Summary
Schlafentzug ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Schlaffunktion und -regulierung zu untersuchen. Wir beschreiben ein Protokoll, um Drosophila mit dem Schlafnullierungsapparat zu schlafen und das Ausmaß des durch Entzug induzierten Rebound-Schlafes zu bestimmen.
Abstract
Die Schlaföostase, die Zunahme des Schlafes, die nach Schlafverlust beobachtet wird, ist eines der definierenden Kriterien, um den Schlaf im gesamten Tierreich zu identifizieren. Infolgedessen sind Schlafentzug und Schlafeinschränkung leistungsstarke Werkzeuge, die häufig verwendet werden, um Einblicke in die Schlaffunktion zu geben. Nichtsdestotrotz sind Schlafentzugsexperimente von Natur aus problematisch, da der Entzugsreiz selbst die Ursache für beobachtete Veränderungen in Physiologie und Verhalten sein kann. Dementsprechend sollten erfolgreiche Schlafentzugstechniken die Tiere wach halten und im Idealfall zu einem robusten Schlafrebound führen, ohne auch eine Vielzahl unbeabsichtigter Folgen zu verursachen. Hier beschreiben wir eine Schlafentzugstechnik für Drosophila melanogaster. Der Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) verabreicht alle 10er Jahre einen Stimulus, um negative Geotaxis zu induzieren. Obwohl der Reiz vorhersehbar ist, verhindert der SNAP effektiv >95% des Nachtschlafs auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb. Wichtig ist, dass die nachfolgende homöostatische Reaktion der durch Handentzug erreichten sehr ähnlich ist. Das Timing und der Abstand der Reize können modifiziert werden, um den Schlafverlust zu minimieren und somit unspezifische Auswirkungen des Reizes auf Physiologie und Verhalten zu untersuchen. Der SNAP kann auch zur Schlafeinschränkung und zur Beurteilung von Erregungsschwellen eingesetzt werden. Der SNAP ist eine leistungsstarke Schlafunterbrechungstechnik, mit der die Schlaffunktion besser verstanden werden kann.
Introduction
Schlaf ist bei Tieren nahezu universell, aber seine Funktion bleibt unklar. Schlaföostase, die kompensatorische Zunahme des Schlafes nach Schlafentzug, ist eine definierende Eigenschaft des Schlafes, die verwendet wurde, um Schlafzustände bei einer Reihe von Tieren1,2,3,4,5zu charakterisieren .
Schlaf in der Fliege hat viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Schlaf, einschließlich einer robusten homöostatischen Reaktion auf Schlafverlust4,5. Zahlreiche Studien über schlaf in der Fliege haben Schlafentzug verwendet, um sowohl die Schlaffunktion abzuleiten, indem die nachteiligen Folgen eines längeren Aufwachens untersucht werden, als auch um die Schlafregulation zu verstehen, indem die neurobiologischen Mechanismen bestimmt werden, die die homöostatische Regulierung des Schlafes steuern. So wurde gezeigt, dass schlaflose Fliegen Beeinträchtigungen im Lern- und Gedächtnis aufweisen6,7,8,9,10,11,12, strukturelle Plastizität13,14,15, visuelle Aufmerksamkeit16, Erholung von neuronalen Verletzungen17,18, Paarung und aggressives Verhalten19, 20, Zellproliferation21und Reaktionen auf oxidativen Stress22,23, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus haben Untersuchungen der neurobiologischen Mechanismen, die den Rebound-Schlaf steuern, kritische Einblicke in die neuronale Maschinerie geliefert, die den Schlaf-Homöostaten8,9,23,24,25,26,27,28,29 bildet. . Schließlich haben Studien zur Schlafentzug nicht nur grundlegende Einblicke in die Schlaffunktion bei gesunden Tieren, sondern auch Erkenntnisse über die Schlaffunktion in erkrankten Zuständen30,31.
Während Schlafentzug unbestreitbar ein mächtiges Werkzeug ist, ist es bei jedem Schlafentzugsexperiment wichtig, Phänotypen, die aus längerem Aufwachen resultieren, von denen zu unterscheiden, die durch den Reiz induziert werden, der verwendet wird, um das Tier wach zu halten. Schlafentzug durch Händeentzug oder sanfte Handhabung gilt allgemein als Standard für minimal störenden Schlafentzug. Hier beschreiben wir ein Protokoll für schlafentziehende Fliegen mit dem Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Das SNAP ist ein Gerät, das alle 10Er Jahre einen mechanischen Reiz an Fliegen liefert und Fliegen wach hält, indem es negative Geotaxis induziert (Abbildung 1). Der SNAP entzieht Fliegen effizient >98% des Nachtschlafs, auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb8,32. Der SNAP wurde auf knallempfindliche Fliegen kalibriert, das Rühren von Fliegen im SNAP schadet den Fliegen nicht; Schlafentzug mit dem SNAP induziert einen Rebound, der mit dem durch Handentzug7vergleichbar ist. Der SNAP ist somit eine robuste Methode, um Fliegen zu schlafentziehen und gleichzeitig die Wirkung des erregenden Reizes zu kontrollieren.
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Protocol
1. Experimentelle Vorbereitung
- Sammeln Sie Fliegen, während sie sich in Fläschchen verwandeln und männliche und weibliche Fliegen trennen.
HINWEIS: Schlafexperimente werden häufig mit weiblichen Fliegen durchgeführt. Es ist wichtig, jungfräuliche Weibchen zu sammeln. Gepaarte Weibchen legen Eier, die zu Larven schlüpfen, was die Analyse der Daten erschwert. - Hausfliegen eines geschlechts geschlechts in Gruppen von <20.
HINWEIS: Die Unterbringung von Fliegen in einer sozial angereicherten Umgebung (Gruppen von >50) moduliert den Schlafantrieb6,13 potenziell verwirrende Messungen des Rebound-Schlafes. Darüber hinaus wird der Schlaf nach sozialer Bereicherung über einige Tage abnehmen6. Daher ist der Ausgangsschlaf nicht stabil, was die Analyse des Rebound-Schlafes erschwert. Das Halten von Fliegen in Gruppen von <20 vermeidet dieses potenzielle Verwechslung. - Halten Sie Fliegen in Fläschchen für 3-5 Tage in einer licht- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung.
HINWEIS: Alter und Reife von Fliegen beeinflussen den Schlaf stark. Der Schlaf ist bei einem Tag alten Fliegen hoch und stabilisiert sich um 3-5 Tage im Alter von4 Jahren. Fliegen werden typischerweise auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan bei 50% Luftfeuchtigkeit gehalten.
2. Vorbereitung von Schläuchen für die Schlafaufzeichnung
HINWEIS: Der Schlaf wird mit Bewegungsaktivitätsmonitoren überwacht. Ein Monitor kann 32 Fliegen aufnehmen, die einzeln in Rohren mit einem Durchmesser von 5 mm untergebracht sind. Typischerweise werden Genotypen in Gruppen von 16 oder 32 Fliegen analysiert.
- Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Röhrchen mit Fliegenfutter an einem Ende vor.
HINWEIS: Es ist bekannt, dass Ernährung und Stoffwechsel den Schlaf beeinflussen33,34, daher ist es besonders wichtig, Fliegen auf die gleiche Nahrung zu legen, auf der sie aufgezogen wurden. - Versiegeln Sie das Ende der Röhrchen mit Wachs.
HINWEIS: Schlafentzug und Rebound ist ein fünftägiges Experiment, und Lebensmittel können austrocknen, wenn sie nicht richtig versiegelt sind. In ordnungsgemäß verschlossenen Röhrchen können Lebensmittel 10 Tage oder mehr gehalten werden. Daher ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Enden der Rohre gut abgedichtet sind. Fliegen können jedoch auch an Nassfutter hängen bleiben. So hilft es, Röhren 1-2 Tage vor Beginn des Experiments herzustellen. - Wake, Behaving Fliegen einzeln in 65 mm lange Glasröhren zur Schlafaufzeichnung mit einem Absauger legen und das Ende der Schläuche mit einem Schaumstoffstopper verstopfen.
HINWEIS: Fliegen werden niemals wieder einer CO2-Anästhesie ausgesetzt, wenn Fliegen zur Schlafaufzeichnung in Schläuche gelegt werden. Der Absauger besteht aus Gummischläuchen, wobei ein Ende mit einem Käsetuch bedeckt und in eine 1 mL Pipettenspitze eingeführt wird.
3. Schlaf aufzeichnen
- Load fliegt in Röhren in Aktivitätsmonitore, um den Schlaf zu überwachen.
HINWEIS: Die SNAP-Felsen überwachen alle ~10 s von -60° bis +60° hin und her. Die Monitore werden bei -60° für ~5,9s gehalten; Es dauert ~2,9 s, bis sich das Fach, in dem die Monitore gehalten werden, von -60° auf +60° bewegt und ~1 s, um sich von +60° auf -60° zurückzubewegen. Die Zykluslänge kann nach Bedarf durch Anpassung der dem Motor zugeführten Spannung geändert werden.- Achten Sie darauf, dass die Röhren in der richtigen Ausrichtung in Aktivitätsmonitoren platziert werden. In der richtigen Ausrichtung befindet sich das Ende der Röhre mit Nahrung an der Oberseite des SNAP, um sicherzustellen, dass Fliegen nicht in die Nahrung gedrückt werden. Darüber hinaus befindet sich das Ende mit Essen an der Seite des Monitors mit der Schlafaufzeichnungsbuchse. Auf diese Weise können Aktivitätsmonitore im SNAP für einen effizienten Schlafentzug richtig ausgerichtet werden und gleichzeitig die Aktivität überwacht werden.
- Platzieren Sie Aktivitätsmonitore in der Aufzeichnungskammer, um den Schlaf zu überwachen.
- Überwachen Sie den Schlaf für mindestens zwei volle Tage, um den Ausgangsschlaf abzuschätzen.
HINWEIS: Der Tag, an dem Fliegen in Aktivitätsmonitore geladen werden, ist in der Regel als Anpassungstag ausgeschlossen, damit sich die Fliegen an die Unterbringung in Röhren anpassen können. Der Ausgangsschlaf wird für mindestens zwei volle Tage (48 Stunden) aufgezeichnet, beginnend mit dem Morgen nach dem Tag, an dem fliegen geladen werden. - Speichern Sie die Anzahl der Bewegungsaktivität von Fliegen in 1-Minuten-Behältern von der Zeit der Lichter an einem bestimmten Tag bis zur Beleuchtung am Vortag mit einer Aktivitätsaufzeichnungssoftware (z. B. von 8 Uhr morgens bis 8 Uhr morgens).
- Schätzen Sie den Schlaf aus den Bewegungsaktivitätsdaten mit benutzerdefinierten Makros unter Verwendung von 5 Minuten Inaktivität als Schwellenwert für einen Schlafanfall35.
HINWEIS: Aus den Zählungen der Bewegungsaktivität werden eine Reihe von Schlafmetriken berechnet. Dazu gehören Schlaf in min / h über 24 h, Gesamtschlafzeit in 24 h, durchschnittliche und maximale Tages- und Nachtschlaflängen36.
4. Schlafentzug und Erholung
- Da Fliegen für variable Zeiträume (z. B. 12 h, 24 h und 36 h) schlaflos werden können und der Erholungsschlaf auch in verschiedenen Intervallen (z. B. 6 h, 12 h, 24 h und 48 h) bewertet werden kann, bestimmen Sie die Dauer der Genesung durch experimentellen Bedarf. Die Schlaferholung kann mit einem Schlafgewinn-/-verlust-Diagramm oder durch Untersuchung des prozentualen Schlafes, der über ein vorgegebenes Intervall (z. B. 6 Stunden) wiederhergestellt wurde, visualisiert werden.
- Wenn der Schlaf an den beiden Basistagen stabil ist, platzieren Sie am dritten Tag Aktivitätsmonitore für Schlafentzug über Nacht im SNAP.
HINWEIS: Fliegen zeigen einen robusten Schlaf-Rebound über einen Bereich von Schlafzeiten8,32,37,38, aber der Schlaf muss stabil sein, um den Rebound-Schlaf zuverlässig zu bewerten. Der Schlaf ist stabil, wenn der Schlafunterschied zwischen den Basistagen ± 100 Minuten beträgt. - Stellen Sie sicher, dass Aktivitätsmonitore mit Monitorhalterstiften, eingesteckten Monitorkabeln und korrekt ausgerichteten Monitoren mit dem Ende mit Lebensmitteln auf der Rückseite und Kunststoffbarrieren vorne gesichert sind (Abbildung 1).
HINWEIS: Der SNAP ist so konzipiert, dass sich der Nocken alle 10 s dreht (Abbildung 1). Der Kunststoffeinsatz setzt die Schläuche zurück, indem er die Schläuche zurückdrückt, wenn sich das Gerät in der Position "oben" befindet. Das Zurücksetzen der Rohre ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle Rohre zu Beginn jedes Zyklus den vollen Bewegungsumfang haben. - Trennen Sie die Aktivitätsmonitore und nehmen Sie die Monitore sofort aus dem SNAP, sobald die Lichter nach schlafentzug über Nacht eingeschaltet sind.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Schlafentzug beendet wird und die Fliegen sofort nach 12 Stunden Schlafentzug über Nacht in die Genesung versetzt werden. Selbst eine Verzögerung von 20-30 Minuten beim Einsetzen von Fliegen in die Genesung kann das Ausmaß des Rebound-Schlafes beeinträchtigen. - Legen Sie Fliegen in eine Aufnahmekammer, wo sie zwei Tage (48 h) ungestört sind, um den Erholungsschlaf zu überwachen.
HINWEIS: Wenn die Aufnahmekammer für andere Experimente verwendet wird, muss besonders darauf geachtet werden, dass sich die Fliegen nicht stimulieren. - Berechnen Sie die Menge des verlorenen Schlafes. Berechnen Sie für jede einzelne Fliege die stündliche Differenz zwischen dem Schlaf, der während des Schlafentzugs erhalten wird, und der entsprechenden Stunde während des Ausgangswerts. Summieren Sie die stündlichen Differenzen, um den gesamten verlorenen Schlaf zu berechnen.
- Berechnen Sie die Menge des wiederhergestellten Schlafes. Berechnen Sie für jede einzelne Fliege die stündliche Differenz zwischen dem Schlaf, der während der Erholung erhalten wird, und der entsprechenden Stunde während des Ausgangswerts. Summieren Sie die stündlich gewonnenen Differenzen, um den gesamten Schlaf zu berechnen.
HINWEIS: Ob eine Fliege tatsächlich unter Schlafentzug liegt, ist empirisch. Daher sollte der Experimentator den prozentualen Schlafverlust untersuchen. Wenn die Fliege nicht genügend Schlaf verloren hat, kann sie von der Analyse ausgeschlossen werden. Obwohl dies für andere Schlafentzugsansätze erforderlich sein kann, ist es selten, wenn überhaupt, für den SNAP erforderlich. Häufiger kann der Schlaf in einer bestimmten Fliege vor Beginn des Schlafentzugs nicht stabil sein. Wenn der Schlaf nicht stabil ist, kann die Homöostase nicht berechnet werden. Wir akzeptieren eine maximale Differenz von ± 100 Minuten Schlaf, die vor Beginn des Schlafentzugs berechnet wurde, als Kandidaten für die Aufnahme. Gelegentlich ist der Schlaf einer einzelnen Fliege ungleichmäßig über den 24-Stunden-Tag verteilt (z. B. können einige Personen 60-70% ihrer Schlafquote während des Tages erhalten und somit nur einen kleinen Teil ihrer 24-Stunden-Schlafquote verlieren, wenn sie nachts 12 Stunden lang entzogen werden). Diese Fliegen können separat bewertet werden. - Berechnen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz des Schlafes (relativ zum Ausgangswert) über 12 h, 24 h und 48 h der Erholungsphase für jeden Genotyp.
- Berechnen Sie anhand von Schlafdaten die durchschnittliche und maximale Tagesschlafdauer auf der Basislinie und die Erholungstage für jeden Genotyp.
HINWEIS: Rebound-Schlaf bei Fliegen ist durch erhöhte Schlafmenge und erhöhte Schlaftiefe in den Erholungstagen gekennzeichnet. Die Schlafkonsolidierung wird als Maß für die Schlaftiefe verwendet. Erregungsschwellen könnten auch als Maß für die Schlaftiefe verwendet werden.
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Representative Results
Canton S (Cs) wurde als Wildtyp-Stamm verwendet. Fliegen wurden auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan gehalten und Schlaf für 12 Stunden über Nacht entzogen. Die Untersuchung der Schlafprofile von Cs-Fliegen am Basistag (bs), am Schlafentzugstag (sd) und an zwei Erholungstagen (rec1 und rec2)(Abbildung 2A)legt nahe, dass Fliegen im SNAP effektiv Schlaf entzogen wurden und der Schlaf während des Tages im Einklang mit den beobachteten Berichten in der Literatur4,5wiederhergestellt wurde. Die Wirksamkeit des SNAP bei der Wachhaltung von Fliegen zeigt sich auch in der hohen Aktivität (300-350 Zählungen / h), die Fliegen während des Schlafentzugs zeigen (Abbildung 2B). In der Tat kann die Überwachung der Aktivitätszahlen von Fliegen während des Schlafentzugs ein nützliches Barometer für die Wirksamkeit des Entzugsprotokolls und / oder ein indirektes Maß für den Schlafantrieb sein. Wenn der Schlafentzug unwirksam ist, sind Fliegen während der Entzugsphase nicht so aktiv. Fliegen, die unter hohem Schlaf stehen, schlafen nach jedem Reiz schnell ein und durchqueren die Röhre nicht so viel35. Sowohl der Neigungswinkel des Geräts als auch die Geschwindigkeit des Tropfens sind entscheidend, um sicherzustellen, dass Fliegen effektiv wach gehalten werden, ohne sie zu schädigen. Jedes Labor kann den Winkel und die Geschwindigkeit optimieren, indem es die Feder (Abbildung 1B) und/oder die Größe und Form der Nocke(Abbildung 1C und Abbildung 1D, rechts) anpasst.
Um die Wirksamkeit von Schlafentzug und Erholung quantitativ abzuschätzen, wurde für jede einzelne Fliege Schlaf berechnet, der während des Entzugs verloren ging und dann in den Erholungstagen wiedererlangt wurde (Abbildung 2C). Wichtig ist, dass es keine signifikante Veränderung des Ausgangsschlafs zwischen dem Entzugstag und dem Basistag gab (siehe 0-12 h in Abbildung 2C),was darauf hindeutet, dass der Schlaf bei diesen Fliegen stabil ist. Ein großer Unterschied im Schlaf in diesem Zeitraum von 12 Stunden (z. B. ± 100 Minuten) würde darauf hindeuten, dass der Schlaf nicht stabil war. Das SNAP beraubte Fliegen effektiv >98% ihres Nachtschlafs. Fliegen erholten sich in den ersten 12 Stunden ~ 20% ihres Schlafes und erholten sich während der Nacht nicht, wie zuvor berichtet. Fliegen begannen jedoch am nächsten Tag den Schlaf wiederherzustellen, so dass sie ~ 36% ihres Schlafes über 48 Stunden der Genesung erholten (Abbildung 2D). 30 - 40% erholter Schlaf über 48 Stunden ist ziemlich typisch für Wildtypfliegen, denen der Schlaf entzogen wird, der mit dem SNAP.
Die Schlaföostase ist sowohl durch eine erhöhte Schlafdauer als auch durch eine erhöhte Schlaftiefe während der Erholungsphase nach Entzug gekennzeichnet. Die Tagesschlafkonsolidierung wird häufig als Auslesung der Schlaftiefe verwendet. Die Schlafkonsolidierung kann als durchschnittliche Schlafdauer über den ganzen Tag beurteilt werden (Abbildung 2E). Da der Schlafdruck jedoch während der Genesung abgebaut wird, wird die durchschnittliche Schlafdauer im Laufe des Tages reduziert. Daher ist es häufig hilfreich, auch Änderungen in der maximalen Schlafdauer zu untersuchen, die eine empfindlichere Metrik liefern können (Abbildung 2F).
| Methode des Schlafentzugs | Gesamtzahl der Papiere | % Papiere / Technik | Durchschnittliche Wiederherstellung ausgewertet |
| SCHNAPPEN | 52 | 37.14% | 33 ± 3 |
| Vortexer/Zufälliges Schütteln | 49 | 35.00% | 18 ± 3 |
| Entbehrung der Hand | 9 | 6.43% | 36 ± 11 |
| Thermogenetische SD | 15 | 10.71% | 36 ± 12 |
| Unspezifiziert | 15 | 10.71% | 29 ± 10 |
Tabelle 1: Übersicht über verschiedene Methoden des Schlafentzugs, die in der Literatur verwendet werden. Nur 116 /254 Papiere verwendeten Schlafentzug. Die Anzahl der Papiere, die jede Methode verwenden = "Gesamtzahl der Papiere". Der Anteil der Papiere, die jede Methode verwenden = "% Papiere / Technik". Die mittlere Dauer der für jede Methode ausgewerteten Wiederherstellung = "Bewertete durchschnittliche Wiederherstellung". SD - Schlafentzug. SNAP - Sleep Nullifying Apparatus
| Länge der SD | Studien gesamt |
| < 6 Std. | 12 |
| 6 Std. | 23 |
| >6 h & < 12 h | 17 |
| 12 Uhr | 69 |
| >12 h & <24 h | 7 |
| 24 Uhr | 19 |
| > 24 h | 9 |
| Chronische SD | 4 |
| Beliebige SD | 160 |
Tabelle 2. Dauer des Schlafentzugs in verschiedenen Studien durchgeführt. SD - Schlafentzug
Abbildung 1. Der Schlaf-Nullifying APparatus (SNAP). A) Vorderansicht des Geräts. Der SNAP kann 8 Aktivitätsmonitore in zwei Reihen aufnehmen; Halterstifte halten die Monitore an Ort und Stelle. Die Beine können so eingestellt werden, dass sie helfen, das Gerät in der richtigen Ausrichtung zu positionieren. B)Nahaufnahme des Motors und der Feder, die das Gerät hin und her schaukeln. Der Motor dreht einen Nocken, der das Gerät zurück in die Position "nach oben" kippt und die Feder komprimiert. Durch Lösen der Feder aus der Kompression rastet das Gerät wieder in die "down"-Position ein. C) Links - Seitenansicht des Geräts in der "abwärts" Position. Halterstifte halten Monitore zurück; Ein Monitorkabelsteckplatz sorgt dafür, dass die Monitorkabel an Ort und Stelle gehalten werden. Pads helfen, den Aufprall des Geräts abzufedern, das in die "abwärts" Position rast. Rechts - Nahansicht der Kamera. D) Linke Seitenansicht des Geräts in der Position "oben". Rechts - Die Drehung des Nockens gegen den Uhrzeigersinn neigt das Gerät in die Position "nach oben". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Experimentelle Ergebnisse. A) Schlafdiagramme von Cs-Fliegen für die vier Tage des Experiments: der Basistag (bs), der Schlafentzugstag (sd) und zwei Tage der Genesung (rec1 und rec2). B) Durchschnittliche Bewegungsaktivität der Fliegen am Tag des Schlafentzugs. Fliegen wurden von den Stunden 12-24 schlaflos. C) Zeitverlauf von Schlafentzug und Erholung. Cs Fliegen wurden von den Stunden 12 - 24 schlaflos und durften sich von Stunde 24 - 72 erholen. Der SNAP entzog den Fliegen effektiv >98% Schlaf, der teilweise über 48 h wiederhergestellt wurde (n = 12 Fliegen, Wiederholte Messungen ANOVA für die Zeit, F [70.1470]= 12,97, p < 10-15). D) Prozentsatz des Schlafes, der sich über 48 Stunden erholt hat. Fliegen erholten sich ~ 20% ihres Schlafes über 12 h und ~ 36% ihres Schlafes über 48 h. E) Schlafkonsolidierung für jeden Tag des Experiments, gemessen an der durchschnittlichen Schlafdauer während des Tages. Der Schlaf ist am ersten Erholungstag im Vergleich zum Ausgangswert stärker konsolidiert (p <0,05, t-Test). F) Schlafkonsolidierung für jeden Tag des Experiments, gemessen an der maximalen Schlafdauer während des Tages. Der Schlaf ist am ersten Erholungstag im Vergleich zum Ausgangswert stärker konsolidiert (p <0,05, t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Schlaf in Drosophila wurde unabhängig voneinander im Jahr 2000 durch zwei Gruppen4,5charakterisiert. In diesen bahnbrechenden Studien wurde Fliegen durch sanfte Handhabung (d.h. Händeentzug) des Schlafes beraubt und gezeigt, dass sie eine robuste homöostatische Reaktion auf Schlafentzug über Nacht zeigen. Wichtig ist, dass es bei jedem Schlafentzugsexperiment entscheidend ist, mögliche verwirrende Auswirkungen der Methode zu kontrollieren, mit der das Tier wachgehalten wird. Handentzugsstudien setzen den Maßstab für Studien zur Fliegenöostase als minimal störendes Mittel zur Schlafentzugsfliege. Der SNAP entzieht fliegen effizient den Schlaf von >98% des Nachtschlafs und induziert vor allem einen Schlafrebound, der mit dem bei Händetzug4,7vergleichbar ist.
Seit den grundlegenden Studien, die den Schlaf bei Fliegen definieren, wurde eine Reihe von Methoden entwickelt, um die Schlafhomöostase bei Fliegen mit hohem Durchsatz zu bewerten7,9,39,40,41. Wir haben ~ 250 Artikel über Schlaf bei Fliegen befragt und festgestellt, dass ~ 46% dieser veröffentlichten Artikel berichteten, Schlafentzug zu verwenden, um die Schlafregulation oder -funktion zu bewerten (Tabelle 1). Eine Reihe verschiedener Methoden induzierte effektiv einen Schlafrebound bei Fliegen. Interessanterweise unterschieden sich von den Studien, die den Schlafrebound ausgewertet haben, die Protokolle für Schlafentzug und Schlafrebound. Insbesondere variierten sowohl die Dauer des Schlafentzugs (Tabelle 2) als auch die Dauer, für die der Rebound bewertet wurde (Tabelle 1), erheblich, was den Vergleich der mit verschiedenen Protokollen erzielten Ergebnisse möglicherweise erschwerte. Es ist bekannt, dass der Schlafrebound bei Fliegen bis zu 48 Stunden nach Schlafentzuganhält 5. Dementsprechend denken wir, dass eine gründliche Beschreibung der Auswirkungen einer bestimmten Schlafmanipulation auf die Homöostase am besten erhalten wird, wenn der homöostatische Rebound über eine Erholungsphase von 48 Stunden ausgewertet wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass der Entzug von Schlaffliegen während des Tages den Schlafantrieb nicht konsequent erhöht4. Daher würde das Starten eines 24-Stunden-Schlafentzugsprotokolls bei Licht und das Fortsetzen bis zum nächsten Tag den Erholungsschlaf im Vergleich zu einem 12-Stunden-Schlafentzugsprotokoll, das bei ausgeschaltetem Licht beginnt, nicht zusätzlich verbessern. Tatsächlich kann der berechnete Schlafrückprall niedriger sein, da er neben dem Nachtschlaf auch nicht-homöostatisch regulierten Tagesschlaf umfasst. Die Beobachtung, dass Schlafentzug am Tag keinen homöostatischen Rebound induziert, kann jedoch verwendet werden, um mögliche verwirrende Auswirkungen der Methode des Schlafentzugs zu kontrollieren. So werden Fliegen, denen über Nacht im SNAP der Schlaf entzogen wird, mit Fliegen verglichen, die tagsüber einen vergleichbaren Reiz erhalten7.
Neben der Verwendung für totalen Schlafentzug, durch Änderung der Frequenz des Reizes, kann der SNAP auch verwendet werden, um den Schlaf chronisch einzuschränken und zu fragmentieren7,42, wodurch zustände des chronischen Schlafverlusts beim Menschen nachgeahmt werden. Darüber hinaus kann der SNAP durch die Abgabe von Reizen in Schritten zunehmender Frequenz auch zur Messung von Erregungsschwellen verwendet werden8. Der SNAP ist somit eine einfache Möglichkeit, fliegen den Schlaf effektiv zu entziehen und einzuschränken, die homöostatische Reaktion zu bewerten und andere Schlafeigenschaften zu messen.
Der SNAP kann in einen Standard-Labor-Fliegeninkubator passen, stört aber definitiv Fliegen im Inkubator, die nicht Teil des Experiments sind. Glücklicherweise kann der SNAP an einem isolierten Ort platziert werden, um Fliegen zu schlafentziehen, ohne andere laufende Experimente zu stören. Da der Erholungsschlaf zerbrechlich ist, sollte darauf geachtet werden, dass der Erholungsschlaf an einem ruhigen Ort stattfindet.
Ergänzend zu Studien über Schlafentzug wurden genetische und pharmakologische Werkzeuge entwickelt, um den Schlaf bei Fliegen zu verbessern8,43,44. Die Fähigkeit, den Schlaf bidirektional zu modulieren, wird es der Fliegenschlafforschung ermöglichen, weiterhin tiefe Einblicke in die Schlafregulation und -funktion zu liefern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse 5R01NS051305-14 und 5R01NS076980-08 an PJS unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
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