Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,4, 5, 2, 1
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences, University of Essex, 3X-ray Science Division, Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences, University of Southampton

Summary

Vi presenterar en omfattande guide till förberedelse av fasta målprover, datainsamling och databehandling för seriell synkrotronkristallografi vid Diamond beamline I24.

Abstract

Seriell datainsamling är en relativt ny teknik för synkrotronanvändare. Diamond Light Source är en användarhandbok för insamling av fasta måldata på I24 och presenteras med detaljerade steg-för-steg-instruktioner, siffror och videor för smidig datainsamling.

Introduction

Seriell synkrotronkristallografi (SSX) är en framväxande metod för datainsamling som inspirerades av röntgenfria elektronlasrar (XFEL)1,2,3. Vid en XFEL registreras ett enda diffraktionsmönster från en vanligtvis mycket liten proteinkristall, innan kristallen förstörs av den extremt ljusa röntgenpulsen. Detta innebär vanligtvis att en ny kristall måste införas i röntgenstrålen för att få ett annat diffraktionsmönster4. Detta behov av att kontinuerligt fylla på kristaller har drivit utvecklingen av många seriella provleveranstekniker5.

Vid synkrotroner tillämpas klassiska (icke-seriella) rotationskristallografimetoder i stor utsträckning och utnyttjar en enda stor kristall som roteras i en röntgenstråle med hjälp av en goniometer för att samla in en komplett datauppsättning för strukturlösning6. För att öka kristallernas livslängd så att en komplett datauppsättning kan samlas in7,8, och även för att underlätta frakt och automatiserad provöverföring, är kristaller cryocooled till ~ 100 K för datainsamling. Vid intensiva mikrofokusstrålar används ofta multikristallstrategier eftersom strålningsskador kan förbjuda insamling av en komplett datauppsättning från en enda kristall9,10,11. Trots de begränsningar som strålskadorna medför är antalet kristaller som används fortfarande relativt blygsamt och det tillvägagångssätt som används är i huvudsak identiskt med det enda kristallexperimentet.

SSX, å andra sidan, använder seriell prov leverans för att få enstaka fortfarande diffraktions mönster från tusentals slumpmässigt orienterade kristaller för att generera en komplett data uppsättning. Det noteras att seriella tekniker som innehåller kristallrotation är under utveckling12,13 även om vi fokuserar på stillbild, nollrotation, tillvägagångssätt. Det finns ett brett utbud av provleveranssystem med olika fördelar och nackdelar14, allt från att leverera en ström av kristaller i en flödesfokuserad / trögflytande jet15,16,17, mikrofluidiskt chip18,19eller kristaller på ett fast mål som ett etsat kiselchip20,21 . Vanligtvis hålls kristaller i rumstemperatur, vilket gör att större konformationell mångfald kan observeras och ger en mer fysiologiskt relevant miljö22. SSX möjliggör insamling av datamängder med mycket låg dos23, eftersom den totala dosen av datauppsättningen motsvarar en enda kort röntgenexponering av en kristall. En annan stor fördel som SSX ger är studier av proteindynamik genom tidsupplösta metoder, med reaktioner som utlöses av exponering för laserljus24,25,26,27eller genom blandning av kristaller och ligand / substrat28,29. Med hjälp av mindre kristaller kan laserljus tränga in i kristallens helhet och initiera reaktionen på ett enhetligt sätt utan multifotonabsorption för att ge väldefinierade reaktionsinteriärer för diffraktionsdata som tas vid olika tidpunkter27. Användning av större kristaller och rotationsbaserade datainsamlingsmetoder lider av ett begränsat laserpenetrationsdjup, ickeuniform eller multifotonaktivering, strålningsskador och mekanisk overheadtid inom datasvep, vilket resulterar i en blandning av reaktionsinteriärer som kan visa sig vara svåra eller omöjliga att tolka vid snabbare reaktionshastigheter. Mindre kristaller ger en liknande fördel vid blandningsexperiment, eftersom ligands snabbt och mer enhetligt kan spridas i hela kristallen, vilket återigen gör det möjligt att registrera definierade reaktionsmediärer vid olika tidpunkter30,31,32.

På Diamonds mikrofokusstrålelinje kan både konventionell rotation och SSX-experiment utföras. Här presenteras ett omfattande protokoll för SSX-provberedning och datainsamling med fasta mål på I24 och protokoll för dataanalys av seriella data på Diamond. Även om manuskriptet och medföljande videor bör göra det möjligt för användare att utföra ett framgångsrikt SSX-experiment vid I24, bör det noteras att detta är ett snabbt utvecklande område och att tillvägagångssätt ständigt utvecklas. Det bör också noteras att seriella metoder finns tillgängliga vid andra synkrotronkällor, inklusive men inte begränsat till Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI och PXII)34och NSLS (FMX)35. Även om detaljerna för insamling och behandling av seriella uppgifter kommer att skilja sig åt mellan olika källor, kommer de grundläggande principerna att förbli desamma. Protokollen nedan bör ses som en utgångspunkt och en väg till baslägret snarare än toppen av vad som skulle kunna uppnås.

Detta protokoll förutsätter att användarna har ett protein- eller litet molekylkristallsystem, från vilket en mikrokristallslam i ordningen 0,5-2,0 ml med en god densitet av mikrokristaller per ml har producerats. Protokoll för att erhålla kristallslamm har beskrivits tidigare 36. Många olika typer av fasta mål finns tillgängliga, den vanligaste används på I24 använder ett exakt definierat kiselchip. För att skilja från andra chiplayouter, nedan och i beamline-gränssnittet kallas detta för ett "Oxford-chip". Som tidigare beskrivits består Oxfords chiplayout av 8×8 "stadsblock", var och en innehållande 20×20 bländare för totalt 25 600 bländare20,21.

Protocol

1. Förbereda och ladda ett chip

OBS: Processen sker i en fuktkontrollerad miljö (figur 1), vanligtvis mellan 80% och 90% eller högre relativ fuktighet, för att förhindra att proteinkristaller torkar ut. När kristallerna har laddats och förseglats kan de överleva i upp till 24 timmar. Detta kan dock variera kraftigt mellan kristallsystem. I kammaren krävs en lågdriven vakuumpump som är fäst vid ett laststeg för att hålla ett kiselchip (figur 1),ett kiselchip, en spånhållare med polyesterfolie (figur 2),en p200-pipett, 200 μL pipetterspetsar, pincett, filterpapper och proteinkristallslammet.

  1. Förbered en spånhållare.
    1. Skär två ark polyesterfolie i rutor ca 6 cm x 6 cm.
    2. Lägg polyesterplåtarna över de två bottenplattorna (stora och små).
    3. Fäst polyesterplåtarna på plats med metalltätningsringarna.
    4. Dra försiktigt i överskottet av polyesterfolie för att ta bort eventuella veck för att underlätta visualisering och centrering av prover senare.
  2. Välj ett kiselchip med 7-30 μm i förhållande till kristallernas storlek.
  3. Glow tömr chipet i 25 sekunder vid 0,39 mBar och använder en ström på 15 mA för att möjliggöra enkel spridning av mikrokristaller på chipet.
  4. Placera silikonchipet på spånbelastningssteget med pincett med de upphöjda stängerna vända nedåt.
  5. Applicera 200 μL av mikrokristallslammet på den plana sidan av chipet med en pipett.
  6. Sprid ut kristallslammet för att täcka alla "stadsblock" av chipet.
  7. Om chipet är skadat, täck eventuella hål med en liten bit polyesterfolie eller filterpipettspets för att säkerställa att ett jämnt vakuum kan appliceras.
  8. Applicera ett mjukt vakuum tills all överskottsvätska har sugits genom chipet.
  9. Ta bort chipet från spånbelastningssteget med pincett.
  10. Torka försiktigt undersidan av chipet med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska.
  11. Placera det laddade chipet på den större halvan av spånhållaren mellan styrskenmärkena platt sida nedåt.
  12. Försegla spånet genom att placera den lilla halvan av spånhållaren ovanpå.
    1. De två halvorna av spånhållaren kommer att snäppa på plats. Om den andra halvan inte sitter i jämnhöjd, snurra hållaren 180° för att justera magneterna ordentligt.
  13. Skruva fast spånhållaren med haxbultar för att fästa spånet ordentligt på plats.
    OBS: Alternativt kan ett "spånfritt" chip laddas på ett liknande sätt, med en mindre volym kristallslam (~ 15 μL) inklämt mellan de två lagren av polyesterfolie i spånhållaren 37, eller en mindre volym kan laddas med en 50 μm tjock dubbelsidig lim distans som appliceras direkt på polyesterfolien som beskrivits tidigare 38 . Användningen av självhäftande distanser gör det också möjligt att ladda flera prover (eller varianter av prover som ligand soaks) på varje chipless chip. En kompletterande lastningsmetod som utnyttjar akustisk dropputmatning (ADE) för att ladda kiselchips kan också användas på Diamond39. ADE gör det möjligt att ladda spånor med mindre volymer kristallslam än pipettbelastning. Det är en särskilt användbar teknik när det är ont om prover, även om slammets kemiska sammansättning och viskositet måste beaktas.

2. GUI och inställning vid strållinjen

  1. Utför all chipjustering och installation för datainsamling genom ett enkelt EPICS Display Manager (edm) grafiskt användargränssnitt (GUI) (bild 3a). Detta ger ett peka-och-klicka-gränssnitt för beamline-instrumentering och tillhandahåller indataparametrar för Python-baserad datainsamling. Underfönster ger ytterligare kontroll för insamling från underregioner av en provhållare(figur 3b) eller laser/LED-pumpsondexperiment(figur 3c).

3. Justera chipet

  1. Placera det laddade chipet på XYZ-scenen vid strållinjen (visas i figur 4a)med hjälp av de kinematiska fästena.
    1. Var noga med att undvika att dra etapperna längs deras färdriktning. Magneterna i de kinematiska fästena är ganska starka så detta kan göras ganska enkelt av misstag.
    2. När du närmar dig fästet ska spånhållaren hållas i en liten vinkel (±30°). När magneterna kommer i kontakt, låt spånhållaren rotera parallellt med golvet (0°) och spånhållaren klickar på plats (bild 4b).
    3. När du tar bort ett chip följer du en omvänd väg. Rotera och vinkla spånet bort från stegen innan du drar bort spånhållaren.
  2. Använd strållinjens visningssystem på axeln och chipjusterings-GUI: et, hitta chipets övre vänstra fidukial. Fiducials är tre rutor, två små och en stor, i rät vinkel mot varandra (figur 5a). Chipet är tillbaka belyst så att chipet kommer att se mörkt ut med bländare som vita rutor.
  3. Centrera på fiducial noll i X, Y och Z (bild 5b). Justera X och Y genom att flytta åt vänster/höger respektive uppåt/nedåt. Justera Z genom att flytta chipet in och ut ur fokus.
  4. Klicka på Ange fiduktiv noll.
  5. Upprepa steg 3.2 för fiducial ett (uppe till höger, bild 5c)och fiducial två (nedre vänstra, bild 5d)för att anpassa alla fiducials med röntgenstrålen.
  6. Generera en koordinatmatris genom att trycka på gör koordinatsystem, detta beräknar chipets förskjutning, tonhöjd, rulle och gir i förhållande till stegen så att alla efterföljande rörelser kan göras i chipkoordinaramen.
  7. Klicka på Blockera kontroll för att flytta XYZ-scenen till den första brunnen i varje stadsblock för visuell bekräftelse på att chipet är väl justerat.
  8. Om röntgenkorset ligger i linje med bländarna är chipet i linje. Om inte, upprepa steg 3.2-3.3.
    ANMÄRKNINGAR: Vid svårigheter att justera (brutna fiducials) kan olika bländare på chipet användas för justering med hjälp av "justeringstypen" neddragningsmenyn. Många olika typer av chip är tillgängliga för insamling av fasta måldata. Olika chiptyper tillgodoses genom användning av "chip type" pull-down-menyn. De vanligaste chiptyperna som används på I24 är "Oxford" och "anpassade" chips. Numret och avståndet mellan bländare och fiducialer på chipet läses från en chipordlista som definieras via den neddragningsvänliga menyn. Anpassat chip gör det möjligt att definiera bländaravståndet i farten, vilket är särskilt användbart för tunnfilmsark på ark eller andra "spånlösa" chips där kristaller slumpmässigt placeras överhållaren 37. Ett nytt Python GUI, som erbjuder funktionen för att flytta på klick och automatiserad chipjustering, är för närvarande under utveckling, men är ännu inte redo för rutinmässig användning vid tidpunkten för skrivandet av detta manuskript.

4. Ställa in datainsamling

Datainsamlingsinställningar beror på vilket system som studeras och vilket experiment som ska utföras. Detta kan sträcka sig från det enklaste SSX-experimentet, samla in en låg dosstruktur, till ett tidslöst experiment med lasrar eller snabb blandning för att initiera en reaktion som kräver flera kompletta data uppsättningar vid olika tidpunktsfördröjningar. För att ställa in en datainsamling måste följande parametrar definieras.

  1. Experimentella variabler: Fyll i mappen, filnamnet, exponeringstiden, överföringen, detektoravståndet och antalet bilder per bländare i förekommande fall.
  2. Chiptyp: Matcha chiptypen med det chip som används.
    1. Om en tunn film eller ett "chipless" chip används ställer du in chiptypen på Ingen.
    2. Definiera antalet steg och stegstorlek i både x och y i det grafiska gränssnittet.
  3. Ange karttyp: detta gör att underavsnitt av ett chip kan väljas för datainsamling (bild 3b). "Ingen" innebär att data samlas in från varje bländare på ett chip. Lite: uppgifter samlas in från utvalda kvarter på chipet (figur 3b). Detta kan vara användbart om till exempel en region i ett chip är känd för att vara dåligt laddad eller tom. "Full" gör det möjligt att välja enskilda bländare för datainsamling. I det här fallet måste en korrekt formaterad textfil tillhandahållas. Detaljer och en mall kan erhållas från beamline personal.
  4. Pumpsond: Välj typ av pumpsondexperiment och önskad tidsfördröjning. Utlösningen av pumpen (vanligtvis en LED eller laser) är ofta specifik för ett visst experiment, så kommer inte att beskrivas i detalj här.
    1. "Korta" fördröjningar avser experiment när det finns en öppning vid varje öppning mellan pumpen och sonden (dvs. pump, sond, "flytta till nästa prov.) Förseningar är vanligtvis i 1 sekund eller tiotals millisekunder.
    2. Longs förseningar avser en excite och besök igen (EAVA) strategi, där öppningar besöks två gånger, med en definierad tidsfördröjning mellan besök (dvs. pumpa, flytta, pumpa, flytta, sonden, flytta, sonden etc.). Tidsfördröjningen beräknas och röntgenexponeringstider(bild 3c) och det är vanligtvis ~ 1 sekund eller mer.

5. Vanliga metoder för datainsamling

OBS: Följande är de viktigaste parametrarna som definierar vilken typ av experiment som utförs. I det här avsnittet förutsätts att de andra inställningarna från protokoll 3 "Konfigurera datainsamling" har definierats.

  1. Scenario 1: Datainsamling med låg dos. Samling av en enda diffraktionsbild från varje vald bländare på provhållaren.
    1. Ange antalet bilder per bländare till 1.
    2. Ställ in pumpsonden på Ingen.
  2. Scenario 2: En dosserie som samlar in n bilder sekventiellt från varje vald bländare på provhållaren. Chipet står stilla vid varje bländare medan varje uppsättning n-bilder samlas in.
    1. Ställ in antalet bilder per bländare till'n'. Observera att bearbetningen förenklas om n=5, 10, 20 eller någon annan multipel av 10. Det är svårt att fastställa trender om n < 5. Det är användbart att överväga den totala tiden som krävs för att täcka ett chip och antalet bildfiler som produceras när n ökas.
    2. Ställ in pumpsonden på Ingen.
  3. Scenario 3: Metoder för pumpsond
    1. Välj en metod på pumpsondens neddragningsmeny för att öppna laserexcitationskontrollcentret.
    2. För ett pumpsondexperiment fyll i Laser Dwell vid varje bländaralternativ.
    3. Fyll i Laser Dwell vid varje bländare och röntgenexponering för EAVA och klicka på Beräkna.
    4. Välj lämpligt upprepa-alternativ i listrutan edm GUI-pumpsond för önskad fördröjningstid.
    5. Om experimentet kräver ett steg före belysning fyll i laser 2 Dwell-sektionen.
    6. När alla experimentella variabler har definierats trycker du på Ange parametrar och skapar en kort lista. Detta laddar experimentella variabler på geobrick-styrenheten. När detta är klart trycker du på Start kommer detektorn att flytta in, bakgrundsbelysningen ut och starta datainsamlingen. Vid alla tidpunkter när du ställer in datainsamling är det användbart att ha ett terminalfönster öppet där feedback om status och resultat för vart och ett av stegen skrivs ut.

6. Databehandling

OBS: I stort sett kan databehandling delas in i tre grupper baserat på hur brådskande feedback krävs. Snabb feedback krävs för att visa om kristaller är närvarande och diffract, och i så fall i vilka siffror. Detta bör hålla jämna steg med datainsamlingen. Utföra dataindexering och integrering som kan vara långsammare men som fortfarande bör utföras på jämförbara tidsskalor med datainsamling. Sammanslagning och skalning av reflektionsintensiteter till en mtz-fil för strukturlösning och generering av elektrontäthetskartor representerar det sista steget och kan vara långsammare. Här kommer endast att diskuteras att starta pipelines på I24 för de två första stegen, eftersom de krävs för feedback i realtid för att vägleda ditt experiment, men observera att mätvärden som träfffrekvens och skalningsstatistik inte är en ersättning för inspektion av elektrontäthet, vilket kan ge den enda bekräftelsen på att en ligand har bundit, eller en reaktion inträffade, i crystallo.

  1. Snabb feedback
    1. För att ladda databehandlingsmodulerna typ modul ladda i24-ssx i terminalen på någon beamline arbetsstation.
    2. Så här kör du hit-finding-analystypen i24-ssx /path/to/visit/directory/ till terminalen: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/
      OBS: Detta öppnar tre terminalfönster och, när data har skrivits till disk, en grafisk representation av spotsökningsresultat från Diffraktionsintegration för avancerade ljuskällor (DIALS) 40,41(Figur 6a).
      1. Standardinställningarna poängsätter var tiondebild och uppdateras med några sekunders mellanrum för att minimera beräkningsbelastningen.
      2. Ändra standardvärdet genom att lägga till ett argument i slutet av kommandot ovan. Till exempel skulle 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx köra hit finding på alla andra bilder. Detta kan dock sätta onödig belastning på klustret (en delad resurs!) och sakta ner bearbetnings tiderna. Diagrammet är färgkodat baserat på sannolikheten för framgångsrik indexering, rött visar minst 15 Bragg-fläckar har hittats (god chans att indexera), blått visar lite eller ingen användbar diffraktion.
      3. Visa diffraktionsbilder av intresse för DIALS-bildvisaren genom att klicka på fläckarna på spot finder-gränssnittet.
  2. Feedback om indexering och integration
    INDEXERING och integrering av diffraktionsdata utförs med DIALS med hjälp av funktionen dials.still_process 40,41. Därför bör specifik information om kristallen (förväntad kristallutrymmesgrupp, enhetscell och en experimentgeometri) placeras i en PHIL-textfil.
    1. Läs in DIALS-moduler genom att skriva in inläsningsrarar för modulen i en terminal.
    2. Så här börjar du bearbeta en datauppsättningstyp dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil-file.phil. Förloppet för alla datamängder som fortfarande bearbetas kan övervakas genom att köra stills_monitor-skriptet genom att skriva monitor_stills_process.py (efter att modulen har lästs in i24-ssx och ändrat katalog till det aktuella besöket) ( bild6b).
    3. Enhetscellfördelningen av indexerade diffraktionsdata (bild 7a) kan övervakas med kommandot ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Detta är särskilt användbart för att identifiera och lösa enhetscellspolymorfningar som diskuterats tidigare 42.
    4. "Visualzie" om och hur denna fördelning varierar över ett fast mål genom att producera ett 2D-diagram (figur 7b) med kommandot python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.
    5. Ta fram stereografiska projektioner av alla indexerade diffraktionsdata (bild 7c) med kommandot DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt.
      OBS: Det är en vanlig patologi vid bearbetning av stillbilder data från kristaller där symmetrin hos Bravais gitter är högre än rymdgruppssymmetrin som sammanslagna data visas som en perfekt tvilling. Databehandlingsalgoritmer har utvecklats för att lösa denna patologi 43,44,45,46 men användare bör vara medvetna om detta när de bearbetar sina data.

Representative Results

Insamling och serie med låg dos
Lågdosdata (steg 5.1: Scenario 1) och dosserier (steg 5.2: Scenario 2) samlades in på kopparnitritreductasmikrokristaller vid I24 och har publicerats tidigare 42. Alla prover utarbetades enligt beskrivningen i steg 1, data som samlats in enligt steg 3, 4 och 5 och bearbetades med metoder i steg 6. I detta arbete samlades en snabb dosserie in med 20 diffraktionsbilder tagna vid varje bländare (dvs. n=20 i det grafiska gränssnittet för datainsamling som visas ovan) innan de flyttades till ett nytt prov. Från dessa data identifierades en bimodal fördelning av enhetsceller i rymdgrupp P213 (a = b = c = 97,25 Å och a = b = c = 96,38 Å). Identifiering och avskiljning av dessa enhetscellspolymorfer för bearbetning visade en markant förbättring av datakvalitetsindikatorer och visade två olika strukturer i en flexibel slinga mellan resthalterna 189-193 i stället för det blandade tillstånd som observerats vid bearbetning av alla data tillsammans. Identifiering av sådana polymorfer skulle kunna göra hela skillnaden i en delikat tidsupplöst strukturell studie där endast små strukturella förändringar förväntas. Dessutom visade den insamlade dosserien en dosberoende enhetscellförändring i kristallen, med ökad dos som skiftade populationen till förmån för den större enhetscellen.

Liknande arbete utfördes av Ebrahim et al (2019)47, där en dosserie (steg 5.2: Scenario 2) samlades in från en färgämnesliknande hemeperoxidas från Streptomyces lividans (DtpAa) för att jämföra lågdosstrukturer från SSX (Steg 5.1: Scenario 1) med de som mäts i samma fasta målsystem med hjälp av SFX. SFX-data samlades in vid SACLA Beamline BL2 EH3 med en pulslängd på 10 femtosekunder och en repetitionshastighet på 30 Hz. 10 femtosekundspulsens varaktighet säkerställer att dosberoende effekter inte förekommer i SFX-data. SFX-data jämfördes med SSX-data som samlats in på strållinjen I24, där 10 sekventiella 10 millisekundexponeringar mättes vid varje provposition (dvs. n=10). Den dosberoende migrationen av en heme järnkoordinerad vattenmolekyl bort från järnet observerades, liksom en konformationell förändring i en av heme propionatgrupperna i SSX dosserien. Även om dosserien inte var skadefri som SFX-strukturen, tillät dosserien att Fe-O-bindningslängden för en nolldosuppsättning (ferric heme) extrapolerades, och detta överensstämde inom experimentellt fel med det värde som erhållits från SFX.

De seriella metoder för datainsamling som beskrivs här kan också enkelt anpassas för att ge nya provmiljöer för att till exempel studera anaeroba proteinstrukturer vid rumstemperatur. Som beskrivs i Rabe et al 2020 48möjliggör lastning av ett "ark-på-ark"-prov, eller "chipless chip", med olika tätningsfilmer i en anerob kammare, insamling av strukturella data i rumstemperatur från dioxygenkänsliga prover.

Pump sond
Även om följande representativa resultat inte samlades in på Diamond Beamline I24, har dessa metoder utvecklats i nära samarbete mellan anläggningar i iNEXT-programmet för att arbeta mot standardmetoder inom utveckling av seriell kristallografimetod. Beamline I24 erbjuder, eller kommer snart att erbjuda, likvärdiga insamlingsmetoder till de som beskrivs nedan för att utföra sådana experiment med de metoder som beskrivs i protokollen ovan.

Pumpsond: Snabb blandning
Snabb blandning av SSX har utförts vid beamline T-REXX vid PETRA III av Mehrabi et al (2019) 28 med hjälp av en piezodriven droppinjektor för att initiera reaktioner på fasta mål. Detta arbete presenterar ett principbevis på chipblandningsexperiment som binder GlcNac3till lysozyme mikrokristaller, med bindning som sker inom 50 ms av en 75 pL droppe som appliceras på provet. Denna studie följdes upp med en 7-struktur tidsupplöst serie av xylose isomeras aktivitet, som visar glukosbindning inom 15 ms och bildandet av en öppen ringkonformation i glukosmolekylen efter en 60 sekunders fördröjning. En motsvarande inställning för droppinjektion är för närvarande under utveckling för användning på I24.

Pumpsond: Ljusaktivering
Ett ljusaktiverat seriellt experiment med pumpsond presenteras i Schulz et al (2018) 49. Fluoroacetate dehydrogenase dränktes med fotokaged fluoroacetat och pumpades med 320-360 nm laserljus för att producera strukturer vid 4 tidpunkter (t =0, 30, 752 och 2,052 ms). Vilotillståndsstrukturen (0 ms) visar en tom aktiv plats, med undantag för några få vattenmolekyler, och motsvarande densitet mellan lockdomänerna för båda proteinunderenheterna. 30 ms och 752 ms efter ljusaktivering kan en signifikant minskning av elektrontätheten observeras i locket av underenhet B i förhållande till underenhet A. Minskningen av elektrontätheten i underenhet B:s lockområde sammanfaller med fluoroacetatets utseende på den aktiva platsen för underenhet A vid 752 ms. Den slutliga data uppsättningen vid 2 052 ms visar ytterligare strukturell omorganisering av liganden, misstänks underlätta rätt geometri för SN2-attack och potentiell bildning av ett mellanliggande tillstånd i reaktionen. På I24 kan ett portabelt Pharos-lasersystem som inte kan från 210-2500 nm som ger femtosekundspulser användas för ljusaktivering. Inledande experiment visade framgångsrik aktivering av en fotocage med 308 nm excitation med bindning av den släppta ligand till målproteinet observerade. I skrivande stund pågår integration i strållinjens personalsäkerhetssystem och rutinmässiga användarexperiment förväntas i början av 2021. För experiment när mindre intensiva ljuspulser krävs har ljusaktivering med TTL-styrda lysdioder utförts framgångsrikt.

Figure 1
Bild 1:Provladdningsutrustning på plats vid Diamond Light Source. Upplägget består av en vakuumpump (a), handsklåda (b) och luftfuktare (c). I handskfackets vakuum används vakuumtrycket för att verka på ett chip laddat med kristallslam som hålls i ett provblock (d) fäst vid en Büchnerkolv(e, grön pil), via en tryckregulator (f, gul pil) fäst vid en kran (g, blå pil). Fuktig luft pumpas in i tältet via plastslangar som är fästa vid luftfuktaren (h) och mäts med en hygrometer (i). Komponenterna hålls på plats med hjälp av klämstativ (j). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Provhållare. De använder en O-ring av metall (a) för att klämma polyesterfilm på en topp (b) och botten (c) hälften, med den nedre halvan sportmagnetfästen (d) som används för att fästa provhållaren på provstegen. Polyesterfilmen (6 μm (e) eller 3 μmf) samt gummi-O-ringar (vita pilar) förhindrar att ett kristallbelt chip torkar snabbt i en provhållare som är stängd med sexkantsbultar (g). Chips rengörs med sekventiella 15-minutersbad i dH2O, 1 M HCl och dH2O (h). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Gui för datainsamling för insamling avfasta måldata vid I24. a) Visar huvudgränssnittet som används för att justera chips och definiera parametrar för datainsamling,b) är det mappningsgränssnitt som används för att definiera underregioner i ett chip för datainsamling och (c) är ett gränssnitt för att definiera parametrar för laserbelysning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Bild 4: Processen att montera en spånhållare på stegen enligt beskrivningen i steg 3, punkt 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5:Spånjustering. Ett chip justeras genom att klicka på tre fiducial markörer på chipet som visas i (a). Vyer av fiducialerna 0, 1 och 2 genom strållinjens visningssystem på axeln visas ib,c) ochd). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Bild 6: Resultaten för automatisk bearbetning visar hur de beskrivs i steg 6.1. En uppdatering av träfffrekvensdiagram visas (a, infälld). Om du klickar på en "träff" visas motsvarande diffraktionsbild i bildvisaren. Träfffrekvensen för den aktuella datainsamlingen visas (29,6 % i det här exemplet). Panelb) visar ett exempel på ett fönster som visar aktuella indexerings- och integrationshastigheter för data som hittills samlats in under besöket och som uppdateras i realtid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Mer djupgående dataanalys. Visualisering av enhetscellparametrar kan visa polymorfer (a). Genomsnittliga enhetscellparametrar beräknas. Detta omfattar dock ännu inte individuella medelvärden för polymorfer. Visualisering av en liten delmängd av data (data som visas är en delmängd av 793 kopparnitritrepartaskristaller från de data som beskrivs i Ebrahim et al 2019) är ofta tillräckligt för att avslöja trender. 2D-diagram med användbara parametrar kan också produceras för att avslöja variationer som uppstår på grund av belastning eller uttorkningseffekter som kan åtgärdas för kommande datainsamlingar (b). Stereografiska projektioner kan avslöja närvaron, eller frånvaron, föredragna orienteringar som matas tillbaka till laddningsprotokollet (c). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Seriell synkrotrondatainsamling är en relativt ny teknik vid MX-strållinjer, som överbryggar klyftan mellan de ultrasnabba datainsamlingar som för närvarande utförs på XFELs och traditionell synkrotronbaserad MX. Detta manuskript syftar till att ge en översikt över hur man framgångsrikt samlar in seriella data med fast mål vid beamline I24, Diamond Light Source för låg dos, dosserier och tidsupplösta experiment. Som med standardkristallografi är provberedning en stor flaskhals i strukturlösning. SSX är inte annorlunda, och beredning av en homogen kristallslam i tillräckliga mängder har ännu inte dragit nytta av flera årtionden av studier och förfining som tillväxten av enstaka stora proteinkristaller har. Beredningen av dessa slam är dock utanför ramen för detta dokument och har sammanfattats någon annanstans36. Det kritiska steget i metoden som beskrivs här innebär noggrann användning av det tillgängliga exemplet med lättanvända GUI-gränssnitt (steg 3) och automatiserade databehandlingspipelines (steg 6) för att informera chipbelastningen (steg 1) och hur ett experiment ska fortsätta.

Den snabba feedback-pipelinen är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för användare att bedöma initiala träffhastigheter under datainsamlingen för att informera efterföljande chip-laddningsprotokoll för framgångsrik datainsamling. När användarna står inför en låg träfffrekvens (<5%) riskerar de att samla in ofullständiga data och/eller slösa bort stråltid med ytterligare samlingar. I detta fall kan provet slås samman, koncentreras genom skonsam centrifugering, och/eller större volymer kan laddas i steg 1,5. En högre träfffrekvens är i allmänhet gynnsam, men det finns en punkt av minskande avkastning där överbelastning leder till flera kristaller i samma brunn. DIALS kan hantera multi-gitterdiffraktionsdata50, men ett större problem än indexering och integration är den skadliga effekt kristallgruppering kan ha på jämn aktivering av kristaller genom laserljus eller snabb blandning för exakta tidsupplösta experiment. Särskild försiktighet bör därför iakttas för att undvika överbelastning av fasta mål för tidsbestämda experiment.

Indexerings- och integrationsbearbetningssteget ger upphov till ett område med det centrala korset som representerar strålriktningen, varje punkt som representerar riktningen för hkl 001-reflektionen av enskilda gitter och cirkelns yttre ring som representerar en rotation på 90° bort från strålaxeln. Detta visar om dina kristaller har en önskad orientering, vilket kan påverka data fullständigheten och indikera behovet av att samla in mer data eller variera laddningsprotokollet. På den vänstra panelen i figur 7cvisas effekten av överbelastning av ett chip med HEWL-kristaller. När bländare fylls med fler kristaller håller de sig till bländarnas vinklade väggar snarare än att vise vid basen i slumpmässig orientering. De två ortogonala ellipserna är ett resultat av kristaller som ligger på chipets inre väggar som är på ~ 35° till strålriktningen. Detta minskar mängden laddade kristaller, minskar träffhastigheten och minskar dramatiskt fraktionen av kristaller som ligger i dessa föredragna plan.

Det bör noteras att andra seriella metoder finns tillgängliga på I24, såsom LCP-extruders och mikrofluidiska chips. Dessa använder liknande GUI och samma bearbetningspipelines så mycket av ovanstående kommer att förbli tillämpliga även om en annan teknik används. Ett antal seriella metoder finns för både SSX och SFX utöver den fasta målmetoden som beskrivs här, var och en har vissa fördelar jämfört med den andra beroende på experimentet som ska utföras och den strållinje som används för experimentet. Eftersom seriella tillvägagångssätt utvecklas snabbt är det lämpligt att kontrollera beamline-webbsidorna (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) för de senaste uppdateringarna och prata med beamline-personalen i ett så tidigt skede som möjligt när man planerar stråltid. Tillgång till I24 för standard- och serieexperiment är gratis vid användningsstället. För användare i Storbritannien och EU täcks rese- och boendekostnader delvis genom iNEXT Discovery.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av iNEXT-Discovery (Grant 871037) som finansierades av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer. New York, NY. 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer New York. New York, NY. 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, Pt 4 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, Pt 5 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer New York. New York, NY. 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, Pt 2 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, Pt 4 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, Pt 2 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, Pt 4 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, Pt 6 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip - without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, Pt 10 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, Pt 4 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

Biokemi nummer 168 Seriell kristallografi strukturbiologi makromolekylär kristallografi
Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horrell, S., Axford, D., Devenish,… More

Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter