWnt3a馴化培地(Wnt3aCM)を調製する。
- 腸管オルガノイドベース培地調製
注:すべての成長因子および試薬を製造業者の推奨に従って使用してください。小さなアリコートを使用し、凍結融解サイクルを避けます。機能性成長因子は、オルガノイド培養を成功させるために不可欠である。- BMに1 μM A83-01、2.5 mM N-アセチルシステイン、2x B27サプリメント、100 ng/mLヒト上皮成長因子(hEGF)、10 nMガストリン、200 ng/mL hNoggin、および100 μg/mLの初代細胞用抗菌製剤を補充して、濃縮された2x 腸オルガノイドベース培地(2x IBM)を調製する( 材料表を参照)。
- 2x IBMをアリコートし、-20°Cで最大4ヶ月間凍結する。必要に応じて、アリコートを4°Cで一晩、または室温(RT)で数時間解凍します。
- 腸管オルガノイド拡張培地(IEM)を調製するには、2x IBMに50%Wnt3aCMまたは50%BMおよび0.5nM NGS-Wnt、250ng/mLヒトRspondin-3(hRspo3)、10mMニコチンアミド、および10μM SB202190を補充する。
- 腸管オルガノイド分化培地調製
- 2x IBMに50%BM、250ng/mL hRspo3、および1.5μM Wnt経路阻害剤(IWP-2)を補充して腸球分化培地(eDM)を調製する。eDMを4°Cで最大10日間保存する。
- 2x IBM に 40% BM および 10% Wnt3aCM または 50% BM および 0.1 nM NGS-Wnt、250 ng/mL hRspo3、10 μM DAPT および 100 nM PD0325901 のいずれかを補充することにより、組み合わせ分化培地 (cDM) を調製します。cDMを4°Cで最大10日間保存する。
- 細胞外マトリックス(ECM)の操作
注:細胞外マトリックス(ECM)( 材料表を参照)は、製造元の推奨に従って準備してください。- 氷上で一晩ECMを解凍する。ECMを5mLピペットを用いてボトルから15mL円錐管に移し、両方とも-20°Cで予備冷却した。 アリコートを-20°Cで1回だけ再凍結する。 解凍後、ECMを4°Cの冷蔵庫に最大7日間保管してください。使用前に氷上で少なくとも30分間インキュベートする。
メモ: ECM を適切に混合し、陰窩またはオルガノイドを埋め込む前に、ECM が冷たくなっていることを確認してください。
- 氷上で一晩ECMを解凍する。ECMを5mLピペットを用いてボトルから15mL円錐管に移し、両方とも-20°Cで予備冷却した。 アリコートを-20°Cで1回だけ再凍結する。 解凍後、ECMを4°Cの冷蔵庫に最大7日間保管してください。使用前に氷上で少なくとも30分間インキュベートする。
2. オルガノイド培養
- 凍結オルガノイドからの培養の確立
注:BMをRTに到達させ、12mLのアリコートを37°Cに加温し、凍結オルガノイドを含む1つのクライオビアルを解凍する手順を開始する前に準備を整える。- オルガノイドクライオビアルを37°Cの水浴中で攪拌して、氷のほんの一握りだけが残るまで急速に解凍する。直ちに500μLの温かいBMをクライオバイアルに滴下し、数回上下にピペットをかけて凍結培地を希釈し、内容物を慎重に混合する。
- P1000ピペットを用いて、オルガノイドを15mL円錐管に移し、チューブの底部を穏やかに混合しながら、別の1mLの温かいBMを滴下する。数回上下にピペットをかけて凍結培地を希釈し、内容物を慎重に混合する。
- オルガノイドを含む15mL円錐形チューブに最大12mLの温かいBMを滴下し、10mL滅菌ピペットで上下にピペットしてオルガノイドを穏やかに再懸濁する。
- オルガノイド懸濁液を85× g および8°Cで5分間遠心分離する。 ペレットを乱すことなく上清を慎重に廃棄し、オルガノイドを10μM Y27632または他のrho関連コイル形成プロテインテインテインセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)を添加したIEMの30%v/vに再懸濁する。チューブを氷の上に置きます。
- オルガノイドを含む15mL円錐管にECMの70%v/vを加える。15 mL円錐管を氷上に保ったオルガノイド懸濁液と、懸濁液5 μLの種子を混合して密度を確認します(図1A)。密度が適切であればめっきを続けます。密度が高すぎる場合は、それぞれ 30 ~ 70% v/v の同じ比率で IEM/ECM ソリューションを追加します。
- 予温した24ウェルプレートの各ウェルにおいて、10μLの5つの別々の滴をピペッティングすることによってオルガノイド懸濁液の種子50μLを調製した(図1B)。プレートを裏返し、バイオセーフティキャビネットに5分間放置します。プレートを逆さまにしたまま37°Cのインキュベーターに移し、さらに30分間放置する。
- 各ウェルに10 μM ROCK阻害剤を含む500 μLのIEMを加え、プレートをインキュベーターに移した。成長を監視するために定期的に1滴の画像を撮影し、古い培地を吸引し、500μLの新鮮なIEMを添加することによって、2〜3日ごとにIEMをリフレッシュする。
- オルガノイドは、解凍から適切に回復し、処理する適切なサイズに達したら通過させます(図1C)(セクション2.2で説明)。
- 腸オルガノイドの継代
注: 使用する前に、ECM を氷上で少なくとも 30 分間冷やし、IEM を RT に少なくとも 1 時間保管してください。- 1つの培養ウェルからの培地を使用して、1250 μLの低保持フィルターチップを使用してオルガノイドドームを分解し、ウェルの内容物を標識された15mL円錐管に移す。1 mLのBMでウェルを洗浄し、それを同じ15 mLの円錐管に移した。
- 他のすべてのウェルで手順2.2.1および2.2.2を繰り返します(最大半分のプレートまたは600 μLのECM滴を洗浄し、1つの15 mL円錐管に加えることができます)。
- BMを加えてチューブを12 mLまで充填し、10 mLピペットを使用して10倍に上下にピペットします。85 × g で8°Cで5分間遠心分離する。
- BMを除去する前に、顕微鏡下で、すべてのオルガノイドが15mL円錐管の底部でペレット化されているかどうかを確認します(図1D)。オルガノイドペレットにオーバーレイするECMがない場合、またはECM層がクリーンであるか、またはペレット化されたオルガノイドと比較して破片、単一細胞、または非常に少数のオルガノイドを含む場合は、上清を吸引し、P200ピペットを使用してオルガノイドペレットをオーバーレイするECMを非常に慎重にピペットでピペットします。
注:オルガノイドはECMに閉じ込められ、遠心分離力が低いためコンパクトなペレットとして沈殿しません。ECMにオルガノイドが含まれている場合は、チューブを450 × g で8°Cで5分間再度遠心分離し、2.2.4に記載されているように上清を慎重に除去します。複数の 15 mL 円錐管がある場合は、ステップ 2.2.4 の後にプールできます。 - 各ペレットに1mLのBMを加え(オルガノイド培養および密度に応じて50〜200μLの容量)、慎重に再懸濁する。オルガノイドを少なくとも5倍に上下にピペッティングして剪断し、泡の形成を避けます。顕微鏡でオルガノイドが破壊されていないか確認してください(図2A)。オルガノイドが破壊されている場合は、ステップ 2.2.7 に進みます。オルガノイドが破壊されない場合は、さらに5倍にピペッティングします。今度は、プラスチックチューブの壁をピペットチップで触れて、オルガノイドを破壊するためにより機械的な力を発揮します。
注:オルガノイドの破壊に必要な容量に応じて、嚢胞性(図1C)および出芽(図1E)オルガノイドの機械的剪断は、低保持率の1250μLフィルターチップ(図1F)に取り付けられた200μLまたは10μLプラスチックピペットチップのいずれかで可能です。オルガノイドを含むECMを200 μL以上処理する場合(6ウェルプレートの1ウェルまたは24ウェルプレートの4ウェル)には、狭くしたガラスピペット(図1F)の使用が推奨されます。 - オルガノイドが破壊されているかどうかを確認するために、もう一度顕微鏡下で確認してください。中断された場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は、オルガノイドを20倍までピペッティングし、顕微鏡下でオルガノイドを定期的にチェックします。オルガノイドがまだ破壊されていない場合は、懸濁液に25%v/v細胞解離試薬1( 材料表参照)を加え、37°Cのウォーターバス内で2分間インキュベートし、オルガノイドを最大20倍ピペッティングし、顕微鏡下でオルガノイドを定期的にチェックして、単一細胞に消化されていないことを確認します。
- 15mLの円錐管に最大12mLのBMを加え、オルガノイドペレットを上下にピペッティングして洗浄する。85 × g で8°Cで5分間遠心分離する。 上清を捨て、オルガノイドペレットにIEMとECMを加えて終濃度を70%v/v ECMに調整する。
- 継代のために回収したIEM/ECMの2倍の容量でオルガノイドペレットの再懸濁を開始し、懸濁液5 μLをシードして密度を確認します。密度が適切であればめっきを続けます(図2B)。密度が高すぎる場合は、IEM/ECM ソリューションを追加します。予め加温した6ウェルプレートの各ウェルに200 μLの懸濁液を加え、10 μL容量の別々の滴を作る。
- プレートを裏返し、バイオセーフティキャビネットに5分間放置します。プレートを逆さまにしたまま37°Cのインキュベーターに移し、さらに30分間放置する。各ウェルに10μM ROCK阻害剤を含む2mLのIEMを加え、プレートをインキュベーターに移した。
- 成長を監視するために定期的に1滴の画像を撮影し、古い培地を吸引し、2mLの新鮮なIEMを加えることによって、2〜3日ごとにIEMをリフレッシュする。
- 上皮単層調製のための腸管オルガノイドの継代
- 継代オルガノイドは、1つの例外を除いてセクション2.2に記載したのと同じ継代プロトコールに従うことによって単層調製のために収穫する3日前に。ステップ2.2.7では、単層調製のために回収されたときに、オルガノイドをIEM/ECMの開始体積の1〜1.5倍に再懸濁して、より高い密度および膨張電位を有するようにする(図3A)。
3. 上皮単層調製
- 24ウェルおよび96ウェルの両方の膜インサート上の上皮単層を、様々な利用可能なプレートタイプで培養した(表1)。ハイスループットシステム(HTS)メンブレンインサートは、メンブレンインサートとレシーバープレートを備えた一体型トレイが含まれているため、両方のサイズに使用します。24ウェルフォーマットの場合、別々の取り外し可能なメンブレンインサートを備えたプレートの使用も可能です。
注:異なる膜タイプ(ポリエチレンテレフタレート(PET)またはポリカーボネート)および孔径(0.4〜8.0μm)が利用可能であり、実験ニーズに応じて使用することができる。単層は、PET膜を備えたインサートが使用される場合にのみ明視野によって画像化することができる。光密膜は、頂端から基底側区画への蛍光光漏れを遮断し、蛍光標識された基質の動的輸送または透過性を研究する際に考慮することができる。現在のプロトコルは、24ウェルメンブレンインサートを使用しています。96ウェル膜インサートの適応は、セクション5で説明されています。オルガノイドの密度、形態、およびサイズ(図3A)に応じて、6ウェルプレート(セクション2.3で播種したように)の6ウェルは、膜挿入物の完全な24ウェルプレートを播種するのに十分である。 - ECMによる膜インサートのコーティング
注:十分な細胞を持つことに疑問がある場合は、細胞を数えた後に挿入物をコーティングしてください。これは、高価な膜インサートの不要なコーティングおよび損失を防止するためである。- メンブレンインサートをバイオセーフティキャビネット内の支持プレートに置きます。ECM 40xを氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でCa2+およびMg2+で希釈し、希釈したECMを150μLを各インサートの頂端区画にピペットで固定する。プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。
- 播種用細胞の調製
- 細胞解離試薬2のアリコートを水浴(37°C)に予め温める。6ウェルプレートの各ウェルに対して2mLの試薬を調製する。
- オルガノイド(セクション2.3で調製)を含む培養プレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移す。手順 2.2.1.-2.2.4 で説明するように、オルガノイドを処理します。複数のチューブを 1 つのチューブにプールしないでください。
- 6ウェルプレートの最大3ウェルからのオルガノイドを含むチューブを充填し、DPBS(Ca2+およびMg2+なし)で最大12mL、および10mLピペットを使用して10倍上下にピペットする。85×gで8°Cで5分間遠心分離し、オルガノイドペレットを乱すことなく上清を吸引した。
- 出発物質として用いた6ウェルプレートのウェルあたり2 mLの予温した細胞解離試薬2を加え、再懸濁した。チューブを斜めまたは水平に37°Cの水浴中で5分間インキュベートし、オルガノイドのチューブの底部への沈み込みを防止する。
- 細胞解離試薬の全容量に応じて、5mL滅菌プラスチックピペットまたはP1000ピペットを使用して10倍にピペットを上下させる。顕微鏡下でオルガノイド懸濁液をチェックして、単一細胞と2〜4個の細胞からなるいくつかの細胞凝集塊の混合物が形成されたかどうかを確認します(図3B)。必要に応じて、混合物が 図3Bのようになるまで、ステップ3.3.4〜3.3.5(細胞解離試薬の体積を増やさないでください)を繰り返して消化を続けます。
注:オルガノイドを単一細胞に完全に消化することは避けてください。いくつかの小さな細胞群(すなわち、2〜4個の細胞群)を有する必要がある。 - 細胞懸濁液に 10μM ROCK阻害剤を含むBMを最大12mL 添加することによって細胞解離を止める。450× g で8°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引した。同じオルガノイド培養物を数本の15mL円錐管で処理する場合は、細胞ペレットをプールし、12mLのBMに再懸濁する。
- BMでプリウェットした40μmのストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、フロースルーを50mLの円錐形チューブに回収する。ストレーナーを10 mLのBMで洗浄し、フロースルーを同じ50 mLの円錐管に収穫します。
- 緊張した細胞懸濁液を2つの新しい15mL円錐管に移す。450× g で8°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引した。出発物質として使用した完全培養プレートあたり10μM ROCK阻害剤を添加した4mLのIEMに細胞を再懸濁する。
- 少量の細胞懸濁液を1:1の比率でトリパンブルーと混合して計数する。青ではなく生の細胞を数え(図3C)、生細胞の総数を計算します。小さな塊では、個々の細胞を数えます。
- 10 μM ROCK阻害剤を添加したIEMの1mLあたり3×106 個の生細胞を含む細胞懸濁液を調製する。
- ポリエステル膜インサートに細胞を播種する
- ECMコーティングされたインサートからDPBSを慎重に吸引し(ステップ3.2.1)、プレートを水平に保ちます。IEMのピペット800 μLを各側方区画にROCK阻害剤を補充した。ステップ3.3.10で調製した細胞懸濁液150 μLを頂端区画のECMコーティング膜上に滴下する。プレートごとに、BMのみで少なくとも1つの「空白」ウェルがあることを確認してください。
- 細胞が膜上に沈降したら、セクション4.1で説明したように経上皮電気抵抗(TEER)を測定し、顕微鏡を使用して膜挿入物を画像化します。プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーター内に置く。TEERを毎日測定し、画像を定期的に取得して単層形成を監視します(図4A-D)。
- 爽やかな単層
注:2〜3日ごとに培地をリフレッシュし、細胞の上に正の静水圧を維持し、細胞が膜から押し出されるのを防ぐために、次の順序で接着してください。培地をリフレッシュしながら、培地の吸引時に見える単層がピペットチップによって損傷を受けていないことを確認してください。- 膜インサートを含むプレートの基底側区画から培地を除去する。次いで、膜挿入物の頂端区画から培地を注意深く吸引する。
- 150 μLの新鮮なIEMを各頂端コンパートメントに滴下し、次に800 μLの新鮮なIEMを各側方コンパートメントに加える。
- 所望の腸上皮細胞型のための単層の濃縮
- 単層がIEMで合流し、約100 Ω・cm²のTEER値(ステップ4.1.1.4で計算)に対応するようにします。顕微鏡で、単層が完全に形成されたかどうか(図4D)、および穴がないかどうか( 図4B、Cを参照)を確認します。
- 膜インサートの側底および頂端コンパートメントからIEMを慎重に取り外し、セクション1.4で準備したようにeDMまたはcDMのいずれかと交換する。この単層を特異的分化培地中でさらに3〜4日間培養し、所望の特定の細胞型で富化されたオルガノイド細胞を得る。セクション 3.4 で説明されているように、2 ~ 3 日ごとに培地をリフレッシュします。
- TEERを毎日測定し、必要に応じて定期的に画像を取得します(図5A-C)。
注:完全に組織化された濃縮単分子層を示すTEER値は、オルガノイド培養ごとに異なる。通常、TEER 値は 600 に増加し、分化培地で 3 日後に最大 1000 Ω・cm2 (ステップ 4.1.1.4 で計算) まで増加し、3 ~ 5 日間安定です。
4. 上皮単層アッセイの読み出し
- 経上皮電気抵抗(TEER)の測定
注:TEER測定は、上皮単分子層28,29などの生理学的障壁の生物学的モデルにおけるタイトジャンクションダイナミクスおよびバリア機能の完全性を分析する方法として広く受け入れられている。タイトジャンクションでの細胞相互作用の増加による分化後のTEERの増加は、手動TEER計または自動TEER測定ロボットを使用して測定することができる。- 手動TEERメーターを使用したTEERの測定
- 電極を70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で空気乾燥させます。BMの入ったチューブに電極を入れ、手動のTEERメーターに電極を接続します。 ファンクション スイッチを回して 、オーム(Ω)で測定します。 電源 スイッチをオンにします。
- 短い電極をインサートの頂端コンパートメントに配置し、一方、長い電極を側方コンパートメントに配置します(図6A)。単層に触れないでください。
- ブランクウェル(Rブランク)の抵抗を測定し、残りのサンプル(Rサンプル)を同じ方法で測定します。異なる条件のサンプル間で電極をBMで洗浄する。電極を最初にデミ水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄し、風乾させます。
- TEER(Ω・cm2):[R試料 (Ω)-Rブランク (Ω)]×膜面積(cm2)を算出する(表1 及び 図6B)。
- 自動TEER測定ロボットによるTEER測定(材料表)
- メンブレンインサートを含む96ウェルおよび24ウェルHTSプレートにHTSシステムを使用する場合は、自動TEER測定を実行します。TEER測定には、両方のタイプ(24-および96-HTSメンブレンインサート)で異なる電極を使用します。自動TEER測定ロボットを使用してTEERを測定するには、製造元の指示に従ってください。
- 手動TEERメーターを使用したTEERの測定
- 上皮バリアの完全性と透過性の測定
注:このプロトコルは、単層の完全性の指標として、頂端から側方コンパートメントへのルシファーイエロー透過性を導入する。このセクションでは、単層透過性、ひいてはバリア完全性を評価するための1時間のインキュベーションステップ後の側底区画における蛍光測定について説明する。この測定はエンドポイントアッセイであり、化合物がバリアの完全性に及ぼす影響をテストする場合に特に役立ちます。- 氷の上でルシファーイエローを解凍し、BMをRTに平衡化させる。膜インサートの1つの24ウェルプレートについて、BM中の60μMルシファーイエローの5mLの作業溶液を調製する。
注:ルシファーイエローは光に敏感です。暗所の1.5 mL滅菌チューブで希釈液を準備し、バイオセーフティキャビネットのライトをオフにしてすべての手順を実行します。 - ステップ3.5.1で説明したように、膜挿入物の側底側および頂端区画から培地を慎重に除去する。必要に応じて、損傷した障壁を通るルシファーイエロー漏れの陽性対照としてピペットチップを使用して、未処理の単分子層を1つ引っ掻きます。
- 各頂端区画に60 μMルシファーイエローを含む150 μLのBMを加え、各側方コンパートメントにルシファーイエローを含まないBMを800 μL加える。プレートをシェーカー上に置き、37°C、50rpmで60分間置く。
- その間に、ステップ4.2.1で調製した作業溶液から始めて、BM中のルシファーイエローの標準曲線を準備する。3nMの濃度に達するまで各ステップで1:3に希釈する。陰性対照(BMのみ)を含める。
- 各標準物質100 μLを3連で96ウェル透明プレートに移す。60分間のインキュベーション後、膜インサートを取り出し、各側方ウェルから100 μLを3連で96ウェル透明プレートに移した(ステップ4.2.3)。プレートリーダーを用いて、励起波長430nm、発光波長530nmでプレートの蛍光を測定する。
- 陰性対照値(BMのみ)を補正した後、検量線値を使用して、側底区画内のルシファーイエロー濃度(最終受信機濃度(μM))を計算した。
- 見かけの透磁率係数(Papp)を下記式に従って算出する(図6C):
- メンブレンインサートを含む24ウェルプレートの場合、次の式を使用します。
- 氷の上でルシファーイエローを解凍し、BMをRTに平衡化させる。膜インサートの1つの24ウェルプレートについて、BM中の60μMルシファーイエローの5mLの作業溶液を調製する。
- 単分子膜を固定し、組織学のためのパラフィンブロックを準備する
注:上皮単層は、それらの細胞組成、極性、および接合タンパク質、増殖、または分化マーカーなどの目的の異なるタンパク質の発現を評価するための組織学的染色に使用することができる。このセクションでは、組織学的染色のためのパラフィンブロック調製物について説明する。- ステップ3.5.1で説明するように、膜挿入物の側底および頂端区画から培地を慎重に除去する。
- 各頂端区画に150 μLのDPBS(Ca2+ およびMg2+なし)を、各基底側区画に800 μLを加えて単層を洗浄する。DPBSを再び慎重に、まず側底コンパートメントから、次に頂端コンパートメントから吸引する。
注:このステップ以降、側底コンパートメントは空のままです。 - ヒュームフード内で、150μLの4%パラホルムアルデヒドを各頂端コンパートメントに加え、RTで30分間インキュベートする。
注:このステップ以降は、パラホルムアルデヒドは有毒であるため、ヒュームフード内でこのセクションのすべてのアクションを実行します。 - 膜インサートの頂端コンパートメントから固定液を慎重に吸引し、液体ハロゲン廃棄物として処分する。
注: このステップ以降は、すべての液体廃棄物を液体ハロゲン廃棄物として処分してください。 - 各頂端コンパートメントに200μLのDPBS(Ca2+ およびMg2+なし)を加えて単層を洗浄し、DPBSを再び注意深く吸引する。この手順をもう一度繰り返します。
- 200 μLの25%エチルアルコール(EtOH)を各頂端コンパートメントに加え、RTで15分間インキュベートした。15分後、膜挿入物の頂端コンパートメントから25%EtOHを注意深く吸引する。50%EtOH溶液で繰り返し、続いて70%EtOH溶液で繰り返す。
- 各頂端コンパートメントに200 μLの70%EtOHを加え、プレートをパラフィルムで包みます。さらに使用するまで4°Cで保存してください。
- 70%のEtOHを慎重に吸引し、メスを使用してインサートから単層膜を慎重に切断する。インサートの端の周り、基底側から切り取ります。
- パラフィンブロックは、標準的な手順に従って準備する。
- パラフィンがまだ温かいときは、ピンセットでパラフィンから単層を取り出し、予冷した表面に置きます。
- 単層を傷つけないように注意してください。シングルエッジブレードを使用して単層を半分に切断します。
- カセットの底部のパラフィンが固化し始めたら、加熱ピンセットを使用して、2つの単層部品をパラフィン内に、直線側を下にして垂直方向に隣り合わせに配置し、単層がクーペ内で垂直になるようにします。
- パラフィンブロックの準備ができたら、ミクロトームでブロックを切断し、標準的な手順に従って厚さ4μmの切片をスライドさせます。単層がクーペで垂直になることを確認します。
- 先に記載した組織学的染色を行う7、9。ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)、Ki67、ムチン-2(MUC2)、およびアルシアンブルーを使用して、それぞれ一般的な形態、増殖性細胞、粘液産生および杯細胞を示す(図6E)。
注:パネス細胞のリゾチームなどの追加の分化マーカーも使用できます。このマーカーは、パネス細胞が結腸上皮ではなく小腸上皮に存在するとして 図6E には提示されていない。
- 培地上清中の分泌タンパク質測定
- 回腸単層の頂端上清中のリゾチームレベルを測定し( 図6D参照)、 材料表に列挙されたキットを使用する。所望により、異なるサイトカインおよび目的の他のタンパク質のレベルを測定する。
- 遺伝子発現解析
- 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて、上皮細胞マーカー遺伝子の発現に対する分化培地の影響を定量する。
- 単層を350 μLのRNA溶解バッファーで溶解し、その後、製造元の指示に従ってRNA単離します。cDNA合成およびqPCRは、前述の7、9で説明したように、材料表に記載されているcDNA合成キット、マスターミックス、およびオリゴヌクレオチドを使用して行います。
- 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて、上皮細胞マーカー遺伝子の発現に対する分化培地の影響を定量する。
5. メンブレンインサートを含む96ウェルプレートへのアップスケーリング
注: 膜インサートを含む HTS 96 ウェルプレートを使用して、よりスループットの高い薬物スクリーニングまたは複数の培地条件のために上皮単層を調製します。
- 96ウェルフォーマットで単分子層を調製する際の適応
- 膜挿入物を含む 24 ウェルプレートについて、このプロトコルに記載されているすべての手順に従い、体積と細胞数を 表 1 に記載のものに変更します。メンブレンインサートを備えた96ウェルプレート上に単分子膜を調製するには、セクション3で説明したように、以下の相違点を伴って続行します。
- 図3Aで表されるオルガノイド密度を有する6ウェル培養プレートの約9ウェルは、メンブレンインサートを備えた完全な96ウェルプレートを播種するために必要である。ステップ3.2.1では、DPBS中の40倍希釈ECMの67μL(Ca2+およびMg2+を含む)で膜をプレコートする。
- セクション3.5では、まず膜インサートの一体プレートを別の96ウェルプレートに移して、頂端および側方コンパートメントの両方の培地リフレッシュを可能にする。
- 膜挿入物を含む 24 ウェルプレートについて、このプロトコルに記載されているすべての手順に従い、体積と細胞数を 表 1 に記載のものに変更します。メンブレンインサートを備えた96ウェルプレート上に単分子膜を調製するには、セクション3で説明したように、以下の相違点を伴って続行します。
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Representative Results
図1Aは、それらをクライオビアルから解凍した後の腸管オルガノイドの代表的な明視野画像を示す。最適な回収率を確保するためには、オルガノイドを高密度で解凍することが重要です。オルガノイドは、約10μLのECMドーム内の24ウェルまたは6ウェルプレートに播種される(図1B)。ほとんどの正常な腸オルガノイドは嚢胞性形態を有する。解凍プロセスから回復した後、オルガノイドはより大きなサイズに成長し、オルガノイド培養物に応じて3〜7日後に継代する準備ができている(図1C)。オルガノイドを採取し、ECMを洗い流した後(図1D)、機械的せん断によってオルガノイドを小さなサイズに破壊することができます。オルガノイドの形態(嚢胞性図1C、出芽図1E)に応じて、プラスチックまたはガラスピペットを使用してオルガノイドを破砕することができる(図1F)。オルガノイドは懸濁液中で破壊され(図2A)、顕微鏡下で定期的に監視する必要があります。オルガノイドの成長を確実にするために細胞群が一緒にいる必要があるため、それらを小さすぎるものにすることは避けることが重要です。図2Bは、継代直後のECM滴中のオルガノイドを示す。一般に、嚢胞性オルガノイドは比較的高密度でメッキされ、出芽オルガノイドは低密度でメッキされる。しかし、これは異なるオルガノイド培養物間で異なる可能性がある。
単層の調製のためにオルガノイドを継代するときは、必ずそれらを高密度にプレートし、それらが最適な膨張状態になるように3日間成長させるようにしてください。オルガノイドは、サイズと密度が図3Aに匹敵する場合、単層調製のために採取することができ、6ウェルプレートの6ウェル(それぞれ200μLのオルガノイドドームを含む)は、典型的には、膜挿入物の完全な24ウェルプレートを播種するのに十分である。細胞解離試薬による単一細胞懸濁液の調製後、単一細胞および細胞の小さな凝集塊が見えるはずであり(図3B)、生細胞を計数することができる(図3C)。矢印はトリパンブルーで染色された死細胞を示しており、これは計数から除外されるべきである。次いで、単一細胞および小さな凝集塊を、図4Aに見られるように膜挿入物に播種する。単層形成は1〜3日後に可視であり(図4B、C)、単層はオルガノイド培養に応じて3〜6日後に一般にコンフルエントになる(図4D)。単層は、コンフルエントになるまで膨張培地中にとどまり、その後、異なる濃縮培地を使用して、とりわけ腸細胞または杯細胞で富化することができる。図5Aは、増殖培地(IEM)中で8日間培養した単層を示す。腸細胞(eDM)で富化されると、構造が見られ、図5Bのように、一方、併用培地に曝露された単層(cDM)はより滑らかな構造を示す(図5C)。
単層形成は、TEERを測定することによって定量的に続くことができる(図6A)。完全にコンフルエントな単分子膜は、約100 Ω・cm2のTEER値を有し、これは、いずれかの分化培地に曝露すると〜1000 Ω・cm2 に増加する(図6B)。すべての中程度の条件下での単層は、ルシファーイエロー(0.45kDa)に対する低い見かけの透過性(Papp)を示す。IEMで培養された回腸単層によるリゾチーム分泌は、eDMまたはcDMでコンフルエントになるまでおよびさらに4日間(+後続のeDMまたはcDMと表記される)までIEMで培養された単層よりも高かった(図6D)。IEMで培養された単層は、IEM+後続のeDMまたはIEM+後続のcDMが、H&E染色で観察され得るように、異なる形態を示す(図6E)。IEMおよびcDM培地中の結腸オルガノイド由来上皮単層は滑らかな頂端表面を有するが、腸球分化単層は、Wnt. Ki67陽性増殖細胞の非存在下では、浸潤した頂端形態を呈し、拡張条件下でのみ検出することができる。アルシアンブルーおよびMUC2染色粘液は、杯細胞によって産生され、これは、それぞれWnt、Notch、およびEGFシグナル伝達が阻害されるときに、eDMで分化した単層およびcDMにおいてより顕著に可視化される(図6E)。分化すると、増殖細胞は減少し、杯細胞および腸球マーカー遺伝子発現は、それぞれqRT-PCRによるLGR5、MUC2、およびALPI遺伝子発現定量によって示されるように、IEM条件下で観察されたものと比較して増加する(図6F)。
図1:凍結オルガノイドから腸管オルガノイド培養物を樹立した(A)融解後の腸管オルガノイド培養物の代表的な明視野像。(b)ECMドーム(50 μL)を24ウェル培養プレートの各ウェルに播種する。(c)継代可能な正常な腸管オルガノイド培養物の代表像。(d)オルガノイドを含む15mLチューブ中のECMの存在を光学顕微鏡下で確認する方法に関する代表的な画像。(e)継代可能な出芽腸オルガノイド培養物の代表像。(F)オルガノイドの機械的せん断のために、低保持率の1250μLフィルターチップ(左)と狭くなったガラスピペット(右)に取り付けられた10μLのプラスチックピペットチップ。スケールバー = 100 μm。略語:ECM=細胞外マトリックス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単層の維持または調製のための腸管オルガノイドの処理。(b)継代後に播種した腸管オルガノイド培養物の代表像。スケール バー = 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単層調製のために腸管オルガノイドから単一細胞を調製する。 (A)単層調製のために収穫する準備ができている腸管オルガノイド。(b)単一細胞および単一細胞調製後の細胞の小さな凝集塊。(c)グリッドチャンバ内での計数中に目に見える単一細胞および小さな凝集塊。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:単一細胞を膜上に播種した後の単層形成。平均して、(B)単層は播種後1〜3日目に約50%コンフルエントであり、(C)〜90%コンフルエントは3〜5日目に、および(D)完全な単層は4〜7日目頃に形成されている。スケール バー = 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:単層における特定の細胞型の濃縮。(B)IEMで4日後、eDMでさらに4日後に腸細胞で富化した単層。(C)IEMで4日後、cDMでさらに4日後にゴブレット細胞および他の細胞型で富化した単層。スケールバー = 100 μm。略語:IEM =腸管オルガノイド膨張媒体;eDM = 腸球分化培地;cDM=組み合わせ分化培地。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:上皮オルガノイド単層を用いた様々な可能な読み出し。(b)単分子膜が合流点に達すると〜100 Ω・cm2の値で時間とともにTEER値が増加する。腸細胞または異なる上皮細胞の組み合わせで単層を富化した後、TEERは1000 Ω・cm2以上に増加する。(C)すべての培地条件(IEM + 4日間IEM / eDM / cDM)の単層は、ルシファーイエローに不浸透性である。(d)リゾチームの発現は、いずれのタイプの分化培地(IEM+4日間IEM/eDM/cDM)よりも増殖培地中で増殖させた場合、回腸単層において高い。(E)大腸単層は、H&E、Ki67、アルシアンブルー、およびMUC2染色によって視覚化された異なる培地条件(IEM + 4日間IEM/eDM/cDM)に曝露されると、異なる形態を示す。予想通り、増殖培地で培養された単層は、Ki67染色によって示されるように、非常に増殖性である。eDMで分化した単層は、増殖性細胞を含まない柱状上皮を示す。cDMに曝露された単層はまた、増殖性ではなく、より多くの杯細胞を発達させる。(F)幹細胞(LGR5)、杯細胞(MUC2)、および腸細胞(ALPI)マーカー遺伝子は、qRT−PCRによる結腸単層における発現。略語: TEER = 経上皮電気抵抗;IEM = 腸管オルガノイド膨張培地;eDM = 腸球分化培地;cDM = 組み合わせ分化培地;Pアプリ=見かけの透過係数;LGR5 = ロイシンリッチ反復含有Gタンパク質共役型受容体5;H&E = ヘマトキシリンおよびエオジン;AB = アルシアンブルー;MUC2 = ムチン-2;ALPI = 腸アルカリホスファターゼ;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| メンブレンインサート | ||
| 24ウェルプレート | 96ウェルプレート | |
| 膜表面(cm2) | 0.33 | 0.143 |
| 頂端体積(μL) | 150 | 100 |
| 基底側体積(μL) | 800 | 300 |
| # ウェルごとにシードする細胞 | 450,000 | 200,000 |
| メンブレンインサート付きHTSプレート | ペット | ペット |
| 独立したインサート付きプレート | ペット | ティッカー |
| メンブレンインサート付きライトタイトプレート | ||
| 電極は2つのフォーマットで異なります | 材料表を参照 | |
表 1
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Discussion
このプロトコールは、腸管オルガノイドの一般的な操作および維持、ならびにこれらのオルガノイドに由来する上皮単層の調製および可能な適用を記載する。今日まで、単層は、十二指腸、回腸、および正常および以前におよび活発に炎症を起こした腸組織に由来する結腸オルガノイドの異なる領域から首尾よく調製されてきた(未発表データ)。患者由来のオルガノイド単層の適用は、疾患および患者特異的な様式でのバリア機能の研究、ならびに様々な薬物治療に対する患者特異的応答の研究を容易にする。細胞株は腸腸細胞および杯様細胞を含む分化および分極単層を形成することができるが、多くの異なる酵素およびトランスポーターがこれらの細胞株において異常に発現され、複雑さおよび生理学的関連性の低下をもたらす3,30。オルガノイド培養は、細胞培養よりも技術的に要求が厳しく、面倒です。しかし、オルガノイドはin vivoの状況をより代表していますが、細胞株は複雑なセットアップで組織応答を表すことに繰り返し失敗しています。
一次組織ベースのモデルは、in vivoのイチュエーションを代表するものであり得るが、それらは、限られた入手可能性および倫理的制約に関連する試験動物の使用またはヒト材料へのアクセスを必要とする。さらに、一次組織は、拡張性が全くないか、または限定的であり、延長された実験時間枠において安定ではない。オルガノイド技術は、上皮組織の複雑さと患者の不均一性を表しながら、遺伝的および生理学的に安定した長期拡張培養を確立するために、限られた量の一次組織を必要とする。Caco-2などの異なる細胞株は、上皮単層を調製するためにしばしば使用される。Caco−2細胞は、任意の実験30に使用することができる分極上皮単層を確立するのに21日かかる。オルガノイド由来上皮単層は、現在のプロトコールに記載されているようにオルガノイド単一細胞から調製され、3〜6日後に、さらに分化して腸細胞または杯細胞でそれらを富化することができる分極上皮を形成する。
単分子層は、臓器オンチップに見られるように、マイクロ流体の流れまたは機械的ストレッチを欠いている静的モデルである。しかし、それらは(自家)免疫細胞、ならびに細菌または寄生虫17,18,19,31と共培養する機会を提供する。オルガノイドは、それらがそれらの膨張段階にあるときの単層調製に適している。腸オルガノイドの場合、これは通常、継代後3日である。単一細胞へのオルガノイドの解離は、消化酵素への長期曝露を避けるために迅速に行うべきである。単一細胞懸濁液の調製後の幹細胞の生存率を高めるために、Rho関連プロテインキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)、Y27632を細胞に添加して、アノイキス誘発細胞死を予防する32。さらに、ECMでプレコートされた膜上で単層を培養して、オルガノイド特性と分極を確実に維持することが重要です。外部刺激に対する消化管上皮細胞応答を定量化する機能スクリーニングアッセイの場合、オルガノイド培養物は、開発するアッセイの種類および最終的な読み出しに応じて、必要な細胞の複雑さを表すことが重要です。
腸内オルガノイドは、インビボに存在する異なる上皮細胞型、例えば、ステム、TA、腸球、パネス、ゴブレット、および腸内分泌細胞4、5を表し、このプロトコールに記載されるように調製された定義されたオルガノイド培地を用いて調製および維持される。Wnt経路を二重に阻害する培養条件を用いてオルガノイドをさらに4日間培養し、Wnt分子/活性化剤を除去し、ヤマアラシ阻害剤IWP-2(腸球結腸分化培地、eDM)を添加することにより、腸球分化を促進することができる。粘液産生ゴブレット細胞はバリア機能の恒常性維持にも不可欠であるため、第2の培養条件は、IEMで使用される50%(0.5nM NGS-Wnt)ではなくWnt3aCMを10%(またはNGS-Wntの場合は0.1nM)に減少させることによって、NotchおよびEGF経路を阻害しながらWntシグナル伝達を部分的に維持する、ステム、腸球、およびゴブレット細胞を含むより不均一な細胞集団を産生することを目指している。腸球分化を濃縮するeDMとは対照的に、この第2の条件はいくつかの細胞型の存在をサポートし、したがって、組み合わせ分化培地(cDM)と呼ばれる。
オルガノイド由来単層の用途には、上皮バリアの完全性のモニタリング、タイトジャンクションおよびトランスポーター発現の検査が含まれる。バリアの完全性、透過性、および輸送は、このプロトコルで導入された読み出しを使用して分析できます。TEERがタイトジャンクションを通してイオンコンダクタンスを測定するのに対し、透過性アッセイは水流、ひいてはタイトジャンクション28、29を通る傍細胞透過性を測定する。単分子層の上皮バリア完全性、透過性、および輸送機能は、膜挿入物の頂端および側方区画にわたる異なる蛍光または放射性基質のトラフィックを測定することによって評価することができる。TEER測定は、バリア完全性の定量化を可能にし、分極腸細胞および杯細胞に向かって分化するときの値の増加、および単分子層への傷害を誘導した後の減少を示す。
Lucifer Yellow透過性アッセイは、最初のバリア完全性評価、および単分子層への傷害を誘発した後の完全性の低下の確認に使用できます。このプロトコルは、単層の完全性の指標として、頂端から側底区画へのルシファーイエロー透過性を導入する。同様に、4または40kDaデキストランなどの他の蛍光標識試薬を使用して、バリア損傷誘導剤の結果として増加した傍細胞透過性を評価することができる。蛍光標識された基質、例えばローダミン123は、P−糖タンパク質−1などの異なるトランスポーターの活性を測定するために使用することができる。このプロトコールに記載されている蛍光アッセイは、頂端コンパートメントに分泌されるリゾチームなどのタンパク質のレベルの測定を可能にする。前炎症性サイトカインによる傷害誘導に対する応答は、これらの読み出し、ならびにバリア回復化合物の潜在的な効果を用いて測定することができる。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は 、Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland(LSH-TKI )の官民パートナーシップ(PPP)手当によって支援されており、プロジェクト番号LSHM16021オルガノイドは、Hubrecht Organoid Technology(HUB)への毒物学モデリングのための新しいツールとして、HUBは疾患モデリングおよび毒物学部門に内部資金を供給しています。我々は、Sabine Middendorp(小児胃腸科、Wilhelmina Children's Hospital、UMC、Utrecht)およびHugo R. de JongeおよびMarcel J.C. Bijvelds(消化器科および肝臓科、エラスムスMC、ロッテルダム)の研究室が、膜挿入物に単層を設置するための初期技術サポートを提供してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
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