Summary
Her beskriver vi forberedelsen af humane organoidafledte tarmepitelmonolag til undersøgelse af tarmbarrierefunktion, permeabilitet og transport. Da organoider repræsenterer originalt epitelvævsrespons på eksterne stimuli, kombinerer disse modeller fordelene ved udvidelighed af cellelinjer og relevansen og kompleksiteten af primært væv.
Abstract
Tidligere var tarmepitelmodelsystemer begrænset til transformerede cellelinjer og primært væv. Disse modelsystemer har iboende begrænsninger, da førstnævnte ikke trofast repræsenterer original vævsfysiologi, og tilgængeligheden af sidstnævnte er begrænset. Derfor hæmmer deres anvendelse grundforskning og lægemiddeludviklingsforskning. Voksne stamcellebaserede organoider (fremover benævnt organoider) er miniaturer af normalt eller sygt epitelvæv, hvorfra de er afledt. De kan etableres meget effektivt fra forskellige gastrointestinale (GI) kanalregioner, har langsigtet udvidelsesevne og simulerer vævs- og patientspecifikke reaktioner på behandlinger in vitro. Her er etableringen af intestinale organoidafledte epitelmonolag blevet demonstreret sammen med metoder til måling af epitelbarriereintegritet, permeabilitet og transport, antimikrobiel proteinsekretion samt histologi. Desuden kan tarmorganoidafledte monolag beriges med prolifererende stam- og transitforstærkende celler samt med vigtige differentierede epitelceller. Derfor repræsenterer de et modelsystem, der kan skræddersys til at studere virkningerne af forbindelser på målceller og deres virkemåde. Selvom organoidkulturer teknisk set er mere krævende end cellelinjer, kan de, når de først er etableret, reducere fejl i de senere stadier af lægemiddeludvikling, da de virkelig repræsenterer in vivo-epitelkompleksitet og interpatient heterogenitet.
Introduction
Tarmepitelet fungerer som en fysisk barriere mellem tarmens luminalindhold og det underliggende væv. Denne barriere består af et enkelt epitellag af hovedsageligt absorberende enterocytter, der er forbundet med tætte kryds, som etablerer stærke intercellulære forbindelser mellem tilstødende celler. Disse celler danner en polariseret epitelforing, der adskiller tarmens apikale (lumen) og basolaterale sider, samtidig med at de regulerer paracellulær transport af fordøjede næringsstoffer og metabolitter. Ud over enterocytter bidrager andre vigtige epitelceller såsom bæger, Paneth og enteroendokrine celler også til intestinal homeostase ved at producere henholdsvis slim, antimikrobielle peptider og hormoner. Tarmepitelet genopfyldes konstant ved at dividere leucinrige gentagelsesholdige G-proteinkoblede receptor 5-positive (LGR5+) stamceller i bunden af tarmkrypter, der producerer transitforstærkende (TA) celler, der migrerer opad og differentierer sig til andre celletyper1. Forstyrrelse af tarmepitelhomeostase af genetiske og miljømæssige faktorer, såsom eksponering for fødevareallergener, medicinske forbindelser og mikrobielle patogener, fører til forstyrrelse af tarmbarrierefunktionen. Disse tilstande forårsager flere tarmsygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD), cøliaki og lægemiddelinduceret GI-toksicitet2.
Undersøgelser af tarmepitelet udføres ved hjælp af flere in vitro-platformsystemer såsom membranindsatser, organer-på-en-chip-systemer, Ussing-kamre og tarmringe. Disse platforme er egnede til at etablere polariserede epitelmonolag med adgang til både apikale og basolaterale sider af membranen ved hjælp af transformerede cellelinjer eller primært væv som modeller. Selvom transformerede cellelinjer, såsom kolorektale (adeno)carcinomcellelinjer Caco-2, T84 og HT-29, er i stand til at differentiere sig til polariserede intestinale enterocytter eller slimproducerende celler til en vis grad, er de ikke repræsentative for in vivo-epitelet, da flere celletyper mangler, og forskellige receptorer og transportører udtrykkes afvigende3 . Da cellelinjer er afledt af en enkelt donor, repræsenterer de desuden ikke interpatient heterogenitet og lider af reduceret kompleksitet og fysiologisk relevans. Selvom primærvæv, der anvendes i Ussing-kamre og som tarmringe, er mere repræsentative for in vivo-situationen, gør deres begrænsede tilgængelighed, kortsigtede levedygtighed og manglende udvidelsesevne dem uegnede som medium til HT-undersøgelser (High Throughput).
Organoider er in vitro epitelkulturer etableret fra forskellige organer såsom tarm, nyre, lever, bugspytkirtel og lunge. De har vist sig at have langsigtet, stabil udvidelsesevne samt genetisk og fænotypisk stabilitet og er derfor repræsentative biologiske miniaturer af epitelet i det oprindelige organ med trofaste reaktioner på eksterne stimuli 4,5,6,7,8,9. Organoider etableres effektivt fra enten resekteret eller biopsieret normalt, sygt, betændt eller kræftvæv, der repræsenterer heterogene patientspecifikke responser 10,11,12,13,14,15,16. Dette papir viser, hvordan man etablerer intestinale epitelmonollag afledt af organoidkulturer. Monolag er med succes blevet etableret fra tyndtarms- såvel som tyktarms- og rektale organoidkulturer. Denne model skaber mulighed for at studere epitelcellernes transport og permeabilitet til lægemidler samt deres toksikologiske virkninger på epitelet. Desuden tillader modellen samkultur med immunceller og bakterier at studere deres interaktioner med tarmepitelet 17,18,19. Desuden kan denne model bruges til at studere reaktioner på terapier på en patientspecifik måde og indlede screeningsindsats for at lede efter den næste bølge af epitelbarrierefokuserede terapier. En sådan tilgang kunne udvides til klinikken og bane vejen for personlige behandlinger.
Selvom epitelmonolagene i denne protokol fremstilles ud fra humane normale tarmorganoider, kan protokollen anvendes og optimeres til andre organoidmodeller. Epitelorganoid monolag dyrkes i tarmorganoidudvidelsesmedium indeholdende Wnt for at understøtte stamcelleproliferation og repræsentere intestinal kryptcellulær sammensætning. Tarmorganoider kan beriges til at have forskellige intestinale epitelskæbner, såsom enterocytter, Paneth, bæger og enteroendokrine celler ved at modulere Wnt-, Notch- og epidermale vækstfaktorveje (EGF). Her, efter etablering af monolag i ekspansionsmedium, drives de mod mere differentierede tarmepitelceller, som tidligere beskrevet 20,21,22,23,24,25. Til screeningsformål, afhængigt af virkningsmåden for det pågældende stof, dets målceller og de eksperimentelle betingelser, kan monolagene drives mod den valgte cellulære sammensætning for at måle virkningerne af forbindelsen med relevante funktionelle udlæsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af reagenser til kultur
BEMÆRK: Udfør alle trin inde i et biosikkerhedsskab og følg standardretningslinjerne for arbejde med cellekulturer. Ultraviolet lys bruges i 10 minutter, før biosikkerhedsskabet startes. Før og efter brug rengøres overfladen af biosikkerhedsskabet med et silkepapir gennemblødt i 70% ethanol. For at lette dannelsen af tredimensionelle dråber ekstracellulær matrix (ECM) skal du holde en forvarmet bestand på 96-, 24- og 6-brøndsplader klar i inkubatoren ved 37 ° C.
- Basal medium forberedelse
- Forbered basalt medium (BM) i en 500 ml Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium med skinkes næringsblanding F-12 (Ad-DF) medium flaske ved at tilsætte 5 ml 200 mM glutamin, 5 ml 1 M 4-(2-hydroxyethil)-1piperazinethanesulfonsyre (HEPES) og 5 ml penicillin/streptomycin (pen/strep) opløsninger (10.000 U/ml eller 10.000 μg/ml). Dette kan opbevares i køleskabet ved 4 °C i mindst 4 uger.
- Wnt kilder
- Forbered Wnt3a-konditioneret medium (Wnt3aCM) i henhold til den tidligere beskrevne metode26.
BEMÆRK: For nylig er der genereret en næste generations surrogat Wnt (NGS-Wnt), som også understøtter udvidelse af humane tarmorganoider,27.
- Forbered Wnt3a-konditioneret medium (Wnt3aCM) i henhold til den tidligere beskrevne metode26.
- Intestinal organoid base medium forberedelse
BEMÆRK: Brug alle vækstfaktorer og reagenser i henhold til producentens anbefalinger. Brug små aliquots og undgå fryse-optøningscyklusser; funktionelle vækstfaktorer er afgørende for en vellykket organoidkultur.- Forbered koncentreret 2x intestinal organoid base medium (2x IBM) ved at supplere BM med 1 μM A83-01, 2,5 mM N-acetylcystein, 2x B27 supplement, 100 ng / ml human epidermal vækstfaktor (hEGF), 10 nM gastrin, 200 ng / ml hNoggin og 100 μg / ml af en antimikrobiel formulering til primære celler (se materialetabellen).
- Aliquot 2x IBM og frys ved -20 ° C i op til 4 måneder. Når det er nødvendigt, optøes en alikvote natten over ved 4 °C eller i flere timer ved stuetemperatur (RT).
- For at forberede intestinal organoid ekspansionsmedium (IEM), supplere 2x IBM med enten 50% Wnt3aCM eller 50% BM og 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng / ml human Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM nicotinamid og 10 μM SB202190.
- Intestinal organoid differentiering medium forberedelse
- Forbered enterocytdifferentieringsmedium (eDM) ved at supplere 2x IBM med 50% BM, 250 ng / ml hRspo3 og 1,5 μM Wnt-vejhæmmer (IWP-2). Opbevar eDM ved 4 °C i op til 10 dage.
- Forbered kombinationsdifferentieringsmedium (cDM) ved at supplere 2x IBM med enten 40% BM og 10% Wnt3aCM eller 50% BM og 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng / ml hRspo3, 10 μM DAPT og 100 nM PD0325901. Opbevar cDM ved 4 °C i op til 10 dage.
- Manipulation af ekstracellulær matrix (ECM)
BEMÆRK: Forbered den ekstracellulære matrix (ECM) (se materialetabellen) i henhold til producentens anbefaling.- Tø ECM natten over på is; overfør ECM fra flasken til et 15 ml konisk rør ved hjælp af en 5 ml pipette, begge forkølet ved -20 °C. Genfrys kun alikvoter én gang ved -20 °C. Når ECM er optøet, skal den opbevares i køleskab ved 4 °C i op til 7 dage. Inkuber i mindst 30 minutter på is før brug.
BEMÆRK: Bland ECM korrekt, og sørg for, at det er koldt, før du indlejrer krypter eller organoider.
- Tø ECM natten over på is; overfør ECM fra flasken til et 15 ml konisk rør ved hjælp af en 5 ml pipette, begge forkølet ved -20 °C. Genfrys kun alikvoter én gang ved -20 °C. Når ECM er optøet, skal den opbevares i køleskab ved 4 °C i op til 7 dage. Inkuber i mindst 30 minutter på is før brug.
2. Organoide kulturer
- Etablering af kulturer fra frosne organoider
BEMÆRK: Lad BM nå RT, og hold en 12 ml alikvote, opvarmet til 37 ° C, klar, inden proceduren med optøning af en kryovial indeholdende frosne organoider påbegyndes.- Optø organoid cryovial hurtigt ved at agitere i et 37 ° C vandbad, indtil der kun er en splint is tilbage. Tilsæt straks 500 μL varm BM dråbevis til kryovialet, og rør op og ned et par gange for at fortynde frysemediet og bland indholdet omhyggeligt.
- Brug en P1000-pipette til at overføre organoiderne til et 15 ml konisk rør og tilsæt yderligere 1 ml varm BM dråbevis, mens du forsigtigt blander bunden af røret. Pipet op og ned et par gange for at fortynde frysemediet og bland indholdet omhyggeligt.
- Tilsæt op til 12 ml varm BM dråbevis til det 15 ml koniske rør, der indeholder organoiderne, og pipet op og ned med en 10 ml steril pipette for forsigtigt at suspendere organoiderne igen.
- Centrifugering af organoidsuspensionen i 5 minutter ved 85 × g og 8 °C. Kassér supernatanten forsigtigt uden at forstyrre pelleten, og genophæng organoiderne i 30% v /v IEM suppleret med 10 μM Y27632 eller anden rho-associeret coiled-coil-dannende protein serin / threoninkinasehæmmer (ROCK-hæmmer). Placer røret på is.
- Tilsæt 70 % v/v ECM i det 15 ml koniske rør, der indeholder organoiderne. Bland organoidsuspensionen, der holder det 15 ml koniske rør på is, og frø 5 μL af suspensionen for at kontrollere densiteten (figur 1A). Fortsæt plettering, hvis densiteten er passende; Hvis densiteten er for høj, skal du tilføje mere IEM/ECM-opløsning i samme forhold på henholdsvis 30-70 % v/v.
- I hver brønd af en forvarmet 24-brønds plade, frø 50 μL af organoidsuspensionen ved pipettering af 5 separate dråber på 10 μL (figur 1B). Vend pladen på hovedet, og lad den ligge i biosikkerhedsskabet i 5 min. Overfør pladen på hovedet til 37 °C-inkubatoren, og lad den stå i yderligere 30 minutter.
- Tilsæt 500 μL IEM med 10 μM ROCK-hæmmer til hver brønd, og overfør pladen til inkubatoren. Forestil dig en dråbe regelmæssigt for at overvåge væksten, og opdater IEM hver 2-3 dage ved at aspirere det gamle medium og tilføje 500 μL frisk IEM.
- Organoiderne passeres, når de er kommet sig korrekt efter optøning og har nået den rette størrelse til at blive behandlet (figur 1C), som beskrevet i punkt 2.2.
- Passaging af intestinale organoider
BEMÆRK: Afkøl ECM på is i mindst 30 minutter, og opbevar IEM på RT i mindst 1 time før brug.- Brug mediet fra en kulturbrønde til at bryde de organoide kupler op ved hjælp af en 1250 μL filterspids med lav retention, og overfør brøndindholdet til et mærket 15 ml konisk rør. Vask brønden med 1 ml BM, og overfør den til det samme 15 ml koniske rør.
- Gentag trin 2.2.1 og 2.2.2 med alle andre brønde (højst en halv plade eller 600 μL ECM-dråber kan vaskes og tilsættes til et 15 ml konisk rør).
- Tilsæt BM for at fylde røret op til 12 ml, og rør op og ned 10x ved hjælp af en 10 ml pipette. Centrifuge ved 85 × g i 5 min ved 8 °C.
- Før du fjerner BM, skal du kontrollere under mikroskopet for at se, om alle organoider er pelleteret i bunden af det 15 ml koniske rør (figur 1D). Hvis der ikke er nogen ECM, der overlejrer organoidpillen, eller ECM-laget enten er rent eller kun indeholder snavs, enkeltceller eller meget få organoider sammenlignet med de pelleterede organoider, aspirerer supernatanten og pipetter ECM ud over organoidpillen meget omhyggeligt ved hjælp af en P200-pipette.
BEMÆRK: Organoider kan blive fanget i ECM og sedimenterer ikke som en kompakt pellet på grund af lav centrifugeringskraft. Hvis ECM indeholder organoider, centrifugeres røret igen ved 450 × g i 5 minutter ved 8 °C og supernatanten fjernes forsigtigt som beskrevet i 2.2.4. Hvis der er flere 15 ml koniske rør, kan de samles efter trin 2.2.4. - Tilsæt 1 ml BM til hver pellet (med et volumen på 50-200 μL, afhængigt af organoidkulturen og densiteten), og genophæft omhyggeligt. Pipet organoiderne op og ned mindst 5x for at skære dem og undgå skumdannelse. Kontroller under mikroskopet for at se, om organoiderne er forstyrret (figur 2A). Hvis organoiderne forstyrres, fortsæt til trin 2.2.7; hvis organoiderne ikke forstyrres, pipet dem yderligere 5x. Denne gang skal du røre ved plastrørets væg med pipettespidsen for at udøve mere mekanisk kraft for at forstyrre organoiderne.
BEMÆRK: Mekanisk forskydning af cystiske (figur 1C) og spirende (figur 1E) organoider er mulig med enten en 200 μL eller 10 μL plastpipettespids monteret på en filterspids med lav retention på 1250 μL (figur 1F), afhængigt af det volumen, der kræves for at forstyrre organoiderne. Brug af en indsnævret glaspipette (figur 1F) anbefales, når mere end 200 μL ECM indeholdende organoiderne behandles (en brønd af en 6-brønds plade eller 4 brønde af en 24-brønds plade). - Kontroller under mikroskopet igen for at se, om organoiderne er forstyrret. Hvis forstyrret, fortsæt med det næste trin; hvis ikke, pipet organoiderne op til 20x, kontrollere organoiderne under mikroskopet regelmæssigt. Hvis organoiderne stadig ikke er forstyrret, tilsættes 25% v/v-celledesociationsreagens 1 (se materialetabellen) til suspensionen, inkuberes i vandbadet ved 37 °C i 2 minutter og pipetterer organoiderne op til 20x, idet organoiderne kontrolleres regelmæssigt under mikroskopet for at sikre, at de ikke fordøjes til enkeltceller.
- Tilsæt op til 12 ml BM til det 15 ml koniske rør, og vask organoidpillen ved at pipettere op og ned. Centrifuge ved 85 × g i 5 min ved 8 °C. Kassér supernatanten, og juster den endelige koncentration til 70% v / v ECM ved at tilføje IEM og ECM til organoidpillen.
- Begynd at genbruge organoidpillen med dobbelt så stor mængde IEM/ECM opsamlet til passaging, og frø 5 μL af suspensionen for at kontrollere densiteten. Fortsæt pletteringen, hvis densiteten er passende (figur 2B); tilføj mere IEM/ECM-løsning, hvis densiteten er for høj. Tilsæt 200 μL af suspensionen til hver brønd i en forvarmet 6-brønds plade, hvilket gør separate dråber på 10 μL volumen.
- Vend pladen på hovedet, og lad den ligge i biosikkerhedsskabet i 5 min. Overfør pladen stadig på hovedet til 37 °C-inkubatoren, og lad den stå i yderligere 30 minutter. Tilsæt 2 ml IEM med 10 μM ROCK-hæmmer til hver brønd, og overfør pladen til inkubatoren.
- Forestil dig en dråbe regelmæssigt for at overvåge væksten, og opdater IEM hver 2-3 dage ved at aspirere det gamle medium og tilføje 2 ml frisk IEM.
- Passaging af intestinale organoider til epitelmonolagspræparat
- Passageorganoider 3 dage før høst til enkeltlagsforberedelse ved at følge den samme passagingprotokol som beskrevet i punkt 2.2 med en undtagelse. I trin 2.2.7 skal organoiderne i 1-1,5x startvolumenet af IEM/ECM suspenderes igen for at have et højere densitets- og ekspansionspotentiale, når de høstes til enkeltlagsforberedelse (figur 3A).
3. Epitel monolags forberedelse
- Kulturepitelmonolag på både 24-brønds og 96-brønds membranindsatser med en række tilgængelige pladetyper (tabel 1). Brug HTS-membranindsatser (high-throughput system) til begge størrelser, da disse indeholder en integreret bakke med membranindsatserne og en modtagerplade. Til 24-brøndsformatet er det også muligt at bruge plader med separate aftagelige membranindsatser.
BEMÆRK: Forskellige membrantyper (polyethylenterephthalat (PET) eller polycarbonat) og porestørrelser (0,4-8,0 μm) er tilgængelige og kan anvendes afhængigt af eksperimentelle behov. Monolag kan kun afbildes ved hjælp af brightfield, når der anvendes indsatser med PET-membraner. Lystætte membraner blokerer fluorescerende lyslækage fra det apikale til det basolaterale rum og kan overvejes, når dynamisk transport eller permeabilitet af fluorescerende mærkede substrater undersøges. Den nuværende protokol bruger 24-brønds membranindsatser; tilpasninger til 96-brønds membranindsatser er beskrevet i afsnit 5. Afhængigt af organoidernes densitet, morfologi og størrelse (figur 3A) er 6 brønde af en 6-brønds plade (som podet i afsnit 2.3) nok til såning af en fuld 24-brønds plade af membranindsatser. - Belægning af membranindsatser med ECM
BEMÆRK: Hvis der er tvivl om at have nok celler, skal du belægge indsatserne efter at have talt cellerne. Dette er for at forhindre unødvendig belægning og tab af de dyre membranindsatser.- Anbring membranindsatserne i støttepladen i biosikkerhedsskabet. Fortynd ECM 40x i iskold Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS) med Ca2+ og Mg2+, og pipet 150 μL af den fortyndede ECM ind i det apikale rum i hver indsats. Inkubere pladen ved 37 °C i mindst 1 time.
- Forberedelse af celler til såning
- Prævarm alikvoter af celle dissociationsreagens 2 i vandbadet (37 °C). Forbered 2 ml af reagenset til hver brønd af en 6-brønds plade.
- Kulturpladen, der indeholder organoiderne (fremstillet i punkt 2.3), overføres fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet. Organoiderne behandles som beskrevet i trin 2.2.1.-2.2.4. Pool ikke flere rør i et rør.
- Fyld røret, der indeholder organoider fra maksimalt 3 brønde med en 6-brønds plade, op til 12 ml med DPBS (uden Ca2+ og Mg2+), og pipet op og ned 10x ved hjælp af en 10 ml pipette. Centrifugering ved 85 × g i 5 minutter ved 8 °C og aspirerer supernatanten uden at forstyrre organoidpillen.
- Tilsæt 2 ml af det forvarmede celle dissociationsreagens 2 pr. brønd af en 6-brønds plade, der anvendes som udgangsmateriale og resuspend. Inkuber rørene diagonalt eller vandret i 5 minutter i vandbadet ved 37 °C for at forhindre, at organoiderne synker ned i bunden af røret.
- Pipet op og ned 10x ved hjælp af en 5 ml steril plastpipette eller en P1000-pipette afhængigt af det samlede volumen af celledissociationsreagenset. Kontroller organoidsuspensionen under mikroskopet for at se, om der er dannet en blanding af enkeltceller og nogle celleklumper bestående af 2-4 celler (figur 3B). Fortsæt om nødvendigt fordøjelsen ved at gentage trin 3.3.4-3.3.5 (forøg ikke volumenet af celledistsociationsreagens), indtil blandingen ligner figur 3B.
BEMÆRK: Undgå at fordøje organoiderne fuldt ud til enkeltceller. Det er nødvendigt at have nogle små grupper af celler (dvs. grupper på 2-4 celler). - Stop celle dissociation ved at tilføje op til 12 ml BM inklusive 10 μM ROCK-hæmmer til cellesuspensionen. Centrifuge ved 450 × g i 5 minutter ved 8 °C og aspirere supernatanten uden at forstyrre cellepillen. Ved håndtering af den samme organoidkultur i flere 15 ml koniske rør skal du samle cellepillerne og suspendere dem igen i 12 ml BM.
- Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 μm sil, der er forvædet med BM, og høst gennemstrømningen i et 50 ml konisk rør. Vask silen med 10 ml BM, og høst gennemstrømningen i det samme 50 ml koniske rør.
- Overfør den anstrengte cellesuspension til to nye 15 ml koniske rør. Centrifugering ved 450 × g i 5 minutter ved 8 °C og aspirerer supernatanten uden at forstyrre cellepillen. Resuspend cellerne i 4 ml IEM suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer pr. Fuld dyrkningsplade, der anvendes som udgangsmateriale.
- Bland en lille mængde cellesuspension i forholdet 1:1 med trypanblå til tælling. Tæl de levende, ikke blå, celler (figur 3C), og beregn det samlede antal levende celler. I små klumper tælles hver enkelt celle.
- Forbered en cellesuspension indeholdende 3 × 106 levende celler pr. ml IEM suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer.
- Såning af celler på polyestermembranindsatser
- Forsigtigt aspirere DPBS fra de ECM-belagte skær (trin 3.2.1), mens pladen holdes vandret. Pipet 800 μL IEM suppleret med ROCK-hæmmer i hvert basolateralt rum. Pipet 150 μL af cellesuspensionen fremstillet i trin 3.3.10 på den ECM-belagte membran i det apikale rum dråbevis. Pr. Plade skal du sørge for kun at have mindst en "tom" brønd med BM.
- Når cellerne har sedimenteret på membranen, måles transepitelial elektrisk modstand (TEER), som beskrevet i punkt 4.1, og membranindsatserne afbildes ved hjælp af et mikroskop. Anbring pladen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Mål TEER hver dag, og hent billeder regelmæssigt for at overvåge dannelsen af etlag (figur 4A-D).
- Forfriskende monolag
BEMÆRK: Opdater mediet hver 2-3 dage, idet du overholder følgende rækkefølge for at opretholde et positivt hydrostatisk tryk over cellerne og forhindre celler i at blive skubbet ud af membranen. Mens du opdaterer mediet, skal du sørge for, at monolaget, som er synligt ved aspiration af mediet, ikke beskadiges af pipettespidsen.- Fjern mediet fra de basolaterale rum på pladen, der indeholder membranindsatserne. Derefter aspirerer forsigtigt mediet fra de apikale rum i membranindsatserne.
- Tilsæt 150 μL frisk IEM dråbevis til hvert apikalt rum, og tilsæt derefter 800 μL frisk IEM til hvert basolateralt rum.
- Berigelse af monolaget for ønskede intestinale epitelcelletyper
- Monolaget må blive sammenflydende i IEM, svarende til en TEER-værdi på ca. 100 Ω·cm² (som beregnet i trin 4.1.1.4). Kontroller under mikroskopet for at afgøre, om monolagene er dannet fuldstændigt (figur 4D) og for fravær af huller (som det ses i figur 4B,C).
- Fjern forsigtigt IEM fra de basolaterale og apikale rum i membranindsatserne, og udskift med enten eDM eller cDM som forberedt i punkt 1.4. Kultur monolaget i yderligere 3-4 dage i det specifikke differentieringsmedium for at få organoidcellerne beriget med den ønskede specifikke celletype. Opdater mediet hver 2.-3. dag som beskrevet i punkt 3.4.
- Mål TEER dagligt, og hent billeder regelmæssigt, hvis det ønskes (figur 5A-C).
BEMÆRK: TEER-værdien, der angiver et fuldt organiseret beriget monolag, varierer pr. organoidkultur; typisk stiger TEER-værdierne til 600 og kan stige op til 1000 Ω·cm2 (som beregnet i trin 4.1.1.4) efter 3 dage i differentieringsmedier og er stabile i 3-5 dage.
4. Epitel monolags assay udlæsninger
- Måling af transepitelial elektrisk modstand (TEER)
BEMÆRK: TEER-målinger er bredt accepteret som en metode til at analysere tæt krydsdynamik og barrierefunktionsintegritet i biologiske modeller af fysiologiske barrierer, såsom epitelmonolag28,29. Stigning i TEER efter differentiering på grund af øget cellulær interaktion i tætte kryds kan måles ved hjælp af en manuel TEER-måler eller en automatiseret TEER-målerobot.- Måling af TEER ved hjælp af en manuel TEER-måler
- Rengør elektroden med 70% ethanol, og lad den lufttørre inde i biosikkerhedsskabet. Anbring elektroden i et rør, der indeholder BM. Tilslut elektroden til den manuelle TEER-måler. Drej funktionskontakten for at måle i ohm (Ω). Tænd for afbryderen .
- Anbring den korte elektrode i indsatsens apikale rum, mens den lange elektrode er placeret i basolaterrummet (figur 6A). Undgå at røre ved monolaget.
- Modstanden i blindprøven måles (R-emnet), og de resterende prøver (R-prøve) måles derefter på samme måde. Vask elektroden med BM mellem prøver med forskellige forhold. Rengør elektroden først med demivand og derefter med 70% ethanol og lad den lufttørre.
- Beregn TEER (Ω·cm2): [R-prøve (Ω) -R-emne (Ω)] × membranområde (cm2) (tabel 1 og figur 6B).
- Måling af TEER ved hjælp af en automatiseret TEER-målerobot (Table of Materials)
- Udfør automatiserede TEER-målinger, når du bruger HTS-systemer til HTS-plader med 96 brønde og 24 brønde, der indeholder membranindsatser. Brug forskellige elektroder til TEER-måling til begge typer (24- og 96- HTS-membranindsatser). Følg producentens anvisninger for at måle TEER ved hjælp af en automatiseret TEER-målerobot.
- Måling af TEER ved hjælp af en manuel TEER-måler
- Måling af epitelbarrierens integritet og permeabilitet
BEMÆRK: Denne protokol introducerer Lucifer Yellow permeabilitet fra det apikale til basolaterale rum som en indikation af monolagsintegritet. Dette afsnit beskriver fluorescensmåling i basolateralrummet efter et 1 timers inkubationstrin for at evaluere monolagspermeabilitet og dermed barriereintegritet. Denne måling er et slutpunktsassay og er især nyttigt, når man tester forbindelser for deres virkning på barrierens integritet.- Tø Lucifer Yellow op på is, og lad BM udligne til RT. For en 24-brønds plade af membranindsatser skal du forberede 5 ml arbejdsløsning på 60 μM Lucifer Yellow i BM.
BEMÆRK: Lucifer Yellow er lysfølsom. Forbered fortyndinger i mørke 1,5 ml sterile rør, og udfør alle trin med biosikkerhedsskabslyset slukket. - Fjern forsigtigt mediet fra membranindsatsernes basolaterale og apikale rum som beskrevet i trin 3.5.1. Hvis det ønskes, ridses et ubehandlet monolag ved hjælp af en pipettespids som en positiv kontrol for Lucifer Yellow-lækage gennem en beskadiget barriere.
- Tilsæt 150 μL BM med 60 μM Lucifer Yellow til hvert apikalt rum, og tilsæt 800 μL BM uden Lucifer Yellow til hvert basolateralt rum. Anbring pladen på en ryster ved 37 °C, 50 o/min i 60 min.
- I mellemtiden skal du udarbejde en standardkurve for Lucifer Yellow i BM startende med den arbejdsløsning, der er udarbejdet i trin 4.2.1. Fortynd 1:3 i hvert trin, indtil en koncentration på 3 nM er nået. Medtag en negativ kontrol (kun BM).
- Overfør 100 μL af hver standard i tre eksemplarer til en 96-brønd gennemsigtig plade. Efter 60 minutters inkubation skal du fjerne membranindsatserne og overføre 100 μL fra hver basolateral brønd (trin 4.2.3) i tre eksemplarer til den 96-brønd gennemsigtige plade. Mål fluorescens af pladen ved hjælp af en pladelæser ved en excitationsbølgelængde på 430 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm.
- Når du har korrigeret for den negative kontrolværdi (kun BM), skal du bruge standardkurveværdierne til at beregne Lucifer Yellow-koncentrationen i det basolaterale rum (endelig modtagerkoncentration (μM)).
- Beregn den tilsyneladende permeabilitetskoefficient (P-app) i henhold til følgende formel (figur 6C):
- For en 24-brønds plade indeholdende membranindsatser skal du bruge følgende formel:
- Tø Lucifer Yellow op på is, og lad BM udligne til RT. For en 24-brønds plade af membranindsatser skal du forberede 5 ml arbejdsløsning på 60 μM Lucifer Yellow i BM.
- Fastgørelse af monolag og forberedelse af paraffinblokke til histologi
BEMÆRK: Epitelmonolag kan anvendes til histologisk farvning til evaluering af deres cellulære sammensætning, polaritet og ekspression af forskellige proteiner af interesse, såsom junctionale proteiner, proliferation eller differentieringsmarkører. Dette afsnit beskriver paraffinblokforberedelse til histologisk farvning.- Fjern forsigtigt mediet fra membranindsatsernes basolaterale og apikale rum som beskrevet i trin 3.5.1.
- Vask monolagene ved at tilsætte 150 μL DPBS (uden Ca2+ og Mg2+) til hvert apikalt rum og 800 μL til hvert basolateralt rum. Aspirer forsigtigt DPBS igen, først fra basolateralrummet og derefter fra det apikale rum.
BEMÆRK: Det basolaterale rum forbliver tomt fra dette trin. - I en stinkhætte tilsættes 150 μL 4% paraformaldehyd til hvert apikalt rum og inkuberes i 30 minutter ved RT.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter skal du udføre alle handlinger i dette afsnit inde i en stinkhætte, da paraformaldehyd er giftigt. - Aspirer forsigtigt fikseringsmidlet fra de apikale rum i membranindsatserne, og bortskaf det som flydende halogenaffald.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter bortskaffes alt flydende affald som flydende halogenaffald. - Vask monolagene ved at tilsætte 200 μL DPBS (uden Ca2+ og Mg2+) til hvert apikalt rum, og aspirer forsigtigt DPBS igen. Gentag dette trin endnu en gang.
- Tilsæt 200 μL 25% ethylalkohol (EtOH) til hvert apikalt rum, og inkuber i 15 minutter ved RT. Efter 15 minutter aspirerer du forsigtigt 25% EtOH fra de apikale rum i membranindsatserne. Gentag med 50% EtOH-opløsning og derefter med 70% EtOH-opløsning.
- Tilsæt 200 μL 70% EtOH til hvert apikalt rum, og pakk pladen med parafilm. Opbevar den ved 4 °C indtil videre brug.
- Aspirer forsigtigt 70% EtOH, og brug en skalpel til forsigtigt at skære monolagsmembranerne fra indsatserne. Skær fra den basolaterale side, rundt om kanten af indsatsen.
- Forbered paraffinblokke efter standardproceduren.
- Når paraffinen stadig er varm, skal du tage monolaget fra paraffinen med en pincet og placere den på en forkølet overflade.
- Pas på ikke at beskadige monolaget. Skær monolaget i halve ved hjælp af et enkelt kantblad.
- Når paraffinen i bunden af kassetten begynder at størkne, skal du bruge opvarmet pincet til at placere de to monolagsdele i paraffinen ved siden af hinanden med den lige side nedad og i lodret retning for at sikre, at monolaget vil være lodret i coupéen.
- Når paraffinblokke er klar, skal du skære blokkene ved hjælp af et mikrotome og lave dias med 4 μm tykke sektioner efter standardproceduren. Sørg for, at monolagene ender lodret i coupéen.
- Udfør histologiske pletter som beskrevet tidligere 7,9. Brug hæmatoxylin og eosin (H & E), Ki67, mucin-2 (MUC2) og Alcian Blue til at vise henholdsvis generel morfologi, proliferative celler, slimproduktion og bægerceller (figur 6E).
BEMÆRK: Yderligere differentieringsmarkører, såsom lysozym til Paneth-celler, kan også bruges. Denne markør er ikke vist i figur 6E , da Paneth-celler er til stede i tyndtarmsepitel snarere end tyktarmsepitel.
- Udskilt proteinmåling i medium supernatant
- Lysozymniveauer måles i det apikale supernatant af ileale monolag (se figur 6D) ved hjælp af det sæt, der er anført i materialetabellen. Hvis det ønskes, måles niveauer af forskellige cytokiner og andre proteiner af interesse.
- Analyse af genekspression
- Kvantificering af virkningerne af differentieringsmediet på ekspressionen af epitelcellemarkørgener ved anvendelse af kvantitativ omvendt transkription-polymerasekædereaktion (qRT-PCR).
- Lys monolagene i 350 μL RNA-lysisbuffer efterfulgt af RNA-isolering i henhold til producentens anvisninger. Udfør cDNA-syntese og qPCR'er, som beskrevet tidligere 7,9, ved hjælp af cDNA-syntesesæt, mastermix og oligonukleotider, der er anført i materialetabellen.
- Kvantificering af virkningerne af differentieringsmediet på ekspressionen af epitelcellemarkørgener ved anvendelse af kvantitativ omvendt transkription-polymerasekædereaktion (qRT-PCR).
5. Opskalering til 96-brønds plader indeholdende membranindsatser
BEMÆRK: Forbered epitelmonolag til screeninger af lægemidler med højere gennemstrømning eller flere mellemstore tilstande ved hjælp af HTS 96-brøndplader indeholdende membranindsatser.
- Tilpasninger ved tilberedning af monolag i 96-brønds format
- Følg alle trin beskrevet i denne protokol for 24-brønds plader, der indeholder membranindsatser, der ændrer volumener og cellenumre til dem, der er beskrevet i tabel 1. Til fremstilling af monolag på plader med 96 brønde med membranindsatser fortsættes som beskrevet i punkt 3 med følgende forskelle.
- Ca. 9 brønde af en 6-brønds kulturplade med organoiddensitet repræsenteret i figur 3A er nødvendige for at så en fuld 96-brønds plade med membranindsatser. I trin 3.2.1 skal du forcoate membranerne med 67 μL 40x fortyndet ECM i DPBS (med Ca2+ og Mg2+).
- I punkt 3.5 overføres først den integrerede plade af membranindsatser til en anden plade med 96 brønde for at muliggøre medium forfriskning af både apikale og basolaterale rum.
- Følg alle trin beskrevet i denne protokol for 24-brønds plader, der indeholder membranindsatser, der ændrer volumener og cellenumre til dem, der er beskrevet i tabel 1. Til fremstilling af monolag på plader med 96 brønde med membranindsatser fortsættes som beskrevet i punkt 3 med følgende forskelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser et repræsentativt brightfield-billede af tarmorganoider efter optøning af dem fra en kryovial. Det er vigtigt at optø organoider ved høj densitet for at sikre optimal genopretning. Organoider er belagt i 24- eller 6-brønds plader i ECM-kupler på ca. 10 μL (figur 1B). De fleste normale tarmorganoider har en cystisk morfologi. Efter at være kommet sig efter optøningsprocessen vokser organoiderne til en større størrelse og er klar til at blive passeret efter 3-7 dage afhængigt af organoidkulturen (figur 1C). Efter høst af organoiderne og vask af ECM væk (figur 1D) kan organoider forstyrres til en lille størrelse ved mekanisk forskydning. Afhængigt af organoidernes morfologi (cystisk figur 1C, spirende figur 1E) kan organoider forstyrres ved hjælp af plast- eller glaspipetter (figur 1F). Organoider forstyrres i en suspension (figur 2A), som regelmæssigt skal overvåges under mikroskopet. Det er vigtigt at undgå at gøre dem for små, da grupper af celler skal forblive sammen for at sikre organoidvækst. Figur 2B viser organoiderne i ECM-dråber lige efter passaging. Generelt er cystiske organoider belagt med en relativt høj densitet, mens spirende organoider er belagt i en lav densitet; Dette kan dog variere mellem forskellige organoidkulturer.
Når du passerer organoider til fremstilling af monolag, skal du sørge for at plade dem med høj densitet og lade dem vokse i tre dage, så de er i optimale ekspansionsforhold. Organoider kan høstes til enkeltlagsforberedelse, når de er sammenlignelige med figur 3A i størrelse og densitet, hvor 6 brønde af en 6-brønds plade, der hver indeholder 200 μL organoidkupler, typisk er nok til at så en fuld 24-brønds plade af membranindsatser. Efter fremstilling af en enkeltcellesuspension med celledsociationsreagenset skal enkeltceller og små klumper af celler være synlige (figur 3B), og levende celler kan tælles (figur 3C). Pilene angiver døde celler farvet med trypanblå, som bør udelukkes fra tælling. Enkeltcellerne og de små klumper poder derefter i membranindsatserne som det ses i figur 4A. Monolagsdannelse er synlig efter 1-3 dage (figur 4B,C), og monolagene vil generelt være sammenflydende efter 3-6 dage afhængigt af organoidkulturen (figur 4D). Monolag forbliver i ekspansionsmediet, indtil de er sammenflydende, hvorefter de kan beriges med blandt andet enterocytter eller bægerceller ved hjælp af forskellige berigelsesmedier. Figur 5A viser et monolag, der blev dyrket i 8 dage i ekspansionsmedium (IEM). Når den beriges med enterocytter (eDM), ses en struktur som i figur 5B, mens monolag udsat for kombinationsmedium (cDM) viser en glattere struktur (figur 5C).
Monolagsdannelse kan kvantitativt efterfølges af måling af TEER (figur 6A). Et fuldstændigt sammenflydende monolag har en TEER-værdi på ~100 Ω·cm2, hvilket stiger til ~1000 Ω·cm2 , når det udsættes for et af differentieringsmedierne (figur 6B). Monolag under alle mellemstore forhold viser en lav tilsyneladende permeabilitet (P-app) til Lucifer Yellow (0,45 kDa). Lysozymsekretion af ileale monolag dyrket i IEM var højere end for monolag dyrket i IEM indtil sammenflydende og i yderligere 4 dage i eDM eller cDM (betegnet som + efterfølgende eDM eller cDM) (figur 6D). Monolag dyrket i IEM, IEM + efterfølgende eDM eller IEM + efterfølgende cDM viser forskellig morfologi, som det kan observeres med H & E-farvning (figur 6E). Mens tyktarmsorganoidafledte epitelmonolag i IEM- og cDM-medier har en glat apikal overflade, præsenterer enterocytdifferentierede monolag en invagineret apikal morfologi i fravær af Wnt. Ki67-positive proliferative celler kan kun påvises under ekspansionsbetingelser. Alcian Blue og MUC2 pletslim produceret af bægerceller, som visualiseres i monolagene differentieret i eDM og mere fremtrædende i cDM, når henholdsvis Wnt-, Notch- og EGF-signalering hæmmes (figur 6E). Ved differentiering falder proliferative celler, mens bægercelle og enterocytmarkørgenekspression øges i forhold til det, der observeres under IEM-betingelser, som vist ved lgr5, MUC2 og ALPI genekspressionskvantificering ved henholdsvis qRT-PCR (figur 6F).
Figur 1: Etablering af en tarmorganoidkultur fra frosne organoider. (A) Repræsentativt lysfeltbillede af en tarmorganoidkultur efter optøning. (B) ECM-kupler (50 μL) podet i hver brønd på en 24-brønds dyrkningsplade. (C) Repræsentativt billede af en normal tarmorganoidkultur klar til passaging. D) Repræsentativt billede af, hvordan man kontrollerer tilstedeværelsen af ECM i et 15 ml-rør, der indeholder organoider under et lysmikroskop. (E) Repræsentativt billede af en spirende tarmorganoidkultur klar til passaging. F) En 10 μL plastpipettespids monteret på en filterspids med lav retention på 1250 μL (til venstre) og en indsnævret glaspipette (højre) til mekanisk forskydning af organoider. Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: ECM = ekstracellulær matrix. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Behandling af tarmorganoider til vedligeholdelse eller forberedelse af monolag. (A) Repræsentativt billede af tarmorganoider efter mekanisk forstyrrelse. (B) Repræsentativt billede af en tarmorganoidkultur, der er podet efter passaging. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forberedelse af enkeltceller fra tarmorganoider til monolagspræparat. (A) Tarmorganoider klar til høst til monolagsforberedelse. (B) Enkeltceller og små klumper af celler efter enkeltcellepræparation. (C) Synlige enkeltceller og små klumper under optælling i et gitterkammer. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Monolagsdannelse efter såning af enkeltceller på membraner. (A) Enkeltceller lige efter såning på membraner. I gennemsnit er (B) monolaget omkring 50% sammenflydende 1-3 dage efter såning, (C) ~ 90% sammenflydende på dag 3-5, og (D) det komplette monolag er dannet omkring dag 4-7. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Berigelse af specifikke celletyper i monolaget. (A) Monolag efter 8 dage i IEM. (B) Monolag beriget med enterocytter efter 4 dage i IEM og yderligere 4 dage i eDM. (C) Monolag beriget med bægerceller og andre celletyper efter 4 dage i IEM og yderligere 4 dage i cDM. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: IEM = intestinal organoid ekspansionsmedium; eDM = enterocytdifferentieringsmedium; cDM = kombinationsdifferentieringsmedium. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: En række mulige udlæsninger ved hjælp af epitelorganoide monolag. (A) Elektrode i membranindsatsen for at måle TEER. (B) TEER-værdierne stiger i tid med en værdi på ~100 Ω·cm2 , når monolaget når sammenløbet. Efter berigelse af monolag med enterocytter eller en kombination af forskellige epitelceller øges TEER til 1000 Ω·cm2 eller højere. (C) Monolag under alle mellemstore forhold (IEM + 4 dages IEM/eDM/cDM) er uigennemtrængelige for Lucifer Yellow. (D) Ekspression af lysozym er højere i ileum monolag, når den dyrkes i ekspansionsmedium end i begge typer differentieringsmedium (IEM + 4 dages IEM/eDM/cDM). (E) Kolonmonolag viser forskellige morfologier, når de udsættes for forskellige mellemstore forhold (IEM + 4 dages IEM / eDM / cDM) som visualiseret af H & E, Ki67, Alcian Blue og MUC2 pletter. Som forventet er monolag dyrket i ekspansionsmedium meget proliferative, som det fremgår af Ki67-farvning. Monolag differentieret med eDM viser et søjleepitel uden proliferative celler. Monolag udsat for cDM er heller ikke proliferative og udvikler flere bægerceller. Skalabjælke = 100 μm. (F) Stamcelle (LGR5), bægercelle (MUC2) og enterocyt (ALPI) markørgenekspression i tyktarmsmonolag ved qRT-PCR. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk modstand; IEM = intestinal organoid ekspansionsmedium; eDM = enterocytdifferentieringsmedium; cDM = kombinationsdifferentieringsmedium; Papp = tilsyneladende permeabilitetskoefficient; LGR5 = leucinrig gentagelsesholdig G-proteinkoblet receptor 5; H&E = hæmatoxylin og eosin; AB = Alcian Blå; MUC2 = mucin-2; ALPI = intestinal alkalisk phosphatase; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Membranindsatser | ||
| Plader med 24 brønde | Plader med 96 brønde | |
| Membranoverflade (cm2) | 0.33 | 0.143 |
| Apikalt volumen (μL) | 150 | 100 |
| Basolateralt volumen (μL) | 800 | 300 |
| # Celler til frø pr. Brønd | 450,000 | 200,000 |
| HTS-plader med membranindsatser | KÆLEDYR | KÆLEDYR |
| Plader med separate indsatser | KÆLEDYR | NA |
| Lystætte plader med membranindsatser | ||
| Elektroder er forskellige for de to formater | Se tabellen over materialer | |
Tabel 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den generelle manipulation og vedligeholdelse af tarmorganoider samt fremstilling og mulig anvendelse af epitelmonolag afledt af disse organoider. Hidtil er monolag blevet fremstillet med succes fra tolvfingertarmen, ileum og forskellige regioner af tyktarmsorganoider afledt af normalt såvel som tidligere og aktivt betændt tarmvæv (upublicerede data). Anvendelsen af patientafledte organoide monolag letter undersøgelsen af barrierefunktion på en sygdoms- og patientspecifik måde samt undersøgelsen af patientspecifikke reaktioner på en række lægemiddelbehandlinger. Selvom cellelinjer kan danne differentierede og polariserede monolag, der indeholder intestinale enterocytter og bægerlignende celler, udtrykkes mange forskellige enzymer og transportører afvigende i disse cellelinjer, hvilket resulterer i reduceret kompleksitet og fysiologisk relevans 3,30. Organoidkultur er teknisk mere krævende og besværlig end cellekultur; organoider er imidlertid mere repræsentative for in vivo-situationen, mens cellelinjer gentagne gange har undladt at repræsentere vævsresponser i komplekse opsætninger.
Selv om primære vævsbaserede modeller kan være repræsentative for in vivo-ituationen, kræver de anvendelse af forsøgsdyreller adgang til humant materiale, hvilket er forbundet med begrænset tilgængelighed og etiske begrænsninger. Derudover har primært væv ingen eller begrænset udvidelsesevne og er ikke stabilt i udvidede eksperimentelle tidsrammer. Organoidteknologi kræver begrænset mængde primært væv for at etablere genetisk og fysiologisk stabile langsigtede ekspanderende kulturer, mens de stadig repræsenterer epitelvævskompleksitet og patientheterogenitet. Forskellige cellelinjer, såsom Caco-2, bruges ofte til at forberede epitelmonolag. Caco-2-celler tager 21 dage at etablere et polariseret epitelmonolag, der kan bruges til ethvert eksperiment30. Organoidafledte epitelmonolag fremstilles ud fra organoide enkeltceller som beskrevet i den nuværende protokol og danner efter 3-6 dage et polariseret epitel, der kan differentieres yderligere for at berige dem med enterocytter eller bægerceller.
Monolag er en statisk model, der mangler en mikrofluidisk strømning eller mekanisk strækning, som det ses i organer-på-en-chip. De giver dog mulighed for samdyrkning med (autologe) immunceller samt bakterier eller parasitter 17,18,19,31. Organoider er egnede til monolagsforberedelse, når de er i deres ekspansionsfase; for intestinale organoider er dette normalt 3 dage efter passaging. Dissociation af organoider til enkeltceller bør udføres hurtigt for at undgå langvarig eksponering for fordøjelsesenzymer. For at øge stamcellernes overlevelse efter fremstilling af en enkeltcellesuspension tilsættes den Rho-associerede proteinkinasehæmmer (ROCK-hæmmer), Y27632, til cellerne for at forhindre anoikis-induceret celledød32. Desuden er det afgørende at dyrke monolagene på en membran, der er forbelagt med ECM for at sikre, at de opretholder deres organoidegenskaber og polarisering. For funktionelle screeningsassays, der kvantificerer GI-epitelcelleresponser på eksterne stimuli, er det vigtigt, at organoidkulturer repræsenterer den krævede cellulære kompleksitet afhængigt af den type assay, der skal udvikles, og eventuelle udlæsninger.
Tarmorganoider repræsenterer forskellige epitelcelletyper, der er til stede in vivo, såsom stamme, TA, enterocyt, Paneth, bæger og enteroendokrine celler 4,5, og fremstilles og vedligeholdes under anvendelse af et defineret organoidmedium fremstillet som beskrevet i denne protokol. Enterocytdifferentiering kan fremmes ved dyrkning af organoider i yderligere fire dage ved hjælp af dyrkningsbetingelser, der dobbelt hæmmer Wnt-vejen ved fjernelse af Wnt-molekyler / aktivatorer og tilsætning af Porcupine-hæmmeren, IWP-2 (enterocytkolondifferentieringsmedium, eDM). Da slimproducerende bægerceller også er afgørende for barrierefunktionshomeostase, sigter en anden kulturbetingelse mod at producere en mere heterogen cellepopulation, der indeholder stam-, enterocyt- og bægerceller, hvor Notch- og EGF-veje hæmmes, mens Wnt-signalering holdes delvist aktiv ved at reducere Wnt3aCM til 10% (eller 0,1 nM for NGS-Wnt) i stedet for 50% (0,5 nM NGS-Wnt), der anvendes i IEM. I modsætning til eDM, som beriger til enterocytdifferentiering, understøtter denne anden betingelse tilstedeværelsen af flere celletyper og kaldes derfor kombinationsdifferentieringsmedium (cDM).
Anvendelser af organoidafledte monolag omfatter overvågning af epitelbarriereintegritet samt undersøgelse af tæt kryds og transportørekspression. Barrierens integritet, permeabilitet og transport kan analyseres ved hjælp af de udlæsninger, der er introduceret i denne protokol. Mens TEER måler ionisk konduktans gennem tætte kryds, måler permeabilitetsassayet vandgennemstrømning og dermed paracellulær permeabilitet gennem de tætte kryds28,29. Epitelbarrierens integritet, permeabilitet og transportfunktionalitet af monolagene kan evalueres ved at måle trafikken af forskellige fluorescerende eller radioaktive substrater på tværs af apikale og basolaterale rum i membranindsatserne. TEER-målinger muliggør kvantificering af barriereintegritet, hvilket viser en stigning i værdier, når de differentieres mod polariserede enterocytter og bægerceller, og et fald efter inducering af skade på monolagene.
Lucifer Yellow permeabilitetsassayet kan bruges til indledende barriereintegritetsvurdering samt bekræftelse af reduceret integritet efter at have fremkaldt skade på monolagene. Denne protokol introducerer Lucifer Yellow permeabilitet fra det apikale til basolaterale rum som en indikation af monolags integritet. Tilsvarende kan andre fluorescerende mærkede reagenser, såsom 4 eller 40 kDa dextran, anvendes til at evaluere øget paracellulær permeabilitet som følge af barriereskadefremkaldende midler. Fluorescerende mærkede substrater, såsom Rhodamin 123, kan anvendes til måling af aktiviteten af forskellige transportører, såsom P-glycoprotein-1. Fluorescensassayet beskrevet i denne protokol tillader måling af niveauerne af proteiner, såsom lysozym, der udskilles i det apikale rum. Reaktioner på skadeinduktion af proinflammatoriske cytokiner kan måles med disse udlæsninger såvel som de potentielle virkninger af barrieregenoprettende forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) offentlig-private partnerskaber (PPP) i den hollandske LSH-sektor med projektnummer LSHM16021 Organoider som nyt værktøj til toksikologimodellering til Hubrecht Organoid Technology (HUB) og HUB intern finansiering til afdeling for sygdomsmodellering og toksikologi. Vi takker laboratorierne Sabine Middendorp (Division of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) og Hugo R. de Jonge og Marcel J.C. Bijvelds (Institut for Gastroenterologi og Hepatologi, Erasmus MC, Rotterdam) for at yde indledende teknisk støtte til opsætning af monolag på membranindsatser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
- Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C.
- Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
- Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
- Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
- Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
