Summary
睡眠不足は、睡眠機能と調節を調査するための強力なツールです。我々は、睡眠排便装置を使用して ショウジョウバエ を奪い、剥奪によって誘発されるリバウンド睡眠の程度を決定するプロトコルを記述する。
Abstract
睡眠恒常性は、睡眠喪失後に観察される睡眠の増加であり、動物界全体の睡眠を識別するために使用される定義基準の1つである。その結果、睡眠不足と睡眠制限は、睡眠機能に関する洞察を提供するために一般的に使用される強力なツールです。しかし、睡眠不足の実験は、剥奪刺激自体が生理学と行動の観察された変化の原因である可能性があるという点で本質的に問題です。したがって、成功した睡眠不足技術は、動物を目覚めさせ、理想的には、意図しない結果を多数誘発することなく、堅牢な睡眠リバウンドをもたらすべきである。ここでは、ショ ウジョウバエのメラノガスターの睡眠剥奪技術について説明します。睡眠の無効化装置(SNAP)は否定的なジオタキシスを誘発するために10年代ごとに刺激を与える。刺激は予測可能であるが、SNAPは効果的に高い睡眠駆動を持つハエでも夜間睡眠の>95%を防ぐ。重要なことに、その後の恒恒動応答は、手による剥奪を用いて達成された応答と非常によく似ている。刺激のタイミングと間隔は睡眠喪失を最小限に抑え、刺激が生理学や行動に及ぼす非特異的な影響を調べるために変更することができる。また、睡眠制限や覚醒閾値の評価にも使用できます。SNAPは、睡眠機能をよりよく理解するために使用できる強力な睡眠破壊技術です。
Introduction
睡眠は動物では普遍的に近いが、その機能は不明のままである。睡眠恒常性は、睡眠不足後の睡眠の代償的増加、睡眠の定義性の特性であり、多くの動物1、2、3、4、5の睡眠状態を特徴付けるために使用されてきた。
ハエの睡眠は、睡眠喪失4、5に対する堅牢な恒育応答を含む、人間の睡眠と多くの類似点を有する。ハエの睡眠に関する数多くの研究は、睡眠不足を使用して、延長覚覚から生じる有害な結果を調べることによって睡眠機能を推測し、睡眠の恒食調節を制御する神経生物学的メカニズムを決定することによって睡眠調節を理解してきた。したがって、睡眠不足のハエは、学習と記憶6、7、8、9、10、11、12、構造可塑性13、14、15、視覚注意16、神経損傷17、18、交配および攻撃的な行動19、交配および攻撃的な行動の障害を示すことが示された。20、細胞増殖21、及び酸化ストレス22に対する応答を、23に挙げ、いくつか挙げる。さらに、リバウンド睡眠を制御する神経生物学的メカニズムの調査は、睡眠ホメオスタット8、9、23、24、25、26、27、28、29を構成する神経機構に関する重要な洞察を生み出した。 .最後に、健康な動物の睡眠機能に関する基本的な洞察を明らかにすることに加えて、睡眠不足の研究はまた、病気の状態で睡眠機能に関する洞察を知らせた30、31。
睡眠不足は間違いなく強力なツールですが、睡眠不足実験では、動物を目覚めさせるために使用される刺激によって誘発されるものと、拡張覚醒から生じる表記型を区別することが重要です。手の剥奪または穏やかな取り扱いによる睡眠不足は、一般的に、最小限の破壊的な睡眠剥奪のための標準を設定すると考えられている。ここでは、睡眠無効装置(SNAP)を使用してハエを奪う睡眠プロトコルについて説明します。SNAPは、10年代ごとにハエに機械的刺激を与え、負のジオタキシスを誘発してハエを目覚めさせる装置です(図1)。SNAPは、高い睡眠駆動8、32を持つハエであっても、夜間の睡眠の>98%のハエを効率的に奪う。SNAPは強打敏感なハエで較正されており、SNAP内のハエの攪拌はハエに害を与えません。SNAPによる睡眠不足は、手の剥奪によって得られたものと同等のリバウンドを誘発する7.SNAPは、したがって、覚醒刺激の影響を制御しながら、ハエを奪う睡眠を取る堅牢な方法です。
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Protocol
1. 実験準備
- 彼らは男性と女性のハエを分離し、バイアルに閉じるようにハエを収集します。
注:睡眠実験は、一般的に雌のハエで行われます。処女女性を収集することが重要です。嵌合雌は、データの分析を複雑にする幼虫に孵化する卵を産む。 - <20のグループで単一のセックスの家のハエ。
注:社会的に豊かな環境(>50のグループ)での住宅ハエは、睡眠ドライブ6、13リバウンド睡眠の潜在的に交わる測定値を調節します。さらに、社会的な豊かさに続いて、睡眠は数日で減少します 6.したがって、ベースライン睡眠は、リバウンド睡眠の分析を複雑にする安定ではない。<20のグループでハエを維持することは、この潜在的な混乱を回避します。 - 光と湿度制御された環境で3〜5日間バイアルにハエを入れておいてください。
注意:ハエの年齢と成熟度は睡眠に強く影響を与えます。睡眠は1日齢のハエで高く、4歳の3〜5日で安定します。ハエは通常12時間の光で維持されます:湿度50%で12時間の暗いスケジュール。
2. 睡眠記録用チューブの準備
メモ:睡眠は運動活動モニターを使用して監視されます。モニターは5つのmmの直径の管の個々に収容される32のハエを収容できる。典型的には、遺伝子型は16または32ハエのグループで分析される。
- 一方の端にフライフードでチューブの適切な数を準備します。
注意:食事と代謝は睡眠33、34に影響することが知られているので、彼らが飼育されたのと同じ食べ物にハエを置くことを特に重要です。 - チューブの端をワックスで密封します。
注:睡眠不足とリバウンドは5日間の実験であり、適切に密封しないと食べ物が乾燥する可能性があります。適切に密閉されたチューブでは、食品を10日以上維持することができる。したがって、チューブの端部がうまく密閉されていることを確認することが重要です。しかし、ハエは濡れた食べ物にこだわることもあります。したがって、実験開始の1〜2日前にチューブを作るのに役立ちます。 - 個別にウェイクを配置し、アスピレーターを使用して睡眠記録のための65ミリメートルの長いガラス管にハエを振る舞い、泡ストッパーでチューブの端を差し込みます。
注:ハエを睡眠記録のためにチューブに入れると、ハエはCO2 麻酔に再び曝されることはありません。吸引器は、一端をチーズクロスで覆ったゴムチューブから作られ、1 mLピペットチップに挿入されます。
3. 睡眠の記録
- 睡眠を監視するために活動モニターにチューブでハエをロードします。
注意:スナップ岩は-60°から+60°から~10 sごとに前後に監視します。モニターは~5.9sの-60°で保持されています。モニターを保持しているトレイが-60°から+60°に移動し、〜1 sが+60°から-60°に戻るには〜2.9 sかかります。サイクル長は、モータに供給される電圧を調整することで、必要に応じて変更できます。- チューブが正しい向きのアクティビティモニタに配置されていることを確認するように注意してください。正しい向きで、食べ物とチューブの端は、ハエが食品に押し込まないようにスナップの上部にあります。また、食べ物との終わりは睡眠記録のジャッキとモニターの側にある。これにより、アクティビティモニタをSNAPで正しく向け、同時に活動を監視しながら効率的な睡眠不足を実現できます。
- 活動モニターを記録室に設置し、睡眠を監視します。
- ベースラインスリープを推定するために、少なくとも2日間の睡眠を監視します。
注:ハエがアクティビティモニターにロードされる日は、通常、ハエがチューブに収容されることに適応できるように適応日として除外されます。ベースライン睡眠は、ハエがロードされた日の翌朝から始まる少なくとも2日間(48時間)記録されます。 - アクティビティ記録ソフトウェア(例えば、午前8時から午前8時まで)を使用して、特定の日のライトの時間から前日のライトまでの1分のビンのハエの運動活動数を保存します。
- 睡眠の発作のしきい値として5分の非活動を使用してカスタムマクロを使用して運動活動データから睡眠を推定する35.
注: 睡眠メトリックの数は、運動活動カウントから計算されます。これらは、24時間以上のmin /hで睡眠、24時間の合計睡眠時間、平均および最大昼時間と夜間睡眠の長さ36が含まれます。
4. 睡眠不足と回復
- ハエは可変長の時間(例えば、12時間、24時間および36時間)のために睡眠を奪われ得、回復睡眠はまた、様々な間隔(例えば、6時間、12時間、24時間および48時間)で評価することができ、実験的必要性によって回復の持続時間を決定する。睡眠回復は、睡眠の利得/損失プロットを使用して、または所定の間隔(例えば、6時間)にわたって回復した睡眠率を調べることによって視覚化することができます。
- 2つのベースライン日にわたって睡眠が安定している場合は、3日目に、活動モニターをSNAPに入れ、一晩の睡眠不足を引き起こします。
注:ハエは睡眠時間8、32、37、38の範囲にわたって堅牢な睡眠リバウンドを示しますが、睡眠は確実にリバウンド睡眠を評価するために安定している必要があります。ベースライン日数間の睡眠の差が100分±場合、睡眠は安定している。 - モニタホルダーピン、モニタコードを接続し、背面にフードを付けて最後に正しく向き、前面にプラスチックバリアを配置して、アクティビティモニタが所定の位置に固定されていることを確認します(図1)。
注:スナップは、カムが10 s(図1)に1回回転するように設計されています。プラスチック製のインサートは、装置が「上」の位置にあるときにチューブを押し戻すことによってチューブをリセットします。チューブをリセットすることは、すべてのチューブが各サイクルの開始時に全範囲の運動を持つことを保証するために重要です。 - アクティビティモニタを抜き、一晩の睡眠不足の後のライトの上にすぐにSNAPからモニターを取り出します。
注:睡眠不足を終了し、ハエは一晩の睡眠不足の12時間後のライトの直後に回復に置かれることが重要です。ハエを回復に入れるのに20〜30分の遅延でさえ、リバウンド睡眠の範囲を妨げる可能性があります。 - ハエを記録室に置き、回復睡眠を監視するために2日間(48時間)邪魔されません。
注:記録室が他の実験に使用されている場合は、ハエの回復を刺激しないように細心の注意を払う必要があります。 - 睡眠不足の量を計算します。個々のフライごとに、睡眠不足時に得られた睡眠とベースライン中の対応する時間の間の毎時差を計算します。時間ごとの差を合計して、失われた合計睡眠を計算します。
- 回復した睡眠の量を計算します。個々のフライごとに、回復中に得られた睡眠とベースライン中の対応する時間の時間ごとの差を計算します。得られた合計睡眠を計算するために、毎時の差を合計します。
注:ハエが実際に睡眠不足であるかどうかは経験的です。したがって、実験者は睡眠不足率を調べる必要があります。フライが十分な睡眠量を失っていない場合は、分析から除外することができます。これは他の睡眠不足のアプローチに必要な場合がありますが、SNAPに必要なことはほとんどありません。より一般的には、睡眠不足が開始される前に、所定のハエで睡眠が安定しない場合があります。睡眠が安定していない場合、恒常性は計算できません。睡眠不足の開始前 ±に計算された睡眠の最大100分の最大差を包含の候補として受け入れます。時折、個々のハエの睡眠は24時間の日に不均一に分配されます(例えば、一部の個人は日中に睡眠クォータの60〜70%を得ることができ、夜間に12時間奪われたときに24時間の睡眠クォータのごく一部しか失わないかもしれません)。これらのハエは別々に評価することができます。 - 各遺伝子型の回復期間の12時間、24時間、48時間にわたって(ベースラインに対して)回復された睡眠の平均割合を計算します。
- 睡眠データから、ベースラインの平均および最大の昼間の睡眠の長さと、各遺伝子型の回復日数を計算します。
注:ハエのリバウンド睡眠は、睡眠量の増加と回復日の睡眠深さの増加によって特徴付けられる。睡眠の深さの尺度として睡眠の統合が使用されます。覚醒閾値は、睡眠深さの尺度としても使用できます。
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Representative Results
広州S(Cs)は野生型株として使用した。ハエは12時間の光で維持された:12時間暗いスケジュール、そして睡眠は一晩で12時間奪われた。ベースライン日(bs)、睡眠剥奪日(sd)、および2つの回復日(rec1およびrec2)の睡眠プロファイルの検査は、ハエがSNAPで効果的に睡眠を奪われ、文献4、5で観察された報告と一致して日中に睡眠を回復したことを示唆している。ハエを起こしておく際のSNAPの効果は、睡眠不足時にハエが示す高い活動(300〜350カウント/h)にも見られます(図2B)。実際、睡眠不足時のハエの活動数を監視することは、剥奪プロトコルの有効性および/または睡眠ドライブの間接的な尺度の有用なバロメーターとなり得る。睡眠不足が効果がない場合、ハエは剥奪の期間中ほど活発ではありません。高い睡眠駆動下にあるハエは、各刺激の後すぐに眠りに落ち、35ほどチューブを横断しない。装置の傾きの角度と落下速度の両方が、ハエが効果的に目を覚まし続けることを保証するために重要です。各ラボでは、ばね(図1B)、カムのサイズと形状(図1Cと図1D、右)を調整することで、角度と速度を最適化できます。
睡眠不足と回復の有効性を定量的に推定するために、剥奪中に失われた睡眠を回復日に取り戻し、個々のフライごとに計算した(図2C)。重要なのは、欠乏日とベースライン日( 図2Cの0-12時間を参照)の間で、これらのハエでは睡眠が安定していることを示すベースライン睡眠に有意な変化はなかった。この12時間の間に睡眠の大きな違い(例えば、100分±)は、睡眠が安定していなかったことを示唆するであろう。SNAPは事実上、夜間の睡眠の98%>のハエを奪った。ハエは最初の12時間で睡眠の20%を回復し、以前に報告されたように、夜間に追加の睡眠を回復しませんでした。しかし、翌日、ハエは睡眠を回復し始め、48時間の回復を超えて睡眠の36%を回復した(図2D)。48時間を超える30〜40%の回復睡眠は、SNAPを使用して奪われた野生型ハエ睡眠にはかなり典型的です。
睡眠恒常性は、睡眠時間の増加と、剥奪後の回復期間中の睡眠深さの増加の両方によって特徴付けられる。昼間の睡眠の統合は、一般的に睡眠の深さの読み取りとして使用されます。睡眠の統合は、1 日の平均睡眠時間として評価できます (図 2E)。しかし、回復中に睡眠圧が消散するにつれて、日が進むにつれて平均睡眠時間が短縮されます。したがって、より機密性の高いメトリックを提供できる最大睡眠時間の変化も調べることもしばしば役に立ちます(図 2F)。
| 睡眠剥奪の方法 | 論文の総数 | % 論文 /テクニック | 平均回復評価 |
| スナップ | 52 | 37.14% | 33 ± 3 |
| ボルテクサー/ランダム揺れ | 49 | 35.00% | 18 ± 3 |
| 手の剥奪 | 9 | 6.43% | 36 ± 11 |
| 熱遺伝学SD | 15 | 10.71% | 36 ± 12 |
| 未指定 | 15 | 10.71% | 29 ± 10 |
表1:文献で使用される睡眠不足の異なる方法の調査。 睡眠不足を使用した論文はわずか116/254件でした。各方法を使用する論文の数 = 「論文の総数」。各方法を用いた論文の割合= "%論文/技法"。各方法について評価された平均回復の長さ = "平均回復評価"。SD - 睡眠不足。スナップ - スリープ無効装置
| SD の長さ | 総研究 |
| < 6 時間 | 12 |
| 6時間 | 23 |
| >6 h &< 12時間 | 17 |
| 12時間 | 69 |
| >12時間&<24時間 | 7 |
| 24時間 | 19 |
| > 24時間 | 9 |
| 慢性SD | 4 |
| 任意の SD | 160 |
表 2.異なる研究で行われる睡眠不足の長さ. SD - 睡眠不足
図 1.睡眠を無効にするアパラタス(スナップ)。)装置の正面図。SNAP は、8 つのアクティビティー・モニターを 2 行に収めることができます。ホルダーピンは、モニターを所定の位置に拘束します。脚は、装置を正しい向きに合わせて調整できます。 B)装置を前後に揺らすモーターとスプリングのクローズアップビュー。モーターは、装置を「上」の位置に傾けるカムを回し、スプリングを圧縮します。圧縮からのばねの解放は装置を「下」の位置に戻す。 C)左 -"下"位置にある装置の側面図。ホルダーピンはモニターを拘束します。モニタコードスロットは、モニタコードが所定の位置に保持されていることを保証します。パッドは、装置が「ダウン」位置にスナップする衝撃を緩和するのに役立ちます。右 - カムのクローズアップを閉じます。 D)「上」位置の装置の左側図。右 - カムの反時計回りの回転は、装置を「上」位置に傾けます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.実験結果。A)実験の4日間のCsの睡眠プロットは、ベースライン日(bs)、睡眠剥奪日(sd)、および2日間の回復(rec1およびrec2)を飛ぶ。B)睡眠不足の日のハエの平均運動活動数。ハエは12-24時間から睡眠を奪われた。C)睡眠不足と回復の時間経過。Csハエは12時間から24時間から睡眠を奪われ、24時間から72時間まで回復させた。SNAPは事実上、48時間にわたって部分的に回復した>98%の睡眠(n=12ハエ、時間の反復対策ANOVA、F[70,1470]=12.97、p<10-15)のハエを効果的に奪った。 D)48時間にわたって回復した睡眠率。ハエは12時間にわたって睡眠の20%を回復し、睡眠の約36%が48時間を超えて回復した。スリープは、ベースライン (p <0.05、t-test) と比較して、最初の回復日により統合されます。F)1 日の最大睡眠時間で測定した実験の各日の睡眠の統合。スリープは、ベースライン (p <0.05、t-test) と比較して、最初の回復日により統合されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエの睡眠は、2000年に独立して特徴づけられ、2つのグループ4、5によって特徴付けられていた。これらの先駆的な研究では、ハエは穏やかな取り扱い(すなわち、手の剥奪)によって睡眠を奪われ、一晩の睡眠不足に対する堅牢なホメオスタティック応答を示すことが示された。重要なことに、睡眠不足の実験では、動物を目覚めさせるために使用される方法の潜在的な交位効果を制御することが重要です。手の剥奪研究は、ハエを奪う睡眠の最小限の破壊的な手段としてハエホメオスタシスの研究のためのベンチマークを設定します。SNAPは、夜間の睡眠の>98%の睡眠のハエを効率的に奪い、重要なことに、手の剥奪4、7で得られたものと同等の睡眠リバウンドを誘発する。
ハエの睡眠を定義する基礎的研究以来、高スループットの方法でハエの睡眠恒常性を評価するための多くの方法が開発されています7,9,39,40,41.我々は、ハエの睡眠に関する約250の論文を調査し、睡眠調節または機能を評価するために睡眠不足を使用して報告されたこれらの公表された記事の約46%を発見した(表1)。多くの異なる方法が効果的にハエの睡眠リバウンドを誘発した。興味深いことに、睡眠のリバウンドを評価した研究のうち、睡眠不足と睡眠リバウンドに使用されるプロトコルは異なった。具体的には、睡眠不足の持続時間(表2)とリバウンド評価を行った期間(表1)の両方が大きく変動し、異なるプロトコルで得られた結果の比較を複雑にする可能性がある。ハエの睡眠リバウンドは、睡眠不足5後に最大48時間持続することが知られている。したがって、ホメオスタシスに対する睡眠操作の影響を十分に説明することは、48時間の回復期間にわたって恒常性リバウンドが評価される場合に最も良いと考えています。
日中にハエの睡眠を奪うことは、一貫して睡眠ドライブ4を増加させることはできないことに注意することが重要です。したがって、ライトオンで24時間睡眠剥奪プロトコルを開始し、翌日まで続けることは、ライトオフから始まる12時間の睡眠剥奪プロトコルと比較して、回復睡眠をさらに強化しません。実際には, 計算された睡眠のリバウンドは、夜間の睡眠に加えて非恒脈的に調節された昼間の睡眠を含むため、低い可能性があります。.昼間の睡眠不足がホメオスタティックリバウンドを誘発しないという観察は、しかし、睡眠剥奪の方法の潜在的な交和効果を制御するために使用することができる。したがって、SNAPで一晩奪われたハエ睡眠は、昼間7で同等の刺激を受けるハエと比較される。
総睡眠不足に使用されることに加えて、刺激の頻度を変更することによって、SNAPは慢性的に睡眠を制限し、断片化するために使用することができます7,42,したがって、ヒトの慢性的な睡眠喪失の状態を模倣.また、周波数を増加させるステップで刺激を送達することにより、SNAPを用いて覚醒閾値8を測定することもできる。したがって、SNAPは、ハエの睡眠を効果的に奪い、制限し、恒食応答を評価し、他の睡眠特性を測定するための簡単な方法です。
SNAPは標準的な実験室のフライインキュベーターに収まるが、間違いなく実験の一部ではないインキュベーターのハエを邪魔する。幸いなことに、SNAPは、他の進行中の実験を妨げることなく、ハエを奪って眠るために孤立した場所に置くことができます。回復睡眠は壊れやすいので、回復睡眠が静かな場所で行われることを確認するために注意する必要があります。
睡眠不足の補完研究, 遺伝的および薬理学的ツールは、ハエの睡眠を強化するために開発されました8,43,44.したがって、睡眠を双方向に容易に調節する能力は、睡眠調節および機能に関する深い洞察を提供し続けるフライ睡眠研究を可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、5R01NS051305-14および5R01NS076980-08をPJSに付与するNIHによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
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