Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

Bu makalede, sürekli olarak bütün ve bozulmamış tat tomurcukları (içlerini saran sinir lifleri dahil) veren ve tat tomurcukları ile çevresindeki papilla içindeki yapılar arasındaki ilişkileri koruyan tüm mantar formu, sirküvallat ve damak tadı tomurcuklarının doku hazırlama, boyama ve analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Tat tomurcukları, ağız boşluğundaki kimyasal uyaranların alt kümelerini tespit etmek için uzmanlaşmış tat dönüştürücü hücrelerin koleksiyonlarıdır. Bu transdüksiyon hücreleri, bu bilgiyi beyne taşıyan sinir lifleriyle iletişim kurar. Tat alıcı hücreler sürekli olarak öldüğünden ve yetişkinlik boyunca değiştirildiğinden, tat alma ortamı hem karmaşık hem de dinamiktir ve hücre türlerinin, konumlarının ve aralarındaki fiziksel ilişkilerin ayrıntılı analizlerini gerektirir. Ayrıntılı analizler, antikor geçirgenliğini önemli ölçüde azaltan dil-doku heterojenliği ve yoğunluğu ile sınırlanmıştır. Bu engeller, ölçümlerin yalnızca yaklaşık olması ve hücre ilişkilerinin kaybolması için tat tomurcuklarının bölümler arasında bölünmesiyle sonuçlanan bölümleme protokolleri gerektirir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, burada açıklanan yöntemler, üç tat bölgesinden tüm tat tomurcuklarını ve bireysel terminal çardaklarını toplamayı, görüntülemeyi ve analiz etmeyi içerir: mantar biçimi papilla, circumvallate papillae ve damak. Bütün tat tomurcuklarını toplamak önyargıyı ve teknik değişkenliği azaltır ve tat alma hacmi, toplam tat alma iç yüksekliği, dönüştürücü hücre sayıları ve bireysel terminal çardaklarının morfolojisi gibi özellikler için mutlak sayıları bildirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajlarını göstermek için, bu makale genel bir tat alma işareti ve tüm tat lifleri için bir etiket kullanarak mantar formu ve circumvallate tat tomurcukları arasındaki tat tomurcukları ve innervasyon hacimlerinin karşılaştırmalarını sağlar. Tat nöronlarının seyrek hücreli genetik etiketlemesinin (tat dönüştürücü hücrelerin etiketli alt kümeleri ile) kullanımı için bir iş akışı da sağlanmaktadır. Bu iş akışı, görüntü analizi yazılımı kullanarak bireysel tat-sinir çardaklarının yapılarını, hücre türü numaralarını ve hücreler arasındaki fiziksel ilişkileri analiz eder. Birlikte, bu iş akışları hem tüm tat tomurcuklarının hem de içsel çardaklarının tam morfolojisinin doku hazırlanması ve analizi için yeni bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Tat tomurcukları, ağız boşluğunda bulunan kimyasal tat uyaranlarının alt kümelerini bağlayan 50-100 özel epitel hücresinin koleksiyonlarıdır. Tat dönüştürücü hücrelerin genellikle tip1, 2 ,3,4,5,6,7,8,9, başlangıçta daha sonra moleküler belirteçlerle ilişkili elektron mikroskopi kriterlerine dayanarak var olduğu düşünülmektedir. Tip II hücreleri fosfolipaz C-beta 2 (PLCβ2)2 ve geçici reseptör potansiyel katyon kanalını, M üyesi5 1 alt familyalarını ifade etmekte ve tatlı, acı ve umami 1,10'utransdüse eden hücreleri içerir. Tip III hücreler karbonik anhidraz 4 (Car4)11 ve sinaptozomal ilişkili protein 258'i ifade eder ve öncelikle ekşi tada yanıt veren hücreleri gösterir11. Tuzluluğu transdüse eden hücreler12 , 13,14kadar net bir şekilde tanımlanmış değildir, ancak Potansiyel olarak Tip I, Tip II ve Tip III hücreleri15 , 16,17,18,19içerebilir. Tat alma tomurcuk ortamı karmaşık ve dinamiktir, tat dönüştürücü hücrelerin yetişkinlik boyunca sürekli olarak ters dönmesi ve yerini bazal ataların3,20,21'e bırakmalarıdır. Bu tat dönüştürücü hücreler, beyin sapına tat bilgisi ileten genikül ve petrosal gangliyonlardan gelen sözde tek kutuplu sinir liflerine bağlanır. Bu nöronlar öncelikle taşıdıkları tat bilgilerine göre kategorize edilmiştir22,23 çünkü morfolojileri hakkındaki bilgiler yakın zamana kadarzor 24. Tip II hücreleri kalsiyum homeostaz modülatörü proteini 1 iyon kanalları25aracılığıyla sinir lifleri ile iletişim kurarken, Tip III hücreleri klasik sinapslar aracılığıyla iletişim kurar8,26. Transdükleme hücre tipi soyları, farklılaşmalarını etkileyen faktörler ve çardakların bağlanma yapıları dahil olmak üzere tat tomurcuk hücrelerinin daha fazla karakterizasyonu aktif araştırma alanlarıdır.

Tat alma tomurcukları çalışmaları çeşitli teknik zorluklarla engellenmiştir. Dili oluşturan heterojen ve yoğun dokular immünhistokimya için antikor geçirgenliğini önemli ölçüde azaltır27,28,29. Bu engeller, tat tomurcuklarının bölümler arasında bölünmesiyle sonuçlanan bölümleme protokollerini gerektirdi, böylece ölçümler temsili bölümlere göre yaklaşık olarak veya bölümler arasında toplanır. Daha önce, hem hacim değerlerini hem de dönüştürücü hücre sayılarını30'ayaklaşık olarak görmek için temsili ince bölümler kullanılmıştır. Daha kalın seri kesitleme, tüm tat alma bölümlerinin görüntülenmesini ve her bölümdeki ölçümlerin toplanmış olmasını sağlar31. Bu tür kalın bölümlerin kesilmesi ve sadece bütün tat tomurcuklarının seçilmesi, daha küçük tat tomurcuklarına doğru örneklemeönyargıları 32,33,34. Kesitli tat tomurcuklarından gelen sinir innervasyontahminleri,36 , 37,38'in tamamında ölçülürse,13,35piksel numaralarının analizlerine dayanmaktadır. Bu ölçümler, tek tek sinir çardaklarının yapısını ve sayısını tamamen göz ardı eder, çünkü çardaklar bölünür (ve genellikle kötü etiketlenir). Son olarak, epitelin soyulması tüm tat tomurcuklarının lekeli olmasına izin verse de39,40, ayrıca tat tomurcuk sinir liflerini de giderir ve hücreler arasındaki normal ilişkileri bozabilir. Bu nedenle, lekeleme yaklaşımlarının neden olduğu bu bozulma nedeniyle tat tomurcukları içindeki yapısal ilişkilerin araştırılması sınırlanmıştır.

Tüm yapı koleksiyonu temsili bölümlere olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve hacimlerin, hücre sayımlarının ve yapı morfolojilerinin mutlak değer ölçümlerinin belirlenmesine izin verir41. Bu yaklaşım aynı zamanda doğruluğu artırır, önyargıyı sınırlar ve teknik değişkenliği azaltır. Bu son element önemlidir, çünkü tat tomurcukları hem34 , 42hem de43 ,44bölgelerinde önemli biyolojik değişkenlik gösterir ve tüm tat alma tomurcukları analizleri mutlak hücre sayılarının kontrol ve deneysel koşullar arasında karşılaştırılmasını sağlar. Ayrıca, bozulmamış tat tomurcuklarını toplama yeteneği, farklı transdüksiyon hücreleri ve ilişkili sinir lifleri arasındaki fiziksel ilişkilerin analizine izin sağlar. Çünkü tat dönüştürücü hücreler birbirleriyle iletişim kurabilir45 ve sinir lifleri ile iletişim kurabilir46Bu ilişkiler normal fonksiyon için önemlidir. Bu nedenle, işlev kaybı koşulları hücre kaybından değil, hücre ilişkilerindeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Burada, hem tat tomurcukları hem de içsellikleri, tat hücresi sayıları ve şekilleri için hacim analizlerini iyileştirmek ve dönüştürücü hücre ilişkilerinin ve sinir-çardak morfolojilerinin analizlerini kolaylaştırmak için mutlak ölçümlerin faydalarını elde etmek için bütün tat tomurcuklarını toplamak için bir yöntem verilmiştir. Doku hazırlama için bu yeni tam montaj yönteminin aşağı doğru iki iş akışı da sunulmaktadır: 1) tat tomurcuk hacmini ve toplam innervasyonu analiz etmek için ve 2) tat nöronlarının seyrek hücreli genetik etiketlemesi için (tat dönüştürücü hücrelerin alt kümeleri etiketli) ve daha sonra tat-sinir çardak morfolojisinin analizleri, tat hücresi türlerinin ve şekillerinin sayısı ve transdükleyici hücreler ile transdüksiyon arasındaki fiziksel ilişkileri analiz etmek için görüntü analizi yazılımının kullanılması hücreler ve sinir çardakları. Birlikte, bu iş akışları doku hazırlamaya ve tüm tat tomurcuklarının analizlerine ve içsel çardaklarının tam morfolojisine yeni bir yaklaşım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Tüm hayvanlar, LABORATUVAR HAYVANLARININ İnsani Bakımı ve Kullanımına ilişkin ABD Halk Sağlığı Hizmet Politikası ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak bakıldı. Phox2b-Cre fareleri (MMRRC suşu 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) veya TrkBCreER fareleri (Ntrk2tm3.1 (cre /ERT2)Ddg) tdTomato muhabir fareleri (Ai14) ile yetiştirildi. AdvillinCreER47 Phox2b-flpo48 ve Ai65 ile yetiştirildi. 5-etil-2′-deoksiroridin (EdU) enjeksiyonları için, EdU hazırlandı ve Dozlar Perea-Martinez ve ark.49'agöre hesaplandı.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Çözümlerin hazırlanması
    1. 5.244 g monobasik sodyum fosfat ve 23.004 g dibasik sodyum fosfatı bir karıştırma plakasında çift damıtılmış suda (ddH2O) çözün. pH'ı 7,4'e ayarlayın ve toplam hacmi 0,2 M sodyum fosfat tamponunun (PB) 1 L'si elde etmek için getirin.
    2. Çözelti 90 °C'ye ulaşana kadar karıştırma plakasında karıştırırken ısıtılarak duman kaputunda ddH2O'daki paraformaldehit çözün. Paraformaldehiti temizlemek için damla yönünde 4 M NaOH çözeltisi ekleyin ve filtre kağıdı ile vakum erlenmeyer şişesi ve seramik filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyin. 0,2 M PB'lik eşit bir hacim ekleyin ve 0,1 M PB'de %4 PFA elde etmek için pH'ı 7,4'e ayarlayın.

2. Doku hazırlama

  1. Doku toplama
    1. 10 mL steril salin ve 5 g 2,2,2-tribromoethanol ve 5 mL tert-amil alkol içeren bir stok çözeltisi içeren bir çalışma çözeltisi ile anestezik aşırı doz kullanarak fareleri kurban edin. 0,1 M PB'de %4 PFA ile transkardiyöz olarak perfuse; dilleri ve damağı çıkarın.
    2. Arka dili ayıran bir koronal kesim kullanarak sirkülat tat tomurcuklarını intermolar saygınlığın arkasında izole edin; tat tomurcuklarını jiletle kesin; ve sonra ön dili orta çizgide ikiye ayırın. 0,1 M PB'de %4 PFA ile 4 °C'de geceleme sonrası.
    3. 4 °C'de bir gecede % 30 sakkarozda dokuyu kriyoprotect.
      NOT: Doku, kuru buz üzerinde bir beherde soğutulmuş 2-metilbütan kullanılarak optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği içinde dondurulabilir ve prosedür burada duraklatılması gerekiyorsa -80 °C'de saklanabilir.
  2. Mantar formu tat tomurcukları
    1. Adım 2.2.8'e hazırlık için kuru buz üzerinde bir beherde 2-metilbütan soğutun.
    2. Dili 0,1 M PB'de çözün ve durulayın. Mantar biçimi papillasını içeren ön dilin yarısını, diseksiyon mikroskobu altında cam bir kaydırağa yerleştirin.
    3. Kası çıkarmak için künt uçlu tokmaklar ve diseksiyon makası kullanın. Lingual epitel kavisli olduğu için dokuyu açık tutmak için künt uçlu tokmaklar kullanın ve kaba diseksiyon makasının bıçaklarını epitellere paralel tutarak düz bir yönelim sağlayın.
    4. Tat alma tomurcukları içermediği için dilin ventral olmayan keratinize epitelini atın.
    5. Keratinize epitelin alt kısmına daha yakın diseksiyon için ince diseksiyon makası kullanın.
      NOT: Kalan kasın düzgün kalınlıkta olması ve yüzeyin düzgün antikor penetrasyonunu sağlamak için pürüzsüz olması için epitele yakın bir şekilde incelenmek önemlidir. Kalan kasın homojen olmayan kalınlığının sonucu, epiteli daha az kaslı bölgelerde ve diğer bölgeler için daha kalın bir kas tabakasında maruz kalarak kriyostat üzerinde düzensiz bir şekilde kesitlenecektir, bu da antikor penetrasyonunu engeller.
    6. Bir epitel parçasını bir doku kalıbına (kas tarafı aşağı) koymak için künt uçlu tokaları kullanın ve düz olduğundan emin olun. Doku düz olduktan sonra dokuya bir damla OCT ekleyin.
      NOT: Dilin ucunun kavisli olduğu göz önüne alındığında, doku düz bir şekilde döşenebilecek şekilde kavisli olduğu epitelde bir kesim yapılması gerekebilir.
    7. Doku kalıbını, diseksiyon kapsamının altındaki metal bir tabana (daha önce kuru buzda soğutulmuş) yerleştirin. Dokunun mümkün olduğunca düz donmasını sağlamak için OCT donana kadar dokuya asalarla hafifçe dokunmaya devam edin.
    8. OCT donduktan sonra, hızlı bir şekilde ek OCT ekleyin ve kalıbı donana kadar 2 metilbütan (kuru buzda soğutulan) bir kabın içine yerleştirin.
    9. Kriyostat bölümleme
      NOT: Kriyostat, antikor penetrasyonunu inhibe edebilecek kalan deri altı dokusunun ince bir şekilde çıkarılması için kullanılır (Şekil 1).
      1. OCT kalıplarını kriyostat üzerine monte edin ve 20 μm kesitler kesin. Her bölümü toplayın ve epitel tabanına yakınlığını değerlendirmek için ışık mikroskobu altında görüntüleyin (Şekil 1E - H).
      2. Doku epitelinin alt tarafından tıraş edildikten sonra, epitelleri çözün ve bir çalkalayıcı üzerinde 0,1 M PB'de iki kez durulayın.
  3. Circumvallate tat tomurcukları
    1. Jiletli bir koronal kesim kullanarak, sünnet papillasını ön dilden ayırın. Doku lateralini bir diseksiyon kapsamı altında papillaya çıkarmak için aynı jiletle iki parazital kesim kullanın. Papillayı, tokaları kullanarak bir doku kalıbına yerleştirin, böylece sirkülatör papillanın bir yanal kenarı doku kalıbının dibine baka baka.
      NOT: Doku, kuru buz üzerinde bir beherde soğutulmuş 2-metilbütan kullanılarak OCT'de dondurulabilir ve prosedür burada duraklatılması gerekiyorsa -80 ° C'de saklanabilir.
    2. Dokuyu kriyostat üzerinde 90 μm yüzen bölümlere kesin.
  4. Damakta tat tomurcukları
    1. Sert damak ön ön kısmını yumuşak ve sert damak birleştiği yerde kesin (Şekil 2). Yumuşak damağı alttaki dokudan ayırmak için makas kullanın, kalan kemik parçalarının kesildiğinden emin olun. Ek kas ve bağ dokusunu çıkarın.
      NOT: Çıkarıldıktan sonra, kalan tüm doku, damak alt tarafına hafifçe yapışan bezlerden ve gevşek bağ dokusundan oluşacaktır.
    2. Damağı künt uçlu forsepslerle tutun ve kalan bezleri ve gevşek bağ dokusunu jiletle hafifçe kazıyarak çıkarın.
      NOT: Doku, kuru buz üzerinde bir beherde soğutulmuş 2-metilbütan kullanılarak OCT'de dondurulabilir ve prosedür burada duraklatılması gerekiyorsa -80 ° C'de saklanabilir.

3. İmmünohistokinometri boyama

  1. Dokuları 0,1 M PB, 3 x 15 dk ile yıkayın. Dokuları bloke edici çözeltili 1 mL tüplere (%3 eşek serumu, %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif madde (bkz. Malzeme Tablosu), 0,1 M PB) ile bir gecede 4 °C'ye yerleştirin.
  2. Bloklama çözeltisini çıkarın ve birincil antikordaki (tavşan anti-PCLβ2) dokuyu antikor çözeltisinde (0,1 M PB, %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif madde) 4 °C'de 5 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Her yıkamada 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın ve ikincil eşek anti-tavşan 488 antikorunda (1:500) 4 °C'de 2 gün boyunca antikor çözeltisinde kuluçkaya yatır.
  4. Her yıkamada 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın ve antikor çözeltisinde% 5 normal tavşan serumu ile tıkayın.
  5. 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın. 4 °C'de 2 gün boyunca antikor çözeltisinde eşek anti-tavşan blokaj antikor (20 μg / mL) ile kuluçkaya yatır.
  6. Her yıkamada 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın ve ardından 4 °C'de 5 gün boyunca bir antikor çözeltisinde floresan etikete (üreticinin talimatlarına göre) konjuge edilmiş birincil antikor dsRed (tavşan) ile kuluçkaya yatırın.
  7. Her yıkamada 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın ve ardından 4 °C'de 5 gün boyunca antikor çözeltisinde birincil antikor (keçi anti-Car4 (1:500)) ile kuluçkaya yatırın.
  8. Her yıkamada 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın. 4 °C'de 2 gün boyunca antikor çözeltisinde ikincil eşek anti-keçi 647 antikor (1:500) ile kuluçkaya yatır.
  9. Her yıkamada 0,1 M PB, 4 x 15 dk ile yıkayın ve sulu montaj ortamına monte edin (epitel tarafı yukarı) ve doku bölümünün üzerine bir kapak ucu yerleştirin.
    NOT: Sadece keratin-8 ve dsRed'de olduğu gibi farklı türlerden antikorlar kullanıyorsanız, 3.9 adımına geçmeden önce 3.2.

4. Konfokal görüntüleme ve dekonvolüzyon

  1. 60x hedefli (Sayısal Diyafram= 1,40), 4 ms/piksel, 3 yakınlaştırma, 2 Kalman ve 1024 x 1024 boyutunda bir konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler yakalayın. Z ekseni boyunca 0,47 mm'lik bir adım boyutu seçin. Papilla'ya innervasyon yakalamak için, 3 yakınlaştırmalı görüş alanı papillanın tüm innervasyonlarını yakalayamayacak kadar darsa 2,5 yakınlaştırma kullanın.
  2. Görüntülerin tutarsız olmasını sağlamak için, bazı ayarların görüntüyle otomatik olarak içe aktarılacağını unutmayın; bu nedenle, görüntüde yakalanan modalite, objektif lens, sayısal diyafram, daldırma ortamı, örnek ortam ve floroforlar için kalan ayrıntıları doldurun. Ardından, 3D Deconvolution 'ıseçin.

5. Görüntü analizi

  1. Tat alma tomurcukları ve innervasyon hacmi
    1. Tat tomurcuklarının tadındaki toplam innervasyon hacmini ve hacmini belirlemek için deconvoluted görüntü yığınlarını piksel tabanlı bir görüntü analiz yazılımına (Bkz. Malzeme Tablosu)içe aktarın.
      1. Ana Nesne menüsündeKi Ses Düzeyi'nin işaretini kaldırın.
      2. Nesne menüsünden Yeni yüzeyler ekle'yi seçin. Otomatik oluşturmayı atla'yı, el ile düzenle'yi ve sonra Kontur 'useçin.
      3. Seç'e tıklayın ve tat alma tomurcukunun kenarlıklarını izlemeye yardımcı olmak için + olarak görünen oku gözlemleyin. Dilimleyiciyi hareket ettirın ve her optik bölümde tat tokmakını anahatlayın. Konturlar tamamlandıktan sonra Yüzey Oluştur 'utıklatın.
      4. Ana Nesne menüsünde görünen tat alma sesi nesnesini gözlemleyin. Araçlar altında tat alma tomurcukunun hacmini bulun.
    2. Tat alma tomurcukları içindeki innervasyon hacmi
      1. Tat alma tomurcuk nesnesinin altındaki kalem simgesini seçin ve ardından Tüme Maskele'yi seçin.
      2. Açılır menüde sinir lifi etiketine karşılık gelen floresan kanalı seçin. Yinelenen Kanal Oluştur 'u denetleyin.
      3. Voxels'i yüzeyin dışında ayarla:'yı işaretleyin ve kutuya 0 yazın.
      4. Tat alma tomurcukları içinde seçilen floresan kanalın değiştirilmemiş bir kopyası olan Görüntü Ayarı penceresinde görünen yeni kanalı gözlemleyin.
      5. Ana Nesne menüsünde Yeni Yüzey Oluştur 'useçin. Otomatik oluşturmayı atla seçeneğinin işaretini kaldırın, el ile düzenleyin.
      6. Sonraki adıma ilerlemek için mavi oka iki kez tıklayın.
      7. Sil'e tıklayın, ardından tat alma tomurcuklarında bulunan sinir liflerinin hacmini temsil eden yüzeyi tamamlamak için yeşil çift oka tıklayın. Ses düzeyinin değerini bulmak için, sinir lifi Nesne menüsünün altındaki Araçlar'ı seçin ve açılır menüden Ses Düzeyi'ni seçin.
    3. Papilla'ya innervasyon hacmi
      1. Bölüm 5.1'de açıklandığı gibi tat alma tomurcuklarının bir hacmini oluşturun.
      2. Tat alma nesnesinin altındaki kalem simgesini seçin ve ardından Tüme Maskele'yi seçin.
      3. Açılır menüde sinir lifi etiketine karşılık gelen floresan kanalı seçin. Yinelenen Kanal Oluştur 'u denetleyin.
      4. Voxels iç yüzeyi şu şekilde ayarla'yı işaretleyin ve kutuya 0 yazın. Tamam 'ıtıklatın.
      5. Yeni Yüzey Ekle 'yitıklatarak bir yüzey oluşturun. Yalnızca İlgi Alanı Olan Bir Segment 'iseçin.
      6. Mavi okatıklayın ve Z değerini artırın, böylece ilgi alanı tat tomurcukunun tabanından başlar.
      7. Sonraki adıma ilerlemek için mavi oka iki kez tıklayın.
      8. Sil'e tıklayın, ardından papillaya innervation hacmini temsil eden yüzeyi tamamlamak için yeşil çift oka tıklayın. Ses düzeyinin değerini bulmak için, sinir lifi Nesne menüsünün altındaki Araçlar'ı seçin ve açılır menüden Ses Düzeyi'ni seçin.
    4. Terminal çardak temas analizi
      1. Görüntü hazırlama
        1. Düzenle menüsüne gidin ve 3D Kırp 'ıseçin. Görüntüyü her taraftan kırpın, tat alma tomurcukunun dışındaki alanı çıkarın.
          NOT: İlgili herhangi bir yapıyı çıkarmadan tat alma tomurcuklarına yakın kırpın-herhangi bir fazla görüntü işlem süresini uzatacaktır.
        2. Ana menüden Düzenle'yi seçin, Veri türünü değiştir'i tıklatın. Açılan menüden Son: 32 bit float'ı seçin.
        3. Nesne menüsünden Yeni yüzeyler ekle'yi seçin. Otomatik oluşturmayı atla'yı tıklatın, el ile düzenleyin, Kontur'u seçin ve toplam optik dilim sayısını bulmak için dilim konumunu sağa sürükleyin.
        4. İzometrik vokseller oluşturun ve voksellerin dikdörtgenler (0,0691 x 0,0691 x 0,474) yerine XxYxZ olduğundan emin olun, sırasıyla, vokseller 0.0691 x 0.0691 x 0.0691' dir ve dikdörtgenler, floresan yoğunluğu için orijinal, dikdörtgen voksel ile aynı değerlere sahip küplere bölünür. Görüntü Özellikleri 'niseçin. Ardından, Voxel Boyutu için Z değerini X veya Y değerine (= 0,474/0,0691) bölün ve bu değeri önceki adımda bulunan dilim sayısıyla (optik bölümler) çarpın.
        5. Ana menüde Düzenle'ye geri dönün ve 3D'yi Yeniden Örnekle 'yiseçin.
        6. Z değerini (dilim sayısı) yeni hesaplanan değerle değiştirin.
      2. Floresan bazlı otomatik yüzeyler oluşturma
        1. Yeni bir yüzey eklemek için Yeni Yüzey Ekle'yi yeniden tıklatın, Segment'in seçimini kaldırın yalnızca ilgilendiğiniz bir bölgeve İleri'yi tıklatın.
        2. Kaynak kanal açılır menüsünden, tadı dönüştürücü hücre türlerinden birinin kanalını seçin. Düzgünleştir'in seçimini kaldırın ve bir sonraki adıma geçin.
        3. Bir sonraki ekranda görüntüde bulunan floresan yoğunluk aralığını gösteren hiçbir şeyi değiştirmeyin. Bir sonraki adıma geçmek için alttaki mavi oka tekrar tıklayın.
        4. Sil 'etıklayın, ardından yüzeyi tamamlamak için yeşil çift oka tıklayın.
        5. Ekranın sol elindeki Nesne menüsüne gidin, burada tamamlanan hücre yüzeyi görünecek ve Surface 2gibi genel bir şey olarak adlandırılacaktır. Etiketin temsil etmesine göre adlandırmak için yüzey adına çift tıklayın.
          NOT: Bu durumda, üretilen yüzey PLCß2 etiketli hücreye dayanır.
        6. Yüzey yerine noktalar varsa, sol alt köşedeki menünün altında Orta noktayerine Yüzey 'i tıklatın. Ardından, istendiğinde Tamam'ı tıklatın.
        7. Diğer tat dönüştürücü hücre belirteçleri ve sinir lifi belirteci için 5.3.2.1-5.3.2.5 adımlarını yineleyin.
        8. İlerlemeyi kaydedin (dışa aktarın).
        9. Ana menüde Surface hücre türüne tıklayın. Bu nesnenin menüsünden Araçlar'ı ve ardından Uzaktan Dönüştürme'yi tıklatın.
        10. XTDistanceTransformation adlı bir açılır kutunun görünmesini bekleyin. Dış Yüzey Nesnesi 'niseçin. Görüntü Ayarı menüsünde görünen ve yüzey adınauzaklıkadlı yeni kanalı not edin.
        11. Nesne menüsünden Sinir Lifi yüzeyini seçin. Kalem simgesine tıklayın ve ardından Tüme Maskele.
        12. Görüntülenen açılır menüden, yeni kanalı seçin Uzaklık yüzey adına. Görüntü Ayarı penceresinde görünen ve yüzey adınaMaskelenmiş Uzaklıkadlı yeni kanalı not edin.
        13. Ana Nesne menüsünü kullanarak yeni bir nesne oluşturun. Segmentin seçimini yalnızca ilgilendiğiniz bir bölgeye kaldırın ve mavi okatıklayın. PLCß2 kanalına Maskeli Mesafe'yi seçin ve Düzgünleştir'in işaretini kaldırın.
        14. Bir sonraki ekranda, tat dönüştürücü hücrelerin bu yazılım tarafından ayırt edilebilen sinir liflerinden en küçük mesafede olduğu herhangi bir bölge olup olmadığını kontrol edin. Bunu yapmak için, sinir liflerine bu kadar yakın herhangi bir reseptör hücre floresanını kontrol etmek için 0.01-0.11 μm sınırı belirleyin.
        15. Alt eşiği ayarlamak için sol taraftaki yeşil kutuya 0,01 yazın, Sekme tuşunabasın. Ardından kırmızı düğmeye tıklayın ve üst eşiği ayarlamak için 0.11 yazın. Sekme tuşuna basın ve bir sonraki adıma geçmek için alttaki mavi oka tıklayın.
        16. Silmek'e tıklayın ve ardından bitirmek için yeşil çift oka tıklayın.
        17. Nesne menüsünde plcß2'nin 0.01-0.11 içinde bu yüzeyi yeniden adlandırın. Nesne menüsünde PLCß2 yüzeyinin 0,01 - 0,11 içinde öğesini seçin.
        18. Kalemi seçin ve Tüm maskele'yi tıklatın. Açılır menüden kırmızı (sinir lifi) kanalı seçin ve Tamam'ı tıklatın.
        19. Kanalın adınatıklayınız; PLCß2'nin 0.01 - 0.11 içinde kanalı yeniden adlandırın.
          NOT: Bu, oluşturulan yüzeyde bulunan kırmızı floresan kanalın bir kopyasını temsil eden floresan bir kanaldır.
        20. Renk seçicininortasındaki beyaz üzerine tıklayın. Yapıların renkleriyle zıt bir renk seçin.
        21. Bu aşamada dosyayı dışa aktar (yani kaydedin).
        22. Diğer tat dönüştürücü hücre belirteçleri için 5.4.2.9-5.4.2.21 adımlarını yineleyin.
        23. Bu aşamada dosyayı dışa aktar (yani kaydedin).
          NOT: Etiketli bir hücre tipinin diğerine yakınlığını analiz etmek için, 5.4.2.11 adımındaki (ve aşağıdaki adımlarda) Sinir Lifi yüzeyini ilgi çekici nesne ve sonraki her adımla ilgili eşdeğer bileşenlerle değiştirmenız yeterlidir.

6. Nöron çardak rekonstrüksiyonu ve mutlak hücre sayısı nicelemesi

  1. Terminal çardak izleme ve analizi
    1. 3B vektör tabanlı görüntü analiz yazılımında deconvoluted görüntü dosyasını açın (Malzeme Tablosunabakın), İzle 'yiseçin, Nöron'u tıklatın ve sonra Dendrite'i tıklatın.
    2. Görüntü yığınındaki tat tonunun tabanına gidin. Görüntü yığınında gezinirken her fiberi sonuna kadar takip edin.
    3. Dal sonunda, sonuna sağ tıklayın ve Bitiş'i seçin. Dal noktalarında, sağ tıklatın ve Çatallama Düğümü 'nüseçin.
      NOT: Bu, bir dalın sonuna kadar izlenmesini ve daha sonra iki çatallanma noktasına geri dönüldükten sonra, bu izlemenin hala aynı nörondan olduğunu kabul eden programla diğer dalın izlenmesini sağlar.
    4. Veri dosyasını olarak kaydedin. DAHA SONRA 3D vektör tabanlı görüntü analiz yazılımında analiz için açılabilir DAT dosyası.

7. Hücre sayısı nicelemesi

  1. Z konumuna tutturulmuş hücre tiplerini transdüklemek için farklı belirteçler nükleer seviyeye yerleştirilebildiği sürece, herhangi bir görüntü analizi yazılım paketindeki etiketli tat tomurcuk hücrelerini ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Phox2b-Cre:tdTomato farelerinde 10,51(Şekil 3A)hem tüm tat tomurcuklarını hem de tüm tat tomurcuk innervasyonunu etiketleyen dsRed ve keratin-8 'e (genel bir tat alma tomurcukları) karşı antikorlarlalingual epitelin boyanmasını. Bu tat tomurcuklarını gözeneklerinden tabanlarına görüntüleme en yüksek çözünürlüklü x-y düzlem görüntülerini verdi (Şekil 3A,B). Piksel tabanlı görüntüleme programının kontur fonksiyonu, her bölümdeki tat tomurcukunun çevresini özetlemek için kullanılmıştır (Şekil 3B) ve daha sonra tat tomurcuk hacmini temsil eden bir yüzey (Şekil 3C) oluşturmak için. Sadece yüzeydeki tat alma etiketiyle ilişkili floresan maskeleme (veya çoğaltma), sadece bu floresan içeren yeni bir kanal oluşturdu ve tat tomurcuklarını gizleyen papilla lekelerini ortadan kaldırdı (Şekil 3D). Tat alma tomurcuk içindeki sinir lifi floresan maskelendi (Şekil 3E) ve içindeki innervasyon hacmini temsil eden bir yüzeyi otomatik olarak oluşturmak için kullanıldı (Şekil 3F). Benzer bir yaklaşım, tat alma hacmini ve circumvallate tat tomurcuklarındaki ilişkili innervasyonunu ölçmek için de kullanılmıştır (Şekil 3G). Temsili ölçüm verileri, mantarform(p = 0.115) veya circumvallate ( p = 0.090) ölçüm bölgelerindetat alma hacimleri ve innervasyon hacimleri arasında korelasyon olmadığını ortaya koydu (Şekil 3H).

TrkBCreER'dedüşük dozda tamoksifen verilmesi : tdTomato fareleri gen rekombinasyonuna ve az sayıda nöronun etiketlenmesine neden olur, böylece tat tomurcukları sıfır ila birkaç etiketli terminal çardak (tat tozu içindeki nöronal kısım) ile içselleştirilir. Lingual epitel, terminal çardaklar için anti-dsRed antikor ve tat dönüştürücü hücreler için anti-Car4 (ekşi) ve anti-PLCβ2 (tatlı, acı ve umami) antikorları kullanılarak lekelenmiştir (Şekil 4A). Etiketli terminal çardaklarını izlemek için vektör tabanlı bir görüntü analiz programı kullanılmıştır (Şekil 4B). Mavi ve yeşil izlemelerle ilişkili çardakların ortogonal yükseklikleri sırasıyla 33,4 μm (Şekil 4C) ve 32,4 μm (Şekil 4D) şeklindeydi. Mavi terminal çardağı için 3D Dışbükey Gövde ölçümleri (yani, tat tomurcuk içindeki terminal çardak kapsamı) yeşil çardak için 644.0μm 3 ve 3647.0 μm3 idi. Yeşil izlemenin dendrogramı Şekil 4E'de mikron cinsinden ölçülen dal uzunluklarıyla gösterilmiştir. Yeşil çardak yedi dal ucuna ve toplam 183.4 μm uzunluğa sahipti. PLCβ2+ ve Car4+ hücrelerinin mutlak sayılarının ölçülmesi, bu tat tomurcukunun 17 PLCβ2+ hücreye ve iki Car4+ hücreye sahip olduğunu ortaya koydu. Sinir lifleri ve tat dönüştürücü hücreler arasındaki en yakın yakınlığı belirlemek için hücre pikseli tabanlı görüntüleme yazılımının kullanılması, tat alma tomurcuklarındaki toplam 19 tat dönüştürücü hücreden, mavi terminal çardak (Şekil 4F,G'dekırmızı ile gösterilmiştir) açık mavi Car4 + hücresinin (Şekil 4G'deoklarla gösterilen beyaz alanlar) 200 nm (ışık mikroskobunun çözünürlüğü) içindeydi. Yeşil izleme ile ilişkili terminal çardak macenta (Şekil 4F ve Şekil 4H) ile gösterilir ve hem açık hem de koyu mavi Car4 + hücrelerinin (Şekil 4H'dekibeyaz alanlar) 200 nm içindedir. Bu çardaklara en yakın hücre 200 nm'den daha uzakta olduğundan, iki yapıyı ayıran etiketsiz bir voksel vardı.

Bölünen progenitör hücreler 0, 1 ve 3. günlerde EdU enjeksiyonları kullanılarak etiketlendi ve dokular 4. Mantar formu tat tomurcuklarının bütün montaj keratin-8 ve EdU lekeleri, EdU etiketli hücrelerin tat tomurcuklarının içinde ve dışında bulunduğunu ortaya koydu (Şekil 5A-C). Bireysel EdU+/keratin-8+ hücreleri (deniz mavisi ve sarı) ve EdU+/keratin-8- çekirdekleri (mor ve macenta) bölümlere ayrılmıştır (Şekil 5B,C). Gösterilen koyu mavi hücre keratin-8+ idi ve olgun tat dönüştürücü hücrelerle tutarlı uzun bir şekle sahipti. Bu yüzeyler gözenekten tabana yönlendirilmiş tat tosluğu (Şekil 5B) ve tat tomurcukunun uzun ekseni boyunca gösterilmiştir (Şekil 5C). Her yapı içindeki floresan maskelenerek her yapı ayrı optik dilimler halinde görüntülenebilir (Şekil 5D-F). Macenta ve mor çekirdek, beyaz noktalı anahatla belirtilen tat tomurcukunun keratin-8+ kenarlıklarının dışındadır (Şekil 5D, E). Sarı, deniz mavisi ve mavi hücreler tat alma tomurcukları içindeydi (Şekil 5D-F). Bireysel tat dönüştürücü hücreler, Car4 etiketleme ( Şekil 6A -C) veya PLCβ2 etiketleme (Şekil 6D-F)piksel tabanlı görüntüleme yazılımı kullanılarakyenidenyapılandırılabilir. Hücreler arasındaki en yakın yakınlığı ölçmek için piksel tabanlı bir görüntüleme yazılımı kullanıldı ve bir Car4+ hücresinin (Şekil 6B'degösterildiği gibi aynı hücre) tek bir PLCβ2+ hücresinin 200 nm içinde olduğunu ortaya koydu (Şekil 6G, yeşil). Hücrelerin birbirine 200 nm mesafede olduğu alan beyaz (Şekil 6G) ve beyaz oklarla gösterilir. Bir sonraki en yakın hücre 200 nm'den daha uzaktaydı ve Şekil 6H,I'de iki farklı yönde sarı renkte gösterilmiştir. Şekil 7, papilla içinde (ancak tat alma tomurcukunun dışında) sona eren innervasyonun izolasyonunu ve analizini gösterir ve tat tokası etrafındaki dağılımını ve epitelden uzaklığını içerir.

Figure 1
Şekil 1: Mantar şekli tat alma lekelenmesi için dilsel epitel hazırlanması. (A) Kesilen dilin herhangi bir diseksiyondan önce epitel ve kas etiketli görünümü. (B) Yeterli kas çıkarıldıktan sonra, epitelin alt tarafında sadece az miktarda kalan kas vardır. Epiteliumun kesik tarafını görüntüleyerek diseksiyonun ilerlemesini değerlendirmenin yanı sıra, (C) epitelin diseksiyon kapsamının altındaki bir cam kaydırakta düz olarak döşenmesi, dokunun bazı bölümlerinin eşit yarı saydam olduğunu ortaya koymaktadır (mor dikdörtgen); bu bölgeden yeterli kas çıkarıldı. Buna karşılık, mor oklar solda çıkarılması gereken daha fazla kasın olduğu bölgeleri gösterir. Epitelin tüm alt kısmı mor dikdörtgendeki alana benzedikten sonra, bir sonraki adıma geçin. (D) Epitelin bazı bölümleri kas tarafı aşağı doğru dondurulduktan sonra kriyostat kullanılarak ince kesitler olarak ek kas ve lamina propria çıkarılır. Bölümleme tamamlandığında, kalan epitel ince ve yarı saydamdır. (E-F) Seri kesitler (20 μm) cam bir slaytta toplandı ve her bölüm bir sonraki bölümü kesmeden önce floresan mikroskop altında görüntülendi. Epitelin çok altında, kas lifleri birden fazla yöne yönlendirilir, böylece kas lifleri hem kesitte hem de kas lifi boyunca bulunur (E, kırmızı dikdörtgen). E-F'deki seri bölümler, birden fazla yöne yönlendirilmiş kas liflerinden(E, kırmızı dikdörtgen) çoğunlukla tek yöne yönlendirilmekte olan kas liflerine(F, kırmızı dikdörtgen) geçişi gösterir, bu da kas-lamina propria sınırının göstergesidir. Aynı doku parçasının başka bir bölgesi (sarı dikdörtgenler), kas lifleri bir yöne yönlendirildiğinde, tüm kaslar o bölgeden çıkarıldığı için bir sonraki bölümün muhtemelen bağ dokusu vereceğini göstermektedir. Mavi dikdörtgenlerin her ikisi de epitelin alt tarafını temsil eder. Bölümde(G, kırmızı oklar) tat tomurcukları varsa, çok fazla doku çıkarılmıştır. İdeal olarak, epitelin alt kısmı (ancak tat tomurcukları yok) çıkarılan bölümlerde(F, sarı dikdörtgen) göründüğünde bölümleme tamamlanır. Kas liflerinin aynı yöne yöneldiği bölgeler(E, sarı dikdörtgen ve F, kırmızı dikdörtgen) bölümleme için de uygun olsa da, kas liflerinin birden fazla yöne(E, kırmızı dikdörtgen) yöneldiği alanlardan kaçınılmalıdır. (G) Bölümler epitel/lamina proprisinin alt tarafını içerdiğinde, epitelin çok fazla çıkarılmasından ve bölümlerin tat tomurcuklarını içermesinden önce sadece birkaç ek bölüm kesmek mümkündür. (H) En sık yapılan hata, doku kenarında epitel görüldüğü, epitelisin içinde kas görüldüğü ve ortada OTC/seyrek kasın bulunduğu kriyostat bölümleri ile ortaya çıkarır. Bu, en sık, kör uçlu tokmaklarla donmadan veya yetersiz düzleştirmeden önce dokuyu doku kalıbının dibine düz bir şekilde koymamaktan kaynaklanır. A-C =1 mm'de ölçek çubukları; E, F, H = 100 μm'de ölçek çubukları; G = 50 μm'de ölçek çubuğu.

Figure 2
Şekil 2: Lekeleme için damak diseksiyonu. (A) Damak önce sert damağı kesmek için ince bıçak makası kullanılarak, (B) sonra yumuşak damağı alttaki bağ dokusundan ayırmak için aynı makas kullanılarak parçalandı. Ağız boşluğundan doku çıkarıldıktan sonra makasla kalan dokular çıkarıldı. Bu noktada, geriye kalan tek şey yumuşak damağın arkasında bezlerdir. Bu bezleri nazikçe kazımak için bir jilet kullanıldı. Damak tamamlanan diseksiyonunun (C) sırt ve (D) epitel yüzeyi gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Tam montajlı tat tomurcuklarında hacmin ölçülmesi. (A) Tüm montajlı tat tomurcukları, tat gözeneklerinden tat tomurcukunun tabanına kadar görüntülenmiştir, böylece en yüksek çözünürlüklü düzlem x-y düzlemidir. Her optik dilim piksel tabanlı görüntü analizi yazılımında görüntülendi ve kontur işlevi keratin-8 ile boyanmış tat tomurcukunun çevresini manuel olarak ana hatlarıyla belirlemek için kullanıldı. (B) Bir optik dilim örneği verilmiştir. (C) Bu temsili bölümün tat tomurcukunun uzun ekseni boyunca konumu sarı çizgi ile gösterilir. Her optik bölüm özetlendikten sonra, tat tomurcukunun (beyaz) hacmini temsil eden bir yüzey oluşturuldu. Tat tomurcuklarını temsil eden hacimdeki tat tokasına (D'dekeratin-8) veya tdTomato etiketli innervasyona (E'desahte renkli mavi) karşılık gelen floresan kanalı maskeleme veya çoğaltma. Tat tomurcuk içindeki floresan (E) tat tomurcuk içindeki innervasyon hacmini temsil eden bir yüzey oluşturmak için kullanılmıştır (F, mavi). (G) A'dakimantar biçimi tat tomurcuğu ile aynı yönde görüntülenmiş tam montajlı sirkülat tat tomurcuklarına benzer bir yaklaşım uygulanmıştır. (H) Mantar formu ve sirkülasyon tat tomurcuklarının hacminin ve ilgili innervasyon hacminin ölçülmesi, her iki bölge için örneklenen tat tomurcukları için tat tomurcuğu ile innervasyon hacmi arasında bir korelasyon olmadığını ortaya koydu. A-D, F = 4 μm'de ölçek çubukları; G = 5 μm'de ölçek çubuğu. Bu rakam Ohman-Gault ve ark.50'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: FF = mantar formu; CV = circumvallate. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Seyrek hücre genetik etiketlemesi kullanılarak mantar biçimi tat tomurcuklarında temsili terminal çardaklar. (A) Tat dönüştürücü hücre işaretleyiciler Car4 (beyaz) ve PLCβ2 (yeşil) ile boyanmış tam montajlı tat tokası. (B) Bu tat alma tomurcukları, lifleri yeniden yapılandırdıktan sonra çıkarılan tat alma tomurcukları ile gösterilen iki etiketli terminal çardak vardır. (C) Mavi çardak 6 dal ucuna ve 33.4 μm tat tomurcuklarında ortogonal yüksekliğe ve (D) yeşil çardak 7 dal ucuna sahiptir. (E) Yeşil çardaklara karşılık gelen dendrogram, mikrometrelerde her segment uzunluğu ile sağlanır. (F-H) Yapılar arasındaki mesafe ölçüldü. (F-G) C'deki mavi izleme bölümlere ayrılmıştır ve kırmızı renkte gösterilmiştir. (G) Açık mavi Car4+ hücresinin 200 nm içinde bu terminal çardakların bulunduğu alanlar beyaz oklarla gösterilir. (F, H) Yeşil rekonstrüksiyon ile temsil edilen terminal çardak macenta olarak gösterilmiştir. (H) Macenta arbor (4B, D'deki yeşil izleme ile ilişkili) hem koyu hem de açık mavi Car4+ hücrelerinin 200 nm içindedir. Ölçek çubuğu A, B = 4 μm; F-H = 5 μm'deki ölçek çubukları.

Figure 5
Şekil 5: Yeni tat alma tomurcukhücrelerinin birleştirilmesini izlemek için tam montajlar kullanılabilir. Farelere 0, 1 ve 3. (A, B) EdU (yeşil) ile etiketlenmiş hücreler, keratin-8 (A, beyaz, B, gri) ile etiketlenmiş tat tomurcuklarının etrafında ve içinde tanımlanabilir. (B, C) Tat tomurcuk ve keratin-8-içindeki bireysel EdU etiketli, keratin-8+ hücreler, tat tomurcuklarının dışında bölümlere ayrılmıştır. (D-F) A-B'de segmentlere ayrılmıştır her yapıdaki floresan maskelenmiştir ve kesitlerde görülebilir. Tat alma tomurcukunun çevresi beyaz noktalı bir çizgi (D-F) ile özetlenmiştir. (D) Sarı hücre tat alma tomurcuk içindedir ve hem EdU etiketli hem de keratin-8+ şeklindedir. Macenta çekirdeği tat tomurcuklarının dışındadır ve keratin-8-'dir. (E) Deniz mavisi hücre tat tomurcuk içinde ve hem EdU etiketli hem de keratin-8+ . Mor EdU etiketli çekirdek keratin-8 ve tat tomurcuklarının (beyaz ok) dışındadır. (F) Mavi hücre keratin-8+ ve uzundur, olgun tat dönüştürücü hücrelerle tutarlıdır. A-C =3 μm'de ölçek çubukları; D = 2 μm'de ölçek çubukları; ölçek çubukları E, F = 4 μm. Kısaltma: EdU = 5-etil-2′-deoksiyridin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Bütün tat tomurcuk hücrelerinin şekilleri, diğer tat tomurcuk hücreleriyle olan ilişkileri ile birlikte analiz edilebilir. (A-F). Yüzeyler oluşturmak için bireysel tat tomurcuk hücrelerinin segmentlere ayırılması, bireysel tat tomurcuk hücrelerini izole ederek net görselleştirmeyi kolaylaştırır. Bireysel (A-C) Car4+ ve (D-F) PLCβ2+ hücreleri tek tek hücre şekillerindeki varyasyonu gösterir. (G) B'deki Car4+ hücresine en yakın PLCβ2+ hücresinin 200 nm içinde olduğu belirlendi (okla gösterilen tek bir küçük 0,5 μm2 konumda). Bir sonraki en yakın hücre 300 nm'den daha uzaktaydı ve segmentli Car4+ hücresinden ayrı bir yapı olarak ayırt edilebilirdi. (H, I) Bir sonraki en yakın hücre bölümlere ayrılmıştı; ve maskeli floresan sarı renkte gösterilir. Bir sonraki en yakın hücre (sarı) için en yakın üç nokta H, I'deki ok uçlarıyla gösterilir. A-C = 3 μm'de ölçek çubukları; D, E = 4 μm'de ölçek çubukları; F = 2 μm'de ölçek çubuğu; G-I =3 μm'de ölçek çubukları.

Figure 7
Şekil 7: Papillaya innervasyon ölçülmesi. (A) Tat nöronları için bazı etiketler de papillaya innervasyonu etiketler. (B) Tat toynak içindeki innervasyon, tat tomurcukunun (Şekil 3için açıklandığı gibi), (C) tat tomurcukunun içindeki innervasyonu maskelenerek ve daha sonra sadece tat tomurcukunun (koyu mavi) dışındaki innervasyonu maskelenerek tat tomurcukunun dışındaki innervasyondan ayrılır. Tat tokunun (kırmızı) innervasyon hacmi 1649.6 μm3idi. Tat tokmatı dışındaki innervasyon, papillanın altındaki tat liflerini içerecektir ve bu da papillanın innervasyonunun ölçülmesine dahil edilmelidir. (D) Papillaya innervasyon floresan maskeliydi (açık mavi). Papilla'nın innervasyon hacmi 121.8 μm3idi. A-D = 4 μm ölçek çubukları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Üç ağız boşluğu tat bölgesinden (mantar formu, circumvallate ve damak) bütün tat tomurcuklarını sürekli olarak toplamak ve lekelendirmek için bir yaklaşımın geliştirilmesi, tat dönüştürücü hücreleri analiz etmek, yeni birleştirilmiş hücreleri izlemek, innervasyon ve bu yapılar arasındaki ilişkileri izlemek için önemli iyileştirmeler sağlar. Ek olarak, etiketli bir popülasyonun içinde veya dışında potansiyel bir ikincil nöron işaretleyicisinin lokalizasyonunu kolaylaştırır50. Bu, gustatory papillae'nin de bazı tat nöronlarını etiketleyebilen sağlam somatosensör innervasyon52,53aldığı göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Papilla gövde tat tomurcukları da daha düşük bir büyütme kullanılarak görüntülenebilir. Bu, tüm papillanın yanı sıra tat tomurcuklarına innervasyonun görselleştirilmesine izin sağlar ve tat tokma ve çevresindeki sinir liflerine nüfuz eden innervasyonun bağımsız analizlerini sağlar.

Ciltteki somatosensör sinir uçları, saç kökleri etrafındaki organizasyonlarına ve epiteliyumun diğer bileşenleriyle ilişkilerine göre ayırt edilebilir; gustatory papillalarda paralel analizler benzer karakterizasyonlar sağlayabilir54,55. tat tomurcukları ve papillaların içindeki ilişkiler ve bileşimi için normal bir temel oluşturmak, periferik tat fonksiyonlarında açıkların altında kalan mekanizmaları belirlemek için bir temel görevi görecektir56,57. Tat alma tomurcuk, hücre devri ve terminal çardak tadilatının çeşitli faktörler tarafından koordine edildiği dinamik bir duyusal son organdır58. Tat almatomurcukları 59, hastalık süreçleri 57 ve normal tat fonksiyonu58 bozan kemoterapiler içindeki potansiyel devrelere yönelik araştırmalar, tüm tat tomurcuklarını ve sinir liflerini sağlam tutan bu yöntemle geliştirilebilir. Burada açıklanan tüm montaj yöntemi hem analiz olanaklarını genişletir hem de mümkün olan ölçümleri iyileştirir.

Dilin yoğun ve heterojen bir doku olduğu ve tat tomurcuklarının kendisinin geçirgenliği sınırlayan birçok hücreden hücreye birleşim içerdiği göz önüne alındığında27, tat tomurcuklarının tamamen monte boyanmasını gerçekleştirmek için bir yaklaşım geliştirmek önemli bir zorluk ortaya çıkarmıştır. Önceki yöntemler, temsilibölümlerin 60'ı almayı veya daha kalın bölümleri kesmeyi içeriyordu, bu da antikor penetrasyonunu32,33,34 ilesınırlaştırdı. Ek olarak, bu kalın bölümlerden bütün tat tomurcuklarının seçimi, verileri daha küçük tat tomurcuklarına doğru önyargılı yaptı. Alternatif olarak, epitelin soyulması tat alma tomurcuk sinir liflerini bozabilir; Bu yaklaşım kullanıldığında bunlar özellikle etiketli değildir39,40. Sinir çardakları bir tat alma tomurcukları içinde büyük bir pleksus oluşturur26,50,61, bu nedenle çardak kaldırmanın tat tomurcuklarındaki diğer hücreler arasındaki normal ilişkileri bozup bozmadığı belirsizdir. Buna karşılık, mevcut tam tat tomurcuk yöntemi mutlak sayıların ve ölçümlerin ölçülmesine izin eder. Bu boyama, birçok dönüştürücü hücre özelliklerinin (tür, şekil ve konum) ve terminal çardaklarının (ve aralarındaki ilişkilerin) korunmasına ve analiz edilmesine izin verir.

Bu yaklaşımın birkaç sınırlaması vardır. Özellikle, ince bölümlerde62 kullanılan bazı antikorlar, incelenebilecek yapı türlerini sınırlayacak bütün montajlarda çalışmaz. Ek olarak, konfokal mikroskopi çözünürlüğü sınırlı olduğundan, tek tek hücrelerden ve hücreler arasındaki ilişkilerden analiz edilen yapısal veriler de sınırlı olacaktır24. Örneğin, hücreler birbirine 200 nm mesafede olduğu belirlenebilir, ancak hücreler arasındaki özel yapılar (örneğin, sinapslar)63 incelenemez. Son olarak, tüm hücre türleri bu yaklaşım kullanılarak etiketlenemez. Örneğin, bu preparatta tuz eken hücreleri özellikle etiketlemenin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu hücreler Tip 1, Tip II ve Tip III hücreleri14 , 15 , 16,17,18,19,64'ünbirleşiminin bir alt kümesi olabilir. Öncelikle hücreleri destekleyen Tip I hücreleri, diğer hücrelerin etrafına sarılmış gibi göründükleri için tam montajlarda incelenemez, bu da onları ayrı varlıklar65olarak ayırt etmeyi zorlaştırır. Tuz transdükleyici hücreler için güvenilir bir işaretleyiciye sahip olmak, daha kapsamlı analizlere izin verecektir14,66. Aynı şekilde, PLCβ2 boyama birden fazla uyaran türünü üretebilen tat hücrelerini temsil ettiği için, bu hücre tipinin daha fazla ayrılmasına izin veren bir etiket de bir gelişme olacaktır.

Aşağıda bakım gerektiren önemli hazırlık adımları yer uzadı. öncelikle diseksiyon sonrası kalan kas tabakasının mümkün olduğunca eşit ve ince olduğundan emin olun. Bu tabaka eşit değilse, antikor penetrasyonu sonuçta tekdüze olmayacaktır. İkincisi, epitel parçalarının donmadan önce doku kalıbının dibinde düz bir şekilde yatması ve künt uçlu tokaların donana kadar dokuya hafifçe bastırmak için kullanılması çok önemlidir. Minimum miktarda kas (eşit bir tabakada) epitelimun alt tarafında kaldığında, üç kriyostat bölümü epitelimun altına ulaşacaktır. Dokunun kriyostat içinde konumlandırılması, böylece tüm doku yüzünde bölümler alınır, bazen dokunun bazı kısımlarının düzensiz bir şekilde çıkarılmasına neden olur. Bu nedenlerden dolayı, ek çözülme, daha fazla diseksiyon ve dokuyu yeniden çözmeden kaçınmanız şiddetle tavsiye edilir. Bunun yerine, dokuyu dondurmadan önce doku diseksiyonu değerlendirmeye özen edilmelidir.

Genel olarak, burada sunulan tam montajlı doku hazırlama yöntemi, tüm tat tomurcuklarının yanı sıra üç tat tomurcuk bölgesinden çevredeki papillaları toplamak için kullanılabilir: mantar formu, sirkülat ve damak. Çeşitli hastalık koşulları56,57 ve kemoterapi56 tat fonksiyonunu bozduğu bilinse de, bu değişikliklerin altında neden olan mekanizmalar bilinmemektedir. Burada sunulan tat tomurcukları için tüm montajlı boyama yaklaşımının kullanılması, hem tat dönüştürücü hücrelerin hem de sinir liflerinin, bir açığın belirli bir hücre tipinin kaybından mı, terminal çardak morfolojilerinden, tat dönüştürücü hücreler arasındaki ilişkileri bozup bozmadığını veya dönüştürücü hücreler ile sinir lifleri arasındaki ilişkileri bozup bozmadığını belirlemek için etiketlenebildiği sağlam bir deneysel tasarımı temsil eder. Ek olarak, sadece tat tomurcuklarındaki etiketli yeni hücrelerin mutlak sayısını ölçmek değil, aynı zamanda tanımlanmış bir türdeki (PLCβ2+ veya Car4+ gibi) yeni tat dönüştürücü hücrelerin (EdU etiketli) sayısını ölçmek de mümkündür. Bu yeni hücrelerin normal şekiller geliştirip normal olarak tat alma tomurcuklarına dahil olup olmadığı (yani tedaviden sonra tat alma tomurcuklarına taşınıp taşınmadığı) da incelenebilir. Bu önlemlerin çoğu, tat alma numarası ile birlikte, bir deney için gerekli farklı hayvanların sayısını sınırlayarak aynı dokudan yapılabilir. Bu olasılıklar, tat eksiklikleri için klinik müdahaleler sağlamak için deneysel yöntemlerin düzene girmesini kolaylaştırabilir ve tat fonksiyonunun altında yatan normal mekanizmalar hakkında fikir verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Doku lekeleme ve circumvallate tat tomurcuklarının görüntülenmesine yaptığı katkılar için Kavisca Kuruparanantha'ya, papillaya innervasyon lekesi ve görüntülemesi için Jennifer Xu'ya, hayvan bakımı ve genotipleme için Kaytee Horn'a ve yumuşak damak tadı tomurcuklarının doku lekesi için Liqun Ma'ya teşekkür ederiz. Bu proje R21 DC014857 ve R01 DC007176 tarafından R.F.K ve F31 DC017660 için L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 168 tat alma tomurcuk tüm montaj innervasyon afferent dil tat
Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter