Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Окрашивание, визуализация и анализ грибковых, циркумваллятных и нёбных вкусовых рецепторов

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

В данной работе описываются методы подготовки тканей, окрашивания и анализа целых грибовидных, циркумваллятных и небных вкусовых рецепторов, которые последовательно дают целые и неповрежденные вкусовые рецепторы (включая нервные волокна, которые их иннервируют) и поддерживают отношения между структурами в вкусовых рецепторах и окружающим сосочком.

Abstract

Вкусовые рецепторы представляют собой наборы вкусовых трансдуцирующих клеток, специализированных для обнаружения подмножеств химических стимулов в ротовой полости. Эти трансдуцирующие клетки общаются с нервными волокнами, которые несут эту информацию в мозг. Поскольку вкусовые клетки непрерывно умирают и заменяются на протяжении всей взрослой жизни, среда вкусовых рецепторов является сложной и динамичной, требуя детального анализа ее типов клеток, их местоположения и любых физических отношений между ними. Подробные анализы были ограничены гетерогенностью и плотностью тканей языка, которые значительно снизили проницаемость антител. Эти препятствия требуют протоколов секционирования, которые приводят к расщеплению вкусовых рецепторов по секциям, так что измерения только аппроксимируются, а клеточные отношения теряются. Чтобы преодолеть эти проблемы, способы, описанные в настоящем описании, включают сбор, визуализацию и анализ целых вкусовых рецепторов и отдельных терминальных беседок из трех вкусовых областей: грибовидных сосочков, циркумваллятных сосочков и неба. Сбор целых вкусовых рецепторов уменьшает смещение и техническую изменчивость и может быть использован для представления абсолютных чисел по таким признакам, как объем вкусовых рецепторов, общая иннервация вкусовых рецепторов, количество трансдукирующих клеток и морфология отдельных терминальных беседок. Чтобы продемонстрировать преимущества этого метода, в данной работе приведены сравнения объемов вкусовых рецепторов и иннервации между грибовидными и циркумваллятными вкусовыми рецепторами с использованием общего маркера вкусовых рецепторов и этикетки для всех вкусовых волокон. Также предусмотрен рабочий процесс для использования разреженно-клеточной генетической маркировки вкусовых нейронов (с мечеными подмножествами вкусопередающих клеток). Этот рабочий процесс анализирует структуры отдельных вкусовых нервных беседок, номера типов клеток и физические отношения между клетками с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Вместе эти рабочие процессы обеспечивают новый подход к подготовке тканей и анализу как целых вкусовых рецепторов, так и полной морфологии их иннервирующих беседок.

Introduction

Вкусовые рецепторы представляют собой совокупность 50-100 специализированных эпителиальных клеток, которые связывают подмножества химических вкусовых стимулов, присутствующих в ротовой полости. Обычно считается, что вкусопередающие клетки существуют как типы1,2,3,4,5,6,7,8,9,первоначально основанные на критериях электронной микроскопии, которые позже были коррелированы с молекулярными маркерами. Клетки типа II экспрессируют фосфолипазу C-бета 2 (PLCβ2)2 и транзиторный рецепторный потенциал катионного канала, подсемейства M член 51 и включают клетки, которые трансдуцируют сладкий, горький и умами1,10. Клетки iii типа экспрессируют карбоангидразу 4 (Car4)11 и синаптосомально-ассоциированный белок 258 и обозначают клетки, которые в первую очередь реагируют на кислый вкус11. Клетки, которые передают соленость, не были так четко очерчены12,13,14,но потенциально могут включать клетки типа I, типа II и типа III15,16,17,18,19. Среда вкусовых рецепторов сложна и динамична, учитывая, что вкусопередающие клетки непрерывно переворачиваются на протяжении всего взрослого возраста и заменяются базальными прародителями3,20,21. Эти вкусообразующие клетки соединяются с псевдоуниполярными нервными волокнами из геникулятных и петросальных ганглиев, которые передают вкусовую информацию стволу мозга. Эти нейроны в основном были классифицированы на основе типа информации о вкусе, которую онинесут 22,23, потому что информация об их морфологии была неуловимой донедавнего времени 24. Клетки типа II сообщаются с нервными волокнами через модулятор гомеостаза кальция 1 ионных каналов25,тогда как клетки типа III общаются через классические синапсы8,26. Дальнейшая характеристика клеток вкусовых почек, включая трансдуцирующие линии клеточного типа, факторы, влияющие на их дифференцировку, и структуры соединительных беседок являются областями активного исследования.

Исследования вкусовых рецепторов были затруднены несколькими техническими проблемами. Гетерогенные и плотные ткани, составляющие язык, значительно снижают проницаемость антител для иммуногистохимии27,28,29. Эти препятствия потребовали протоколов секционирования, которые приводят к расщеплению вкусовых рецепторов по секциям, так что измерения либо аппроксимируются на основе репрезентативных секций, либо суммируются по секциям. Ранее репрезентативные тонкие сечения использовались для аппроксимации как объемных значений, так и количества преобразовательных клеток30. Более толстое последовательное сечение позволяет получать изображения всех участков вкусовых рецепторов и суммировать измерения из каждой секции31. Вырезание таких толстых участков и отбор только целых вкусовых рецепторов склоняет выборку в сторону более мелких вкусовых рецепторов32,33,34. Оценки иннервации нервов из секционированных вкусовых рецепторов были основаны на анализе чисел пикселей13,35,если количественно оценить их на всех36,37,38. Эти измерения полностью игнорируют структуру и количество отдельных нервных беседок, потому что беседки расщепляются (и обычно плохо маркируются). Наконец, хотя удаление эпителия позволяет окрашивать целые вкусовые рецепторы39,40,оно также удаляет нервные волокна вкусовых рецепторов и может нарушить нормальные отношения между клетками. Поэтому исследования структурных отношений во вкусовых рецепторах были ограничены из-за этого нарушения, вызванного подходами окрашивания.

Сбор всей структуры устраняет необходимость в репрезентативных секциях и позволяет определять абсолютные значения измерений объемов, количества клеток и морфологий структуры41. Этот подход также повышает точность, ограничивает смещение и уменьшает техническую изменчивость. Этот последний элемент важен, потому что вкусовые рецепторы показывают значительную биологическую изменчивость как в пределах34,42, так и в регионах43,44,а анализы вкусовых рецепторов позволяют сравнивать абсолютные числа клеток между контрольными и экспериментальными условиями. Кроме того, способность собирать неповрежденные вкусовые рецепторы позволяет анализировать физические отношения между различными трансдуцирующими клетками и связанными с ними нервными волокнами. Поскольку вкусопередающие клетки могут общаться друг с другом45 и взаимодействовать с нервными волокнами46,эти отношения важны для нормальной функции. Таким образом, условия потери функции могут быть вызваны не потерей клеток, а изменениями в клеточных отношениях. Здесь представлен метод сбора целых вкусовых рецепторов для достижения преимуществ абсолютных измерений для уточнения объемных анализов как для вкусовых рецепторов, так и для их иннервации, количества и формы вкусовых клеток, а также для облегчения анализа отношений между трансдуцирующими клетками и морфологии нервно-беседки. Два рабочих процесса также представлены после этого нового метода приготовления тканей: 1) для анализа объема вкусовых рецепторов и общей иннервации и 2) для разреженно-клеточной генетической маркировки вкусовых нейронов (с помеченными подмножествами клеток, преобразующих вкус) и последующего анализа морфологии вкусово-нервных деревьев, количества типов вкусовых клеток и их форм, а также использование программного обеспечения для анализа изображений для анализа физических отношений между трансдуцирующими клетками и между трансдукцией. клетки и их нервные беседки. Вместе эти рабочие процессы обеспечивают новый подход к подготовке тканей и анализу целых вкусовых рецепторов и полной морфологии их иннервирующих беседок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Уход за всеми животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами, установленными Политикой Службы общественного здравоохранения США по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Руководством NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию. Мыши Phox2b-Cre (штамм MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) или мыши TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg)были выведены с мышами-репортерами tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 были выведены с Phox2b-flpo48 и Ai65. Для инъекций 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) готовили EdU и рассчитывали дозы в соответствии с Perea-Martinez et al.49.

1. Подготовка материалов

  1. Приготовление растворов
    1. Растворите 5,244 г моноосновного фосфата натрия и 23,004 г двухосновного фосфата натрия в двухдистиллированной воде (ddH2O) на перемешиваемой пластине. Отрегулируйте рН до 7,4 и доведите общий объем до получения 1 л 0,2 М фосфатно-натриевого буфера (ПБ).
    2. Параформальдегид растворяют в ddH2Oв вытяжном шкафу путем нагревания при перемешивании на перемешиваемой пластине до достижения раствором 90°С. Добавьте 4 M Раствор NaOH по каплям, чтобы очистить параформальдегид, и процедите раствор с помощью вакуумной колбы Эрленмейера и керамического фильтра с фильтровальной бумагой. Добавьте равный объем 0,2 М ПБ и отрегулируйте рН до 7,4, чтобы получить 4% ПФА в 0,1 М ПБ.

2. Подготовка тканей

  1. Коллекция тканей
    1. Жертвоприношение мышей с использованием передозировки анестетика рабочим раствором, содержащим 10 мл стерильного физиологического раствора и 0,25 мл запасного раствора, содержащего 5 г 2,2,2-трибромэтанола и 5 мл трет-амилового спирта. Перфьюзиально с 4% ПФА в 0,1 М ПБ; удалить языки и небо.
    2. Изолируют циркумваллятивные вкусовые рецепторы с помощью коронального разреза, разделяющего задний язык, позади межмолярного возвышения; срезать вкусовые рецепторы бритвенным лезвием; а затем разделить передний язык пополам по средней линии. Постфиксируют ночью при 4 °C с 4% PFA в 0,1 М ПБ.
    3. Криозащита тканей в 30% сахарозы в течение ночи при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть заморожена в соединении с оптимальной температурой резания (OCT) с использованием 2-метилбутана, охлажденного в стакане на сухом льду и хранящегося при -80 °C, если процедура должна быть приостановлена здесь.
  2. Грибовидные вкусовые рецепторы
    1. Охладить 2-метилбутан в стакане на сухом льду при подготовке к этапу 2.2.8.
    2. Разморозить и промыть язык в 0,1 М ПБ. Поместите одну половину переднего языка, содержащую грибкообразные сосочки, на стеклянный предметный предметный предмет под рассекающим микроскопом.
    3. Используйте тупые щипцы и ножницы для рассечения, чтобы удалить мышцу. Используйте тупые щипцы, чтобы держать ткань открытой, когда язычный эпителий изогнут, и обеспечьте плоскую ориентацию, удерживая лезвия грубых ножниц для рассечения параллельно эпителию.
    4. Отбросьте вентральный неорогатый эпителий языка, так как он не содержит вкусовых рецепторов.
    5. Используйте тонкие ножницы для рассечения для более близкого рассечения к нижней стороне ороговевшего эпителия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно рассечь близко к эпителию, чтобы оставшаяся мышца имела равномерную толщину, а поверхность была гладкой, чтобы обеспечить равномерное проникновение антител. Следствием неравномерной толщины оставшейся мышцы будет неравномерное сечение на криостате, с воздействием эпителия в области с меньшим количеством мышц и более толстым слоем мышц для других областей, что препятствует проникновению антител.
    6. Используйте тупые щипцы, чтобы положить кусок эпителия в тканевую форму (мышечную сторону вниз) и убедиться, что он лежит ровно. Как только ткань станет плоской, добавьте каплю ОКТ в ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что кончик языка изогнут, может потребоваться сделать разрез в эпителии, где он изогнут, чтобы ткань могла лежать плоско.
    7. Поместите тканевую форму на металлическую основу (предварительно охлажденную в сухом льду) под рассекающий прицел. Продолжайте слегка постукивать по ткани щипцами, пока ОКТ не замерзнет, чтобы ткань замерзла как можно более плоской.
    8. Как только OCT замерзнет, быстро добавьте дополнительный OCT и поместите форму в стакан из 2-метилбутана (охлажденного в сухом льду) до замерзания.
    9. Секционирование криостата
      ПРИМЕЧАНИЕ: Криостат используется для тонкого удаления оставшейся подкожной клетчатки, которая может ингибировать проникновение антител(рисунок 1).
      1. Установите формы OCT на криостат и вырежьте секции размером 20 мкм. Соберите каждый участок и просмотрите его под световым микроскопом, чтобы оценить его близость к основанию эпителия(рисунок 1E - H).
      2. После того, как ткань сбрить с нижней стороны эпителия, разморозьте эпителий и промыть его дважды по 0,1 М ПБ на шейкере.
  3. Циркумваллатные вкусовые рецепторы
    1. Используя корональный разрез бритвенным лезвием, отделите циркумваллятный сосочек от переднего языка. Используйте два парасагиттальных разреза одним и тем же лезвием бритвы, чтобы удалить ткань, боковую к сосочку под рассекающим прицелом. Поместите сосочек в тканевую форму с помощью щипцов так, чтобы один боковой край циркумваллатного сосочки был обращен к нижней части тканевой формы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть заморожена в ОКТ с использованием 2-метилбутана, охлажденного в стакане на сухом льду и сохраненного при -80 °C, если процедура должна быть приостановлена здесь.
    2. Разрежьте ткань на 90 мкм плавающие участки на криостате.
  4. Вкусовые рецепторы на вкус
    1. Срежьте твердое небо спереди к соединению мягкого и твердого неба(рисунок 2). Используйте ножницы, чтобы отделить мягкое небо от подлежащей ткани, убедившись, что все оставшиеся фрагменты кости отрезаны. Удалить дополнительные мышцы и соединительную ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления вся оставшаяся ткань будет состоять из желез и рыхлой соединительной ткани, которые слегка прилипают к нижней стороне неба.
    2. Удерживайте небо тупыми щипцами и удалите оставшиеся железы и рыхлую соединительную ткань, аккуратно соскоблив их лезвием бритвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть заморожена в ОКТ с использованием 2-метилбутана, охлажденного в стакане на сухом льду и сохраненного при -80 °C, если процедура должна быть приостановлена здесь.

3. Иммуногистохимическое окрашивание

  1. Промыть салфетки с 0,1 М ПБ, 3 х 15 мин. Поместите ткани в пробирки по 1 мл с блокирующим раствором (3% ослиная сыворотка, 0,5% неионное поверхностно-активное вещество (см. Таблицу материалов),0,1 М ПБ) при 4 °C на ночь.
  2. Удаляют блокирующий раствор и инкубируют ткань в первичном антителе (кроличий анти-PCLβ2) в растворе антител (0,1 М ПБ, 0,5% неионное поверхностно-активное вещество) в течение 5 дней при 4 °C.
  3. Промыть с 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая промывка, и инкубировать во вторичном антителе против осла против кролика 488 (1:500) в растворе антител в течение 2 дней при 4 °C.
  4. Промыть по 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая стирка, и блокировать 5% нормальной кроличьей сывороткой в растворе антител.
  5. Стирка с 0,1 М ПБ, 4 x 15 мин. Инкубировать с анти-кроликом блокирующим антителом (20 мкг/мл) в растворе антител в течение 2 дней при 4 °C.
  6. Промыть с 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая промывка, а затем инкубировать с первичным антителом dsRed (кроликом), конъюгированным с флуоресцентной этикеткой (согласно инструкциям производителя) в растворе антител в течение 5 дней при 4 °C.
  7. Промывайте с 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая промывка, а затем инкубируйте с первичным антителом (козий анти-Car4 (1:500)) в растворе антител в течение 5 дней при 4 °C.
  8. Стирайте 0,1 М ПБ, 4 x 15 мин каждая стирка. Инкубировать с вторичным ослиным антителом против козы 647 (1:500) в растворе антител в течение 2 дней при 4 °C.
  9. Вымойте 0,1 М ПБ, 4 x 15 мин каждая стирка, установите (эпителиальную сторону вверх) в водных монтажных средах и поместите крышку поверх участка ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании антител из разных видов, как в случае только с кератином-8 и dsRed, добавьте все первичные антитела к раствору антител на этапе 3.2 и все вторичные антитела на этапе 3.3, прежде чем переходить к шагу 3.9.

4. Конфокальная визуализация и деконволюция

  1. Делайте конфокальные изображения с помощью конфокального микроскопа с объективом 60x (числовая диафрагма = 1,40), 4 мс/ пиксель, зумом 3, Калманом 2 и размером 1024 x 1024. Выберите шаг размером 0,47 мм по оси Z. Для захвата иннервации в сосочек используйте зум 2,5, если поле зрения с зумом 3 слишком узкое, чтобы захватить всю иннервацию в сосочек.
  2. Чтобы деконволюциировать изображения, обратите внимание, что некоторые настройки будут автоматически импортироваться вместе с изображением; поэтому заполните оставшиеся детали для модальности, объектива, числовой диафрагмы, иммерсионной среды, образца среды и флуорофоров, захваченных на изображении. Затем выберите 3D Deconvolution.

5. Анализ изображений

  1. Вкусовая рецептор и объем иннервации
    1. Импортируйте деконволютированные стеки изображений в программное обеспечение для анализа изображений на основе пикселей (см. Таблицу материалов)для определения объема вкусовых рецепторов и объема общей иннервации во вкусовой рецепторе.
      1. Снимите флажок Громкость в главном меню Объекта.
      2. Выберите Добавить новые поверхности в меню Объект. Выберите Пропустить автоматическое создание, изменить вручную,а затем выберите Контур.
      3. Нажмите «Выбрать» и наблюдайте за стрелкой, появляющейся как +, чтобы проследить границу вкусового рецептора. Переместите слайсер и наметьте вкусовой рецептор в каждой оптической секции. Как только контуры будут завершены, нажмите «Создать поверхность».
      4. Наблюдайте за объектом объема вкусового рецептора, который теперь появляется в главном меню «Объект». Найдите объем вкусового рецептора в разделе Инструменты.
    2. Объем иннервации внутри вкусового рецептора
      1. Щелкните значок карандаша под объектом вкусового рецептора, затем выберите «Замаскировать все».
      2. В раскрывающемся меню выберите флуоресцентный канал, соответствующий метке нервного волокна. Установите флажок Создать дубликат канала.
      3. Установите флажок Устанавливать вокселы на внешней поверхности на:, и введите 0 в поле.
      4. Наблюдайте за новым каналом, появляющимся в окне «Настройка дисплея», который является неизмененным дубликатом флуоресцентного канала, выбранного во вкусовой рецепторе.
      5. В главном меню «Объект» выберите «Создать новую поверхность». Снимите флажок Пропустить автоматическое создание, редактировать вручную.
      6. Дважды нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу.
      7. Нажмите «Удалить»,затем нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить поверхность, которая представляет собой объем нервных волокон, присутствующих во вкусовой рецепторе. Чтобы найти значение громкости, выберите Инструменты в меню «Объект нервного волокна» и выберите «Громкость» в раскрывающемся меню.
    3. Объем иннервации к сосочку
      1. Создайте объем вкусового рецептора, как описано в разделе 5.1.
      2. Выберите значок карандаша под объектом вкусового рецептора, затем выберите «Маскировать все».
      3. В раскрывающемся меню выберите флуоресцентный канал, соответствующий метке нервного волокна. Установите флажок Создать дубликат канала.
      4. Установите флажок Установить вокселы внутри поверхности на: и введите 0 в поле. Нажмите кнопку ОК.
      5. Создайте поверхность, щелкнув Добавить новую поверхность. Выберите Сегментировать только интересующую область.
      6. Нажмите на синюю стрелкуи увеличьте Z-значение так, чтобы интересующая область начиналась у основания вкусового рецептора.
      7. Дважды нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу.
      8. Нажмите «Удалить»,затем нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить поверхность, которая представляет собой объем иннервации к сосочку. Чтобы найти значение громкости, выберите Инструменты в меню «Объект нервного волокна» и выберите «Громкость» в раскрывающемся меню.
    4. Анализ контактов терминальной беседки
      1. Подготовка изображения
        1. Перейдите в меню Правка и выберите Обрезать 3D. Обрежьте изображение со всех сторон, удалив пространство за пределами вкусового рецептора.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка как можно ближе к вкусовому рецептору без удаления какой-либо соответствующей структуры - любое избыточное изображение удлинит время обработки.
        2. Выберите Изменить в главном меню, нажмите Изменить тип данных. Выберите Кому: 32-битная плавающая точка в раскрывающемся меню.
        3. Выберите Добавить новые поверхности в меню Объект. Нажмите «Пропустить автоматическое создание», отредактируйте вручную,выберите «Контур»,а затем перетащите положение фрагмента вправо, чтобы найти общее количество оптических фрагментов.
        4. Сгенерируйте изометрические вокселы и убедитесь, что вместо того, чтобы вокселы были прямоугольниками (0,0691 x 0,0691 x 0,474) как XxYxZ, соответственно, вокселы составляли 0,0691 x 0,0691 x 0,0691, разделив прямоугольники на кубы с идентичными значениями интенсивности флуоресценции, что и исходный прямоугольный воксель. Выберите Свойства изображения. Затем разделите значение Z для Voxel Size на значение X или Y (= 0,474/0,0691) и умножьте это значение на количество срезов (оптических секций), найденных на предыдущем шаге.
        5. Вернитесь в Раздел Правка в главном меню и выберите Ресамплинг 3D.
        6. Замените значение Z (количество фрагментов) вновь вычисляемым значением.
      2. Создание автоматических поверхностей на основе флуоресценции
        1. Нажмите «Добавить новую поверхность» еще раз, чтобы добавить новую поверхность, снимите флажок «Сегментировать только интересующую область»и нажмите «Далее».
        2. В раскрывающемся меню Исходный канал выберите канал для одного из типов ячеек, преобразующих вкус. Снимите флажок Smooth и перейдите к следующему шагу.
        3. Не изменяйте на следующем экране ничего, что показывает диапазон интенсивности флуоресценции, присутствующей на изображении. Нажмите на синюю стрелку внизу еще раз, чтобы перейти к следующему шагу.
        4. Нажмите «Удалить»,затем нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить поверхность.
        5. Перейдите в меню «Объект» в левой части экрана, где появится завершенная поверхность ячейки и будет называться чем-то универсальным, таким как Surface 2. Дважды щелкните имя поверхности, чтобы назвать ее в соответствии с тем, что представляет собой метка.
          ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае генерируемая поверхность основана на ячейке, меченной PLCß2.
        6. Если вместо поверхности есть точки, под меню в левом нижнем углу щелкните Поверхность вместо Центральной точки. Затем при появлении запроса нажмите кнопку ОК.
        7. Повторите шаги 5.3.2.1-5.3.2.5 для других маркеров клеток, преобразующих вкус, и маркера нервных волокон.
        8. Сохраните (экспортируйте) ход выполнения.
        9. Нажмите на ячейку типа Surface в главном меню. В меню этого объекта нажмите «Инструменты»,затем нажмите «Преобразование расстояния».
        10. Дождитесь появления всплывающего окна под названием XTDistanceTransformation. Выберите Внешний объект поверхности. Запишите новый канал, который появляется в меню «Коррекция дисплея» с именем «Расстояние до поверхности».
        11. Выберите поверхность нервного волокна в меню «Объект». Нажмите на значок карандаша, а затем Маскировать все.
        12. В появившемся раскрывающемся меню выберите новое имя расстояние канала до поверхности. Запишите новый канал, который появится в окне «Коррекция дисплея» с именем «Маскированное расстояние до поверхности».
        13. Создайте новый объект с помощью главного меню Объект. Снимите флажок Сегментировать только интересующую область и нажмите на синюю стрелку. Выберите Маскированное расстояние до канала PLCß2 и снимите флажок Smooth.
        14. На следующем экране проверьте, есть ли какие-либо области, где клетки, передающие вкус, находятся на самом маленьком расстоянии от нервных волокон, различимых этим программным обеспечением. Для этого установите предел в 0,01-0,11 мкм, чтобы проверить наличие флуоресценции любой рецепторной клетки, близкой к нервным волокнам.
        15. Введите 0,01 в зеленом поле слева, чтобы установить нижнее пороговое значение, нажмите клавишу TAB. Затем нажмите на красную кнопку и введите 0,11, чтобы установить верхний порог. Нажмите tab, а затем щелкните синюю стрелку внизу, чтобы перейти к следующему шагу.
        16. Нажмите «Удалить», а затем зеленую двойную стрелку, чтобы закончить.
        17. Переименуйте эту поверхность в пределах 0,01-0,11 от PLCß2 в меню «Объект». Выберите В пределах 0,01 - 0,11 поверхности PLCß2 в меню «Объект».
        18. Выберите карандаш, затем нажмите «Маска всех». Выберите красный канал (нервное волокно) в раскрывающемся меню и нажмите кнопку «ОК». Запишите новый канал, который появится в окне «Коррекция дисплея» под названием «Маскированный CHS2».
        19. Нажмите на название канала; переименовать канал В пределах 0.01 - 0.11 от PLCß2.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Это флуоресцентный канал, который представляет собой дубликат красного флуоресцентного канала, присутствующего в создаваемой поверхности.
        20. Нажмите на белый в середине селектора цвета. Выберите цвет, контрастирующий с цветами структур.
        21. Экспортируйте (т.е. сохраните) файл на этом этапе.
        22. Повторите шаги 5.4.2.9-5.4.2.21 для других маркеров клеток, преобразующих вкус.
        23. Экспортируйте (т.е. сохраните) файл на этом этапе.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проанализировать близость одного меченого типа клеток к другому, просто замените поверхность нервного волокна на шаге 5.4.2.11 (и следующих шагах) объектом интереса и эквивалентными компонентами, которые относятся к каждой последующей стадии.

6. Реконструкция нейронной беседки и количественная оценка абсолютного числа клеток

  1. Трассировка и анализ беседки терминала
    1. Откройте файл деконволютированного изображения в программном обеспечении для анализа 3D-векторных изображений (см. Таблицу материалов),выберите «Трассировка»,нажмите «Нейрон»,а затем нажмите «Дендрит».
    2. Прокрутите до основания вкусового рецептора в стеке изображений. Проследите каждое волокно до конца во время прокрутки стека изображений.
    3. Находясь на конце ветви, щелкните правой кнопкой мыши на конце и выберите Окончание. В точках ветвления щелкните правой кнопкой мыши и выберите Разделяющий узел.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет отслеживать одну ветвь до конца, а затем возвращаться к точке раздвоения и отслеживать другую ветвь с помощью программы, распознающей, что эта трассировка все еще принадлежит тому же нейрону.
    4. Сохраните файл данных в формате . файл DAT, который затем можно открыть для анализа в программном обеспечении для векторного анализа 3D-изображений.

7. Количественная оценка номера ячейки

  1. Количественно оцените меченые ячейки вкусовых рецепторов в любом программном пакете для анализа изображений, если отдельные маркеры для преобразования типов клеток, закрепленных в z-положении, могут быть размещены на ядерном уровне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Окрашивание лингвального эпителия антителами к dsRed и кератину-8 (общий маркер вкусовых рецепторов) помечено как целыми вкусовыми рецепторами, так и всей иннервацией вкусовых рецепторов у мышей Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (рисунок 3A). Визуализация этих вкусовых рецепторов от их пор до их оснований дала изображения плоскости x-y с самым высоким разрешением(рисунок 3A,B). Контурная функция программы визуализации на основе пикселей использовалась для очерчивания периферии вкусового рецептора в каждом участке(рисунок 3B),а затем для создания поверхности(рисунок 3C),которая представляла объем вкусового рецептора. Маскировка (или дублирование) флуоресценции, связанной с меткой вкусовой почки только внутри поверхности, создала новый канал, который содержал только эту флуоресценцию и устраняла любое окрашивание сосочков, скрывающее вкусовой рецептор(рисунок 3D). Флуоресценцию нервного волокна внутри вкусовой палочки маскировали(рисунок 3E)и использовали для автоматического создания поверхности, представляющей объем иннервации внутри нее(рисунок 3F). Аналогичный подход был также использован для измерения объема вкусовой почки и связанной с ней иннервации в циркумваллятных вкусовых рецепторах(рисунок 3G). Репрезентативные данные измерений не выявили корреляций между объемами вкусовых почек и объемами иннервации ни в грибовидной(p = 0,115), ни в циркумваллятной(p = 0,090) областях измерения(рисунок 3H).

Введение низкой дозы тамоксифена у мышей TrkBCreER:tdTomato вызывает рекомбинацию генов и маркировку небольшого количества нейронов, так что вкусовые рецепторы иннервируются от нуля до нескольких меченых концевых беседок (нейронная часть в вкусовой рецепторе). Лингвальный эпителий окрашивали с использованием анти-dsRed антитела для терминальных беседок и анти-Car4 (кислый) и анти-PLCβ2 (сладкий, горький и умами) антител для вкусообразующих клеток(рисунок 4A). Для трассировки меченых терминальных беседок использовалась программа векторного анализа изображений(рисунок 4B). Ортогональные высоты беседок, связанных с синей и зеленой трассировками, составляли 33,4 мкм(рисунок 4C)и 32,4 мкм(рисунок 4D)соответственно. Измерения 3D Convex Hull (т.е. протяженность терминальной беседки в пределах вкусового рецептора) для синей терминальной беседки составили 644,0 мкм3 и 3647,0 мкм3 для зеленой беседки. Дендрограмма для зеленой трассировки показана на рисунке 4E с длинами ветвей, измеренными в микронах. Зеленая беседка имела семь концов ветвей и общую длину 183,4 мкм. Количественная оценка абсолютных чисел клеток PLCβ2+ и Car4+ показала, что этот вкусовой рецептор имел 17 клеток PLCβ2+ и две клетки Car4+. Использование программного обеспечения для визуализации на основе клеточных пикселей для определения наиболее близкой близости между нервными волокнами и клетками, передающими вкус, показало, что из в общей сложности 19 вкусовых преобразующих клеток во вкусовом рецепторе синяя терминальная беседка (показанная красным цветом на рисунке 4F,G)находилась в пределах 200 нм (разрешение светового микроскопа) от светло-голубой клетки Car4+ (белые области обозначены стрелками на рисунке 4G). Концевая беседка, связанная с зеленой трассировкой, показана в пурпурном цвете(рисунок 4F и рисунок 4H)и находится в пределах 200 нм как светлых, так и темно-синих ячеек Car4+ (белые области на рисунке 4H). Поскольку следующая ближайшая ячейка к этим беседкам находилась на расстоянии более 200 нм, существовал немаркированный воксель, разделяющий две структуры.

Делящиеся клетки-предшественники были помечены с помощью инъекций EdU в дни 0, 1 и 3, а ткани были собраны на 4-й день. Окрашивание грибовидных вкусовых рецепторов цельным кератином-8 и EdU показало, что меченые EdU клетки присутствуют как внутри, так и снаружи вкусовых рецепторов(рисунок 5A-C). Отдельные клетки EdU+/keratin-8+ (чирковые и желтые) и ядра EdU+/keratin-8-ядер (фиолетовый и пурпурный) были сегментированы(рисунок 5B,C). Показанная темно-синяя клетка была кератин-8+ и имела вытянутую форму, соответствующую зрелым вкусопередающим клеткам. Эти поверхности показаны со вкусовым рецептором, ориентированным от поры до основания(рисунок 5B)и вдоль длинной оси вкусовойрецептора (рисунок 5C). Каждая структура может быть просмотрена в отдельных оптических срезах путем маскировки флуоресценции внутри каждой структуры(рисунок 5D-F). Пурпурные и фиолетовые ядра находятся за пределами границы кератина-8+ вкусовой рецептора, обозначенной белым пунктирным контуром(рисунок 5D,E). Желтые, чирковые и синие клетки находились в пределах вкусовойрецептора (рисунок 5D-F). Отдельные ячейки, преобразующие вкус, могут быть реконструированы с использованием пиксельного программного обеспечения для визуализации либо маркировки Car4(рисунок 6A-C),либо маркировки PLCβ2(рисунок 6D-F). Для измерения ближайшей близости между клетками было использовано программное обеспечение для визуализации на основе пикселей, которое показало, что ячейка Car4+ (та же ячейка, как показано на рисунке 6B)находилась в пределах 200 нм от одной ячейки PLCβ2+(рисунок 6G,зеленый). Область, где клетки находились в пределах 200 нм друг от друга, показана белым цветом(рисунок 6G)и обозначена белыми стрелками. Следующая ближайшая ячейка находилась на расстоянии более 200 нм и показана желтым цветом на рисунке 6H,I в двух разных ориентациях. Рисунок 7 демонстрирует выделение и анализ иннервации, заканчивающейся внутри сосочка (но вне вкусовой рецептора) и включает ее распределение вокруг вкусовой рецептора и ее удаленность от эпителия.

Figure 1
Рисунок 1:Подготовка лингвального эпителия для окрашивания грибовидных вкусовых рецепторов. (А) Вид разрезанного языка с эпителием и мышцами, помеченными перед любым рассечением. (B) После того, как достаточное количество мышц было удалено, на нижней стороне эпителия остается только небольшое количество оставшейся мышцы. В дополнение к оценке прогресса рассечения путем просмотра разрезанной стороны эпителия,(C)укладка эпителия плоско на стеклянную горку под рассекающим прицелом показывает, что некоторые участки ткани равномерно полупрозрачны (фиолетовый прямоугольник); из этой области было удалено достаточно мышц. Напротив, фиолетовые стрелки указывают области слева, где есть больше мышц, которые необходимо удалить. Как только вся нижняя сторона эпителия будет похожа на область в фиолетовом прямоугольнике, переходите к следующему шагу. Послетого, как части эпителия были заморожены мышечной стороной вниз, дополнительные мышцы и пластинки удаляются в виде тонких участков с помощью криостата. Когда сечение завершено, оставшийся эпителий тонкий и полупрозрачный. (E-F) Серийные секции (20 мкм) собирали на стеклянном предметном стекле, и каждую секцию рассматривали под флуоресцентным микроскопом перед вырезанием следующей секции. Значительно ниже эпителия мышечные волокна ориентированы в нескольких направлениях, так что мышечные волокна присутствуют как в поперечном сечении, так и вдоль мышечного волокна(E,красный прямоугольник). Последовательные участки в E-F демонстрируют переход от мышечных волокон, ориентированных в нескольких направлениях(E,красный прямоугольник), к мышечным волокнам, ориентированным в основном в одном направлении(F,красный прямоугольник), что свидетельствует о границе мышцы-ламины проприи. Другая область того же куска ткани (желтые прямоугольники) демонстрирует, что, когда мышечные волокна ориентированы в одном направлении, следующий участок, скорее всего, даст соединительную ткань, потому что вся мышца была удалена из этой области. Синие прямоугольники представляют собой нижнюю сторону эпителия. Если на участке присутствуют вкусовые рецепторы(G,красные стрелки), было удалено слишком много ткани. В идеале сечение завершается, когда нижняя сторона эпителия (но без вкусовых рецепторов) видна на удаленных участках(F,желтый прямоугольник). Хотя области с мышечными волокнами, ориентированными в одном направлении(E,желтый прямоугольник и F,красный прямоугольник), также подходят для секционирования, следует избегать областей, где мышечные волокна ориентированы в нескольких направлениях(E,красный прямоугольник). (G) После того, как секции включают нижнюю сторону эпителия / пластинки проприи, можно только вырезать несколько дополнительных секций, прежде чем слишком много эпителия будет удалено, а секции включают вкусовые рецепторы. Наиболеераспространенная ошибка выявляется криостатными участками, где эпителий виден на краю ткани, мышца видна внутри эпителия, а внебиржевая / разреженная мышца присутствует посередине. Чаще всего это происходит из-за того, что ткань не укладывается ровно на дно тканевой плесени перед замерзанием или недостаточным уплощением тупыми щипцами. Шкала стержней в А-С = 1 мм; шкала стержней в E, F, H = 100 мкм; шкала в G = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Рассечение неба для окрашивания. (А)Небо сначала рассекали с помощью тонких ножниц лезвия, чтобы разрезать твердое небо,затемс помощью тех же ножниц для отделения мягкого неба от подлежащей соединительной ткани. После удаления ткани из ротовой полости все оставшиеся ткани удалялись ножницами. В этот момент все, что может остаться, это железы на задней части мягкого неба. Бритвенный клинок использовался, чтобы аккуратно соскоблить эти железы. Показаны(C)задняя и(D)эпителиальная поверхность завершенного рассечения неба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Измерение объема в цельных вкусовых рецепторах. (A) Цельные вкусовые рецепторы были изображены от вкусовой поры до основания вкусового рецептора таким образом, что плоскостью самого высокого разрешения является плоскость x-y. Каждый оптический срез просматривался в программном обеспечении для анализа изображений на основе пикселей, а функция контура использовалась для ручного очертания периферии вкусового рецептора, окрашенного кератином-8. (B)Приведен пример одного оптического среза. (C)Положение этого репрезентативного участка вдоль длинной оси вкусового рецептора показано желтой линией. После того, как каждый оптический участок был очерчен, была создана поверхность, представляющая собой объем вкусовой рецептора (белый). Маскировка или дублирование флуоресцентного канала, соответствующего вкусовой рецепторке (кератин-8 в D)или tdTomato-меченой иннервации (псевдо-окрашенный синий в E)в объеме, представляющем вкусовую рецептор. Флуоресценция в вкусовой рецепторе в(E)использовалась для создания поверхности, представляющей объем иннервации внутри вкусовой рецептора(F, синий). (G) Аналогичный подход был применен к цельно-маунтным циркумваллятным вкусовым рецепторам, изображенным в той же ориентации, что и грибовидный вкусовой рецептор в A. (H) Измерение объема грибовидных и циркумваллятных вкусовых рецепторов и их соответствующего объема иннервации показало, что нет никакой корреляции между вкусовой рецепторкой и объемом иннервации для вкусовых рецепторов, отобранных для любого региона. Шкала стержней в форматах A-D, F = 4 мкм; шкала в G = 5 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Ohman-Gault et al.50. Сокращения: FF = грибовидный; CV = циркумваллат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Репрезентативные концевые беседки в грибовидных вкусовых рецепторах с использованием разреженноклеточной генетической маркировки. (A)Цельномонтный вкусовой рецептор окрашен маркерами вкусовых преобразователей Car4 (белый) и PLCβ2 (зеленый). (B) Этот вкусовой рецептор имеет две маркированные концевые беседки, которые показаны с удалением вкусового рецептора после реконструкции волокон. (C) Голубая беседка имеет 6 концов ветвей и ортогональную высоту во вкусовой рецепторе 33,4 мкм и(D)зеленая беседка имеет 7 концов ветвей. (E)Дендрограмма, соответствующая зеленой беседке, обеспечивается длиной каждого сегмента в микрометрах. (Ф-Н) Измерялось расстояние между структурами. (Ф-Г) Синяя трассировка в C была сегментирована и показана красным цветом. (G) Области, где эта терминальная беседка находится в пределах 200 нм от светло-синей ячейки Car4+, обозначены белыми стрелками. (Ф, Н) Беседка терминала, представленная зеленой реконструкцией, изображена пурпурным цветом. (H) Пурпурная беседка (связанная с зеленой трассировкой в 4B, D) находится в пределах 200 нм как темных, так и светло-синих клеток Car4+. Шкала в А, В = 4 мкм; шкалы в F-H = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Цельные крепления могут использоваться для отслеживания включения новых ячеек вкусовых рецепторов. Мышам вводили EdU для маркировки разделительных прародителей в дни 0, 1 и 3 и приносили в жертву на 4-й день. (А, Б) Клетки, помеченные EdU (зеленым), могут быть идентифицированы как вокруг, так и внутри вкусовой рецептора, который помечен кератином-8 (A, белый, B, серый). (B, C) Отдельные EdU-меченые, кератин-8+ клетки внутри вкусовой рецептора и кератин-8-, EdU-меченые ядра сегментированы снаружи вкусовой рецептора. (D-F) Флуоресценция внутри каждой структуры, сегментированной в A-B, была замаскирована и может быть замечена в поперечном сечении. Периметр вкусовой рецептора очерчен белой пунктирной линией(D-F). (D) Желтая клетка находится внутри вкусовой рецептора и имеет маркировку EdU и кератин-8+. Пурпурное ядро находится вне вкусовой рецептора и представляет собой кератин-8-. (E) Клетка чирка находится внутри вкусовой рецептора и помечена EdU и кератином-8+. Фиолетовое ядро, меченое EdU, представляет собой кератин-8- и снаружи вкусовой рецептора (белая стрелка). (F)Синяя клетка представляет собой кератин-8+ и удлиненная, согласующаяся со зрелыми вкусопередающими клетками. Шкала стержней в А-С=3 мкм; шкала стержней в D = 2 мкм; шкала баров в E, F = 4 мкм. Аббревиатура: EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6:Формы целых клеток вкусовых рецепторов могут быть проанализированы вместе с их отношениями с другими клетками вкусовых рецепторов. (A-F). Сегментация отдельных клеток вкусовых рецепторов для создания поверхностей изолирует отдельные клетки вкусовых рецепторов, облегчая четкую визуализацию. Отдельные(A-C)Car4+ и(D-F)PLCβ2+ клетки показывают вариации в отдельных формах клеток. (G)Было определено, что ближайшая ячейка PLCβ2+ к ячейке Car4+ в B находится в пределах 200 нм (в одном небольшом месте 0,5мкм2, обозначенном стрелкой). Следующая ближайшая ячейка находилась на расстоянии более 300 нм и отличалась как отдельная структура от сегментированной ячейки Car4+. (H, I) Следующая ближайшая ячейка была сегментирована; а маскированная флуоресценция показана желтым цветом. Три ближайшие точки для следующей ближайшей ячейки (желтый) обозначены стрелками в H, I. Шкала стержней в А-С = 3 мкм; шкала стержней в D, E = 4 мкм; шкала в F = 2 мкм; шкалы шкалы в G-I = 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7:Количественная иннервация к сосочку. (A) Некоторые метки для вкусовых нейронов также помечают иннервацию к сосочку. (Б) Иннервация внутри вкусовой рецептора отделяется от иннервации вне вкусовой рецептора путем сегментации вкусовой рецептора (как описано на рисунке 3),(C),маскируя иннервацию внутри вкусовой рецептора (красный), а затем маскируя иннервацию только снаружи вкусовой рецептора (темно-синий). Объем иннервации к вкусовому рецептору (красному) составил 1649,6мкм3. Иннервация вне вкусового рецептора будет включать вкусовые волокна под сосочком, которые не должны включаться в количественную оценку иннервации к сосочку. (D)Флуоресценция иннервации к сосочку была замаскирована (светло-голубая). Объем иннервации к сосочку составил 121,8мкм3. Шкала стержней в A-D = 4 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка подхода к последовательному сбору и окрашиванию целых вкусовых рецепторов из трех вкусовых областей полости рта (грибовидная, циркумвалляция и небо) обеспечивает значительные улучшения для анализа вкусовых клеток, отслеживания вновь включенных клеток, иннервации и отношений между этими структурами. Кроме того, он облегчает локализацию потенциального вторичного нейронного маркера как внутри, так и за пределами меченой популяции50. Это особенно актуально, учитывая, что вкусовые сосочки также получают надежную соматосенсорную иннервацию52,53,которая также может маркировать некоторые вкусовые нейроны. Вкусовые рецепторы сосочков также могут быть изображены с использованием более низкого увеличения. Это позволяет визуализировать иннервацию всего сосочка, а также вкусовых рецепторов и позволяет проводить независимый анализ иннервации, которая проникает во вкусовую рецептор и окружающие нервные волокна.

Соматосенсорные нервные окончания в коже можно выделить по их организации вокруг волосяных фолликулов и их отношению к другим компонентам эпителия; параллельные анализы в вкусовых сосочковах могут дать аналогичные характеристики54,55. Установление нормальной основы для взаимоотношений внутри и состава вкусовых рецепторов и сосочков послужит основой для определения механизмов, лежащих в основе дефицита периферических вкусовых функций56,57. Вкусовая рецептор представляет собой динамический сенсорный конечный орган, где клеточный оборот и ремоделирование терминальной беседки координируются множеством факторов58. Исследования потенциальной схемы во вкусовой рецепторе59,болезненных процессов57и химиотерапии, которые нарушают нормальную вкусовую функцию58, могут быть усилены этим методом, который сохраняет целые вкусовые рецепторы и нервные волокна нетронутыми. Описанный здесь метод полного монтажа расширяет возможности анализа и уточняет возможные измерения.

Учитывая, что язык представляет собой плотную и гетерогенную ткань, и что сам вкусовой рецептор содержит много межклеточных соединений, которые ограничивают проницаемость27,разработка подхода к выполнению сплошного окрашивания вкусовых рецепторов представляла собой значительную проблему. Предыдущие методы включали взятие репрезентативных участков60 или разрезание более толстых участков, которые затем ограничивали проникновение антител32,33,34. Кроме того, выбор целых вкусовых рецепторов из этих более толстых участков смещал данные в сторону меньших вкусовых рецепторов. В качестве альтернативы, шелушение эпителия, вероятно, нарушит нервные волокна вкусовых рецепторов; они специально не обозначены при использовании этого подхода39,40. Нервные беседки образуют большое сплетение внутри вкусовой палочки26,50,61,поэтому неясно, нарушает ли удаление беседки нормальные отношения между другими клетками во вкусовом рецепторе. В отличие от этого, нынешний метод полного вкусового рецептора позволяет количественно определять абсолютные числа и измерения. Это окрашивание позволяет сохранять и анализировать многие элементы преобразовательных клеток (тип, форма и местоположение) и концевые беседки (а также отношения между ними).

У этого подхода есть несколько ограничений. В частности, некоторые антитела, которые были использованы в тонких срезах62, не работают в цельных креплениях, что ограничит типы структур, которые могут быть исследованы. Кроме того, поскольку разрешение конфокальной микроскопии ограничено, структурные данные, проанализированные как из отдельных клеток, так и из отношений между клетками также будут ограничены24. Например, клетки могут быть определены как находящиеся в пределах 200 нм друг от друга, но специализированные структуры между клетками (например, синапсы)63 не могут быть исследованы. Наконец, не все типы клеток могут быть помечены с помощью этого подхода. Например, оказалось трудно специфически маркировать клетки, которые трансдукционируют соль в этом препарате. Эти клетки могут быть подмножеством комбинации клеток типа 1, типа II и типа III14,15,16,17,18,19,64. Клетки типа I, которые в основном являются поддерживающими клетками, не могут быть исследованы в цельных установках, потому что они, по-видимому, оборачиваются вокруг других клеток, что затрудняет их различение как отдельных сущностей65. Наличие надежного маркера для солепередающих клеток позволило бы проводить более полные анализы14,66. Аналогичным образом, поскольку окрашивание PLCβ2 представляет собой вкусовые клетки, способные трансдуцировать несколько типов стимулов, метка, которая допускает дальнейшее разделение этого типа клеток, также будет улучшением.

Ниже приведены важные подготовительные шаги, требующие ухода. Во-первых, убедитесь, что мышечный слой, который остается после рассечения, является ровным и как можно более тонким. Если этот слой не ровный, проникновение антител в конечном итоге не будет равномерным. Во-вторых, крайне важно, чтобы кусочки эпителия лежали ровно в нижней части тканевой плесени перед замерзанием, и чтобы тупые щипцы использовались для легкого давления на ткань, пока она не замерзнет. Когда минимальное количество мышц (в ровном слое) остается на нижней стороне эпителия, всего три секции криостата достигнут нижней стороны эпителия. Позиционирование ткани в криостате, так что срезы проходят по всему лицу ткани, иногда приводит к неравномерному удалению частей ткани. По этим причинам настоятельно рекомендуется избегать дополнительного оттаивания, дальнейшего рассечения и повторного замораживания тканей. Вместо этого следует позаботиться о том, чтобы оценить рассечение ткани перед замораживанием ткани.

В целом, представленный здесь способ приготовления целой ткани может быть использован для сбора целых вкусовых рецепторов, а также окружающих сосочков из трех областей вкусовых рецепторов: грибовидной, циркумваллатной и небной. Хотяизвестно,что различные заболевания56,57 и химиотерапии56 нарушают вкусовую функцию, механизмы, лежащие в основе этих изменений, остаются неизвестными. Использование подхода к окрашиванию вкусовых рецепторов представляет собой надежную экспериментальную конструкцию, в которой как вкусовые, так и их нервные волокна могут быть помечены, чтобы определить, вызван ли дефицит потерей определенного типа клеток, скомпрометированными морфологиями терминальной беседки, нарушенными отношениями между клетками, преобразующими вкус, или нарушенными отношениями между трансдуцирующими клетками и их нервными волокнами. Кроме того, можно было бы не только количественно оценить абсолютное количество меченых новых клеток во вкусовых рецепторах, но и количественно оценить количество новых вкусопередающих клеток (меченых EdU) определенного типа (т.е. PLCβ2+ или Car4+). Также можно изучить, развивают ли эти новые клетки нормальные формы и нормально включаются во вкусовую рецептор (то есть перемещаются во вкусовую почку после обработки). Многие из этих мер, наряду с количеством вкусовых рецепторов, могут быть сделаны из одной и той же ткани, ограничивая количество различных животных, необходимых для эксперимента. Эти возможности могут облегчить оптимизацию экспериментальных методов для обеспечения клинических вмешательств при вкусовом дефиците, а также дать представление о нормальных механизмах, лежащих в основе вкусовой функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Кависку Курупаранантху за ее вклад в окрашивание тканей и визуализацию циркумваллатных вкусовых рецепторов, Дженнифер Сюй за окрашивание и визуализацию иннервации в сосочек, Кайти Хорн за уход за животными и генотипирование и Ликун Ма за окрашивание тканей вкусовых рецепторов мягкого неба. Этот проект был поддержан R21 DC014857 и R01 DC007176 для R.F.K и F31 DC017660 для L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

Неврология Выпуск 168 вкусовая рецептор вся гора иннервация афферент язык вкус
Окрашивание, визуализация и анализ грибковых, циркумваллятных и нёбных вкусовых рецепторов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter