Summary
Questo documento descrive i metodi per la generazione, il trattamento farmacologico e l'analisi di espianti derivati dal paziente per valutare le risposte ai farmaci tumorali in un sistema modello preclinico vivo, rilevante per il paziente.
Abstract
La comprensione della resistenza ai farmaci e lo sviluppo di nuove strategie per sensibilizzare i tumori altamente resistenti si basano sulla disponibilità di modelli preclinici adatti in grado di prevedere con precisione le risposte dei pazienti. Uno degli svantaggi dei modelli preclinici esistenti è l'incapacità di preservare contestualmente il microambiente tumorale umano (TME) e rappresentare accuratamente l'eterogeneità intratumorale, limitando così la traduzione clinica dei dati. Al contrario, rappresentando la coltura di frammenti vivi di tumori umani, la piattaforma di espianto derivato dal paziente (PDE) consente di esaminare le risposte ai farmaci in un contesto tridimensionale (3D) che rispecchia il più possibile le caratteristiche patologiche e architettoniche dei tumori originali. Precedenti rapporti con PDE hanno documentato la capacità della piattaforma di distinguere i tumori chemiosensibili da quelli chemioresistenti, ed è stato dimostrato che questa segregazione è predittiva delle risposte dei pazienti alle stesse chemioterapie. Allo stesso tempo, le PDE consentono l'opportunità di interrogare le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche dei tumori che predicono le risposte ai farmaci, identificando così i biomarcatori per la stratificazione del paziente e nuovi approcci interventistici per sensibilizzare i tumori resistenti. Questo documento riporta in dettaglio la metodologia PDE, dalla raccolta di campioni di pazienti fino all'analisi degli endpoint. Fornisce una descrizione dettagliata della derivazione dell'espianto e dei metodi di coltura, evidenziando le condizioni su misura per particolari tumori, se del caso. Per l'analisi degli endpoint, ci si concentra sull'immunofluorescenza multiplexata e sull'imaging multispettrale per la profilazione spaziale di biomarcatori chiave all'interno di entrambe le regioni tumorali e stromali. Combinando questi metodi, è possibile generare dati quantitativi e qualitativi sulla risposta ai farmaci che possono essere correlati a vari parametri clinicopatologici e quindi potenzialmente utilizzati per l'identificazione dei biomarcatori.
Introduction
Lo sviluppo di agenti antitumorali efficaci e sicuri richiede modelli preclinici appropriati che possano anche fornire informazioni sui meccanismi d'azione che possono facilitare l'identificazione di biomarcatori predittivi e farmacodinamici. L'eterogeneitàinter- e intratumorale1,2,3,4, 5 e la TME6,7,8,9,10, 11,12sono note per influenzare le risposte ai farmaci antitumorali e molti modelli di cancro preclinico esistenti come linee cellulari, organoidi e modelli murini non sono in grado di accogliere pienamente questi cruciali tratti somatici. Un modello "ideale" è quello che può ricapitolare le complesse interazioni spaziali di cellule maligne con cellule non maligne all'interno dei tumori e riflettere le differenze regionali all'interno dei tumori. Questo articolo si concentra sulle PDE come piattaforma emergente in grado di soddisfare molti di questi requisiti13.
Il primo esempio dell'uso di PDE umane, note anche come istocolture, risale alla fine degli anni 1980 quando Hoffman et al. generarono fette di tumori umani appena resecati e li coltivarono in una matrice di collagene14,15. Ciò ha comportato la creazione di un sistema di coltura 3D che ha preservato l'architettura dei tessuti, garantendo il mantenimento dei componenti stromali e delle interazioni cellulari all'interno della TME. Senza decostruire il tumore originale, Hoffman et al.16 hanno annunciato un nuovo approccio di ricerca traslazionale e, da questo momento, molti gruppi hanno ottimizzato diversi metodi di espianto con l'obiettivo di preservare l'integrità del tessuto e generare dati accurati sulla risposta ai farmaci17,18, 19,20,21,22,23,24 , anche se alcune differenze tra i protocolli sono evidenti. Butler et al. hanno coltivato espianti in spugne di gelatina per aiutare la diffusione di nutrienti e farmaci attraverso il campione20,21,25,mentre Majumder et al. hanno creato un ecosistema tumorale coltivando espianti su una matrice composta da proteine tumorali e stromali in presenza di siero autologo derivato dallo stesso paziente22, 23.
Più recentemente, il nostro gruppo ha istituito un protocollo in base al quale gli espianti sono generati dalla frammentazione dei tumori in pezzi di dimensioni 2 - 3 mm3che vengono poi posizionati senza componenti aggiuntivi su membrane permeabili all'interfaccia aria-liquido di un sistema dicoltura 24. Nel loro insieme, questi numerosi studi hanno dimostrato che le PDE consentono la coltura di frammenti intatti e vivi di tumori umani che conservano l'architettura spaziale e l'eterogeneità regionale dei tumori originali. Negli esperimenti originali, gli espianti o le istocolture venivano solitamente sottoposti a omogeneizzazione dopo il trattamento farmacologico, dopo di che sono stati applicati vari saggi di vitalità ai campioni omogeneizzati come il saggio di risposta ai farmaci inistocoltura 20,21, il saggio MTT (3-(6) -2,5-difeniltetrazolio bromuro), il saggio della lattato deidrogenasi o il saggio a base di resazurina26,27,28 . I recenti progressi nelle tecniche di analisi degli endpoint, in particolare la patologia digitale, hanno ora ampliato il repertorio di test e saggi endpoint che possono essere eseguiti su espianti29,30. Per applicare queste nuove tecnologie, invece dell'omogeneizzazione, gli espianti vengono fissati in formalina, incorporati nella paraffina (FFPE) e quindi analizzati utilizzando tecniche di immunocolorazione, consentendo la profilazione spaziale. Esempi di questo approccio sono stati documentati per il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), il cancro al seno, il cancro del colon-retto e gli espianti di mesotelioma, per cui la colorazione immunoistochimica per il marcatore di proliferazione, Ki67, e il marcatore apoptotico, la poli-ADP ribosio polimerasi scissa (cPARP), è stata utilizzata per monitorare i cambiamenti nella proliferazione cellulare e la morte cellulare24,31,32,33,34.
L'immunofluorescenza multiplexata è particolarmente suscettibile per la profilazione spaziale delle risposte ai farmaci negli espianti all'endpoint35. Ad esempio, è possibile misurare la rilocalizzazione e la distribuzione spaziale di specifiche classi di cellule immunitarie, come macrofagi o cellule T, all'interno della TME dopo il trattamento farmacologico13,36,37,38,e indagare se un agente terapeutico può favorire il passaggio da "tumore freddo" a "tumore caldo"39 . Negli ultimi anni, questo gruppo si è concentrato sulla derivazione di PDE da diversi tipi di tumore (NSCLC, cancro renale, cancro al seno, cancro del colon-retto, melanoma) e sulla sperimentazione di una serie di agenti antitumorali tra cui chemioterapie, inibitori di piccole molecole e inibitori del checkpoint immunitario (ICO). I metodi di analisi degli endpoint sono stati ottimizzati per includere l'immunofluorescenza multiplexata per consentire la profilazione spaziale dei biomarcatori per la vitalità e dei biomarcatori per i diversi costituenti della TME.
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Protocol
1. Raccolta dei tessuti
- Dopo l'intervento chirurgico, trasferire campioni di tumore umano appena resecati in un tubo contenente 25 ml di terreno di coltura fresco (il mezzo Eagle modificato di Dulbecco integrato con 4,5 g / L di glucosio e L-glutammina + 1% (v / v) siero fetale del vitello + 1% di penicillina-streptomicina) e conservato su ghiaccio. Elaborare l'espianto entro 2 ore dall'intervento chirurgico in una cappa sterile di classe II.
2. Preparazione Explant
- Pulire tutte le attrezzature chirurgiche (lame di innesto / superficie di cera dentale / pinzette) con una soluzione di spirito metilato industriale al 70% (IMS).
- Riempi un piatto di coltura di 10 cm (vedi la Tabella dei materiali)con ~ 25 ml di terreno fresco e posizionalo sopra un letto di ghiaccio.
- Usando una pinzetta, trasferire il campione su una superficie di cera dentale (vedere la tabella dei materiali)e tagliare il tessuto in frammenti di circa 2-3 mm3 usando due lame di innesto cutaneo.
NOTA: Per ottenere le migliori prestazioni, iniziare a affettare il tessuto per ottenere una singola striscia di 2-3 mm di spessore, quindi tagliare la striscia lungo la lunghezza per ottenere gli espianti finali. Ripetere il processo fino a quando l'intero campione non viene tritato. - Trasferire prontamente gli espianti nel terreno di coltura ghiacciato nel piatto da 10 cm. Prendere una parte degli espianti (6-9 pezzi), metterli in un tubo da 1 mL contenente il 10% di soluzione di formalina non tamponata e lasciare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore.
NOTA: Questi frammenti rappresenteranno gli espianti di controllo per la condizione "non coltivata". - Riempire il numero desiderato di pozzetti di piastre a 6 pozzetti con 1,5 ml di terreno fresco per pozzetto e posizionare un disco di inserto di coltura organotipico (vedere la Tabella dei materiali)in ciascun pozzetto in modo che galleggi sopra il mezzo, evitando accuratamente bolle d'aria all'interfaccia media-insert.
- Selezionare gli espianti in modo casuale e posizionarli uno alla volta sulla parte superiore del disco di inserimento. Per essere coerenti con la condizione "non coltivata", utilizzare 6-9 espianti per pozzetto. Posizionare la piastra multiwell in un incubatore a CO2 a 37 °C e 5% CO2e lasciare recuperare gli impianti per 16 ore.
NOTA: Per evitare di schiacciare il tessuto, si consiglia vivamente di maneggiare delicatamente le pinzette.
3. Trattamento farmacologico
- Dopo 16 ore, prendere nuove piastre a 6 pozzetti, aggiungere 1,5 ml di mezzo fresco a ciascun pozzetto, aggiungere i farmaci pertinenti alle concentrazioni desiderate e includere un pozzo per il controllo del veicolo. Usando le pinzette, spostare ogni inserto contenente gli espianti sulle piastre a 6 pozzetti appena preparate contenenti i farmaci. Posizionare le piastre nell'incubatore a CO2 a 37 °C e al 5% di CO2 per 24-48 ore.
- Trasferire gli espianti non coltivati precedentemente fissati in formalina in una cassetta istologica (vedere paragrafo 4 di seguito) e conservare in IMS al 70% fino alla fine dell'esperimento.
4. Trattamento istologico
- Fissazione dei tessuti
- Dopo il trattamento farmacologico, trasferire i dischi di inserto contenenti gli espianti in nuove piastre a 6 pozzetti contenenti il 10% di formalina e aggiungere alcune gocce di formalina al 10% sulla parte superiore degli impianti per garantire una copertura completa con il fissativo.
ATTENZIONE: La formalina è pericolosa. Evitare qualsiasi contatto con la pelle e maneggiarlo all'interno di un alimento fumi per prevenire l'inalazione. - Lasciare che gli espianti rimangano durante la notte (20-24 ore) nel 10% di formalina.
- Il giorno successivo, immergere il numero rilevante di piccole spugne istologiche nel 70% di IMS e posizionarle all'interno di cassette istologiche. Trasferire delicatamente tutti gli espianti da una determinata condizione di trattamento farmacologico su una singola spugna (mantenere l'orientamento degli espianti in modo che i lati degli impianti a contatto con i dischi dell'inserto, e quindi le aree trattate con il farmaco, siano posti a contatto con la spugna). Posizionare un'altra spugna presoaperta sopra gli espianti e fissarla all'interno di una cassetta istologica (una cassetta per pozzo / trattamento).
- Immergere le cassette in 70% IMS e lasciare a RT per 24 ore.
- Dopo il trattamento farmacologico, trasferire i dischi di inserto contenenti gli espianti in nuove piastre a 6 pozzetti contenenti il 10% di formalina e aggiungere alcune gocce di formalina al 10% sulla parte superiore degli impianti per garantire una copertura completa con il fissativo.
- Incorporamento di paraffina e sezionamento dei tessuti
- Il giorno seguente, trasferire le cassette istologiche contenenti gli espianti nel cestello campione del processore tissutale (vedere la Tabella dei materiali)e fissare il coperchio. Posizionare il cestello nella storta e chiudere delicatamente. Selezionare il programma desiderato e avviare il processore. Scolare la storta, aprirla per rimuovere il cestello e trasferire il cestello nel bagno di cera centrale incorporato.
- Dopo l'incorporamento, trasferire i coperchi delle cassette metalliche nel cestello e tornare alla storta del processore tissue per il programma di pulizia. Pulire il sensore con un fazzoletto asciutto, rimuovere la cera in eccesso dal coperchio della storta e procedere con il programma di pulizia.
- Posizionare un blocco di paraffina nel microtomo rotante, tagliare alcune sezioni a 4 μm e riportare il blocco sul ghiaccio. Riposizionare il blocco e tagliare più sezioni da 4 μm. Trasferire le sezioni con un piccolo pennello e una pinza a bagnomaria per rimuovere pieghe e bolle.
- Posizionare le sezioni centralmente sui vetrini del microscopio, scaricare i vetrini per alcuni minuti e metterli in una griglia per asciugare durante la notte in un'incubatrice a 37 °C. Quando le sezioni sono asciutte, conservarle a RT in una cartella o scatola di diapositive per proteggerle dalla polvere.
5. Colorazione di ematossilina ed eosina (H & E)
- Riempire la scala (vedi la Tabella dei materiali)con reagenti e impostare il programma richiesto per la colorazione H & E: tempo di incubazione dell'ematossilina: 5 min; tempo di incubazione eosina: 3 min.
- Collegare il portapacchi al supporto, posizionarlo nel primo contenitore con xilene e avviare il programma. Rimuovere il supporto per diapositive dal rack e portare il contenitore con il rack scorrevole nell'area di montaggio.
- Montare i vetrini con dibutilftalato xilene (DPX) sotto il cappuccio di estrazione. Posiziona DPX su ogni coverslip e abbassa la diapositiva sul coverslip con la sezione verso il basso, consentendo al DPX di diffondersi.
NOTA: DPX è pericoloso. Evitare qualsiasi contatto con la pelle e utilizzare in una cappa aspirante designata.
6. Immunocolorazione
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti a RT, se non diversamente specificato.
- Deparaffinazione e reidratazione
- Posizionare i vetrini in una griglia e riscaldare a 65 °C per 10 minuti prima di deparaffinizzare le sezioni in xilene per 3 minuti (2x). Ridurre al minimo la quantità di soluzione di riporto.
NOTA: lo xilene è infiammabile, pericoloso e irritante. Maniglia all'interno della cappa aspirante utilizzando guanti a doppio strato. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Smaltire i rifiuti all'interno di un contenitore sigillato. - Reidratare le diapositive in un gradiente alcolico come segue: 99% IMS per 1 min (2x) e 95% IMS per 1 min. Ridurre al minimo la quantità di soluzione di riporto.
NOTA: IMS è altamente infiammabile, volatile e irritante. Maneggiare all'interno della cappa aspirante ed evitare il contatto con la pelle e gli occhi. - Immergere completamente il portascivolo in acqua ultrapura (UP) per 5 minuti.
- Posizionare i vetrini in una griglia e riscaldare a 65 °C per 10 minuti prima di deparaffinizzare le sezioni in xilene per 3 minuti (2x). Ridurre al minimo la quantità di soluzione di riporto.
- Recupero dell'antigene
- Preparare il tampone di recupero dell'antigene secondo le linee guida del produttore per il particolare anticorpo utilizzato.
NOTA: Tampone citrato 0,2 M, pH 6, o tris(idrossimetil)aminometano (Tris)-etilendiammina acido tetraacetico (EDTA) 0,1 M, pH 9, sono i tamponi comuni utilizzati per condizioni acide o alcaline, rispettivamente. L'acido citrico monoidrato e tris sono agenti irritanti. Preparare tutte le soluzioni stock nella cappa aspirante. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. - Immergere il rack contenente i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene e nel microonde (vedere la Tabella dei materiali)a piena potenza (800 W) per 20 min.
NOTA: mantenere le diapositive completamente immerse nel buffer durante l'intero processo. Per evitare un'eccessiva riduzione del volume del tampone, posizionare un coperchio sopra il contenitore utilizzato.
- Preparare il tampone di recupero dell'antigene secondo le linee guida del produttore per il particolare anticorpo utilizzato.
- Immunofluorescenza multiplex (mIF)
NOTA: questo processo richiede 1-2 giorni.- Riempire un contenitore pulito con 250 ml di acqua UP e immergere completamente il rack scorrevole per 2 minuti (2x). Procedere con l'assemblaggio di ogni diapositiva in una piastra di copertura della diapositiva (vedere la Tabella dei materiali).
- Per assemblare uno scivolo su una piastra di copertura, preparare un trogolo di vetro con acqua. Immergere sia la piastra di copertura che scivolare nell'acqua, posizionando il lato della sezione del tessuto rivolto verso la piastra di copertura.
- Posizionare il bordo inferiore della diapositiva sopra le protuberanze nella parte inferiore della piastra di copertura e infine allineare la diapositiva alla piastra di copertura, consentendo all'acqua di riempire lo spazio intermedio senza intrappolare l'aria. Tenere la piastra di copertura e farla scorrere insieme e posizionarle in un rack di copertura.
- Riempire la piastra di copertura con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e attendere che il tampone lavi i vetrini, che fuoriescono per gravità (2x). Pipettare 110 μL di tampone di blocco (vedere la tabella dei materiali)su ciascuna piastra di copertura e incubare per 10 min.
- Preparare la diluizione dell'anticorpo primario desiderata in PBS o tampone di blocco secondo le raccomandazioni del produttore. Incubare i vetrini con anticorpo primario (110 μL ogni vetrino) per 30 min. Lavare i vetrini con 5 mL di PBS (2x), come descritto al punto 6.3.2.
- Incubare i vetrini con 110 μL di polimero perossidasi di rafano per 30 min. Lavare i vetrini con 5 mL di PBS (2x), come descritto al punto 6.3.2.
- Preparare la diluizione del fluoroforo in diluente di amplificazione 1:100 (v/v) e incubare i vetrini con fluoroforo (110 μL ogni vetrino) per 10 min. Lavare i vetrini con 5 mL di PBS (2x), come descritto al punto 6.3.2.
NOTA: Per l'uso del fluoroforo 780, seguire le linee guida del produttore. L'esperimento può essere sospeso qui se i vetrini vengono incubati nel lavaggio finale di PBS e conservati a 4 °C durante la notte. - Sganciare i vetrini dalle piastre di copertura e tornare alla fase di recupero dell'antigene per iniziare la colorazione con un anticorpo diverso. Ripetere la colorazione per il numero desiderato di anticorpi da testare.
- Seguendo il passaggio 6.3.5 per l'ultimo fluoroforo in uso, tenere i vetrini sulle piastre di copertura, preparare una soluzione da 6 μM di dilatato di 4'-6-diamidino-2-fenilide (DAPI) con acqua UP e controbattere i vetrini per 5 minuti (110 μL ogni diapositiva). Lavare i vetrini con acqua UP (2x) e rimuovere l'acqua in eccesso asciugando i bordi delle diapositive. Assemblare le copertine sulle diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e conservare a RT al buio.
- Riempire un contenitore pulito con 250 ml di acqua UP e immergere completamente il rack scorrevole per 2 minuti (2x). Procedere con l'assemblaggio di ogni diapositiva in una piastra di copertura della diapositiva (vedere la Tabella dei materiali).
7. Scansione
NOTA: la scansione delle diapositive è stata eseguita utilizzando un sistema di imaging automatizzato multispettrale (vedere la Tabella dei materiali).
- Assemblare le diapositive nel supporto e caricarle nello scanner nell'ordine desiderato.
NOTA: Si raccomanda di includere un vetrino di controllo in cui non venga utilizzato fluoroforo o DAPI durante la colorazione immunoistochimica. Questo vetrino sarà utilizzato come controllo per la fioritura intrinseca (autofluorescenza (AF)) del tessuto. - Dopo aver avviato il software dello scanner di diapositive, selezionare Modifica protocollo dalla home page. Creare un nuovo protocollo indirizzando il nome,la modalità di imaging,il tipo di scansione multispettrale da eseguire(4-7 canali)e lo studio(directory).
NOTA: per modificare le impostazioni predefinite delle bande analizzate, selezionare/deselezionare i filtri desiderati utilizzando la funzione Seleziona bande di scansione - Procedere con Scan Exposure and Load carrier, e infine selezionare il vettore per la configurazione del protocollo. Selezionare Panoramica per rilevare il tessuto sul vetrino. Scegli una diapositiva visualizzata sul supportoe seleziona un'area specifica del tessuto con il cursore rosso per portarlo in vista dal vivo nella finestra di sinistra dello schermo.
- Selezionare il filtro DAPIe fare clic su Messa a fuoco automatica o regolare manualmente il dispositivo di scorrimento Altezza stage per mettere a fuoco il campo di interesse. Fare clic su Autoexpose per consentire al sistema di trovare l'esposizione migliore per quel filtro / banda.
NOTA: il tempo di esposizione per ciascun filtro è impostato su 12 ms. Dopo aver esposto automaticamente il sistema, perfezionare il tempo di esposizione per una stima migliore. È anche possibile ignorare il valore di esposizione automatica digitando manualmente un valore nella cella evidenziata. - Ripetere i passaggi precedenti per tutti i filtri nel protocollo. Se necessario, modificare le posizioni e/o le diapositive per trovare i segnali migliori per impostare le esposizioni.
NOTA: se il tessuto è evidenziato in rosso in live view, il segnale fluorescente del filtro analizzato è saturo e l'autoesposizione deve essere ripetuta. - Una volta stabilite le impostazioni di esposizione, fare clic sul pulsante Indietro e salvare il protocollo. Dalla home page del software (vedere la tabella dei materiali),selezionare Scansiona diapositive.
- Impila tutti i corrieri da scansionare nello Slide Carrier Hotele prendi nota dell'ordine delle diapositive per assegnare il loro ID nel sistema.
NOTA: nella schermata del software, ogni operatore sarà correlato a uno slot contenente 4 diapositive. - Per configurare più diapositive con gli stessi parametri, clicca su Configura attività,e seleziona uno o più Slot con l'opzione Ucanta le stesse regole per le stesse slide. Una volta aperta la finestra di dialogo Modifica diapositive, configurare: Attività, Studioe Protocollo,e fare clic su OK.
- Etichettare ogni diapositiva facendo clic sull'icona Slot e digitare un nome nella cella ID diapositiva. Fare clic su Scansione per avviare la scansione.
NOTA: Una volta che l'icona Slot diventa blu e le diapositive sono contrassegnate da una freccia blu, il corriere ha tutte le regole ed è pronto per essere scansionato. È possibile salvare gli ID diapositiva, gli studi, i protocolli e le attività facendo clic sul pulsante Salva configurazione.
8. Analisi
NOTA: Il protocollo seguente illustra il metodo per l'analisi del fenotipo.
- Preparazione dell'immagine
- Per preparare le immagini per l'analisi, aprire il software del visualizzatore (vedere la Tabella dei materiali)e selezionare Carica diapositive. Selezionare le scansioni desiderate per il progetto di formazione sul lato destro dello schermo.
- Per ogni scansione, fare clic su Timbroe scegliere Progetto nella casella Seleziona per: Definire un timbro con dimensioni 1 x 1 nel campo immagine da utilizzare in seguito come modello per l'analisi dell'addestramento. Osserva che questo timbro sarà contrassegnato come un quadrato rosso.
NOTA: il numero di annotazioni di timbro per il progetto è arbitrario. Si consiglia di generarne uno per la scansione di fluorescenza intrinseca e alcuni altri che sono generalmente rappresentativi della distribuzione del segnale all'interno del tessuto. - Infine, apri tutte le scansioni dell'esperimento. Per ognuno, fai clic su Timbroe questa volta scegli l'opzione Batch nella casella Seleziona per: Posiziona un timbro che circoscrive ogni espianto.
NOTA: questa volta, i timbri saranno contrassegnati come quadrati verdi e saranno necessari una volta avviata l'analisi del batch. Scegli la dimensione appropriata per i francobolli (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) ed evita la sovrapposizione dei francobolli, che genererebbero dati duplicati nel file esportato.
- Analisi della formazione
- Avviare il software per l'analisi (vedere la Tabella dei materiali)e creare un nuovo progetto: Selezionare File | Nuovi | Progetto.
- Digitare un nome nella casella Nome progetto e configurare il tipo di progetto.
NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando le seguenti specifiche: segmentazione dei tessuti addestrabili; segmentazione cellulare adattiva; fenotipizzazione. - Carica le scansioni contenenti i timbri per l'allenamento: File | Apri | Immagine. Nella vista a modalità singola,navigare tra le immagini e selezionare le scansioni con fluorescenza intrinseca.
- Fare clic sul pulsante Autofluorescenza (AF) e, con il selettore Autofluorescenza,disegnare su una porzione di tessuto non macchiata. Clicca su Prepara immagini per permettere al software di sottrarre l'intensità della fluorescenza intrinseca da tutte le immagini caricate per l'allenamento.
- Fare clic sul pulsante Modifica marcatori e colori e immettere i nomi dei marcatori nella casella associata al loro fluoroforo. Fare clic sul passaggio Segment Tissue nella parte superiore dello schermo per aprire la finestra Tissue Segmentation Training.
- Nella finestra Categorie di tessuto, digitare il nome delle categorie di tessuto in cui segmentare le immagini (ad esempio, Tumore, Stroma, Sfondo, Necrosi).
- Nella finestra Formazione sulla segmentazione dei tessuti, fare clic sul pulsante Disegna e disegnare le regioni attorno a gruppi di cellule per definire una categoria di tessuto di interesse. Ad esempio, per definire un'area tumorale, disegnare una regione attorno a un gruppo di cellule tumorali. Passare alla categoria successiva e ripetere il processo di disegno.
NOTA: si consiglia di disegnare le regioni nella maggior parte delle immagini caricate per l'allenamento. È anche possibile perfezionare la formazione modificando la Scala del Modello e la Risoluzione di Segmentazione i cui dettagli sono meglio descritti nel manuale dell'utente. - Dopo aver definito le regioni di allenamento, procedere con Train the Tissue Segmenter.
NOTA: durante il processo di allenamento, il software visualizza la percentuale di precisione della segmentazione dei tessuti. Per risultati ottimali, si raccomanda che la segmentazione dei tessuti sia accurata almeno al 90%. Una volta che il segmenter si è stabilizzato, fare clic sul pulsante Fine. - Per vedere la maschera Categoria Tessuto su tutte le immagini, fare clic sul pulsante Segmenta tutto.
- Dopo aver verificato la qualità della segmentazione dei tessuti, ridisegnare le regioni di allenamento intorno alle aree che sono state classificate in modo errato e ri-addestrare il Tissue Segmenter fino a quando il processo non ha successo.
- Fare clic sul passaggio Segmentazione cella nella barra dei passaggi nella parte superiore della finestra per procedere con l'analisi.
- Scegli i compartimenti cellulari da segmentare: Nuclei, Citoplasmae/o Membrana.
NOTA: poiché la segmentazione cellulare adattiva può rilevare solo cellule con segnale nucleare, non deselezionare Nuclei. Sebbene sia anche possibile segmentare il citoplasma e/o la membrana, si raccomanda di scegliere prima il componente nucleare più forte e più abbondante (ad esempio, DAPI). - Configurare il componente nucleare utilizzando il dispositivo di scorrimento Intensità tipica per regolare la soglia utilizzata per rilevare i pixel nucleari. Prendi nota della finestra di anteprima che si apre e fornisce feedback in tempo reale quando la soglia viene regolata.
NOTA: questa soglia è adattiva e viene misurata rispetto allo sfondo circostante. Aumentare questo valore se viene rilevato troppo background come nucleare. Abbassare questo valore se si perdono nuclei deboli. Utilizzare il pulsante Mostra/Nascondi regioni per attivare e disattivare le maschere di segmentazione e verificare se i pixel corretti vengono rilevati come nucleari. - Per dividere gruppi di pixel nucleari, utilizzate il pannello Divisione componenti nucleari. Scegli il pulsante che meglio descrive la qualità di colorazione dei nuclei. Quindi, utilizzare la barra di scorrimento per regolare la sensibilità di divisione, tenendo presente che valori più bassi comporteranno una maggiore divisione.
- Fare clic sul pulsante Segmenta tutto per segmentare tutte le immagini. Se il risultato non è accurato, modificare le impostazioni e riaddestrare il software fino a ottenere una segmentazione soddisfacente.
- Procedere all'ultima fase dell'analisi: Fenotipizzazione. Nel pannello Fenotipi, aggiungete l'elenco dei fenotipi da rilevare e digitate il nome nella casella di testo corrispondente. Fare clic sul pulsante Modifica fenotipi, selezionare una particolare cella per visualizzare un menu a discesa e scegliere il fenotipo corrispondente.
NOTA: Sono necessarie almeno cinque cellule per ogni fenotipo per addestrare il classificatore. Disattivare la visualizzazione dei nuclei consente una migliore visualizzazione del fenotipo cellulare che deve essere assegnato. - Una volta completata la selezione per la formazione, fare clic sul pulsante Classificatore treno.
NOTA: Il software classificherà ogni singola cella nell'immagine e ogni volta che si verificano errori di classificazione, è possibile modificare il fenotipo delle cellule e ripetere l'addestramento del classificatore. Salva il progetto prima di procedere all'analisi batch e fai clic su Esporta nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo. - Selezionate la scheda Analisi bagno (Bath Analysis) nel menu a sinistra e caricate il progetto nella casella Algoritmo batch o Progetto (Batch Algorithm) o Progetto (Batch Algorithm) .
- Fare clic su Opzioni di esportazione per creare directory separate per ogni immagine e, con il pulsante Sfoglia, spostarsi per trovare la posizione in cui esportare i dati. Clicca su tutte le opzioni delle Immagini e Tabelle da esportare.
- Sul lato destro dello schermo, fare clic su Aggiungi diapositive e caricare tutte le immagini contenenti timbri per lotti precedentemente preparati (passaggio 7.3). Fare clic sul pulsante Esegui per avviare l'analisi batch ed elaborare un timbro alla volta, esportando i dati corrispondenti.
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Representative Results
L'imaging multispettrale di sezioni istologiche colorate con mIF consente l'identificazione e la fenotipizzazione di singole popolazioni cellulari e l'identificazione di componenti tumorali e stromali nell'espianto TME (Figura 2). L'imaging multispettrale è particolarmente utile per l'analisi di tessuti ad alta autofluorescenza intrinseca, come tessuti ad alto contenuto di collagene, in quanto consente di deconvolure il segnale di autofluorescenza da altri segnali ed escluderlo da analisi successive. La successiva segmentazione del tessuto e delle cellule in silico consente la quantificazione della risposta al farmaco con una moltitudine di output inclusi, ma non limitati a, numeri di cellule grezze (ad esempio, percentuale di positività), intensità del segnale, dimensioni delle cellule, area tissutale e posizione spaziale delle singole cellule.
La segmentazione tissutale e cellulare è quindi estremamente utile per l'analisi quantitativa degli esiti del trattamento farmacologico e l'identificazione delle risposte tumore-specifiche e stromali. Ad esempio, la colorazione per Ki67 e cPARP insieme a un marcatore tumorale consente la quantificazione dei livelli di proliferazione e morte cellulare, rispettivamente, negli espianti (Figura 3). Nell'esempio fornito, i livelli di Ki67 e cPARP sono quantificati per le regioni stromali e tumorali nelle PDE in risposta all'inibitore del checkpoint immunitario (ICI) della proteina di morte cellulare anti-programmata 1 (PD-1), nivolumab. Inoltre, la capacità di estrarre informazioni spaziali da sezioni colorate consente il calcolo delle distanze intercellulari e delle distanze dai bordi tumorali e da altre strutture. Pertanto, i cambiamenti nella distribuzione cellulare dopo il trattamento farmacologico possono essere analizzati quantitativamente (Figura 4). L'esempio mostrato rappresenta il trattamento della PDE con nivolumab.
Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione e l'analisi delle PDE. (A) I campioni di tumore umano appena resecati vengono elaborati e disposti su un disco di inserto di coltura permeabile che galleggia nel terreno di coltura. (B)Dopo il trattamento farmacologico, gli espianti vengono raccolti, sottoposti a FFPE e quindi sezionati per l'analisi istologica, ad esempio per la colorazione H & E. (C)La colorazione mIF e la scansione delle sezioni tissutali vengono eseguite per generare immagini multispettrali da cui i singoli segnali possono essere deconvoluti e analizzati separatamente. (D) L'analisi di immagini composite consente la separazione delle aree tumorali e stromali e la valutazione del fenotipo di diversi tipi di cellule. Abbreviazioni: PDE = espianto derivato dal paziente; FFPE = fissato in formalina, incorporato nella paraffina; H&E = ematossilina ed eosina; mIF = immunofluorescenza multiplex; HRP = perossidasi di rafano; H2O2 = perossido di idrogeno; Ab = anticorpo; TSA = amplificazione del segnale tiromidico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di sezione di tessuto macchiata di mIF. Il tessuto di espianto NSCLC è stato colorato per i marcatori di vitalità cellulare, vale a dire, cPARP (rosso) e Ki67 (verde), nonché un marcatore pan-citocheratina (giallo) e DAPI (blu) per contrassegnare i nuclei. L'imaging multispettrale è stato eseguito per deconvolure i segnali fluorescenti e rimuovere l'autofluorescenza. Le immagini mostrano un ingrandimento 20x del campo selezionato. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: mIF = immunofluorescenza multiplex; NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule; cPARP = poli-ADP ribosio polimerasi scissa; CK = citocheratina; DAPI = 4'-6-diamidino-2-fenilindolo; AF = autofluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione della morte cellulare e della proliferazione nelle PDE. Esempio di grafici scatola e baffi che mostrano l'induzione dell'apoptosi nelle PDE NSCLC dopo 24 ore di trattamento con nivolumab da 5 μg/mL rispetto al controllo medio. La percentuale di proliferazione (Ki67) e la percentuale di eventi di morte cellulare apoptotica (cPARP) sono visualizzate rispettivamente nell'area tumorale e nello stroma. Ogni punto rappresenta un singolo espianto, la linea centrale della scatola rappresenta la mediana della distribuzione e i lati della scatola (inferiore e superiore) rappresentano rispettivamente il primo e il terzo quartile. Le barre di errore rappresentano l'intervallo interquartile (oltre 1,5 x IQR). Abbreviazioni: PDE = espianto derivato dal paziente; NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule; cPARP = poli-ADP ribosio polimerasi scissa; IQR = intervallo interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Organizzazione spaziale dopo il trattamento farmacologico. (A) Immagini rappresentative che mostrano la colorazione mIF dei marcatori delle cellule T - CD4, FOXP3, CD8 (pannello di sinistra) - eseguita su un espianto di melanoma e la corrispondente analisi fenotipica (a destra) che identifica le distanze intercellulari tra cellule CD8 + e cellule Treg (CD4 + / FOXP3 +). Barre di scala = 200 μm. (B) Grafico dell'istogramma che mostra una maggiore distanza tra cellule T citotossiche (CD8+) e cellule Treg (CD4+/FOXP3+) dopo il trattamento delle PDE del melanoma con 5 μg/mL di nivolumab, confermando gli effetti sul bersaglio del farmaco IO. L'unità di densità è espressa come il numero di celle diviso per la somma di tutte le celle per larghezza di banda. Abbreviazioni: mIF = immunofluorescenza multiplex; CD = cluster di differenziazione; FOXP3 = Scatola a forcella P3; PDE = espianto derivato dal paziente; NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule; IO = immunooncologia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive i metodi per la generazione, il trattamento farmacologico e l'analisi delle PDE ed evidenzia i vantaggi della piattaforma come sistema modello preclinico. La coltivazione ex vivo di un tumore appena resecato, che non comporta la sua decostruzione, consente la ritenzione dell'architettura tumorale13,24 e, quindi, le interazioni spaziali dei componenti cellulari nella TME e l'eterogeneità intratumorale. Questo metodo dimostra come, utilizzando un marcatore tumore-specifico, sia possibile identificare aree di tessuto tumorale rispetto ad aree di stroma e quindi separare le risposte farmacologiche all'interno di questi compartimenti (Figura 3). Inoltre, più biomarcatori possono essere profilati contemporaneamente per valutare, ad esempio, il movimento mirato delle cellule immunitarie all'interno della TME (Figura 4).
Una precedente pubblicazione ha documentato l'applicazione di questa piattaforma PDE alla stratificazione di PDE NSCLC per la chemioterapia standard di cura, il cisplatino, dimostrando che è possibile separare il chemoresistant dalle popolazioni chemiosensibili24. Questi risultati correlati alla PDE rispecchiano le risposte dei pazienti. Seguendo i metodi qui descritti, è possibile intraprendere approcci simili per altri tipi di tumore e con diversi tipi di farmaci, chemioterapici o altro. La separazione delle PDE in popolazioni sensibili ai farmaci e resistenti ai farmaci crea una risorsa inestimabile per generare ulteriori informazioni meccanicistiche sulla resistenza ai farmaci. Ad esempio, poiché le PDE possono essere elaborate per l'isolamento di RNA, DNA, proteine o metaboliti, ciò può consentire l'implementazione di tecnologie "omiche" per identificare biomarcatori chiave predittivi della risposta. In alternativa, le sezioni FFPE generate da PDE trattate possono essere utilizzate per un'ampia profilazione spaziale per comprendere in che modo i diversi tipi di cellule nella PDE contribuiscono alla resistenza ai farmaci.
Ciò può essere facilitato da ulteriori sviluppi nell'imaging multispettrale e negli approcci di citometria di massa35,40, 41,42, 43,che consentirebbero di profilare contemporaneamente centinaia di biomarcatori. I modelli preclinici che valutano l'efficacia immunoterapeutica sono molto ricercati e questo documento dimostra che le PDE possono riempire questa nicchia critica (Figura 3 e Figura 4). Anticorpi monoclonali mirati ai checkpoint immunitari, come l'antigene 4 dei linfociti T citotossici e pd-1/ligando di morte programmata-1 (PD-L1), sono stati sviluppati44,45,46,47 con alcuni notevoli miglioramenti nella sopravvivenza globale del paziente in un gran numero di tumori solidi rispetto alla chemioterapia standard. Tuttavia, le ICI sono efficaci in un numero limitato di pazienti per ragioni non chiare, che richiedono l'identificazione di biomarcatori predittivi48. L'eccezionale caratteristica delle PDE , che preserva l'architettura 3D del tessuto tumorale, facilita la valutazione dell'efficacia dell'ICI (Figura 3) e il monitoraggio delle cellule immunitarie in risposta al trattamento ICI (Figura 4). Pertanto, le PDE sono una piattaforma ideale per distinguere i casi sensibili all'ICI rispetto ai casi resistenti all'ICI e per studiare i meccanismi alla base di questa distinzione.
La tecnologia PDE soffre di alcuni svantaggi. La generazione di risultati accurati e sperimentali dalle PDE si basa sull'integrità del tumore e, occasionalmente, i campioni di tumore dopo l'intervento chirurgico sono troppo necrotici per essere elaborati per le PDE. Inoltre, nonostante alcuni esempi specifici di ritenzione dell'integrità tissutale dopo coltura prolungata25, per la maggior parte dei casi segnalati, l'integrità e la vitalità sono state perse dopo 72 ore in coltura e si verifica la disintegrazione dei tessuti. La finestra di tempo per eseguire esperimenti farmacologici è quindi relativamente limitata, vietando l'uso di questo modello per lo studio dei meccanismi di resistenza ai farmaci acquisiti o lo studio dell'invasione e delle metastasi13. Estendere la vitalità degli impianti potrebbe diventare possibile in futuro attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie, come impalcature e canali perfusi, che possono facilitare la diffusione e l'assorbimento dei nutrienti, consentendo una coltura più estesa.
Tuttavia, fino a quando questi miglioramenti non saranno apportati, la piattaforma PDE dovrebbe essere considerata un metodo di coltura a breve termine in grado di fornire dati immediati sulla risposta ai farmaci. Dovrebbe essere utilizzato insieme ad altri sistemi modello, come organoidi e modelli PDX, in grado di fornire dati di risposta ai farmaci a lungo termine. Nel complesso, la piattaforma PDE è un sistema di modelli preclinici proof-of-concept che è utile per determinare la sensibilità del tumore di un paziente a un determinato agente antitumorale, per ricavare informazioni sui meccanismi di azione del farmaco in un tumore reale e per sviluppare biomarcatori predittivi e farmacodinamici.
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Disclosures
Niente da rivelare
Acknowledgments
Ringraziamo i chirurghi e i patologi degli ospedali universitari di Leicester NHS Trust per aver fornito tessuto tumorale resecato chirurgicamente. Ringraziamo anche la struttura di istologia all'interno di Core Biotechnology Services per l'aiuto con la lavorazione dei tessuti e il sezionamento dei blocchi di tessuto FFPE e Kees Straatman per il supporto con l'uso di Vectra Polaris. Questa ricerca è stata sostenuta e finanziata dal Consorzio Explant composto da quattro partner: l'Università di Leicester, l'Unità di Tossicologia MRC, i Laboratori di Scoperta Terapeutica di Cancer Research UK e LifeArc. Un ulteriore supporto è stato fornito dal CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Il finanziamento per GM, CD e NA è stato fornito dal Breast Cancer Now's Catalyst Programme (2017NOVPCC1066), supportato da finanziamenti di Pfizer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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