Summary
Zebrafiskembryon/larver utvecklas externt och är optiskt transparenta. Bioackumulering av mikroplaster hos fisk i tidiga livsstadier bedöms lätt med fluorescerande märkta mikrober.
Abstract
Som en ny typ av miljöföroreningar har mikroplaster hittats i stor utsträckning i vattenmiljön och utgör ett stort hot mot vattenlevande organismer. Bioackumulering av mikroplaster spelar en nyckelroll i deras toxiska effekter. Som partikel skiljer sig dock deras bioackumuleringar från många andra föroreningar. Beskrivs här är en genomförbar metod för att visuellt bestämma ackumulering och distribution av mikroplaster i zebrafiskembryon eller larver med fluorescerande mikroplaster. Embryon utsätts för olika koncentrationer (0, 1, 1 och 10 mg/L) fluorescerande mikroplaster med en diameter av 500 nm i 120 timmar. Det framgår av resultaten att mikroplaster kan bioackumuleras i zebrafiskembryon/larver på ett koncentrationsberoende sätt. Före kläckning finns stark fluorescens runt den embryonala koreringen; medan i zebrafisk larver, äggula säck, perikardium och mag-tarmkanalen är de viktigaste ackumulerade platserna för mikroplaster. Resultaten visar upptag och internalisering av mikroplaster hos zebrafisk i tidiga skeden, vilket kommer att ge grund för att bättre förstå mikroplasternas inverkan på vattenlevande djur.
Introduction
Sedan första syntetiserade på 1900-talet används plast ofta inom olika områden, vilket resulterar i snabb tillväxt av global produktion1. Under 2018 producerades cirka 360 miljoner ton plast över hela världen2. Plasten i den naturliga miljön kommer att brytas ner till fina partiklar på grund av kemiska, fysiska eller biologiska processer3. I allmänhet definieras fina <5 mm i storlek som mikroplaster4. Mikroplaster är också konstruerade för specifika applikationer, såsom mikrober från kosmetiska produkter5. Som nästan permanenta föroreningar ackumuleras mikroplaster i miljön och har fått allt större uppmärksamhet från forskare, beslutsfattare och allmänheten1,6. Tidigare studier dokumenterade att mikroplaster kan orsaka negativa effekter hos fisk, såsom gastrointestinal skada7,neurotoxicitet8,endokrin störning9,oxidativ stress10 och DNA-skador11. Toxiciteten hos mikroplaster har dock inte avslöjats helt hittills12,13.
Zebrafiskembryon erbjuder många experimentella fördelar, inklusive liten storlek, extern befruktning, optisk transparens och stora kopplingar, och anses vara en idealisk modellorganism för in vivo som studerar föroreningars effekter på fisk i tidiga livsstadier. Dessutom behövs endast begränsade mängder testämnen för utvärdering av biologiska reaktioner. Här utsätts zebrafiskembryon för olika koncentrationer av mikroplaster (0,1, 1, 10 mg/L) i 5 dagar, och bioackumulering och distribution av mikroplaster i zebrafiskembryon/larver utvärderas. Detta resultat kommer att främja vår förståelse om toxiciteten hos mikroplaster till fisk, och den metod som beskrivs här kan potentiellt generaliseras för att bestämma ackumulering och distribution av andra typer av fluorescerande material i de tidiga livsstadierna av zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vuxna zebrafiskar kommer från China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Kina). Försöken genomfördes i enlighet med den nationella vägledningen "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018).
1. Insamling av embryon
- Underhåll fisk i 20 L glastankar med återcirkulerande kolfiltrerade kranvattensystem (pH 7.0 ± 0.2) vid en konstant temperatur (28 ± 0,5 °C) på en fotoperiod på 14:10 h ljus: mörk.
- Mata fisk två gånger dagligen med Artemia nauplii. Det rekommenderas att maten ges på max 3% fiskvikt per dag och bör ätas inom 5 min varje gång14.
- Överför välutvecklad vuxen zebrafisk (med kroppslängd på 3-4 cm) till gyttanken i ett förhållande av en hane till två honor natten före aveln.
OBS: Följande morgon börjar fisken leka efter början av ljuscykeln. - Samla ägg med en Pasteur-pipett. Skölj med 10% Hanks lösning flera gånger och kontrollera sedan för befruktning med ett mikroskop. Befruktade ägg genomgår klyvningsperioden efter ca 2 h efter befruktning (hpf) och kan tydligt identifieras15.
- Inkubera de befruktade embryona i en 500 ml bägare som innehåller 200 ml 10 % Hanks lösning med 1 % metylenblått för desinfektion vid 28 °C. Överskrid inte en lasthastighet på 1 embryo/2 ml lösning.
OBS: 10% Hanks lösning består av 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4 och 4,2 mM NaHCO3.
2. Beredning av mikroplastsuspensioner
- Sonicate stamlösningen av gröna fluorescerande märkta polystyrenpärlor (10 mg/ml) med nominell diameter på 500 nm (excitation/emission: 460/500 nm) i 10 minuter.
- Späd ut stamlösningen med 10% Hanks lösning för att producera önskade exponeringslösningar (0,1, 1 och 10 mg/L).
- Förbered alltid exponeringslösningarna för mikroplaster före exponering.
OBS: Försiktighet bör iakttas vid bedömning av mikroplasternas toxiska effekter, eftersom förekomsten av konserveringsmedel, såsom natriumazid, i de kommersiella partikelformuleringarna kan vara giftig för olika organismer 16. Därför bör dessa tillsatser avlägsnas eller redovisas i kontrollerna innan toxicitetsexperimentet.
3. Mikroplastexponering
- Välj slumpmässigt 6 nybefruktade embryon (4 hpf) och överför sedan till varje brunn med 6-brunnsplatta som innehåller 5 ml mikroplastlösningar med olika koncentrationer. Inkludera kontrollgrupperna som innehåller 10% Hanks lösning.
- Använd triplicate brunnar (med totalt 18 embryon) för varje behandling.
- Inkubera embryona under samma ljus: mörk cykel och temperatur som vuxna (se 1.2) och observera var 12: e timme. Avlägsna de döda omedelbart.
- Förnya mikroplastlösningarna 90% var 24:e timme. Under exponeringsperioden matas fisken inte.
OBS: I allmänhet börjar kläckningen av embryot vid 48 hpf och slutförs vid ca 72 hkf.
4. Bedömning av mikroplastdistribution
- Vid 24, 48, 72, 96 och 120 h efter befruktning, välj slumpmässigt embryon / larver (en från var och en av de tre replikaterna) och skölj med 10% Hanks lösning.
- Överför larverna till en Petri-maträtt och exponera för 0,016% trikain för anestesi.
- Bered stamlösningen av trikain: 4 mg trikainpulver löses upp i 100 ml dubbeldestillerat vatten och justera pH-talet till 7,0 med Tris-HCl (pH 9.0). Förvara lagerlösningen i frysen.
- Förbered arbetslösningen. Späd stamlösningen till önskad koncentration (0,016%) med 10% Hanks lösning vid rumstemperatur14.
- Ordna embryona / larverna och förbered för observation.
- Observera fisken med ett fluorescensmikroskop och bild med bildåtergivningsprogram.
- Kvantifiera fluorescensintensiteten hos fisk med ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fördelningen och ackumuleringen av fluorescerande mikroplaster visas i figur 1 och tabell 1. Ingen synlig fluorescens observeras i den oexponerade gruppen (kontroll). En ackumulering av fluorescens finns dock kring korition efter exponering för olika koncentrationer av mikroplaster (24 hpf). Grön fluorescens detekteras också i larver, och fluorescensnivåerna verkar öka på ett koncentrations- och tidsberoende sätt. Äggulasäcken, perikardiet och mag-tarmkanalen är de viktigaste ackumulerade platserna för mikroplaster (figur 2).
Figur 1: Fördelning av fluorescerande mikroplaster av polystyren i embryon/larver av zebrafisk (40×). Fisken provtas från kontrollgruppen, eller de grupper som utsätts för 500 nm mikroplaster vid 0,1, 1 och 10 mg/L. Skalstreck 100 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Platserna för mikroplastackumulering i zebrafisklarver (40×). Denna larva provtas från gruppen som utsätts för 500 nm mikroplaster vid 10 mg/L i 120 timmar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| koncentration | embryo | larv | ||||
| (mg/L) | 24 hkf | 48 hkf a | 48 hkf b | 72 hkf | 96 hkf | 120 hkf |
| Forts. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: Endast två embryon bedömdes. b: Endast en larva bedömdes. | ||||||
Tabell 1: Förändring av fluorescensnivån hos zebrafisk efter exponering för fluorescerande mikroplaster (n=3). På grund av chorions inverkan på absorptionen av fluorescerande mikroplaster är data uppdelade i två delar, embryonas (före kläckning) och larver (efter kläckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enligt riktlinjen om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål, såsom EU-direktiv 2010/63/EU, är djuretiktillstånd inte obligatoriskt för ett försök med tidiga livsstadier av zebrafisk förrän stadiet för att kunna utfodring självständigt (5 dagar efter befruktningen)17. Bästa välfärdspraxis är dock viktig för att optimera användningen av zebrafisk, och till exempel bör de humana metoderna för anestesi och dödshjälp vara oroande. Etyl 3-aminobenzoatmetansulphate (MS-222, eller trikain), det rutinmässigt använda medlet i de flesta laboratorier, används här för anestesi och dödshjälp.
Före observation under mikroskopet bör embryona och larverna sköljas eftersom mikroplasterna som adsorberas på den yttre ytan kan störa resultaten. Dessutom kan autofluorescensen i embryona/larverna, särskilt runt äggulasäcken, som har rapporterats ibland, vara problematisk. Förekomsten av många biomacromolecules, såsom flaviner, nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD), aromatiska aminosyror, lipofusciner, avancerade glykos slutprodukter och collage, kommer att avge ljus när de är upphetsade vid lämplig våglängd.
Det är viktigt att notera att som partikelförorening betraktas storleken på mikroplast som en av de avgörande faktorerna för biotillgänglighet ochtoxicitet 18. Den nominella diametern på mikroplast som används här är 500 nm, vilket är jämförbart med embryo chorions porstorlek (inom intervallet 300 nm till 1 μm)19. Därför förväntas dessa mikroplaster inte lätt passera genom zebrafisk chorion. Konsekvent finns det lite fluorescens synligt i embryona före kläckning (figur 1). Eftersom chorion kommer att fungera som en effektiv barriär mot partiklarna med stor storlek, kan avskolningsprocessen före exponering behövas. Chorion kan enkelt avlägsnas med hjälp av tången, men enzymatisk dechorionation med pronase föredras när embryona hanteras i bulk. Även om avkrionation kommer att öka biotillgängligheten och underlätta screening med hög genomströmning för ämnenas toxicitet, rekommenderas embryot med korition intakt att bedöma föroreningarnas ekotoxicitet när man överväger tillståndet för exponering i den "verkliga" världen.
Även om avsevärda ansträngningar har gjorts för att undersöka mikroplasternas negativa effekter på fisk, är den nuvarande kunskapen, inklusive bioackumuleringen, fortfarande begränsad eller till och med motstridig. Dessa inkonsekvenser mellan studierna beror främst på skillnaderna i egenskaper hos partiklar, inklusive storlek, densitet och ytegenskaper (till exempel ytladdning). Beteendet hos mikroplaster i lösningen är också avgörande för biotillgängligheten. Mikroplasternas fysikalisk-kemiska egenskaper bör spåras under exponeringstiden, och det aggregeringsfenomen som kan förekomma bör registreras. Faktum är att för de exponeringar som kräver att mikroplasterna avbryts under en längre period rekommenderas ultraljudsbehandling eller omrörning med en magnetisk stång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) och Programmet för Changjiang Scholars and Innovative Research Team vid University (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L.
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R.
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
