Summary
Este artigo descreve métodos para a geração, tratamento medicamentoso e análise de explants derivados do paciente para avaliar as respostas de medicamentos tumorais em um sistema modelo pré-clínico vivo, relevante para o paciente.
Abstract
A compreensão da resistência a medicamentos e o desenvolvimento de novas estratégias para sensibilizar cânceres altamente resistentes dependem da disponibilidade de modelos pré-clínicos adequados que possam prever com precisão as respostas dos pacientes. Uma das desvantagens dos modelos pré-clínicos existentes é a incapacidade de preservar contextualmente o microambiente tumoral humano (TME) e representar com precisão a heterogeneidade intratumoral, limitando assim a tradução clínica dos dados. Em contraste, representando a cultura de fragmentos vivos de tumores humanos, a plataforma de explante derivada do paciente (PDE) permite que as respostas medicamentosas sejam examinadas em um contexto tridimensional (3D) que espelha as características patológicas e arquitetônicas dos tumores originais o mais de perto possível. Relatórios anteriores com PDEs documentaram a capacidade da plataforma de distinguir quimosensitivos de tumores quimorsistantes, e foi demonstrado que essa segregação é preditiva das respostas dos pacientes às mesmas quimoterapias. Simultaneamente, os PDEs permitem a oportunidade de interrogar características moleculares, genéticas e histológicas de tumores que predizem respostas medicamentosas, identificando assim biomarcadores para estratificação do paciente, bem como novas abordagens intervencionistas para sensibilizar tumores resistentes. Este artigo relata em detalhes a metodologia do PDE, desde a coleta de amostras de pacientes até a análise de ponto final. Fornece uma descrição detalhada dos métodos de derivação e cultura explanta, destacando condições sob medida para tumores específicos, quando apropriado. Para análise de ponto final, há um foco em imunofluorescência multiplexada e imagem multiespectral para o perfil espacial de biomarcadores-chave dentro das regiões tumorais e estrômicas. Ao combinar esses métodos, é possível gerar dados quantitativos e qualitativos de resposta a medicamentos que possam estar relacionados a vários parâmetros clínicopatológicos e, portanto, potencialmente utilizados para identificação de biomarcadores.
Introduction
O desenvolvimento de agentes anticancerígenos eficazes e seguros requer modelos pré-clínicos adequados que também possam fornecer insights sobre mecanismos de ação que possam facilitar a identificação de biomarcadores preditivos e farmacodinâmicos. Heterogeneidade inter e intratumor1,2,3,4,5 e o TME6,7,8,9,10,11,12 são conhecidos por influenciar respostas anticancerígenas, e muitos modelos de câncer pré-clínico existentes, como linhas celulares, organoides e modelos de camundongos não são capazes de acomodar totalmente esses modelos cruciais de medicamentos Características. Um modelo "ideal" é aquele que pode recapitular as complexas interações espaciais de malignos com células não malignas dentro dos tumores, bem como refletir as diferenças regionais dentro dos tumores. Este artigo se concentra nos PDEs como uma plataforma emergente que pode cumprir muitos desses requisitos13.
O primeiro exemplo do uso de PDEs humanos, também conhecidos como histoculturas, remonta ao final da década de 1980, quando Hoffman et al. geraram fatias de tumores humanos recém-ressecados e os cultivaram em uma matriz de colágeno14,15. Isso envolveu o estabelecimento de um sistema de cultura 3D que preservasse a arquitetura tecidual, garantindo a manutenção de componentes estrômicos e interações celulares dentro do TME. Sem desconstruir o tumor original, Hoffman et al.16 anunciaram uma nova abordagem da pesquisa translacional, e desde então, muitos grupos otimizaram diferentes métodos de explantamento com o objetivo de preservar a integridade do tecido e gerar dados precisos de resposta a medicamentos17,18,19,20,21,22,23,24 , embora algumas diferenças entre os protocolos sejam evidentes. Butler et al. cultivaram explanações em esponjas de gelatina para ajudar a difusão de nutrientes e medicamentos através do espécime20,21,25, enquanto Majumder et al. criaram um ecossistema tumoral ao cultivar explants em cima de uma matriz composta de tumor e proteínas estrômicas na presença de soro autólogo derivado do mesmo paciente22, 23.
Mais recentemente, nosso grupo criou um protocolo pelo qual as explanações são geradas pela fragmentação de tumores em peças do tamanho de 2 - 3 mm3que são então colocadas sem componentes adicionais em membranas permeáveis na interface ar-líquido de um sistema de cultura24. Juntos, esses inúmeros estudos demonstraram que os PDEs permitem a cultura de fragmentos vivos intactos de tumores humanos que retêm a arquitetura espacial e a heterogeneidade regional dos tumores originais. Em experimentos originais, explanações ou histoculturas eram geralmente submetidas à homogeneização após o tratamento medicamentoso, após os quais vários ensaios de viabilidade foram aplicados às amostras homogeneizadas, tais como o ensaio de resposta a medicamentos de histocultura20,21, o ensaio MTT (3-(6)-2,5-difeniltetrazolium), o ensaio lactato desidrogenase, ou o ensaio baseado em resazurina26,27,28 . Os recentes avanços nas técnicas de análise de endpoint, particularmente a patologia digital, agora ampliaram o repertório de testes de ponto final e ensaios que podem ser realizados em explants29,30. Para aplicar essas novas tecnologias, em vez de homogeneização, as explicações são fixadas em formalina, incorporadas na parafina (FFPE) e depois analisadas utilizando técnicas de imunossuagem, permitindo o perfil espacial. Exemplos dessa abordagem foram documentados para câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de mama, o câncer colorretal, e as explanações de mesotelioma pelas quais a coloração imunohistoquímica para o marcador de proliferação, Ki67, e o marcador apoptótico, poli-ADP de poli-ADP (cPARP), foi usada para monitorar alterações na proliferação celular e morte celular24,31,32,33,34.
A imunofluorescência multiplexada é particularmente favorável ao perfil espacial das respostas de medicamentos em explantes no pontofinal 35. Por exemplo, é possível medir a relocalização e a distribuição espacial de classes específicas de células imunes, como macrófagos ou células T, dentro do TME após o tratamento medicamentoso13,36,37,38, e investigar se um agente terapêutico pode favorecer a transição de "tumor frio" para "tumor quente"39 . Nos últimos anos, esse grupo se concentrou na derivação de PDEs de diferentes tipos de tumores (NSCLC, câncer de mama, câncer colorretal, melanoma) e no teste de uma série de agentes anticancerígenos, incluindo quimioterapias, inibidores de pequenas moléculas e inibidores de checkpoint imunológico (ICIs). Os métodos de análise de ponto final foram otimizados para incluir imunofluorescência multiplexada para permitir o perfil espacial de biomarcadores para viabilidade, bem como biomarcadores para diferentes constituintes do TME.
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Protocol
1. Coleta de tecidos
- Após a cirurgia, transfira amostras de tumor humanos recentemente resseccionadas em um tubo contendo 25 mL de meio de cultura fresca (o meio águia modificado de Dulbecco suplementado com 4,5 g/L de glicose e L-glutamina + 1% (v/v) soro fetal do bezerro + 1% penicilina-estreptomicina) e armazenado no gelo. Processe a explanta dentro de 2h de cirurgia em um capô estéril classe II.
2. Preparaçãode xplant
- Limpe todos os equipamentos cirúrgicos (lâminas de enxerto/superfície de cera dentária/pinças) com solução de espírito metilado industrial (IMS) 70%.
- Encha um prato de cultura de 10 cm (veja a Tabela de Materiais) com ~25 mL de meio fresco, e coloque-o em cima de uma cama de gelo.
- Utilizando pinças, transfira a amostra para uma superfície de cera dentária (ver a Tabela de Materiais),e corte o tecido em fragmentos de aproximadamente 2-3 mm3 usando duas lâminas de enxerto de pele.
NOTA: Para melhor desempenho, comece a cortar o tecido para obter uma tira individual de 2-3 mm de espessura e, em seguida, corte a tira ao longo do comprimento para obter as explantas finais. Repita o processo até que todo o espécime seja picado. - Transfira as explantes prontamente para o meio de cultura gelada no prato de 10 cm. Pegue uma proporção das explantas (6-9 peças), coloque-as em um tubo de 1 mL contendo 10% da solução de formalina não tamponada e deixe à temperatura ambiente (RT) por 24 h.
NOTA: Esses fragmentos representarão as explanações de controle para a condição "não culturada". - Encha o número desejado de poços de placas de 6 poços com 1,5 mL de meio fresco por poço, e coloque um disco de inserção de cultura organotípica (veja a Tabela de Materiais) em cada poço para que flutue em cima do meio, evitando cuidadosamente bolhas de ar na interface de inserção de mídia.
- Selecione explantas aleatoriamente e coloque-as uma de cada vez em cima do disco de inserção. Para ser consistente com a condição "não culturada", use 6-9 explants por poço. Coloque a placa multiwell em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2, e deixe que as explantes se recuperem por 16h.
NOTA: Para evitar esmagar o tecido, o manuseio suave da pinça é altamente recomendado.
3. Tratamento medicamentoso
- Depois de 16 horas, pegue novas placas de 6 poços, adicione 1,5 mL de meio fresco a cada poço, adicione os medicamentos relevantes nas concentrações desejadas e inclua um poço para o controle do veículo. Utilizando a pinça, mova cada inserção contendo as explantas para as placas recém-preparadas de 6 poços contendo as drogas. Coloque as placas na incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2 para 24-48 h.
- Transfira as explantas não culturadas previamente fixadas em formalina em um de histologia (ver seção 4 abaixo) e armazene em 70% de IMS até o final do experimento.
4. Processamento histológico
- Fixação tecidual
- Após o tratamento medicamentoso, transfira os discos de inserção contendo as explantas em novas placas de 6 poços contendo 10% de formalina, e adicione algumas gotas de 10% de formalina na parte superior das explants para garantir uma cobertura completa com o fixador.
ATENÇÃO: A formalina é perigosa. Evite qualquer contato com a pele e manuseie-a dentro de um alimento de fumaça para evitar a inalação. - Deixe que as explantas permaneçam durante a noite (20-24 h) na formalina de 10%.
- No dia seguinte, mergulhe o número relevante de pequenas esponjas de histologia em 70% IMS, e coloque-as dentro de de histologia. Transfira suavemente todas as explantas de uma determinada condição de tratamento medicamentoso para uma única esponja (mantenha a orientação das explantas para que as laterais das explantas em contato com os discos de inserção e, portanto, as áreas tratadas com drogas, sejam colocadas em contato com a esponja). Coloque outra esponja pré-colocada em cima das explantas, e fixe dentro de um de histologia (um por bem/tratamento).
- Submergir as fitas em 70% IMS, e sair em RT por 24 h.
- Após o tratamento medicamentoso, transfira os discos de inserção contendo as explantas em novas placas de 6 poços contendo 10% de formalina, e adicione algumas gotas de 10% de formalina na parte superior das explants para garantir uma cobertura completa com o fixador.
- Incorporação de parafinas e secção de tecidos
- No dia seguinte, transfira as fitas de histologia contendo as explantas para a cesta de amostras do processador de tecido (veja a Tabela de Materiais),e proteja a tampa. Coloque a cesta na réplica e feche delicadamente. Selecione o programa desejado e inicie o processador. Escorra a réplica, abra-a para remover a cesta e transfira a cesta para o banho de cera do centro de incorporação.
- Após a incorporação, transfira as tampas de de metal para a cesta e retorne à réplica do processador de tecido para o programa de limpeza. Limpe o sensor com um tecido seco, remova qualquer excesso de cera da tampa da réplica e proceda com o programa de limpeza.
- Posicione um bloco de parafina no microtome rotativo, corte algumas seções a 4 μm e devolva o bloco ao gelo. Reposicione o bloco e corte mais seções de 4 μm. Transfira as seções com uma pequena escova de tinta e fórceps em um banho de água para remover vincos e bolhas.
- Posicione as seções centralmente em slides de microscópio, escorra os slides por alguns minutos e coloque-os em um rack de slides para secar durante a noite em uma incubadora a 37 °C. Quando as seções estiverem secas, armazene-as no RT em uma pasta de slides ou caixa para proteger contra o pó.
5. Hemaoxilina e eosina (H&E) de coloração
- Encha o colorador (veja a Tabela de Materiais) com reagentes, e defina o programa necessário para a coloração de H&E: tempo de incubação de hematoxilina: 5 min; tempo de incubação da eosina: 3 min.
- Conecte o rack de slides ao porta-malas, coloque-o no primeiro recipiente com xileno e inicie o programa. Remova o porta-slides do rack e leve o recipiente com o rack de slides para a área de montagem.
- Monte os slides com xileno de ftalato de dibutílico (DPX) sob a capa de extração. Coloque o DPX em cada deslizamento de cobertura e abaixe o slide na tampa com a seção para baixo, permitindo que o DPX se espalhe.
NOTA: DPX é perigoso. Evite qualquer contato com a pele e use em um capô de fumaça designado.
6. Imunostaining
NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas na RT, a menos que seja indicado o contrário.
- Desparaffinização e reidratação
- Coloque os slides em um rack de slides e aqueça a 65 °C por 10 minutos antes de desparafinar as seções em xileno por 3 min (2x). Minimize a quantidade de solução de transporte.
NOTA: O xileno é inflamável, perigoso e irritante. Manuseie dentro do capô da fumaça enquanto usa luvas de duas camadas. Evite o contato com a pele e o contato visual. Descarte resíduos dentro de um recipiente selado. - Reidratar os slides em um gradiente de álcool da seguinte forma: 99% IMS para 1 min (2x) e 95% IMS por 1 min. Minimize a quantidade de solução de transporte.
NOTA: O IMS é altamente inflamável, volátil e irritante. Manuseie dentro do capô da fumaça e evite o contato com a pele e o contato visual. - Submergir completamente o rack de lâminas em água ultrauso (UP) por 5 minutos.
- Coloque os slides em um rack de slides e aqueça a 65 °C por 10 minutos antes de desparafinar as seções em xileno por 3 min (2x). Minimize a quantidade de solução de transporte.
- Recuperação de antígenos
- Prepare o tampão de recuperação de antígeno de acordo com as diretrizes do fabricante para o anticorpo específico utilizado.
NOTA: Tampão citrato 0,2 M, pH 6 ou tris(hidroximetila)aminometano (Tris)-ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA) 0,1 M, pH 9, são os tampões comuns utilizados para condições ácidas ou alcalinas, respectivamente. Monohidrato de ácido cítrico e Tris são agentes irritantes. Prepare todas as soluções de estoque no capô da fumaça. Evite contato com a pele e os olhos. - Submergir o rack contendo os slides no tampão de recuperação de antígeno e micro-ondas (ver a Tabela de Materiais) com potência total (800 W) por 20 minutos.
NOTA: Mantenha os slides totalmente submersos no buffer durante todo o processo. Para evitar uma redução excessiva do volume do buffer, coloque uma tampa em cima do recipiente utilizado.
- Prepare o tampão de recuperação de antígeno de acordo com as diretrizes do fabricante para o anticorpo específico utilizado.
- Imunofluorescência multiplex (mIF)
NOTA: Este processo leva de 1 a 2 dias.- Encha um recipiente limpo com 250 mL de água UP e submerse completamente o rack de slides por 2 min (2x). Continue montando cada slide em uma placa de cobertura de slides (veja a tabela de materiais).
- Para montar um slide em uma placa de cobertura, prepare um cocho de vidro com água. Submerque tanto a placa de cobertura quanto deslize na água, colocando o lado da seção do tecido de frente para a placa de cobertura.
- Posicione a borda inferior do slide em cima das protuberâncias na parte inferior da placa de cobertura e, finalmente, alinhe o slide para a placa de cobertura, permitindo que a água preencha a lacuna entre sem ar preso. Segure a placa de cobertura e deslize junto, e coloque-as em um rack de placa de cobertura.
- Encha a placa de cobertura com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e espere que o buffer lave os slides, fluindo por gravidade (2x). Pipet 110 μL de tampão de bloqueio (ver a Tabela de Materiais) em cada placa de cobertura e incubar por 10 minutos.
- Prepare a diluição de anticorpos primário desejada no PBS ou bloqueie o buffer de acordo com as recomendações do fabricante. Incubar os slides com anticorpo primário (110 μL cada slide) por 30 minutos. Lave os slides com 5 mL de PBS (2x), conforme descrito em 6.3.2.
- Incubar os slides com 110 μL de polímero de peroxidase de rabanete por 30 min. Lave os slides com 5 mL de PBS (2x), conforme descrito em 6.3.2.
- Prepare a diluição do fluoródoto em diluente de amplificação 1:100 (v/v), e incubar os slides com fluoróforo (110 μL cada slide) por 10 minutos. Lave os slides com 5 mL de PBS (2x), conforme descrito em 6.3.2.
NOTA: Para o uso do fluorohore 780, siga as orientações do fabricante. O experimento pode ser pausado aqui se os slides forem incubados na lavagem final do PBS e armazenados a 4 °C durante a noite. - Despresece os slides das placas de cobertura, e volte para a etapa de recuperação de antígeno para iniciar a coloração com um anticorpo diferente. Repita a coloração para que o número desejado de anticorpos seja testado.
- Seguindo a etapa 6.3.5 para o último fluorohore em uso, mantenha os slides nas placas de cobertura, prepare a solução de 6 μM de 4'-6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) dilatação com água UP e contratença os slides por 5 min (110 μL cada slide). Lave os slides com água UP (2x) e remova o excesso de água secando as bordas dos slides. Monte as tampas nos slides usando meio de montagem e armazene no RT no escuro.
- Encha um recipiente limpo com 250 mL de água UP e submerse completamente o rack de slides por 2 min (2x). Continue montando cada slide em uma placa de cobertura de slides (veja a tabela de materiais).
7. Digitalização
NOTA: A varredura de slides foi realizada utilizando um sistema de imagem automatizado multiespectral (ver a Tabela de Materiais).
- Monte os slides no porta-aviões e carregue-os no scanner na ordem desejada.
NOTA: Recomenda-se que seja incluído um slide de controle no qual não seja utilizado fluorohore ou DAPI durante a coloração imunohistoquímica. Este slide será usado como controle para florescence intrínseca (autofluorescência (AF)) do tecido. - Depois de iniciar o software do scanner de slides, selecione Editar protocolo na página inicial. Crie um novo protocolo que aborda o nome, modo de imagem,o tipo de varredura multiespectral a ser realizada(4-7 canais)e estude(diretório).
NOTA: Para modificar as configurações padrão das bandas analisadas, selecione/desmarque os filtros desejados usando a função Selecionar faixas de varredura - Proceda com a operadora de exposição e cargade varredura e, finalmente, selecione a operadora para a configuração do protocolo. Selecione Take Overview para detectar o tecido na lâmina. Escolha um slide exibido no portadore selecione uma área específica do tecido com o cursor vermelho para trazê-lo à vista ao vivo na janela esquerda da tela.
- Selecione o filtro DAPIe clique em Foco Automático ou ajuste manualmente o controle deslizante de altura do estágio para focar o campo de interesse. Clique em Autoexpore para permitir que o sistema encontre a melhor exposição para esse filtro/banda.
NOTA: O tempo de exposição de cada filtro é fixado em 12 ms. Depois de autoexporar o sistema, refine o tempo de exposição para uma estimativa melhor. Também é possível substituir o valor da autoexposição digitando um valor manualmente na célula destacada. - Repita as etapas acima para todos os filtros do protocolo. Se necessário, altere os locais e/ou slides para encontrar os melhores sinais para definir as exposições.
NOTA: Se o tecido for destacado em vermelho em exibição ao vivo, o sinal fluorescente do filtro analisado está saturado, e a autoexposição deve ser repetida. - Uma vez estabelecidas as configurações de exposição, clique no botão Voltar e Salve o protocolo. Na página inicial do software (ver a tabela de materiais),selecione Digitalizar slides.
- Empilhe todas as operadoras a serem digitalizadas no Slide Carrier Hotele tome nota da ordem dos slides para atribuir seu ID ao sistema.
NOTA: Na tela do software, cada operadora estará relacionada a um slot contendo 4 slides. - Para configurar vários slides com os mesmos parâmetros, clique em Configurar Tarefase selecione um ou mais Slots com a opção Ucantando as mesmas regras para os mesmos slides. Uma vez que os Slides de edição se abram, configure: Tarefas, Estudoe Protocoloe clique em OK.
- Rotule cada slide clicando no ícone Slot e digite um nome na célula Slide ID. Clique em Digitalizar para iniciar a varredura.
NOTA: Uma vez que o ícone slot fique azul e os slides estejam marcados com uma seta azul, o portador tem todas as regras e está pronto para ser escaneado. É possível salvar os IDs de slides, estudos, protocolos e tarefas clicando no botão Salvar configuração.
8. Análise
NOTA: O protocolo abaixo ilustra o método de análise do fenótipo.
- Preparação de imagens
- Para preparar as imagens para análise, abra o software do visualizador (consulte a Tabela de Materiais)e selecione Deslizars de carga. Selecione as varreduras desejadas para o projeto de treinamento no lado direito da tela.
- Para cada varredura, clique em Carimboe escolha Projeto na caixa Selecione para: Defina um selo com tamanho 1 x 1 no campo de imagem a ser usado posteriormente como um modelo para a análise de treinamento. Observe que este selo será marcado como um quadrado vermelho.
NOTA: O número de anotações de selos para o Projeto é arbitrário. Recomenda-se gerar um para o exame de fluorescência intrínseca e alguns outros que são geralmente representativos da distribuição de sinal dentro do tecido. - Finalmente, abra todos os exames do experimento. Para cada um, clique em Carimbo, e desta vez, escolha a opção Lote na caixa Selecione para: Coloque um carimbo circunscrevendo cada explanta.
NOTA: Desta vez, os selos serão marcados como quadrados verdes e serão exigidos assim que a análise do lote for lançada. Escolha o tamanho apropriado para os selos (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) e evite a sobreposição dos selos, o que geraria dados duplicados no arquivo exportado.
- Análise de treinamento
- Inicie o software para análise (veja a Tabela de Materiais),e crie um novo projeto: Selecione Arquivo | Nova | Projeto.
- Digite um nome na caixa Nome do Projeto e configure o tipo de projeto.
NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando as seguintes especificações: segmentação de tecidos tretilizáveis; segmentação celular adaptativa; fenotítipo. - Carregue as varreduras contendo os selos para treinamento: Arquivo | | aberto Imagem. Em uma visão de modo único,navegue pelas imagens e selecione as varreduras com fluorescência intrínseca.
- Clique no botão Autofluorescência (AF) e com o catador de autofluorescência,desenhe em uma porção não manchada de tecido. Clique em Preparar imagens para permitir que o software subtraia a intensidade da fluorescência intrínseca de todas as imagens enviadas para treinamento.
- Clique no botão Editar marcadores e cores e digite os nomes marcadores na caixa associados ao fluoróforo. Clique no passo do tecido do segmento no topo da tela para abrir a janela de treinamento de segmentação de tecidos.
- Na janela Categorias de Tecidos, digite o nome das categorias teciduais para segmentar as imagens (por exemplo, Tumor, Estroma, Fundo, Necrose).
- Na janela Treinamento de Segmentação de Tecidos, clique no botão Desenhar e desenhe regiões ao redor de grupos de células para definir uma categoria de interesse tecidual. Por exemplo, para definir uma área tumoral, desenhe uma região em torno de um grupo de células tumorais. Mude para a próxima categoria e repita o processo de desenho.
NOTA: Recomenda-se desenhar regiões na maioria das imagens enviadas para treinamento. Também é possível refinar o treinamento editando a Escala de Padrão e a Resolução de Segmentação cujos detalhes são melhor descritos no manual do usuário. - Tendo definido as regiões de treinamento, prossiga com o Train the Tissue Segmenter.
NOTA: Durante o processo de treinamento, o software exibe a porcentagem de precisão da segmentação tecidual. Para obter resultados ideais, recomenda-se que a segmentação tecidual seja pelo menos 90% precisa. Uma vez estabilizado o Segmenter, clique no botão Fazer. - Para ver a máscara categoria de tecido em todas as imagens, clique no botão Segment All.
- Após verificar a qualidade da segmentação tecidual, resenhe as regiões de treinamento ao redor das áreas classificadas incorretamente e ree treine o Segmentador de Tecidos até que o processo seja bem sucedido.
- Clique na etapa de Segmentação celular na Barra de Passo na parte superior da janela para prosseguir com a análise.
- Escolha os compartimentos celulares para segmentar: Núcleos, Citoplasmae/ou Membrana.
NOTA: Como a segmentação celular adaptativa só pode detectar células com sinal nuclear, não dese selecione núcleos. Embora também seja possível segmentar citoplasma e/ou membrana, recomenda-se escolher primeiro o componente nuclear mais forte e abundante (por exemplo, DAPI). - Configure o componente nuclear usando o controle deslizante de intensidade típica para ajustar o limiar usado para detectar pixels nucleares. Tome nota da janela de visualização que abre e fornece feedback ao vivo à medida que o limiar é ajustado.
NOTA: Este limiar é adaptativo e é medido em relação ao fundo circundante. Aumente esse valor se muito fundo for detectado como nuclear. Abaixe esse valor se núcleos fracos forem perdidos. Use o botão Mostrar/Ocultar regiões para piscar as máscaras de segmentação e verificar se os pixels corretos estão sendo detectados como nucleares. - Para dividir clusters de pixels nucleares, use o painel de divisão de componentes nucleares. Escolha o botão que melhor descreve a qualidade de coloração dos núcleos. Em seguida, use a barra de controle deslizante para ajustar a Sensibilidade de Divisão,tendo em mente que valores mais baixos resultarão em mais divisão.
- Clique no botão Segmentar Tudo para segmentar todas as imagens. Se o resultado não for preciso, modifique as configurações e ree treine o software até que uma segmentação satisfatória seja alcançada.
- Proceda à última etapa da análise: Fenotipagem. No painel Phenotypes, adicione a lista de fenótipos a serem detectados e digite o nome na caixa de texto correspondente. Clique no botão Editar fenótipos, selecione uma célula específica para criar um menu suspenso e escolha o fenótipo correspondente.
NOTA: Pelo menos cinco células para cada fenótipo são necessárias para treinar o classificador. Desligar a visualização dos núcleos permite uma melhor visualização do fenótipo celular que precisa ser atribuído. - Quando a seleção para treinamento estiver concluída, clique no botão Classificador de trem.
NOTA: O software classificará cada célula da imagem e, sempre que ocorrerem erros na classificação, é possível editar o fenótipo das células e repetir o treinamento do classificador. Salve o projeto antes de prosseguir para a análise em lote e clique na barra de exportação na barra de ferramentas na parte superior da tela. - Selecione a guia Análise de banho no menu esquerdo e carregue o projeto na caixa Algoritmo de lote ou Projeto.
- Clique em Exportar opções para criar diretórios separados para cada imagem e, com o botão Procurar, navegue para encontrar o local para exportar os dados. Clique em todas as opções das Imagens e Tabelas para exportar.
- No lado direito da tela, clique em Adicionar slides e carregue todas as imagens contendo selos para lotes previamente preparados (etapa 7.3). Clique no botão Executar para iniciar a análise do lote e processe um carimbo de cada vez, exportando os dados correspondentes.
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Representative Results
A imagem multiespectral de seções histológicas manchadas pelo IFM permite a identificação e fenotipagem de populações celulares individuais e identificação de componentes tumorais e estroma na explanação TME (Figura 2). A imagem multiespectral é particularmente útil para a análise de tecidos com alta autofluorescência intrínseca, como tecido com alto teor de colágeno, pois permite que o sinal de autofluorescência seja desconvoluído de outros sinais e excluído da análise subsequente. A subsequente na segmentação de tecidos e células silico permite a quantificação da resposta medicamentosa com uma infinidade de saídas, incluindo, mas não se limitando a, números de células brutas (por exemplo, por cento de positividade), intensidade do sinal, tamanho celular, área de tecido e localização espacial de células individuais.
A segmentação de tecidos e células são, portanto, extremamente úteis para a análise quantitativa dos desfechos do tratamento medicamentoso e para a identificação de respostas específicas do tumor e do estroma. Por exemplo, a coloração para Ki67 e cPARP ao lado de um marcador tumoral permite a quantitação dos níveis de proliferação e morte celular, respectivamente, em explantas(Figura 3). No exemplo dado, os níveis de Ki67 e cPARP são quantitados para regiões estrômicas e tumorais em PDEs em resposta ao inibidor de ponto de verificação imunológica (ICI) da proteína da morte celular anti-programada 1 (PD-1), nivolumab. Além disso, a capacidade de extrair informações espaciais de seções manchadas permite o cálculo de distâncias intercélulas, bem como distâncias para bordas tumorais e outras estruturas. Portanto, mudanças na distribuição celular após o tratamento medicamentoso podem ser analisadas quantitativamente(Figura 4). O exemplo mostrado representa o tratamento PDE com nivolumab.
Figura 1: Fluxo de trabalho para a geração e análise de PDEs. (A) Amostras de tumores humanos recém-ressecados são processadas e organizadas em um disco de inserção de cultura permeável flutuando no meio da cultura. (B) Após o tratamento medicamentoso, as explantas são colhidas, submetidas à FFPE e, em seguida, seccionadas para análise histológica, por exemplo, para coloração de H&E. (C) a coloração e a varredura de mIF das seções teciduais são realizadas para gerar imagens multiespectrais das quais os sinais individuais podem ser desconvolucidos e analisados separadamente. (D) A análise das imagens compostas permite a separação de áreas tumorais e estromais e avaliação do fenótipo de diferentes tipos celulares. Abreviaturas: PDE = explante derivada do paciente; FFPE = fixado em formalina, embutido em parafina; H&E = hematoxilina e eosina; mIF = imunofluorescência multiplex; HRP = peroxidase de rabanete; H2O2 = peróxido de hidrogênio; Ab = anticorpo; TSA = amplificação do sinal de tirado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de uma seção de tecido manchado de mIF. O tecido explant NSCLC foi manchado para marcadores de viabilidade celular, ou seja, cPARP (vermelho) e Ki67 (verde), bem como um marcador pan-citokeratin (amarelo) e DAPI (azul) para marcar núcleos. Imagens multiespectrais foram realizadas para desconvoluir os sinais fluorescentes e remover a autofluorescência. As imagens mostram ampliação de 20x do campo selecionado. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: mIF = imunofluorescência multiplex; NSCLC = câncer de pulmão de células não pequenas; cPARP = poli-ADP de polimerase de costela; CK = citokeratina; DAPI = 4'-6-diamidino-2-fenildole; AF = autofluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da morte celular e proliferação em PDEs. Exemplo de parcelas de caixa e bigode mostrando indução de apoptose em PDEs NSCLC após 24 horas de tratamento com nivolumab de 5 μg/mL em comparação com o controle médio. O percentual de proliferação (Ki67) e percentual de eventos de morte celular apoptótica (cPARP) é exibido na área tumoral e estroma, respectivamente. Cada ponto representa uma única explanta, a linha central da caixa representa a mediana da distribuição, e as laterais da caixa (inferior e superior) representam o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. As barras de erro representam a faixa interquartil (mais de 1,5 x IQR). Abreviaturas: PDE = explante derivada do paciente; NSCLC = câncer de pulmão de células não pequenas; cPARP = poli-ADP de polimerase de costela; IQR = intervalo interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Organização espacial após o tratamento medicamentoso. (A) Imagens representativas mostrando a coloração mIF de marcadores de células T-CD4, FOXP3, CD8 (painel esquerdo)-realizado em uma explanta de melanoma, e análise de fenótipo correspondente (à direita) identificando distâncias intercélulas entre células CD8+ e células Treg (CD4+/FOXP3+). Barras de escala = 200 μm. (B) Trama de histograma mostrando maior distância entre células T citotóxicas (CD8+) e células Treg (CD4+/FOXP3+) após tratamento de PDEs de melanoma com 5 μg/mL de nivolumab, confirmando efeitos no alvo da droga IO. A unidade de densidade é expressa como o número de células divididas por soma de todas as células por largura de banda. Abreviaturas: mIF = imunofluorescência multiplex; CD = cluster de diferenciação; FOXP3 = Caixa de garfo P3; PDE = explante derivada do paciente; NSCLC = câncer de pulmão de células não pequenas; IO = imunooncologia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve os métodos de geração, tratamento medicamentoso e análise de PDEs e destaca as vantagens da plataforma como um sistema de modelo pré-clínico. A ex-cultura de um tumor recém-ressecado, que não envolve sua desconstrução, permite a retenção da arquitetura tumoral13,24 e, portanto, as interações espaciais dos componentes celulares no TME, bem como a heterogeneidade intratumoral. Este método demonstra como, utilizando um marcador específico do tumor, é possível identificar áreas de tecido tumoral versus áreas de estroma e, portanto, separar as respostas medicamentosas dentro desses compartimentos(Figura 3). Além disso, vários biomarcadores podem ser perfilado simultaneamente para avaliar, por exemplo, o movimento on-target das células imunes dentro do TME (Figura 4).
Uma publicação anterior documentou a aplicação desta plataforma PDE à estratificação de PDEs NSCLC para o padrão de quimioterapia assistencial, cisplatina, mostrando que é possível segregar o quimorsistante das populações quemosensitivas24. Esses achados relacionados ao PDE refletem as respostas dos pacientes. Seguindo os métodos aqui descritos, é possível realizar abordagens semelhantes para outros tipos de tumores e com diferentes tipos de drogas, quimioterápicos ou não. A separação dos PDEs em populações sensíveis a medicamentos e resistentes a medicamentos cria um recurso inestimável para gerar uma visão mecanicista mais sobre a resistência às drogas. Por exemplo, como os PDEs podem ser processados para isolamento de RNA, DNA, proteína ou metabólito, isso pode permitir a implementação de tecnologias "omic" para identificar os principais biomarcadores que são preditivos de resposta. Alternativamente, seções FFPE geradas a partir de PDEs tratados podem ser usadas para perfis espaciais extensivos para entender como diferentes tipos de células no PDE contribuem para a resistência a medicamentos.
Isso pode ser facilitado por desenvolvimentos adicionais em imagens multiespectrais e abordagens de citometria em massa35,40,41,42,43, o que permitiria que centenas de biomarcadores fossem perfilados simultaneamente. Modelos pré-clínicos que avaliam a eficácia imunoterapêutica são muito procurados, e este artigo demonstra que os PDEs podem preencher esse nicho crítico (Figura 3 e Figura 4). Anticorpos monoclonais voltados para pontos de verificação imunológicos, como o antígeno citotóxico T-linfócito 4 e PD-1/programado ligand-1 (PD-L1), foram desenvolvidos44,45,46,47 com algumas melhorias notáveis na sobrevivência geral do paciente em um grande número de tumores sólidos em comparação com a quimioterapia padrão. No entanto, as ICIs são eficazes em um número limitado de pacientes por razões que não são claras, necessitando da identificação de biomarcadores preditivos48. A característica destacada da preservação dos PDEs na arquitetura 3D do tecido tumoral facilita a avaliação da eficácia do ICI(Figura 3) e o monitoramento das células imunes em resposta ao tratamento do ICI(Figura 4). Assim, os PDEs são uma plataforma ideal para distinguir casos sensíveis ao ICI versus resistentes ao ICI e para investigar os mecanismos que sustentam essa distinção.
A tecnologia PDE sofre de algumas desvantagens. A geração de resultados precisos e experimentais de PDEs depende da integridade do tumor e, ocasionalmente, amostras de tumores após a cirurgia são muito necrosas para processar PDEs. Além disso, apesar de alguns exemplos específicos de retenção da integridade do tecido após a cultura prolongada25, para a maioria dos casos relatados, a integridade e a viabilidade foram perdidas após 72 h na cultura, e ocorre a desintegração tecidual. A janela de tempo para a realização de experimentos medicamentosos é, portanto, relativamente limitada, proibindo o uso deste modelo para o estudo dos mecanismos de resistência a medicamentos adquiridos ou do estudo da invasão e metástase13. Ampliar a viabilidade das explants pode se tornar possível no futuro através do desenvolvimento de novas tecnologias, como andaimes e canais perfumados, o que pode facilitar a difusão e absorção de nutrientes, permitindo uma cultura mais ampliada.
No entanto, até que essas melhorias possam ser feitas, a plataforma PDE deve ser considerada como um método de cultura de curto prazo que pode fornecer dados imediatos de resposta a medicamentos. Deve ser utilizado juntamente com outros sistemas modelo, como organoides e modelos PDX, que podem fornecer dados de resposta a medicamentos a longo prazo. No geral, a plataforma PDE é um sistema de modelo pré-clínico de prova de conceito que é útil na determinação da sensibilidade do tumor de um paciente a um determinado agente anticâncer, por derivar a visão sobre mecanismos de ação medicamentosa em um tumor real, e para o desenvolvimento de biomarcadores preditivos e farmacodinâmicos.
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Disclosures
Nada para revelar
Acknowledgments
Agradecemos aos cirurgiões e patologistas dos Hospitais Universitários de Leicester NHS Trust por fornecer tecido tumoral ressecado cirúrgico. Agradecemos também à instalação de Histologia dentro dos Serviços de Biotecnologia Core por ajudar no processamento e secção de tecidos FFPE e Kees Straatman pelo apoio com o uso do Vectra Polaris. Esta pesquisa foi apoiada e financiada pelo Consórcio Explant composto por quatro parceiros: A Universidade de Leicester, a Unidade de Toxicologia da MRC, o Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories e o LifeArc. Apoio adicional foi fornecido pelo CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). O financiamento para GM, CD e NA foi fornecido pelo Programa Catalisador do Câncer de Mama Now (2017NOVPCC1066), que é apoiado por financiamento da Pfizer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
