Summary
L’échafaudage DOX-CL préparé satisfaisait aux conditions préalables d’un pansement DW idéal en matière de résistance mécanique, de porosité, d’absorption d’eau, de taux de dégradation, de libération prolongée, d’antibactérien, de biocompatibilité et de propriétés anti-inflammatoires, qui sont considérées comme essentielles pour la récupération des tissus endommagés chez les DW.
Abstract
Une complication importante du diabète sucré est les plaies diabétiques (DW). La phase prolongée de l’inflammation dans le diabète obstrue les étapes ultérieures d’une blessure menant à la cicatrisation retardée de blessure. Nous avons choisi le doxycycline (DOX), comme drogue potentielle de choix, due à ses propriétés antibactériennes avec ses propriétés anti-inflammatoires rapportées. L’étude actuelle vise à formuler des échafaudages non réticulés (NCL) et réticulés (CL) chargés de collagène-chitosane et à évaluer leur capacité de guérison dans des conditions diabétiques. Le résultat de la caractérisation des échafaudages révèle que l’échafaudage DOX-CL présente une porosité idéale, un faible taux de gonflement et de dégradation et une libération prolongée de DOX par rapport à l’échafaudage DOX-NCL. Les études in vitro indiquent que l’échafaudage DOX-CL était biocompatible et a amélioré la croissance cellulaire comparée à l’échafaudage cl traité et aux groupes témoins. Les études antibactériennes ont montré que l’échafaudage DOX-CL était plus efficace que l’échafaudage CL contre les bactéries les plus courantes trouvées dans DW. Utilisant le streptozotocin et le modèle à haute teneur en matières grasses DW d’alimentation-induit, on a observé un taux sensiblement plus rapide (p≤0,05) de contraction de blessure dans le groupe traité par échafaudage dox-CL comparé à ceux dans l’échafaudage de CL traité et les groupes témoins. L’utilisation de l’échafaudage DOX-CL peut s’avérer être une approche prometteuse pour le traitement local des DWs.
Introduction
Le diabète sucré (DM) est une condition où l’incapacité du corps à délivrer de l’insuline ou à réagir à ses résultats dans la digestion anormale des sucres simples entraîne une recrudescence de la glycémie 1. L’enchevêtrement le plus consécutif et le plus écrasant de DM est la blessure diabétique (DW). Environ 25% des patients atteints de DM ont la possibilité de construire un DW dans leur vie 1. La guérison entravée de DW est accréditée à un triopathy de DM : immunopathy, vasculopathy, et neuropathie. Chaque fois que le DW n’est pas traité, il peut en résulter un développement de gangrène, ce qui entraîne le retrait de l’organe concerné 2.
De nombreux traitements, tels que l’instruction des patients (inspecter la plaie quotidiennement, nettoyer la plaie, éviter les activités qui créent une pression sur la plaie, la surveillance périodique de la glycémie, etc.), le contrôle de leur glycémie, le débridement de la plaie, le déchargement de pression, la procédure médicale, l’oxygénothérapie hyperbare et les thérapies innovantes sont en pratique 3,4. La majorité de ces médicaments ne répondent pas à tous les prérequis vitaux pour les soins DW à la lumière des conditions physiopathologiques multifactorielles et des dépenses imprévues liées à ces médicaments 5. Quoique la pathogénie de DW soit multifactorielle, l’inflammation persistante avec la gestion inadéquate de tissu est indiquée pour être la raison réelle de la guérison retardée dans DWs 5,6.
Les niveaux augmentés des médiateurs inflammatoires et pro-inflammatoires dans DW ont comme conséquence les facteurs de croissance diminués responsables de la cicatrisation retardée de blessure 2,6. La formation incorrecte de matrice extracellulaire (ECM) dans les DW est accréditée aux niveaux accrus des protéinases métalliques de matrice (MDP) responsables de la dégradation rapide de l’ECM formé. Dans les MMP, MMP-9 est rapporté comme un intermédiaire important responsable de l’inflammation prolongée et de la dégradation rapide de l’ECM 7. Il est indiqué que le traitement local avec un médicament anti-inflammatoire qui diminue les niveaux élevés de MMP-9 rétablit l’homéostasie cutanée, l’arrangement du cadre et incite à une meilleure guérison des DWs 8,9.
La doxycycline (DOX), un inhibiteur de MMP-9, a été choisie pour supprimer les niveaux élevés de MMP-9, un médiateur inflammatoire majeur responsable de l’inflammation persistante chez les DWs 10,11,12. En outre, DOX possèdent antioxydant (produire des radicaux hydroxy et phénoxy libres capables de se lier avec des espèces réactives de l’oxygène) 13 et anti-apoptotique (inhiber l’expression de la caspase et la stabilisation mitochondriale) 14 activités qui sont essentielles pour le traitement de DW. L’arrangement des cadres contenant DOX, collagène (COL), et chitosan (CS) a été choisi. Le choix de COL dépend de la façon dont il aide à fournir le cadre nécessaire responsable de la résistance mécanique et de la régénération des tissus 15. D’autre part, le CS est structurellement homologue au glycosaminoglycan, associé à plusieurs phases curatives de blessure. Il est également rapporté que CS détient une propriété antibactérienne significative 15. Par conséquent, l’échafaudage COL/CS de DOX est formulé pour supprimer l’inflammation prolongée, suivi en soutenant la formation de matrice pour la blessure réussie guérissant dans des conditions de DM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures animales effectuées ont été approuvées par le comité institutionnel d’éthique animale du JSS College of Pharmacy, Ooty, Inde.
1. Préparation d’échafaudages poreux chargés de DOX par procédé de lyophilisation
- Ajouter 1,2 g de COL à 100 mL d’eau (p. ex. Millipore) et tenir de côté pour l’enflure.
- Remuez la dispersion gonflée du COL à 2000 tr/min pendant la nuit pour assurer la dissolution complète du COL.
- Préparer la solution de CS en dissolvant environ 0,8 g de CS dans 100 mL d’acide acétique à 1 %.
- Remuer la solution CS pendant une nuit à 2000 tr/min pour assurer une dispersion uniforme.
- Mélanger DOX (1 % p/v), suivi de la solution CS, à la solution COL, et agiter pendant 30 min.
- Filtrer le mélange physique obtenu à l’aide d’un chiffon de mousseline pour éliminer les particules.
- Congeler en profondeur le filtrat obtenu à -85 °C ± 4 °C pendant environ 24 h.
- Lyophiliser le mélange de congélation profonde à -85 °C ± 4 °C pendant 72 h.
- Stocker les échafaudages obtenus dans un dessicateur pour une analyse plus approfondie 16,17.
2. Réticulation de l’échafaudage
- Dissoudre le MES (0,488 g) dans 50 mL d’eau.
- Faire tremper 50 mg de l’échafaudage chargé par DOX dans 20 mL du tampon MES pendant 30 min.
- Mélanger 19,5 mL de tampon MES avec 0,1264 g d’EDC et 0,014 g de NHS dans un bécher séparé.
- Immerger l’échafaudage dans le mélange tampon pendant 4 h pour obtenir une réticulation 16.
- Stockez les échafaudages (CL) et non réticulés (NCL) chargés par DOX pour une évaluation plus approfondie.
3. Caractérisation des échafaudages
- Examen morphologique à l’aide d’une microscopie électronique à balayage (MEB)
- Caractériser les échafaudages pour l’analyse morphologique à l’aide de MEB (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Tachez la section transversale et la surface extérieure de l’échafaudage avec la couche délicate d’or (~ 150 Å).
- Capturez l’image photographique à la tension d’excitation de 5 kV et 10 kV.
- Placez les échantillons dans des talons d’aluminium et enfermez-les avec l’or à environ 9 V.
- Mesurer l’échafaudage à l’aide de MEB avec une résolution accrue à 10 kV.
- Détermination de la porosité
- Mesurer la porosité des échafaudages à l’aide de la méthode de déplacement liquide (éthanol) 18.
- Calculer la porosité des échafaudages à l’aide des formules ci-dessous.
Ww = Poids humide de l’échafaudage
Wd = Poids à sec de l’échafaudage
Wv = Volume de l’échafaudage
- Détermination de la capacité d’absorption d’eau
- Mesurer le poids à sec de l’échafaudage.
- Incuber l’échafaudage pesé à 37 °C pendant 24 h dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pH 7,4.
- Retirez l’excès de PBS sur l’échafaudage à l’aide de papier filtre.
- Mesurer la capacité d’absorption d’eau à l’aide des formules ci-dessous 17.
WS = Pourcentage d’absorption d’eau
W1=Poids humide de l’échafaudage
W0= Poids à sec de l’échafaudage
- Dégradation de l’échafaudage
- Incuber l’échafaudage (1cm x 1cm) à 37 °C pendant 7 jours dans un PBS de pH 7,4 contenant des lysozymes.
- Lavez l’échafaudage pour éliminer les ions collés sur la surface.
- Lyophilisé l’échafaudage lavé 17.
- Calculer le taux de dégradation à l’aide de formules.
Ww = Poids initial de l’échafaudage
Wd = Poids de l’échafaudage après lyophilisation
-
Études de libération in vitro
- Déterminez le comportement de libération du DOX à partir de l’échafaudage à l’aide de la méthode du sac de dialyse.
- Disperser l’échafaudage dans quelques millilitres de liquide de plaie simulé (pH 7,4) et le transférer dans un sac de dialyse.
- Fermez hermétiquement les extrémités du sac à membrane et plongez dans les 500 mL de solution de liquide de plaie simulée.
- Remuer la solution liquide de la plaie contenant le sac de dialyse à 200-250 tr / min.
- Recueillir la solution surnageante et la remplacer par une quantité égale de solution tampon fraîche à intervalles de temps définis.
- Déterminer le pourcentage de rejet de DOX par les échafaudages dans la solution surnageante à l’aide d’un spectromètre UV-visible à 240 nm.
4. Études antibactériennes in vitro
- Déterminer la concentration inhibitrice minimale (CMI) des échafaudages CL et DOX-CL contre S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa en utilisant la méthode de dilution du micro-bouillon.
- Préparer les cultures bactériennes à l’aide du bouillon Mueller-Hinton dans un rapport de 1:1000 pour obtenir une turbidité de 0,5 McFarland.
- Ajouter le D-glucose (800 mg/dl) aux cultures bactériennes pour l’hyperglycation 19,20.
- Hacher et solubiliser le CL et le DOX-CL dans le DMSO (contrôle négatif).
- Diluer en série la suspension bactérienne hyperglycée (100 μL) et les échantillons d’essai (100 μL de solution d’échafaudages) dans 96 plaques de puits.
- Incuber la plaque à 37 °C pendant 20-24 h.
- Enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 600 nm 21.
5. Études de biocompatibilité in vitro
- Évaluer la biocompatibilité des échafaudages préparés à l’aide du test MTT [(3-(4,5 diméthyl thiazole-2 yl)-2,5-diphényl tétrazolium)]
- Stérilisez les échafaudages de dimension standard et placez-les dans 24 plaques de puits.
- Ajouter les cellules 3T3-L1 à la plaque de 24 puits et incubées pendant 72 h.
6. Études in vivo sur des animaux
- Induction de DM et plaie d’excision
- Nourrissez l’animal avec un régime riche en graisses pendant deux semaines et administrez une dose unique de streptozotocine (STZ) (50 mg/kg de poids corporel) dans une solution tampon citrate par voie intrapéritonéale aux rats albinos Wistar (180-200 g) pour l’induction du diabète de type 2.
- Choisissez les animaux avec une glycémie constante de 250 mg/dl pour l’étude.
- Randomiser les animaux sélectionnés pour l’induction des plaies d’excision.
- Anesthésiez les rats diabétiques utilisant l’éther diéthylique (5 ml ont été ajoutés à la chambre d’anesthésie avant saturée) et confirmez utilisant la méthode de pincement d’asteil et la couleur de membrane muqueuse.
- Raser la région dorsale (région thoracique dorsale, lombaire) à l’aide d’une tondeuse aseptique et de lames (A40).
- Stérilisez la zone rasée avec un écouvillon alcoolique.
- Exciser la peau (2 x 2 cm2 et une profondeur de 1 mm) avec une lame A40 chirurgicale aseptique sur la zone rasée pour créer une plaie ouverte.
- Divisez les animaux en trois groupes (groupe 1 - Contrôle de la maladie (contrôle), groupe 2 - Échafaudage CL (placebo), groupe 3 - Échafaudage DOX CL), chaque groupe composé de 6 rats.
- Apposez les échafaudages CL et DOX CL à l’aide de ruban chirurgical et couvrez le groupe témoin avec de la gaze stérile pendant 21 jours.
- Tracez la zone de la plaie sur une feuille stérile d’OHP et mesurez le pourcentage de réduction de la plaie à l’aide de la méthode de la grille les jours 0, 7, 14 et 21 pour tous les groupes.
- Calculer le pourcentage de réduction des plaies à l’aide des formules ci-dessous.
7. Études histopathologiques
- Isoler la zone de la plaie cicatrisé les jours 7, 14 et 21, conserver dans une solution de forin (10%).
- Sectionr les tissus à l’aide d’un microtome pour obtenir une épaisseur de 6 μm.
- Montez les sections sur une lame de verre et colorez à l’aide d’hématoxyline et d’éosine 17.
- Capturez les images sous un grossissement 40x à l’aide d’un microscope numérique.
8. Estimation de l’hydroxyproline
- Isolez le secteur guéri de blessure aux jours 0, 7, 14, et 21 pour l’évaluation.
- Estimer la teneur en hydroxyproline à l’aide de la procédure décrite par Reddy G et al., 1996 22.
9. Test Elisa
- Estimer les niveaux de MMP-9 à l’aide du kit Elisa conformément aux instructions du fabricant.
- Isoler les échantillons de tissu de la zone de plaie guérie le jour 21 et hacher à l’aide d’un homogénéisateur de tissu.
- Centrifuger l’homogénéat obtenu et recueillir le surnageant.
- Diluer le surnageant à 100 fois à l’aide d’un tampon d’analyse.
- Numérisez la plaque à l’aide d’un lecteur à plaques multiples.
10. Analyse statistique
- Représenter les résultats obtenus en tant que DD moyen ±.
- Effectuez l’analyse statistique à l’aide de Graph pad prism v5.01.
- Atteindre la signification statistique à l’aide de l’analyse de variance à sens unique (ANOVA) et du test post hoc de Dunnet.
- Considérez les valeurs avec p≤0,05 comme significatives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caractérisation de l’échafaudage NCL et CL chargé par DOX
À l’examen visuel, l’échafaudage de NCL et de CL s’est avéré crème dans la couleur. En outre, les deux échafaudages semblent être comme une éponge, raides et inélastiques lorsqu’ils sont examinés physiquement. Les images MEB des échafaudages NCL et CL sont illustrées à la figure 1. D’après la figure, il était clair qu’il y avait une diminution de la taille des pores après réticulation en formant des liaisons intermoléculaires. De plus, la porosité des échafaudages NCL et CL s’est avérée être de 92,3±4,21 et 71,35±2,65, respectivement. Le pourcentage d’absorption d’eau des échafaudages NCL et CL était 750±11,4% et 492±8,66% à intervalles de temps de 24 h.
En outre, des études de biodégradation ont été réalisées pendant sept jours dans le fluide simulé de plaie de pH 7,4, comprenant des lysozymes. L’échafaudage NCL a montré un taux de dégradation plus rapide au début dans les trois premiers jours et a diminué lentement pendant quatre jours consécutifs. De l’autre côté, l’échafaudage CL a montré un taux prolongé de dégradation. La réticulation de l’échafaudage a amélioré les propriétés mécaniques et la résistance du réseau qui, à son tour, a entraîné une diminution du taux de dégradation, indiquant une meilleure résistance à la dégradation (Figure 2).
De plus, la libération in vitro de DOX à partir de l’échafaudage NCL et CL a été réalisée pendant 120 h(figure 3). Dans le 1 h initial, 27,92±3,45% DOX a été libéré de l’échafaudage NCL, tandis que seulement 16,54±2,21% DOX a été libéré de l’échafaudage CL. Après 6 h, le rejet de DOX des échafaudages a augmenté de 63,15 ±3,78 % dans l’échafaudage NCL et de 44,43 ±3,57 % dans les échafaudages CL. Après 24 h, il y avait un dégagement de 70% DOX de l’échafaudage de NCL, tandis que l’échafaudage CL a pris plus de 72 h pour libérer 70% du DOX. D’après les résultats obtenus, l’échafaudage CL chargé par DOX a été sélectionné pour une évaluation plus approfondie et représenté comme échafaudage DOX-CL. Alors que l’échafaudage CL sans DOX (placebo) est désigné comme échafaudage CL.
Études antibactériennes in vitro
Les patients atteints de DW éprouvent habituellement des infections qui ont comme conséquence la cicatrisation prolongée de blessure. Ainsi, les échafaudages préparés ont été examinés pour leur activité antibactérienne en utilisant le MIC contre un panel sélectionné de bactéries(tableau 1). D’après les résultats, il est clair que DOX a montré une activité inhibitrice avec une CMI de <4 μg/mL contre S. aureus et S. epidermis. Une CMI de <8 μg/mL et <16 μg/mL a été observée contre E. coli et P. aeruginosa. Seul, le chitosane et l’extrait d’échafaudage CL présentaient une activité minimale contre certains organismes tels que S. aureus (<64 μg/mL), S. epidermis (<64 μg/mL), E. coli (<128 μg/mL) et P. aeruginosa (<128 μg/mL). L’échafaudage DOX-CL a montré une activité inhibitrice similaire avec une CMI de <2 μg/mL contre S. aureus et S. epidermis. De plus, l’échafaudage DOX-CL présentait des activités modérées avec une CMI de <8 μg/mL contre E. coli et P. aeruginosa.
Étude de biocompatibilité in vitro
L’analyse de MTT a été exécutée pour déterminer la viabilité cellulaire des cellules 3T3-L1 en présence des échafaudages de CL et de DOX-CL. Les résultats ont illustré que les échafaudages CL et DOX-CL n’ont stimulé aucune cytotoxicité. De plus, la viabilité cellulaire était comparativement plus élevée dans les groupes traités par échafaudage que dans le contrôle, ce qui représente la croissance accrue des fibroblastes en présence d’échafaudages(figure 4).
Études in vivo sur la cicatrisation des plaies
Le secteur moyen de blessure a diminué dans tous les groupes a été déterminé utilisant la méthode graphique les jours 0, 7, 14, et 21 (figure 5). À l’examen visuel, les blessures dans les groupes traités par échafaudage de CL et de DOX-CL étaient libres de suinter le septième jour. En même temps, les blessures dans le groupe témoin suintaient. Le jour 14, une gale sèche a été observée dans tous les groupes; cependant, on a observé un taux plus rapide de contraction de blessure dans l’échafaudage DOX-CL (89.663%). Le jour 21, 99,9% de la blessure a été guéri, et une cicatrice a été formée dans l’échafaudage DOX-CL, tandis que la guérison partielle a été observée dans le contrôle et l’échafaudage cl a traité des groupes.
Étude histopathologique
L’observation histopathologique de la blessure guérissant le jour septième postinjury a montré la rupture de toutes les couches de peau aux bords de la blessure dans tous les groupes. Il n’y avait aucune visibilité de l’épiderme ; cependant, on a observé des neutrophiles prédominantes avec les monocytes et les lymphocytes intermittents dans le groupe témoin. Dans le groupe traité par échafaudage cl, la visibilité modérée de l’épiderme a été notée avec peu de neutrophiles et de macrophages. Considérant que, dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL, la blessure a été recouverte d’une couche mince de l’épiderme, représentant la phase du reepithelization. Des neutrophiles et les macrophages doux, avec le tissu de granulation, ont été également vus plus souvent dans le groupe traité par échafaudage de DOX-CL.
Le jour 14 postinjury, des blessures dans tous les groupes se sont avérées pour être couvertes d’épiderme. Dans le groupe témoin, on a observé que la couche d’épiderme formée était une couche très mince avec les neutrophiles prévaluées. Dans le groupe traité par échafaudage cl, la couche d’épiderme formée était plus épaisse que cela dans le groupe témoin, avec les cellules massives multinucleated douces. Dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL, l’épiderme développé était plus épais comparé à d’autres groupes, avec un nombre abondant de histiocytes et de cellules multinucleated géantes. On a également observé la zone dense des fibroblastes dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL.
Le jour 21 postinjury, dans le groupe témoin, un nombre dominant de neutrophiles ont été diminués avec la répétition des macrophages et des histiocytes représentant l’inflammation diminuée. Considérant que, dans le groupe traité par échafaudage CL, on a observé un nombre modéré d’histocytes et de lymphocytes. On a observé l’épiderme formé pour être sensiblement plus épais dans le groupe traité par échafaudage de DOX-CL que ceux dans le groupe témoin, avec un nombre riche de histiocytes, de lymphocytes, et de cellules multinucleated massives. Dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL, le compte de neutrophiles a été diminué le jour 7. En outre, le rassemblement de macrophages et de leurs variantes morphologiques telles que les cellules massives multinucléées et les histiocytes ont été remarqués les jours 14 et 21(Figure 6).
Estimation de l’hydroxyproline
L’estimation d’hydroxyproline est une mesure indirecte de la quantité de collagène présente dans les blessures curatives. Une concentration plus élevée d’hydroxyproline désigne un pourcentage rapide de cicatrisation des plaies. L’examen biochimique a révélé une quantité plus élevée d’hydroxyproline dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL, suivi du groupe traité par échafaudage CL que dans le groupe témoin(figure 7).
Estimation MMP-9 à l’aide du kit Elisa
Le contenu MMP-9 dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL a été sensiblement diminué comparé à ceux dans le contrôle, et l’échafaudage cl a traité le groupe. Considérant que la teneur en MMP-9 dans le groupe traité par échafaudage CL était légèrement inférieure à celle du groupe traité par échafaudage DOX-CL, comme le montre la figure 8.
Figure 1: Morphologie de l’échafaudage COL-CS chargé par DOX a) avant CL et b) après détermination du CL par SEM à une échelle de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Dégradation matricielle du DOX chargé dans les échafaudages NCL et CL du jour 1 au jour 7 dans un PBS pH de 7,4 à 37 °C montrant le NCL dégradé progressivement pendant 7 jours. Contrairement à cela, le taux de dégradation de l’échafaudage CL considérablement réduit indique une résistance accrue à la dégradation enzymatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Profil de libération in vitro du dox à partir d’échafaudages NCL et CL dans un pH PBS de 7,4 à 37 °C montrant une libération lente du médicament dans toutes les formulations suivie d’une libération prolongée. Données exprimées en moyenne ± et (n=3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Cellules 3T3-L1 cultivées en présence d’échafaudages CL et DOX-CL montrant un pourcentage de croissance cellulaire plus élevé dans le groupe traité par échafaudage DOX-CL suivi d’un échafaudage CL traité et témoin. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:(a)Images représentant la réduction de la surface moyenne de la plaie dans les groupes témoins, échafaudage CL et échafaudage DOX-CL traités les jours 0, 7, 14 et 21 après la blessure. (b) Représentation graphique de la réduction de la zone moyenne de la plaie dans le témoin, l’échafaudage CL et l’échafaudage DOX-CL traités groupes les jours 0, 7, 14 et 21 post-blessure. Les données sont exprimées en moyenne ± l’écart-type (n = 6 plaies/groupe). La signification statistique a été obtenue par l’analyse onnel de variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Dunnet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Changements histologiques au cours du processus de cicatrisation des plaies dans la ZST et diabète induit par le régime alimentaire riche en graisses dans la peau de rat albinos Wistar les jours 7, 14 et 21 sans (contrôle) et avec traitement (échafaudages CL et DOX-CL) dans un modèle de plaie d’excision pleine épaisseur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Résultat représentant la teneur en hydroxyproline dans les plaies des jours 0, 7, 14 et 21 comme indicateur de l’estimation indirecte du niveau de collagène. Les résultats sont exprimés en μg d’hydroxyproline/mg de tissu sec de la plaie. Les données représentent la moyenne±SD (n = 6 plaies/groupe). La signification statistique a été obtenue par l’analyse onnel de variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Dunnet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: Graphique représentant les niveaux de MMP-9 dans les homogénats obtenus à partir de plaies cicatrisations dans la ZST et le modèle de rat diabétique induit par le régime alimentaire riche en graisses le jour 21. Des niveaux de MMP-9 ont été déterminés dans des aliquotes de 100 fois des fluides de blessure utilisant l’analyse d’elisa. Les données représentent la moyenne±SD (n=3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| CMI (μg/mL) | ||||
| Échantillon d’essai | S. aureus | S. épiderme | E. coli | P. aeruginosa |
| Dox | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| Extrait de l’échafaudage CL | <64 | <64 | <128 | <128 |
| Extrait de l’échafaudage DOX-CL | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tableau 1: Concentration minimale inhibitrice d’échafaudages CS, DOX, CL et DOX-CL contre un panel sélectionné de bactéries.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’objectif principal de cette étude était de déterminer l’effet de l’échafaudage COL-CS chargé par DOX sur la guérison DW chez les rats. Cl et NCL ont été préparés et évalués en termes de morphologie, d’index de gonflement, de cinétique in vitro de libération, et de biocompatibilité.
Caractérisation de l’échafaudage NCL et CL chargé par DOX
Les échafaudages préparés se sont avérés poreux avec des pores interconnectés. Ces pores interconnectés assurent la nature poreuse et spongieuse qui aide à la bonne diffusion de l’oxygène et des nutriments vers les cellules pour la prolifération et la migration, conduisant à une guérison accélérée. Ici, la taille des pores dépendait principalement de la réticulation. La réticulation de l’échafaudage a entraîné une diminution de la taille des pores en formant de fortes interactions intramoléculaires par EDC/NHS avec CS et COL, augmentant ainsi la résistance mécanique de l’échafaudage.
L’indice de porosité repose sur la densité relative, qui est fonction de la masse des entretoises éponges et du volume. En règle générale, le rétrécissement du volume de l’échafaudage se produit si un agent de réticulation modifie la position des jambes de force en les rapprochant les uns des autres, ce qui entraîne une densification de l’échafaudage. Cependant, dans le cas de la chimie du carbodiimide, une augmentation de la masse de l’échafaudage n’est pas prévue en raison de son mécanisme unique, c’est-à-dire l’introduction de la liaison amide (O = C-NH) utilisant le groupe carboxylique (>COOH) et amine (-NH) de la chaîne peptidique adjacente sans entrer dans l’échafaudage. Simultanément, pendant la réticulation, une perte de masse mineure peut survenir en raison de la dissolution et de la migration de chaînes polymères non attachées. Néanmoins, en cas d’échafaudage, le traitement par EDC/NHS n’a produit aucun effet notable sur la morphologie de l’échafaudage.
La capacité de l’échafaudage à absorber le fluide biologique est cruciale pour évaluer son aptitude en tant que vecteur de médicament. La propriété d’absorption d’eau a non seulement un impact sur la forme de l’échafaudage, mais affecte également la croissance cellulaire. On a observé que l’échafaudage CL avait montré un taux d’absorption d’eau inférieur à celui de l’échafaudage NCL, ce qui peut être attribué à la réticulation de l’échafaudage. D’ailleurs, l’hydrophilie du matériel d’échafaudage a été sensiblement réduite après réticulation due à (i) la perte des groupes hydrophiles (>COOH &- NH) dans le processus de formation de liaison d’amide ; (ii) inhibition de l’enflure par la formation de nouvelles liaisons (O=C-NH). Ces résultats sont en bon accord avec les rapports précédemment publiés 23,24.
Une étude enzymatique de biodégradation a été réalisée en surveillant le pourcentage d’une masse résiduelle après sept jours d’incubation dans le fluide simulé de blessure de pH 7,4, comprenant des lysozymes. L’échafaudage NCL a montré un taux de dégradation plus rapide au début dans les trois premiers jours et a diminué lentement pendant quatre jours consécutifs. De l’autre côté, l’échafaudage CL présentait un taux de dégradation prolongé. La réticulation de l’échafaudage a amélioré les propriétés mécaniques et la résistance du réseau qui, à son tour, a entraîné une diminution du taux de dégradation, démontrant une meilleure résistance à la dégradation.
Des études de libération de drogue ont été réalisées pour des échafaudages cl et NCL pendant 120 h. En général, le coefficient de libération du médicament de l’échafaudage diminue à mesure que la densité de réticulation augmente en raison des interconnexions améliorées entre les pores et de la diminution de l’espace entre les chaînes polypeptidiques. Le coefficient de libération du médicament est également influencé par l’indice de porosité, la teneur en eau, l’indice de gonflement et le degré de réticulation. Dans notre étude, 27,92±3,45% et 63,15±3,78% de DOX de l’échafaudage NCL, tandis que 16,54±2,21% et 44,43±3,57% de DOX de l’échafaudage CL ont été libérés à 1 h et 6 h, respectivement. Après 24 h, il y avait un dégagement de 70% de DOX de l’échafaudage de NCL, tandis que ; L’échafaudage CL a pris plus de 72 h pour libérer 70% du DOX. Les résultats ont montré que la réticulation de l’échafaudage influençait inversement la libération de DOX en diminuant le rapport de gonflement et la teneur en eau.
Études antibactériennes in vitro
L’extrait d’échafaudage de DOX-CL a montré une activité inhibitrice plus élevée (MIC) contre les organizations grampositrices. L’activité plus élevée de l’extrait d’échafaudage DOX-CL pourrait être en raison de l’hydrophobicité accrue de l’échantillon. Cependant, l’extrait d’échafaudage dox-CL a montré l’activité minimale contre les organizations gramnétatives, probablement dues à l’échec de pénétration de paroi cellulaire. De plus, le MIC de DOX-CL était comparativement plus haut que CS, échafaudage CL, et échantillons DOX, qui peuvent être attribués à l’activité synergique de DOX et de CS dans l’extrait de DOX-CL.
Étude de biocompatibilité in vitro
L’étude in vitro de biocompatibilité a été réalisée sur des cellules de fibroblaste (3T3-L1). Les fibroblastes sont responsables de la production d’ECM et de protéines. De plus, ils jouent un rôle crucial dans le maintien de l’intégrité structurelle en améliorant la formation du cadre requis pour la cicatrisation des plaies. Les résultats montrent que l’échafaudage DOX-CL et l’échafaudage CL n’ont produit aucune cytotoxicité cellulaire. Cependant, les deux groupes d’échafaudage ont été observés avec la croissance cellulaire et la différenciation des fibroblastes dans les pores de l’échafaudage, indiquant que les échafaudages préparés étaient biocompatibles. La croissance et la différentiation accrues de cellules dans les deux groupes étaient principalement dues à la présence du CS et du COL comme matrice extracellulaire dans la structure d’échafaudage.
De plus, une croissance cellulaire relativement plus élevée a été observée avec le groupe d’échafaudage DOX-CL que celle de l’échafaudage CL en raison de l’activation du signal PI3K-AKT par DOX, responsable de la croissance cellulaire et de la survie 25.
Études in vivo sur la cicatrisation des plaies
Les diverses complications de DM sont responsables de la guérison prolongée de DW. Pour imiter l’état diabétique chez les rats, un régime à haute teneur en matières grasses a été donné, suivi d’une injection intrapéritonéale de STZ. Après 2-3 jours de confirmation diabétique, des blessures ouvertes ont été créées par l’excision de la peau à la région thoracique dorsale. Le traitement a été effectué pendant 21 jours avec les échafaudages respectifs. La réduction du secteur de blessure a été déterminée pour tous les groupes les jours 0, 7, 14, et 21. Les rats diabétiques traités avec l’échafaudage de DOX-CL ont montré un degré significatif de contraction de blessure comparée aux groupes d’échafaudage de CL et aux groupes non traités.
La phase inflammatoire de la cicatrisation des plaies est responsable de la formation d’une barrière fonctionnelle. Dans l’étape suivante, la phase proliférative de la guérison de blessure attire l’attention dans le soin de blessure, dans lequel 43% de réduction de zone de blessure a été observée avec le groupe d’échafaudage de DOX-CL. En comparaison, seulement 23% et 7% ont été observés avec l’échafaudage cl et les groupes non traités le jour 7, respectivement. À partir des images(figure 5),la contraction de la plaie a été initiée après la fin de la phase inflammatoire et proliférative. Le groupe d’échafaudage de DOX-CL a montré la contraction significative de blessure due à la présence de DOX, qui est responsable des effets anti-inflammatoires et anti-infectieux. D’ailleurs, COL et CS dans l’échafaudage ont aidé la prolifération cellulaire, la différentiation, et la migration ayant pour résultat 99% de DW guérissant en 21 jours.
Les blessures non traitées d’excisional ont montré des neutrophiles, des lymphocytes, et des monocytes le jour 7 postinjury. Comme indiqué précédemment, les neutrophiles aident au débridement de blessure à la partie de la cicatrisation de blessure. En outre, la surabondance de neutrophiles peut influencer négativement le processus de guérison en endommageant le tissu normal. Comme l’ont rapporté Dovi et al., un nombre minimal de neutrophiles accélère le processus de ré-épithélialisation 26.
De plus, les macrophages accrus, les histiocytes, et les cellules multinucleated massives dans le groupe traité par échafaudage de DOX-CL ont favorisé l’environnement pour la blessure accélérée guérissant en réparant les cellules endommagées et en favorisant la synthèse de COL. D’ailleurs, l’amalgamation de COL avec le tissu a été déterminée utilisant les niveaux de hydroxyproline dans tous les groupes. Cependant, on a observé des niveaux comparativement plus élevés de hydroxyproline avec le groupe traité par échafaudage DOX-CL que le groupe traité traité par échafaudage non traité et CL. Comme indiqué dans la littérature, la phase inflammatoire prolongée dans l’état diabétique entrave les autres phases de la guérison. Le taux plus rapide de contraction de blessure dans l’échafaudage DOX-CL peut être attribué à DOX' propriété anti-inflammatoire de s, ayant pour résultat les étapes ultérieures de la blessure se produisant dans la phase de temps appropriée menant à la blessure accélérée guérissant.
L’estimation biochimique des niveaux MMP-9 utilisant l’essai d’ELISA indique que le groupe traité par échafaudage DOX-CL a montré les niveaux diminués de MMP-9 en comparaison de ceux dans l’échafaudage cl traité et les groupes non traités. Selon la littérature, l’augmentation des niveaux de MMP-9 responsable de la dégradation de la matrice, qui, à son tour, prolonge le processus de cicatrisation des plaies. DOX, un agent anti-inflammatoire, a empêché les niveaux MMP-9, qui est considéré la raison d’empêcher la panne de COL, ayant pour résultat la guérison accélérée de DW. Ces résultats sont en accord avec des études publiées antérieurement par Lindeman et coll., 2009 et Zhang et coll., 2014 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Ashish D Wadhwani. (Professeur adjoint et chef du Département de biotechnologie pharmaceutique, JSS College of Pharmacy, Ooty, Inde) pour avoir aidé aux études de viabilité cellulaire in vitro.
Les auteurs tiennent à remercier le Département des sciences et de la technologie - Fonds pour l’amélioration de l’infrastructure scientifique et technologique dans les universités et les établissements d’enseignement supérieur (DST-FIST), New Delhi, pour son soutien à notre département.
Les auteurs tiennent également à remercier M. Sanju. S et M. Sriram. Les étudiants de Narukulla M. Pharm pour leur soutien dans le tournage de la vidéo.
Cette recherche a été soutenue par la JSS Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
