Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Abstract

Hücreler sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlara maruz kalarak farklı hücresel tepkilere neden oluyor. Biyokimyasal ve genetik yaklaşımların uygulanması, DNA hasarı yerinde DNA onarım komplekslerinin işe alınması ve montajı ile ilişkili hücresel olayların ortaya alınmasında esastır. Son birkaç yılda, bölgeye özgü DNA hasarına neden olacak birkaç güçlü araç geliştirilmiştir. Ayrıca, yeni ufuk açıcı teknikler, bu süreçleri hem sabit hem de canlı hücreleri kullanarak tek hücre çözünürlük düzeyinde incelememizi sağlar. Bu teknikler çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için kullanılmış olsa da, burada DNA onarımı, Floresan İmmünostaining (IF) ve Chromatin İmmün Önseçim (ChIP) alanında en yaygın kullanılan protokolleri sunuyoruz, bu da endononikleaz bazlı sahaya özgü DNA hasarı ile birlikte DNA onarım faktörlerinin genomik doluluğunun yönlendirilmiş ve düzenlenmiş bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini mümkün kılmaktadır, sırasıyla. Bu teknikler, araştırmacıların hasarlı genomik lokusa bağlı yeni proteinleri ve DNA onarımı sırasında ince ayar düzenlemeleri için gerekli çeviri sonrası modifikasyonlarını tanımlamaları için güçlü araçlar sağlar.

Introduction

Genomumuz sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlar tarafından zorlanıyor. Bu saldırılar, UV ışığı veya ışınlama gibi çevresel kaynaklardan ve oksidatif stres veya replikasyon hatalarından kaynaklanan metabolik yan ürünler gibi endojen kaynaklardan türetilebilir1,2. Bu lezyonlar bir veya her iki DNA teli bütünlüğünü etkileyebilir ve oluşturulan hatalar kalıcı hale gelirse, sıklıkla translokasyonlara ve genom kararsızlığına yol açar ve bu da tümöregenez3,4ile sonuçlanabilir. Genom bütünlüğünü korumak için evrim sırasında birden fazla onarım sistemi geliştirilmiştir. Belirli DNA hasarı türlerinin kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre, birden fazla onarım mekanizması etkinleştirilebilir. Uyuşmazlıklar, abasik siteler, tek iplik kopmalar ve 8 oxoguanine (8-oxoG) uyumsuz onarım veya baz eksizyon onarım yolu5,6ile çıkarılabilir. UV kaynaklı fotoprodüktürlerin ve hacimli adductların neden olduğu lezyonlar nükleotid eksizyon onarımı (NER) veya DNA çift iplikçik kırma onarımı (DSBR) işlemi ile onarılabilir7,8. NER iki ana alt yoldan oluşur: transkripsiyon bağlantılı NER (TC-NER) ve küresel genomik NER (GG-NER). Hücre döngüsü fazı ile ilgili olarak, DNA çift iplikçik kırılması indüksiyonunu takiben, iki alt yol etkinleştirilebilir: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR)1,9. Dinlenme hücrelerinde baskın yol olan NHEJ, tüm hücre döngüsü aşamalarında aktive edilebilir, daha hızlı ama hataya eğilimli bir yolu temsil eder10. Öte yandan, İk, DSB'lerin kardeş kromatların sıra-homoloji aramasına göre onarıldığı hatasız bir yoldur, bu nedenle esas olarak S ve G2 hücre döngüsü aşamalarında bulunur11. Ayrıca, mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ), kırık DNA uçlarını kuşatan daha önce resepsiyon edilmiş mikrohomolog dizilerin KU70/80 ve RAD51'den bağımsız yeniden ligasyon yoluna dayanan, yukarıda belirtilenlerden farklı başka bir DSB onarım mekanizmasıdır. Bu nedenle, MMEJ hataya eğilimli ve son derece mutajenik olarak kabul edilir12. DNA onarımı sırasında, DSB'ler DNA hasar yanıtını (DDR) indükleyebilir, bu da onarım sırasında hücre döngüsünü durduran kontrol noktası kinazlarının aktivasyonu ile sonuçlanır13,14,15. DDR, onarım sürecinin başlatıcı kilit oyuncularının lezyonlar etrafında işe alınmasına ve kapsamlı bir şekilde yayılmasına yanıt olarak etkinleştirilir ve bir onarım odağının oluşumuna katkıda girer. Bu erken sinyal çağlayanında, ATM (Ataxia Telangiectasia Mutasyona Uğramış) kinaz, Ser139'daki histone varyantı H2AX'ın fosforilasyonunu katalize ederek (φH2AX olarak adlandırılır) lezyon16etrafında önemli bir rol oynar. Bu erken olay, ek onarım faktörlerinin işe alınmasından ve aşağı akış onarım süreçlerinin başlatılmasından sorumludur. İşe alınan proteinlerin onarım odağındaki tam işlevi henüz tam olarak karakterize edilemese de, onarım odaklarının oluşumu ve dinamikleri birkaç laboratuvar tarafından araştırılmıştır. Bu belirteçler onarım kinetiğini takip etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak onarım işlemi sırasındaki kesin rolleri zor olmaya devam etmektedir. DNA onarımı ile ilgili hücresel süreçlerin büyük öneme sahip olmasına rağmen zayıf anlaşılması nedeniyle, DDR'yi teşvik etmek ve görselleştirmek için şimdiye kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.

İstenilen DNA hasarı türünü indük etmek için çeşitli yöntem ve sistemler kurulmuştur. Örneğin, bazı ajanlar [neokarzinostatin (NCS), fenomisin, bleomisin, γ ışınlama, UV] tahmin edilemeyen genomik pozisyonlarda çok sayıda rastgele DNA kırılmasına neden olabilirken, diğerleri (AsiSI, I-PpoI veya I-SceI gibi endonikülalar ve lazer şeritleme) bilinen genomik loci17 , 18,19,20,21'de DNA kırılmalarına neden olabilir. Burada, memeli ve maya hücrelerinde DDR'yi incelemek için şu anda kullanılan endonücleaz bazlı tekniklere odaklanıyoruz. Bu tekniklerin ilkelerini vurgulamanın yanı sıra, hem avantajlarını hem de dezavantajlarını vurguluyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Spesifik proteinlerin immünodeteksiyon

  1. Hücre kültürünün hazırlanması ve deneysel kurulum
    1. %10 fetal baldır serumu, 2 mM glutamin ve %1 antibiyotik-antimycotic çözelti ile desteklenmiş DMEM kültür ortamında monolayerlerde U2OS hücrelerini koruyun.
      NOT: Endonükleaz bazlı DNA hasarı indüksiyonu için, sistem sızıntısını önlemek için kömürle işlenmiş veya steroid içermeyen ortam kullanın.
    2. Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 ortamında% 80 izdiah edene kadar büyütün ve her 2-3 günde bir ortamı yenileyin.
    3. Ortamı emiş edin ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri Tripsin-EDTA çözeltisi ile ayır. Hücreler ayırdığında, hücrelere kültür ortamı ekleyerek trypsin etkinliğini durdurun ve bir hücre süspansiyonu elde edin.
    4. Hücre sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Plaka 2 x 104 hücre /mL/kuyu üzerinde 24 kuyulu bir plaka, her kuyuda steril 12 mm yuvarlak kapaklar.
    5. Kapak altlarına bağlanmaya izin vermek için hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de24 saat boyunca kuluçkaya bırakın.
    6. Zarar verici ajanı doğrudan kültürlü ortama pipetleterek hücreleri 10 ng/mL neokarzinostatin (NCS) ile tedavi edin. Hücreleri NCS içeren ortamla 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından 1x PBS ile yıkayın ve hücrelere taze, takviyeli kültür ortamı ekleyin. Aksi takdirde, ortamı yenilemeden endonükleaz tabanlı sistemler aracılığıyla DSB'leri teşvik etmek için uygun aracıyı (yani 4-OHT) kullanın22.
      NOT: Alternatif olarak, 2-20Gy23 arasında nötron akısı kullanarak 30 dakika ila 8 saat iyileşme süresi arasında değişen DNA hasarına neden olmak için ışınlama kullanın.
    7. DNA onarımının kinetiğini takip etmek için hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de1-8 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Hücrelerin sabitlenmesi
    NOT: Tüm hücreleri yeterince kapsayacak şekilde aşağıdaki adımlarda (adım 1.2-1.5) 300-500 μL çözelti/kuyu kullanılmalıdır. Her inkübasyon ve yıkama adımı (antikor inkübasyonu hariç) hafif ajitasyonlu bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde yapılmalıdır.
    1. DSB indüksiyonu ve hücrelerin inkübasyonundan sonra, ortamı bağlı hücrelerden çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın.
    2. Hücreleri 25 °C'de 20 dakika boyunca %4 formaldehit-PBS çözeltisi ile sabitleyin.
  3. Hücrelerin permeabilizasyonu
    1. Sabitleme solüsyonını çıkarın ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    2. PBS'yi çıkarın ve PBS'de çözünmüş %0,2 Triton X-100 ekleyin. Örnekleri 20 dakika kuluçkaya yatır.
  4. Belirli olmayan bağlama sitelerinin engellenmesi
    1. Hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    2. PBST ile seyreltilmiş %5 BSA (Sığır Serum Fraksiyonu V albümin) ile spesifik olmayan bağlama bölgelerini engelleyin (%0,1 Ara-20 ile desteklenmiş 1x PBS) ve permeabilize numuneleri en az 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. İmmünofluoresans boyama
    1. %1 BSA-PBST çözeltisinde seyreltilmiş uygun miktarda birincil antikoru (yani anti-φH2AX, anti-DNA-PKcs) ekleyin. Her kapak kapağını, seyreltilmiş anti-φH2AX antikorunun 10 μL'lik bir damlacık üzerine bir parafin filminin üzerine baş aşağı yerleştirin.
      NOT: Birlikte immünostaining durumunda her iki antikor da aynı % 1 BSA-PBST çözeltisinde uygun şekilde seyreltilir.
    2. Numuneleri 4 °C'de 1,5 saat boyunca bir nem odasında kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçka geceleme 4 °C'de de yapılabilir.
    3. Kapakları 24 kuyu plakasına geri yerleştirin ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    4. %1 BSA-PBST'de seyreltilmiş uygun miktarda ikincil antikor ekleyin. Her kapak kapağını seyreltilmiş antikorun 10 μL damlacık üzerine bir parafin filmine baş aşağı yerleştirin.
    5. Numuneleri 4 °C'de bir nem haznesinde 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Kapakları 24 kuyu plakasına geri yerleştirin ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    7. Son PBS yıkama solüsyonunun çıkarılmasından önce, kapakları bir cımbız ve iğne kullanarak hafifçe çıkarın ve ardından montaj ortamının damlacıkları ile cam slaytlara baş aşağı yerleştirin (DAPI ile birlikte).
      NOT: Hava kabarcıklarının oluşumundan kaçının. Montaj ortamı kuruduğunda, numunelerin buruşmasını önlemek için kapakların kenarlarının oje ile kapatılması önerilir.

2. Kromatin immün önksepitasyonu

  1. Hücre toplama, çapraz bağlama, hücre ve nükleer liziz ve DNA parçalanması
    1. Her örnek için 150 mm'lik bir tabakta yaklaşık 5 x 106 hücre/mL kültür.
    2. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri buz gibi 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    3. Hücreleri% 1 formaldehit-PBS çözeltisi ile sabitlayın, plakaları bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin ve 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
      NOT: Formaldehit uçucudur; her zaman yeni bir çalışma çözümü hazırlayın. Bazı durumlarda, formaldehit çözeltisi stabilize etmek için metanol içerir, ancak aşağı akış reaksiyonlarına müdahaleyi önlemek için metanol içermeyen bir çözelti kullanmak daha iyidir.
    4. 125 mM glisinin sabitlemeyi durdurun ve 25 °C'de 5 dakika boyunca hafif ajitasyon ile yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
    5. Tabakları buza yerleştirin ve buz gibi 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    6. Hücreleri buz gibi 1x PBS'de kazıyın ve 15 mL konik tüplere aktarın.
    7. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüj edin.
    8. Süpernatantı dikkatlice emiş edin ve peletin 2 mL hücre liziz tamponunda [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, % 0.5 NP-40, 1x PIC (proteaz inhibitörü kokteyli)] ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
    9. Hücre süspansiyonu 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüj edin.
    10. Süpernatantı dikkatlice atın ve peletin 500-1.500 μL nükleer lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, % 0.8 SDS, 1x PIC) yeniden biriktirin ve buz üzerinde 30-60 dakika kuluçkaya yatırın. Lisat sonikasyon için uygun bir polistiren konik tüp içine aktarın.
      NOT: Nükleer lizis tamponu SDS içerdiğinden, buzun üzerine çöker ve çözelti beyaza döner. Çözüm sonication sonra şeffaf açılmalıdır.
    11. DNA'yı yammak için lisat'ı ortalama 300-1.000 bp'lik bir parça boyutuna sonicate edin.
      NOT: Uygun sonikasyon döngüleri ve koşulları hücre tipine ve sonication ekipmanına göre ayarlanmalıdır. 200 bp'den küçük parçalar ChIP için uygun değildir, çünkü nükleozom-DNA etkileşimleri bozulabilir.
  2. Çapraz bağlamanın tersine çevrilmesi, sonik parça boyutlarının belirlenmesi
    1. Sonicated kromatin parça boyutunu doğrulamak için sonicated örnek 100 μL dışarı alın. Kalan kromatin −80 °C'de saklanmalıdır.
    2. Numunenin her 100 μL'sine 0,5 mg/mL RNase A ekleyin ve RNaz'ı etkinleştirmek için 20 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. Numuneleri gece boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. Ertesi gün, 500 μg / mL Proteinaz K ve% 0.5 SDS ekleyin ve numuneleri 50 ° C'de 3 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    5. Her numuneye 0,5 hacim fenol ve 0,5 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    6. 1 dakika boyunca girdap.
    7. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    8. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    9. Her numuneye 1 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    10. 1 dakika boyunca girdap.
    11. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    12. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    13. 2,5 cilt %96 etanol ve 0,1 hacim 3 M Na-Asetat pH 5,2 ekleyin.
    14. −80 °C'de en az 20 dakika kuluçkaya yatır.
    15. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    16. Etanol çıkarın ve peletin% 70 etanol 400 μL ile yıkayın.
    17. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    18. Etanol çıkarın ve peletin havasını kurutun.
    19. Peletin 10 μL TE'de yeniden süzülür.
    20. Örnekleri% 0.8 agarose jel üzerinde çalıştırın. Soniklenmiş kromatin boyutu yaklaşık 500 bp olmalıdır.
      NOT: Bromophenol mavi içermeyen yükleme tamponu kullanın, çünkü bu boyanın boyutu yaklaşık 500 bp'dir, bu da kromatin parçalarının doğru algılanmasını bozabilir. Bunun yerine, yaklaşık 3.000 bp olan ksilen-siyanole ile tamamlanan yükleme tamponu kullanılması önerilir.
    21. Kromatin boyutu kabul edilebilirse, donmuş kromatin örneklerini adım 2.1'den seyreltin. 3 hacimli seyreltme tamponunda (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, %1 Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) ve numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca dönme yoluyla karıştırın.
      NOT: Bu adım, kromatin konsantrasyonunun ölçümü de dahil olmak üzere aşağı akış reaksiyonlarına müdahaleyi önlemek için nükleer lizis tamponunda bulunan SDS'yi seyreltmek için gereklidir.
    22. Bir spektrofotometre kullanarak kromatin örneklerinin DNA konsantrasyonunu 260/280 nm olarak ölçün.
  3. Boncukların hazırlanması, ön temizleme ve immün önkupitasyon
    1. Ön temizleme ve immün önkupitasyon adımları için boncuklar (koyun anti-tavşan veya fare IgG) hazırlayın. Boncukları RIPA tamponu ile 4 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, %1 Triton X-100, %0.1 Na-DOC, %0.1 SDS, 150 mM NaCl ve 1X PIC).
    2. Boncukları, 2.3.1 adımındakiyle aynı RIPA arabelleği hacminde yeniden diriltme.
    3. Her numunenin 25-30 μg kromatinini 4 °C'de 1-2 saat boyunca dönme yoluyla boncukların 4 μL'si ile önceden temizleyin.
      NOT: Numunelerin dönme sırasında düzgün bir şekilde karışmasını sağlamak için her kromatin örneğine 500 μL'ye kadar son hacme ripa tamponu ekleyin. Her örnek setinde NAC (Antikor Kontrolü Yok) ve TIC (Toplam Giriş Kontrolü) için kromatin almayı unutmayın. TİC'ler yalnızca 200 μL'ye kadar son bir hacim gerektirir.
    4. Boncukları bir mıknatısla çökeltin ve süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    5. Her kromatin örneğine (NAC ve TIC hariç) uygun miktarda antikor ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de döndürün.
    6. Ertesi gün, her numuneye (TIC hariç) 40 μL yıkanmış boncuk ekleyin ve 4 °C'de dönerek gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Yıkama
    1. 4 °C'de dönme yoluyla 10 dakika boyunca 300 μL Düşük Tuz tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, %1 Triton X-100, %0.1 SDS, 1x PIC) ile bir kez yıkayın.
    2. 4 °C'de dönüş yoluyla 10 dakika boyunca 300 μL Yüksek Tuz tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, %1 Triton X-100, %0.1 SDS, 1x PIC) ile bir kez yıkayın.
    3. 4 °C'de dönme yoluyla 10 dakika boyunca 300 μL LiCl tamponu (250 mM LiCl, %1 NP-40, %1 Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) ile bir kez yıkayın.
    4. 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) ile iki kez, 4 °C'de ilk yıkama için 10 dakika, ikinci yıkama için 25 °C'de yıkayın.
  5. İfade
    1. Boncuklara 200 μL elution tamponu (%1 SDS ve 100 mM NaHCO3)ekleyin ve 65 °C'de bir termo-çalkalayıcıda 15 dakika boyunca sürekli sallanarak kuluçkaya yatırın (yaklaşık 400 RPM). Süpernatant yeni bir tüpe aktarın ve 200 μL Elution tamponunda tekrar elute boncukları. Eluatları birleştirin (400 μL son hacim).
    2. Her numunede 200 mM'lik son konsantrasyona NaCl ekleyin. TIC örneklerini 200 μL Elution tamponu ile tamamlar ve NaCl'i de ekleyin.
      NOT: Bu adımdan itibaren, TIC diğer örneklerle aynı koşullar altında ele alınmalıdır.
    3. Numuneleri 65 °C'de (titremeden) en az 6 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Her numuneye 1 mL soğuk %100 etanol ekleyin, karıştırmak için tüpleri iki kez döndürün ve DNA'yı bir gecede −80 °C'de çökelti edin.
    5. Ertesi gün, 4 °C'de 13.000 x g'da 30 dakika santrifüj.
    6. Süpernatant atın ve peletin% 70 EtOH ile yıkayın.
    7. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    8. Süpernatant atın ve peletleri havayla kurutun.
    9. Peletleri 100 μL TE'de yeniden dirildirin ve her numuneye 0,5 mg/mL RNase A ekleyin. RNase'yi etkinleştirmek için 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Çapraz bağlamanın tersine çevrilmesi
    1. 500 μg/mL Proteinaz K ve %0,5 SDS ekleyin, ardından numuneleri 50 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: ChIP-seq'e devam ediyorsanız, aşağı akış NGS işlemini engellediği için fenol-kloroform ekstraksiyonunu önleyin. Bunun yerine, piyasada bulunan bir kit kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Her numuneye 0,5 hacim fenol ve 0,5 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    3. 1 dakika boyunca girdap.
    4. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    5. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    6. Her numuneye 1 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    7. 1 dakika boyunca girdap.
    8. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    9. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. DNA ekstraksiyonu
    1. 2,5 cilt %96 etanol ve 0,1 hacim 3 M Na-Asetat pH 5,2 ekleyin.
    2. −80 °C'de en az 20 dakika kuluçkaya yatır.
    3. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    4. Etanol çıkarın ve peletin% 70 etanol 400 μL ile yıkayın.
    5. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    6. Etanol çıkarın ve peletin havasını kurutun.
    7. Peletin 50 μL TE'de yeniden süzülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücrelerde bölgeye yönelik DSB kaynaklı onarım süreçlerinin incelenmesi, stabil veya geçici transeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bununla birlikte, kararlı transfeksiyonunun homojen bir hücre popülasyonu sağladığı ve bunun da birleşik ve dolayısıyla daha güvenilir bir hücresel yanıt verdiği belirtilmelidir. Geçici transfeksiyon durumunda, hücre popülasyonunun sadece küçük bir kısmı plazmid alır ve korur, bu da deneye çeşitlilik sağlar. ER-I-PpoI veya ER-AsiSI endonucleaz tabanlı hücre sistemlerinin kurulması, endononikleazı kodlayan plazmidlerle daha etkili bir şekilde enfekte olan% 50 bir konflüent hücre popülasyonu gerektirir. Transfeksiyon için, piyasada bulunan transfeksiyon reaktifleri veya viral enfeksiyon bazlı yöntemler de kullanılabilir. Mikroskobik bir görselleştirme tekniği uygulanacaksa ve geçici transfeksiyon gerekiyorsa, yönlendirilmiş DSB'ler transfeksiyondan sonra 4-OHT ilavesi 24 saat ile indüklenebilir, bu da ER ile kaynaşmış endonükleazlara bağlanır ve nükleer translokasyon ve DSB indüksiyonuna izin verir. En uygun zaman noktalarını belirlemek için immünofluoresans bazlı mikroskopi ve 4-OHT tedavisini takiben farklı zaman noktalarında φH2AX'ın batı lekesi tespiti yapılabilir. Fizyolojik koşullar altında, hücre başına maksimum 10-15 φH2AX odakları tespit edilebilir ve güçlü onarım odaklarının oluşumu endonokleazlar (veya burada tartışılmayan diğer çeşitli teknikler gibi lazer mikroirradiasyonu) ile tetiklenebilir. Tipik bir I-PpoI endonucleaz, ribozomal DNA'da (rDNA) DSB'leri indükleerek nükleolus çevresinde yüksek φH2AX sinyallerinin oluşumuna yol açar. Molalar NHEJ veya HR tarafından onarılırsa, onarım odaklarının sayısı zamanla azalır. Bu nedenle, 4-OHT tedavilerini takiben 0 h, 30 dk, 1, 2, 4 ve 8 h'de temsili zaman noktaları önerilir. DNA onarım süreçlerini izlemek için, bilinen tüm onarım yolları bu hücrelerde tamamen işlevsel olduğu için en sık kullanılan hücre hattı U2OS'tir. Aynı hücrelerdeki birkaç protein araştırılırken, şekil 1'degösterildiği gibi farklı hayvan türlerinde yetiştirilen farklı emisyon dalga boyları ile farklı floroforlarla konjuge edilen antikorlar birleştirilerek birlikte lokalizasyon incelenebilir. Burada, DSB'lerin indüksiyonu, hemagglutinin etiketi (HA) ile kaynaşmış ER-AsiSI kısıtlama endonucleazını temel alan indüksiyonu temsil edilir. Doksiksin, sitoplazmada HA-ER-AsiSI'nin ifade ve eleksiyonunu indükleyebilir ve bu da HA'ya karşı bir antikor kullanılarak izlenebilir(Şekil 1. üçüncü sütun, ikinci ham). 4-OHT ile 4 saat, doksiksin ilavesi sonrası 24 saat kuluçka, endonükleaz çekirdeğe yerle edildiğinden yüksek sayıda DSB'ye neden olabilir(Şekil 1. üçüncü sütun, üçüncü ham ve ikinci sütun, üçüncü ham). DSB'ler φH2AX tanıyan bir antikor kullanılarak görselleştirilebilir.

Figure 1
Şekil 1: HA-ER-AsiSI ifade eden kültürlü hücrelerde φH2AX'ı tespit etmek için immünoresans mikroskopisi kullanılır. DOX (doksiklin) ilavesi HA-ER-AsiSI'nin sitoplazmik ekspresyonunu aktive eder ve 4-OHT (4-hidroksytamoxifen) (4 h) füzyon proteininin nükleer translokasyonunu indükler ve bu da DSB'lerin bilinen genomik pozisyonlarda indüksiyonuna yol açar. HA (hemagglutinin) lekeleme (anti-HA antikoru) ha-ER-AsiSI füzyon proteinini yeşil olarak temsil eder ve kırılmaların indüksiyonu kırmızı φH2AX boyama (anti-φH2AX antikoru) ile doğrulanır. Ölçek çubukları 20 μm'yi temsil eder.

Hasar yerindeki onarım proteinlerinin birlikte lokalizasyonu, aynı DNA lezyon bölgesine alındıklarını gösterir, ancak birbirleriyle etkileşime girmeleri gerekmez. Konfokal mikroskopinin çözünürlüğü yaklaşık 300 nm'dir; kırılma yerindeki spesifik onarım proteinlerinin bağlama düzenini belirlemek için, süper çözünürlüklü mikroskopi (STORM) önerilir 24. Ancak, bu yöntem pahalı mikroskobik ekipman ve uzman bir araştırmacı gerektirir. Alternatif olarak, onarım proteinlerinin bağlayıcı deseni, AsiSI ve I-PpoI endonüselazlarını sırasıyla 17,21olarak ifade edebilen DIvA veya U2OS-pEP15 stabil hücre hatları kullanılarak kromatin immün önkoşülasyonu ile incelenebilir. 4-OHT ilavesi üzerine, her iki endonükleoz da DNA'yı belirli bir şekilde kesebilir, bu da bize beklenen kırılma bölgelerine ve çevresindeki genomik bölgelere locus spesifik astarlar tasarlama fırsatı sağlar. ChIP'nin immün özürlülük kısmına φH2AX antikoru uygulayarak, FARKLı koşullar (bazı onarım faktörlerinin, yani DNA-PKC'lerin susturulması veya inhibe edilmesi gibi) DNA onarım kinetiğini zamansal olarak takip edebiliriz. ChIP-qPCR kullanılarak elde edilen tipik bir deneysel sonuç Şekil 2'de temsil edilir. Burada, φH2AX'ın zamansal zenginleşmesi I-PpoI kaynaklı DNA hasarına bir yanıt olarak gösterilmiştir. Görüntünün sol kısmında, zamanında algılanan φH2AX sinyali kırılma bölgesinde gösterilirken, sağ kısımda φH2AX dağılımı DSB'lerin indüklendirilmediği bir kontrol gen bölgesinde temsil edilir.

Figure 2
Şekil 2: I-PpoI kaynaklı DNA hasarına yanıt olarak kromatin immün önksepitasyonu ile belirlenen φH2AX'ın zamansal zenginleştirilmesi. Sol, mola yerinde φH2AX sinyali; sağ, DSB'lerin indüklendirilmediği bir kontrol bölgesinde φH2AX dağılımı (anti-φH2AX antikor). Temsil edilen sonuçlar bir biyolojik deneyden türetilir ve hata çubukları karşılık gelen örnek çoğaltmalarının varyasyonlarını gösterir. N=3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA onarımı nispeten yeni bir araştırma alanı olmasına rağmen, çeşitli biyokimyasal ve mikroskobik yöntemlerin yardımıyla bilgimiz hızla genişlemektedir. Onarım süreçlerinde yer alan genlerde meydana gelen mutasyonlar tümöregenezin önde gelen nedenleri arasında yer aldığından ve bu nedenle DNA onarım yollarının temel adımlarını aydınlatmak gerekli olduğundan, genetik bilgilerin korunması hücreler için çok önemlidir.

Biyokimyasal teknikler (örneğin, batı lekesi, immüno-prekipitasyon, kütle spektrometresi vb.) çok sayıda hücre gerektirir ve çalışılan onarım süreçleri istenen hücre popülasyonunun bir anlık görüntüsünü temsil eder. ChIP deneyleri yapmak zahmetlidir, zahmetlidir ve DSB onarım sürecini incelemek için belirli bir deney tasarlarken birçok husus dikkate alınmalıdır. Aşağıdaki adımlar bazı örneklerdir: (I) hücreler düzgün bir şekilde lysed edilmelidir; kromatin fraksiyonu (II) kromatinin aşırı veya az tonik olmamasını sağlamak için ayrı hücre ve nükleer lizis tamponu kullanarak iki aşamalı bir lizasyon yöntemi uygulanması şiddetle tavsiye edilir; uygun sonikasyon koşulları önceden her hücre tipine optimize edilmelidir (III) farklı şirketlerden aynı proteine karşı antikorlar verimli immün önkipitasyon için aynı olmayan özellikler (IV) sergilediğinden uygun miktarda saflaştırılmış antikor belirlenmelidir, her koşulda (V) 25-30 ug başlangıç kromatin kullanılmalıdır uygun fiksasyon süresi optimize edilmelidir, aşırı düzeltme, uzak protein komplekslerini çapraz bağlayarak yanlış pozitif sonuçlara neden olabileceğinden ve alt düzeltme, uygulanan antikora dayanarak DNA ile istenen protein (VI) arasında uygun çapraz bağlantıyı önleyebileceğinden, boncukların türü (protein A veya G) yıkama adımları sırasında dikkatlice belirlenmeli (VII), DNA ekstraksiyonu sırasında boncuklardan (VIII) antikorun salınmasını önlemek için yıkama tamponlarının sırası iyice tutulmalıdır, daha fazla aşağı akış reaksiyonlarının verimliliğini azaltmak için fenol izleri düzgün bir şekilde ortadan kaldırılmalıdır. Bu yöntem kurtarılan DNA'nın verimini azalttığından, kişisel tavsiyemiz spesifik DNA saflaştırma kiti kullanmaktır. Tüm kritik noktalar düzgün bir şekilde ele alındığında, ChIP farklı genomik locilerde istenen proteinin doluluğu için değerli veriler sağlayabilir ve DNA onarım süreçlerindeki kritik adımları çözebilir.

Bununla birlikte, QPCR ile birlikte ChIP, seçilen genomik bölgelerdeki protein dağılımını incelemek için dolaylı bir yaklaşımdır ve DNA bağlama bölgesini özellikle tanımaya veya proteinin işlevini doğrudan incelemeye izin vermez. Protein-DNA komplekslerini yakalamak için kullanılan mono veya poliklonal antikorlar da yanlış-pozitif verilere yol açan diğer proteinlerle çapraz reaksiyona girebilse ve bu nedenle bu teknikte kullanılan antikorlar CHIP sınıfı ve ilgi proteinine karşı son derece spesifik olmalıdır. Bununla birlikte, ChIP yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve chIP-on-chip ve ChIP-seq gibi buna dayalı başka yaklaşımlar geliştirilmiştir. İlki, protein bağlama bölgeleri hakkında değerli bilgiler sağlayan tavlanmış dizileri daha da güçlendiren çok çeşitli küçük rastgele DNA dizileri ile bir mikroarray üzerindeki immün özürlü ve saflaştırılmış DNA parçalarını melezlemesine dayanır. Bununla birlikte, ChIP-seq, protein-DNA komplekslerinin ChIP-on-chip ve yüksek verimli genom diziliminden daha yüksek çözünürlüğe sahip genom çapında haritalandırılmasını sağladığından çekici bir alternatif yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. ChIP-seq, gen düzenlemesi hakkında içgörüler sağlayan çeşitli transkripsiyon faktörlerinin DNA bağlama alanlarını ifşa ederek ve genom çapında bir ölçekte kromatin manzaralarını çözerek DNA onarımı alanında devrim yaptı25. Buna göre, DNA onarım alanı ChIP-seq'ten büyük ölçüde yararlanmıştır, çünkü bu veriler kanser ilerlemesi gibi çeşitli hastalıklarda ve biyolojik yollarda çok önemli bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, ChIP yönteminin çeşitli modifikasyonları geliştirilmiştir HaloChIP, ilgi proteinine karşı spesifik antikor gerektirmez, aksine HaloTag ile kaynaşmış DNA bağlayıcı proteinleri kodlayan diziler kullanır, hücrelere ve daha sonra çapraz bağlamaya bulaşır, istenen protein-DNA kompleksleri HaloLink Reçine kullanılarak yakalanabilir. Bununla birlikte, bu teknik yanlış yorumlanan verilerle sonuçlanabilecek istenen proteinlerin endojen seviyesine değil, aşırı ifadeye dayanır26.

Ayrıca mikroskobik teknikler, tek hücreli düzeyde bile OLSA DNA hasarı onarımının mekansal takibi hakkında değerli bilgiler sağlar. Spesifik onarım proteinlerine karşı yetiştirilen antikorların hızlı bir şekilde iyileşmesi, NER ve DSBR alt yollarının mekanizmasının ve çeviri sonrası düzenlemelerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına yol açmıştır. Mikroskobik alan, DNA hasarına bağlı hücresel süreçlerin nükleozomal düzeyde görselleştirilmesini sağlayan ve protein birlikte lokalizasyonunun doğru bir şekilde eşlenmesini sağlayan süper çözünürlüklü mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü tekniklerle devrime uğradı24. Bununla birlikte, onarım oranı ayrışabileceğinden, sonuçların yorumlanabilmesini zorlaştırabileceğinden, deney sırasında hücre soylarındaki varyans göz önünde bulundurulmalıdır. Floresan görüntüleme metodolojisinin hızlı evrimi ve deneysel kurulumun kasıtlı tasarımı göz önüne alındığında, DNA hasarına bağlı hücresel ve moleküler yanıtları tek hücreli düzeyde tek bir protein çözünürlüğünde araştırmak için değerli bir fırsat mükemmellik yolundadır.

Sonuç olarak, süper çözünürlüklü mikroskopi ve tek hücreli dizileme metodolojisinin kombinasyonu, DNA onarım alanını anlamamızı önemli ölçüde artırabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiç kimse

Acknowledgments

Bu araştırma Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi hibe GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, Macar Bilimler Akademisi BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO kısa süreli bursu 8513 ve Tempus Vakfı'nın János Bolyai Araştırma Bursu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Biyoloji Sayı 174 DNA onarımı kromatin immün önkseçimi floresan mikroskopi bölgeye özgü DSB'ler immünostaining
Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter