Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור של ננו-טיפות דקפלואורובוטן מסוננות פאמברנה ממיקרו-טבלים מעוצבים מראש

Published: March 23, 2021 doi: 10.3791/62203
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Radiology, The University of Texas Southwestern

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת כמויות גדולות של מיקרו-נבלות decafluorobutane משומנים באמצעות sonication קצה בדיקה ולאחר מכן עיבוי אותם לתוך nanodroplets פאזה שינוי באמצעות שחול בלחץ גבוה סינון מכני.

Abstract

ישנן שיטות רבות שניתן להשתמש בהן לייצור טיפות פאזה-shift הניתנות להדמיה וטיפול. כל שיטה משתמשת בטכניקות שונות ומשתנה במחיר, בחומרים ובמטרה. רבות משיטות הייצור הללו גורמות לאוכלוסיות רב-ממדיספרס עם סף הפעלה לא אחיד. בנוסף, שליטה בגדלי הטיפות בדרך כלל דורשת נוזלים יציבים perfluorocarbon עם סף הפעלה גבוה שאינם מעשיים vivo. הפקת גדלי טיפה אחידים באמצעות גזים בנקודת רתיחה נמוכה תועיל לניסויים בהדמיה וטיפול ב- vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית להיווצרות ננו-טיפות הזזת פאזה מיוצבות-שומנים עם נקודת רתיחה נמוכה decafluorobutane (DFB). שיטה נפוצה ליצירת מיקרו-חלוקי שומנים מתוארת, בנוסף לשיטה חדשנית של עיבוי אותם עם שחול בלחץ גבוה בשלב אחד. שיטה זו נועדה לחסוך זמן, למקסם את היעילות ולייצר כמויות גדולות יותר של פתרונות microbubble וננו-טיפות למגוון רחב של יישומים באמצעות ציוד מעבדה משותף שנמצא במעבדות ביולוגיות רבות.

Introduction

סוכני ניגודיות אולטראסאונד (UCAs) גדלים במהירות בפופולריות עבור יישומי הדמיה וטיפול. Microbubbles, UCAs המקורי, הם כיום סוכני המיינסטרים המשמשים ביישומי אבחון קליניים. Microbubbles הם כדורים מלאים בגז, בדרך כלל 1-10 מיקרומטר קוטר, מוקף שומנים, חלבון, או קליפות פולימר1. עם זאת, גודלם ויציבותם יכולים להגביל את הפונקציונליות שלהם ביישומים רבים. ננו-טיפות פאזה, המכילות ליבה נוזלית מחוממת במיוחד, יכולות להתגבר על חלק מהמגבלות הללו בשל גודלן הקטן יותר ושיפור מחזור החיים2. כאשר הם נחשפים לחום או לאנרגיה אקוסטית, הליבה הנוזלית החמה מתאדה ויוצרת מיקרו-bble גז2,3,4,5. מכיוון שסף האידוי קשור ישירות לגודל טיפה 5,6, גיבוש מתלים טיפה בגודל אחיד יהיה רצוי מאוד להשגת סף הפעלה עקבי. שיטות ניסוח המייצרות גדלי טיפה אחידים הן לעתים קרובות מורכבות ויקרות, בעוד גישות חסכוניות יותר גורמות לפתרונות פולידיספרסה7. מגבלה נוספת היא היכולת לייצר טיפות יציבות של הסטת פאזה עם גזי פרפלואורוקרבון (PFC) בעלי נקודת רתיחה נמוכה, שהיא קריטית להפעלה יעילה ב-vivo8. בכתב יד זה, פרוטוקול מתואר ליצירת טיפות יציבות של נקודה נמוכה המסוננות ברתיחה נמוכה עבור יישומי הדמיה וטיפול ב- vivo.

ישנן שיטות רבות לייצור טיפות שינוי פאזה מונודיספרסות 7. אחת השיטות החזקות ביותר לשליטה בגודל היא השימוש במכשירים מיקרופלואידיים. מכשירים אלה יכולים להיות יקרים, יש שיעורים איטיים של ייצור טיפות (~ 104-106 טיפות / s)7, ודורשים הכשרה נרחבת. התקנים מיקרופלואידיים דורשים בדרך כלל גזים בנקודת רתיחה גבוהה כדי למנוע אידוי ספונטני וסתימה של המערכת7. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה על ידי דה Gracia Lux et al.9 מדגים כיצד קירור microfluidizer יכול לשמש כדי ליצור ריכוזים גבוהים של שינוי פאזה תת מיקרון (1010-1012/mL) באמצעות decafluorobutane נקודת רתיחה נמוכה (DFB) או octafluoropropane (OFP).

באופן כללי, גזים נקודת רתיחה נמוכה כגון DFB או OFP קל יותר להתמודד באמצעות בועות גז מעוצב מראש. טיפות Vaporizable ניתן לייצר מבועות מיוצבת שומנים מראש על ידי עיבוי הגז באמצעות טמפרטורות נמוכות ולחץ גבוה5,10. ריכוז הטיפות המיוצרות בשיטה זו תלוי בריכוז מיקרו-בועות מבשר ויעילות ההמרה של בועות לט טיפות. מיקרו-בועות מרוכזות דווחו מ- sonication טיפ המתקרב > 1010 MB/mL11, בעוד מחקר נפרד דיווח על ריכוזי טיפות הנעים בין ~ 1-3 x1011 טיפות / מ"ל מבועות OFP ו- DFP מרוכזות12. כאשר טיפות מונודיספרסיות אינן דאגה, שיטות עיבוי הן השיטות הפשוטות ביותר בעלות הנמוכה ביותר ליצירת טיפות הזזת פאזה מיוצבות בשומנים באמצעות PFCs של נקודת רתיחה נמוכה. שיטות ליצירת בועות בגודל אחיד לפני עיבוי יכולות לעזור ליצור אוכלוסיות מונודיספרזה יותר של טיפות. עם זאת, יצירת בועות מבשרי monodisperse היא גם קשה, הדורש גישות יקרות יותר כגון microfluidics או טכניקות צנטריפוגה דיפרנציאלית חוזרת11. גישה חלופית לייצור ננו-טיפות DFB ו- OFB פורסמה לאחרונה באמצעות התגרענות ספונטנית של טיפות בליפוזומים13. שיטה זו, תוך שימוש באפקט "אוזו", היא דרך פשוטה ליצור טיפות PFC בנקודת רתיחה נמוכה ללא צורך לדחוס בועות. התפלגות הגודל של טיפות PFC יכולה להיות נשלטת על ידי titration עדין ערבוב PFC, שומנים, ואתנול רכיבים המשמשים ליזום התגרענות של טיפות. ראוי גם לציין כי ערבוב של perfluorocarbons יכול לשמש כדי לשלוט ביציבות סף הפעלה של nanodroplets14,15. עבודה עדכנית יותר על ידי Shakya ואח 'מדגים כיצד הפעלת nanodroplet ניתן לכוונן על ידי אמולסיה של PFCs נקודת רתיחה גבוהה אמולסיה בתוך אנדוסקלטון פחמימנים כדי להקל על התגרענות הטרוגנית בתוך הליבה טיפה16, שהיא גישה שניתן לשקול יחד עם צורות אחרות של סינון גודל טיפה.

לאחר שנוצר, טיפות פאזה-shift ניתן להבלט לאחר היווצרות כדי ליצור אוכלוסיות monodisperse יותר. למעשה, פרוטוקול דומה לשיטה המתוארת כאן פורסם בעבר על ידי Kopechek et al.17 באמצעות dodecofluorpentane נקודת רתיחה גבוהה (DDFP) כליבה טיפה. קוראים המבקשים להשתמש טיפות פאזה-shift עם perfluorocarbons נקודת רתיחה גבוהה (יציב בטמפרטורת החדר) צריך להתייחס למאמר לעיל במקום. ייצור וחילוק טיפות עם גזים נקודת רתיחה נמוכה, כגון DFB ו- OFP, הוא מסובך יותר והוא ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי עיבוי בועות גז מעוצבות מראש.

בפרוטוקול זה, שיטה נפוצה של יצירת microbubbles שומנים מראש עם ליבת גז DFB באמצעות sonication קצה בדיקה מתואר. לאחר מכן, אקסלר מסחרי משמש לדחיסת מיקרו-יבלות מעוצבות מראש לננו-טיפות משנה של הסטת פאזה (איור 1). הטיפות המתקבלות ניתנות להפעלה על ידי חום ואולטרסאונד. שיטה זו יכולה לייצר כמויות גדולות יותר של פתרון nanodroplet מאשר שיטות עיבוי קונבנציונליות עם חלוקת גודל צרה יותר ללא צורך במכשירים מיקרופלואידיים יקרים. ייצור פתרונות ננו-טיפות עם התפלגות גודל צרה יכול ככל הנראה ליצור סף אידוי אחיד יותר. זה ימקסם את הפוטנציאל שלהם עבור יישומים רבים כגון הדמיה, אבלציה, משלוח סמים, תסחיף1,3,4,6.

Figure 1
איור 1: סכמטי של מערך שחול בלחץ גבוה לעיבוי מיקרו-חלוקים מעוצבים מראש לננו-טיפות פאזה.. פתרון Microbubble מתווסף ומכולם בתא extruder, ו 250 פסאיי, ממיכל החנקן, מוחל דרך שסתום הכניסה של החדר. גז החנקן ידחוף את תמיסת המיקרו-חלוק דרך המסנן שבבסיס התא, וידחוס את הדגימה לננו-טיפות. הפתרון נדחף סוף סוף מתוך extruder דרך צינור שקע מדגם ונאסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביצוע סרטי שומנים בדם

  1. הכן סרטי שומנים לדור microbubble באמצעות 90% DSPC ו 10% DSPE-PEG2K על ידי ערבוב השומנים ביחס הנכון באמצעות הכיוונים הבאים:
    1. הפוך שומנים מלאי של DSPC ו DSPE-PEG2K בכלורופורם. שקול 50 מ"ג של כל אבקת שומנים בבקבוקונים נפרדים. הוסף 1 מ"ל של כלורופורם לכל בקבוקון באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל.
    2. הוסף 287 μL של מלאי DSPC ו 113 μL של מלאי DSPE-PEG2K (שניהם 50 מ"ג / מ"ל) לתוך בקבוקון נוצץ 20 מ"ל באמצעות מזרק זכוכית.
    3. יבש את השומנים המעורבים כדי להסיר כלורופורם באמצעות חנקן. באמצעות אורך מתאים של צינורות המחוברים לחנקן הבית, זרימה קלות גז חנקן מעל מרחב הראש של ה- Vial תוך ערבוב. המשך עד שלא נצפה כלורופורם, וסרט השומנים הנותר מתחיל להפוך ללבן. השתמש בכובעי בורג פוליפרופילן, לכסות את המדגם תוך החדרת חנקן במרחב הראש.
    4. מניחים בקבוקונים תחת ואקום לילה באמצעות חיטוי ואקום כדי להסיר כלורופורם שיורית. סרט שקוף דק יישאר שמצפה את תחתית המצוינה.
    5. יש לאחסן בקבוקונים ב-20 מעלות צלזיוס עד הצורך.

2. יצירת מיקרו-יבלים מסרטי שומנים

  1. כדי להפוך את microbubbles, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט 1x (PBS) המכיל 20% v / v פרופילן גליקול ו 20% v / v גליצל (pH סופי 7.2-7.4) לסרט שומנים יבש.
  2. מכסים מחדש את המדגם ואת המדגם החם ל 65 °C (30 דקות על בלוק חימום (או אמבט מים מחומם).
  3. בזמן המדגם מתחמם, להכין את sonicator האמבטיה על ידי הגדלת טמפרטורת האמבטיה ל 65 °C (65 °F).
    הערה: תהליך זה מהיר יותר אם המים מחומם מראש במיקרוגל או בפלינט לפני הצבת sonicator האמבטיה.
  4. מניחים את מקטורון הניצוצים המכיל את המדגם המחומם בסוניקטור האמבטיה, כך שרק החלק של הוויאל המכיל את תמיסת השומנים שקוע באמבט המים.
  5. Sonicate פתרון השומנים החם במשך מינימום של 15 דקות. ודא כי טמפרטורת המים נשארת ב 65 °C (65 °F). המשיכו להתרווח במרווחים של 10-15 דקות עד שהפתרון יהיה ברור לחלוטין (איור 2).
    הערה: אם sonicator אמבטיה אינו זמין, הפתרון יכול להיות sonicated טיפ ב 10% כוח עד ברור. עם זאת, המיקרו-קצה יתפוגח מהר יותר ויקר יותר להחלפתו.

Figure 2
איור 2: דוגמה לסרטי שומנים מיובשים. דוגמה לסרט שומנים מיובש (A) לפני ו-(B) לאחר sonication אמבטיה כדי ליצור שלפוחיות חד-למלר. לאחר sonication אמבטיה, פתרון השומנים צריך לעבור מפתרון אטום יותר לשקוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בעודכם עדיין חמים, הסירו את המכסה והידוקו את הקטוריון לתוך המתחם אטום לרעש של הסוניקטור, כך שהחיבור הזעיר-קצה של הסוניקאטור שקוע ממש מתחת לממשק האוויר/נוזל (איור 3).
  2. מניחים את הטנק של decafluorobutane ליד המתחם אטום לרעש של sonicator.
  3. הכן אמבט קרח והצב אותה ליד המתחם אטום לרעש. פעולה זו תשמש בהמשך שלב 2.14.
  4. הפעל את מתג ההפעלה עבור sonicator.
  5. לאחר הפעלת המערכת, הגדר את רמת ההספק ל- 70%. אין לחרוג מ-70% משרעת עם צירוף המיקרו-קצה. אל תתחיל את sonicator בשלב זה.
  6. צרף אורך מתאים של צינורות כדי להנחות את הגז משקע טנק DFB לתוך תמיסה שומנים חמים המוחזק במתחם. הצינור צריך להיות ממוקם רק לתוך הצוואר של הוויאל כדי לאפשר גז לזרום לתוך מרחב הראש במהלך sonication (איור 3).
  7. פתח את שסתום המיכל לאט עד שניתן יהיה לראות את הגז זורם מעל תמיסה שומנים בדם. זה יגרום גלים קלים על פני השטח של הנוזל. אם זרימת הגז גבוהה מדי, הפתרון יעלה על גדותיו במהלך ניסוח חלוקי מיקרו.
  8. הפעל את sonicator ולהפעיל במשך 10 s ברציפות כדי ליצור microbubbles. אם פתרון הבועה מתחיל לעלות על גדותיו במהלך sonication, מיד להפסיק את sonicator.
  9. כבה את sonicator ומיד לסגור את שסתום טנק DFB.
  10. מכסים במהירות את תמיסת המיקרו-חלוק ומטביעים את בקבוקון באמבט הקרח כדי לקרר את המדגם מתחת ל-55 מעלות צלזיוס (טמפרטורת המעבר מזכוכית של DSPC)
  11. השאירו את דגימות המיקרו-חלוק באמבט הקרח עד שיידרש.

Figure 3
איור 3: מיקום קצה בדיקה לתמיסת שומנים כדי לייעל את היווצרות המיקרו-חלוק. יש להקפיד לא לאפשר לקצה הגשוש לגעת בכוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת מסחטה לתחוב מיקרו-חלוק

  1. להרכיב מחול בלחץ גבוה כמפורט במדריך למשתמש באמצעות מסנן קרמיקה 200 ננומטר (מסופק מהיצרן).
  2. מניחים את המכבש במרכז מיכל אטום למים, כך צינור שקע מדגם לא נלחץ על הצד או קמט.
  3. צמד את המהלל למיכל גז חנקן באמצעות מתאם שסופק על ידי היצרן.
  4. הפוך אמבט קרח מלוח -2 מעלות צלזיוס במיכל אטום למים סביב המהלומה באמצעות 400 מ"ל של מים ו 10 גרם של נתרן כלורי.
  5. מניחים את קצה צינור השקע בלוויה נוצצת כדי לאסוף את הדגימה המובלטת.
    הערה: אבטחו את הצינור למיכל עם סרט הדבקה אם הוא לא שוכב שטוח או נשאר בתוך הוויאל.

4. הקדמת המהלומה לתחוב מיקרו-חלוק

  1. פתח וסגור את שסתום השחרור כדי לוודא שאין לחץ בתוך המהלל.
  2. הסר את מכסה התא ולהוסיף 5 מ"ל של PBS 1x לתא extruder.
  3. החלף את המכסה וודא שהוא לוחץ בבטחה בחזרה למקומו.
  4. פתח את מיכל הדלק של החנקן כך שמד הלחץ יקרא 250 פסאיי. ודא שסתום בקרת הלחץ הוא במצב סגור.
  5. סגור את מיכל הדלק ופתח את שסתום הכניסה של תא המפלט. פתרון PBS יידחף דרך המערכת החוצה צינור שקע מדגם לתוך מטען הניצוץ.
  6. כאשר רק גז יוצא הצינורות, לפתוח את שסתום השחרור ולאפשר את הלחץ ליפול 0 פסאיי.
  7. הסר את מקטורן הניקוד.

5. מיקרו-קירור לפני שחול

  1. פתח וסגור את שסתום השחרור כדי לוודא שאין לחץ בתוך המהלל. מניחים מקטורן נוצץ חדש בקצה שפופרת השקע.
  2. מלא מיכל פלדה עם 2-מתיל בוטאן ולהוסיף קרח יבש כדי להוריד את הטמפרטורה למינוס 18 מעלות צלזיוס.
  3. הכנס את פתרון microbubble לתוך 2-מתיל בוטאן צונן כך המדגם הוא שקוע במשך 2 דקות. מעבירים את מילון הניקוד לאורך 2 הדקות כדי לערבב בעדינות את הבועות. מוסיפים קרח יבש לפי הצורך כדי לשמור על הטמפרטורה בין -15 ל -18 °C (70 °F). היזהר לא לחרוג -20 °C (70 °F) או הפתרון excipient יקפיא ולהרוס את דגימת הבועה.
    הערה: שלבים 5.2 ו-5.3 יכולים להיעשות גם על ידי קירור דגימת הבועה במקפיא מעבדה לאורך פרק זמן ממושך יותר. עם זאת, יש להשתמש בזהירות כדי לפקח בזהירות על טמפרטורת המקפיא ולהימנע מהקפאת המדגם.
  4. לאחר 2 דקות, להסיר את microbubbles מן 2-מתיל בוטאן צונן, בעדינות לנער את הבקבוקון לערבב את microbubbles ולהשתמש מזרק מצונן 10 מ"ל כדי להעביר את הפתרון אל extruder.
  5. הסר את מכסה תא extruder ולהוסיף את פתרון microbubble לתא על ידי לחיצה איטית הבוכנה על המזרק. החלף את מכסה ההפרשה וודא שהוא לוחץ בבטחה בחזרה במקומו.
  6. ודא כי שסתום בקרת הלחץ ואת שסתום השחרור של extruder נמצאים במצב סגור.
  7. פתח את מיכל הדלק של החנקן עד שמד הלחץ יקרא 250 פסאיי, סגור את מיכל הדלק וסובב את שסתום בקרת הלחץ למיקום הפתוח.
  8. כאשר הפתרון מילא את מקטורן הניצוצים בצינורות היציאה, ורק גז יוצא מהצינור, פתח לאט את שסתום שחרור הלחץ ואפשר ללחץ ליפול ל - 0 פסאיי.
  9. מניחים את מילון הניצים באמבט קרח או במקרר לאחסון.
  10. לאחסון לטווח ארוך ולמזעור אידוי ספונטני, יש לאחסן את הדגימה במקפיא סטנדרטי. ודא את הטמפרטורה היא -20 °C (C) ומעלה כדי למנוע הקפאת המדגם (הפתרון המרגש של 20% PPG ו 20% גליסול ימנע את המדגם מהקפאה ברוב מקפיאי המעבדה).

6. הפרדת טיפות ליפוזומים לפי צנטריפוגה

  1. העבר 10 מ"ל של פתרון טיפה מובלט לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה הדגימה המובלטת ב 1,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). גלולה המורכבת מננו-טיפות DFB תיתגלה בתחתית הצינור (איור 4). טיפות מתאדות באופן ספונטני יופיעו בחלק העליון של הפתרון ויש להשליך.

Figure 4
איור 4: דוגמה לטפות DFB בהזזת פאזה לאחר צנטריפוגה. ננו-טיפות DFB צפופות יותר ליפוזומים ויאספו בתחתית צינור הצנטריפוגה בכדור (קופסה אדומה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 2 מ"ל של 1x PBS עם 20% גליצל ו 20% פרופילן גליקול.
  2. מערבבים את הצינור בעדינות כדי להשיג פתרון הומוגני ולהעביר את הטיפות לצינור צנטריפוגה קטן יותר של 2 מ"ל.
  3. לשטוף את הדגימה פעמיים נוספות בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל.
  4. לאחר הכביסה האחרונה, resuspend הכדור ב 100 μL של 1x PBS עם 20% גליצל ו 20% פרופילן גליקול ולאחסן על קרח או במקפיא עד הצורך.

7. אימות מיקרוסקופיה של אידוי טיפה

  1. הפוך פתרון טיפה מדולל על ידי הוספת 2.5 μl של טיפות מרוכזות ל 7.5 μl של 1x PBS.
  2. הכן שקופית מיקרוסקופ עם 10 מיקרול של המדגם המדולל. באמצעות מטרה של 40x, התבונן בדוגמה ושמור תמונות.
  3. הסר את השקופית מן המיקרוסקופ ומניחים אותו על צלחת חום 65 °C במשך 1 דקות כדי לאדות nanodroplets לתוך microbubbles.
  4. השתמש באותה מטרה 40x כדי לצפות במדגם לאחר חימום כדי לאמת אידוי טיפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות מייצגות של התפלגות הגודל כלולות באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) וניתוח חישת פעימות התנגדותית (TRSP). איור 5 מציג את התפלגות הגודל של פתרונות בועות מרוכזים עם ובלי שחול. ללא שחול, הפרוטוקול מסתיים בשלב 5.3. הבועות המצונן מרוכזות על ידי אוורור המדגם ללחץ אטמוספרי בזמן הקור. המדגם היחיד מרוכז יש הפצה רחבה הרבה יותר מרוכזת ליד 400 ננומטר. המדגם המובלט כולל התפלגות צרה יותר המרוכזת ב- 200 ננומטר. שתי הדגימות כוללות גם ליפוזומים וגם טיפות, שאינן ניתנות להבחנה באמצעות DLS. איור 6 מציג מדגם מייצג של טיפות פאזה לאחר שנשטפו על ידי צנטריפוגה כדי להסיר ליפוזומים עודפים (שלב 6.7). TRPS שימש לניתוח זה כדי להעריך הן את התפלגות הגודל והן את הריכוז של הטיפות בלבד. בדומה ל- DLS, TRPS מציג את גדלי הטיפה הקרובים ל- 200 ננומטר. ריכוזים נעים בין 1011-1012 טיפות לכל mL לאחר שימוש חוזר כל 100 μL של פתרון טיפה סופית ב 1 מ"ל. נתוני TRPS הם בממוצע שלוש מדידות לדגימה.

איור 7 מציג נתוני מיקרוסקופיה מייצגים של אידוי ננו-טיפות בעת חימום. באיור 7A (לפני אידוי), כמה מיקרו-יבלים ניכרים בשדה הראייה (חצים לבנים). הסיבה לכך היא האידוי הספונטני של הננו-טיפות החמות, כאשר שקופיות מיקרוסקופ מוכנות וממו imaged בטמפרטורת החדר. לאחר החימום, נצפים מיקרו-יבלים גדולים (איור 7B). הנתונים כאן אינם לוכדים את הבועות מיד לאחר האידוי. סביר להניח כי התמזגות של בועות מתרחשת לאחר אידוי לפני שהם יכולים להיות מחדש תמונה. אסטרטגיה זו שימושית לאישור נוכחות של nanodroplets לפני שינוי גודל TRPS או להשתמש ב vivo.

קירור הבועות לפני ה עיבוי הוא צעד קריטי כדי למקסם את תשואת טיפה. איור 8 מציג תמונות מייצגות של טיפות לאחר האידוי כאשר לא מתבצעת קירור (איור 8A), המהלושן מקורר ל-0 °C (5 °F), אך המיקרו-חלוקים אינם מקוררים למינוס 18 °C (איור 8B), וכאשר מתבצעים הפרוטוקול בדיוק (איור 8C).

פרוטוקול זה יושם גם, כפי שנכתב, כדי לדחוס בועות OFP נקודת רתיחה נמוכה. איור 9 מציג תמונות מייצגות של טיפות OFP לפני ואחרי אידוי מחום. כמו עם טיפות DFB, כמות משמעותית של התמזגות סביר לאחר חימום. לכן, גדלי הבועה אינם מייצגים סביר של טיפות ראשוניות או בועות על אידוי. גלולה ומיקרוסקופיה מאשרים את הנוכחות והפעילות של טיפות OFP בהזזת פאזה.

Figure 5
איור 5: נתוני פיזור אור דינמיים המשווה מתלים טיפה עם (קו מלא) וללא שחול (קו מקווקו). דגימות נמדדו מיד לאחר עיבוי וחילוק באמצעות מערכת פיזור אור DLS. הנתונים המוצגים כאן הם בממוצע של שלוש מדידות לדגימה. הניתוח מתבצע לפני הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התפלגות הגודל של טיפות decafluorobutane מסוננות מניתוח TRPS. הנתונים הם מתוך ממוצע של שלוש מדידות במדגם יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תמונות מיקרוסקופיות לדוגמה של טיפות decafluorobutane בהזזת פאזה לפני ואחרי אידוי. (A) ניתן לצפות בבועות מסוימות לפני האידוי, ככל הנראה עקב אידוי ספונטני של טיפות DFB של נקודת רתיחה נמוכה לבועות (מיקרוסקופיה המבוצעת בטמפרטורת החדר). (B) עלייה משמעותית microbubbles הוא ציין לאחר חימום. סרגלי קנה מידה הם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמונות מיקרוסקופיות לדוגמה לאחר אידוי של טיפות הזזת פאזה מרוכזות בטמפרטורות משתנות. (A) מיקרו-יבלות מוכנסות למחוץ ישירות ללא קירור מראש. (B) המהדורר מקורר ל-0 מעלות צלזיוס באמבט קרח ומיקרו-יבלים מוכנסים לתא ומותר להם להתפרק במשך 2 דקות. (C) המהלומה מקוררת עד 0 מעלות צלזיוס באמבט קרח והמיקרו-חלוקים מקוררים מראש למינוס 18 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפני שהם ממוקמים במתלהר. מיקרו-חלוקים מקוררים מראש יהיו בדרך כלל בגדלים קטנים יותר ותפוקה גבוהה יותר של טיפות. סרגלי קנה המידה הם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: תמונות מיקרוסקופיות לדוגמה משנות פאזה של טיפות תמנונים לפני ואחרי אידוי. סרגלי קנה מידה הם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גוף ספרות מקיף זמין הדן בניסוח, בפיזיקה וביישומים פוטנציאליים של מיקרו-יבלות וטיפות פאזה-הסטה להדמיה וטיפול ב- vivo. דיון זה נוגע במפורש ליצירת מיקרו-חלוקי שומנים ולהמרתם לטירות משנה-מיקרון של העברת פאזה באמצעות גז DFB של נקודת רתיחה נמוכה ושחול בלחץ גבוה. השיטה המתוארת כאן נועדה לספק שיטה פשוטה יחסית של ייצור כמויות גדולות של microbubbles שומנים טיפות פאזה DFB על ידי שילוב שיטות עיבוי microbubble קודמות עם שחול טיפה בשלב אחד. שיטה זו יש את היתרון של יצירת ריכוזים גבוהים של בועות המשמשות ליצירת טיפות DFB עם התפלגות גודל צר המבוסס על בחירת מסנן. התפלגות הגודל הצרה משמעותית בשל סף אידוי הדגם העקבי שנוצר. שיטה זו פשוטה ופחות יקרה משיטות נפוצות אחרות המשמשות ליצירת התפלגות גודל צרה. בנוסף, נפח הפתרון הפוטנציאלי גדול משיטות דומות אחרות. הפרוטוקול יכול להיות מופרד לשלוש קטגוריות עיקריות: (1) יצירת microbubbles שומנים, (2) עיבוי ובלט microbubbles, (3) הפרדת טיפות פאזה-shift מליפוזומים על ידי צנטריפוגה.

ייצור Microbubble באמצעות sonication קצה בדיקה היא אחת הדרכים הנפוצות יותר של ביצוע microbubbles השומנים. ישנם פרסומים רבים המתארים הליך זה. פרוטוקול זה מותאם מ Feshitan et al.11 ומותאם כדי להפוך 10 מ"ל של פתרון microbubble, שהוא הקיבולת המרבית של מכבש הספסל העליון. שיטה זו יכולה גם להיות קנה מידה כדי ליצור כמויות גדולות יותר של פתרון microbubbles השומנים על ידי הסרת הקובץ המצורף microtip והגדלת נפח פתרון השומנים ל 100 מ"ל או יותר, כפי שהוכח על ידי Feshitan et al11. כמו כן, מפלט בקנה מידה מסחרי גדול יותר שיכול להכיל נפחים מ 100 מ"ל ל 800 מ"ל ניתן להשתמש כדי להכיל נפחי microbubble מוגברת, ובכך למקסם את הייצור טיפה. תוצאות השיטה מוגבלות רק על ידי הציוד המשמש, אשר ניתן לשנות כדי להגדיל את הנפח בהתאם. ייצור טיפה מסונן גודל מועיל עבור יישומים שונים עקב סף אידוי אחיד יותר. שינויים עתידיים בפרוטוקול יכולים להתבצע כדי להתאים אישית את התוצאות לצרכים ספציפיים, כגון פונקציונליזציה של המיקרו-יבלים והפגזים טיפה לטעינת נוגדנים ומיקוד מולקולרי.

שיטת שחול המשמש כאן משמשת בדרך כלל להכנת ליפוזום monodispersed. שיטה דומה שימשה גם בעבר ליצירת טיפות פאזה-shift באמצעות טיפות DDFP נקודת רתיחה גבוהה יותר17. ישנם כמה הבדלים קריטיים במתודולוגיה המתוארת הזו, כלומר (1) יצירת מיקרו-בועות מעוצבות מראש עם גזי נקודת רתיחה נמוכה (DFB), (2) קירור פתרון הבועה ומערכת ההצצה כדי ליצור ביעילות טיפות ו -(3) יישום מהיר של לחץ כדי למקסם את יעילות עיבוי טיפה ולהימנע פירוק גז בועה10.

קירור מדגם microbubble עבור שחול הוא צעד קריטי ביצירת ריכוזים גבוהים של טיפות DFB יציב. בפרוטוקול זה, המהלומה כולה ממוקמת במלח המכיל אמבט קרח ומתוחזקת ב -2 מעלות צלזיוס. המהלל כולל יציאות כניסה ושקע להזרמת נוזלים כדי לאפשר קירור יעיל ומהיר יותר, המחייב משאבה במחזור. עבור ייצור טיפות DFB, ריכוזים גבוהים של טיפות (1011-1012 טיפות / מ"ל) ניתן ליצור ללא מערכת מים במחזור. עם זאת, צפוי כי יעילות הייצור טיפה ניתן לשפר עוד יותר על ידי הכללת אמבטיה במחזור קר, צמצום זמן ההמתנה לקירור. פרוטוקול מדויק זה שימש גם עבור חלוקי מיקרו-שטויות של OFP. באופן מעניין, בועות OFP נראו רבות יותר וקטנות יותר כאשר נצפו באמצעות מיקרוסקופיה (איור 9), אם כי התשואה של טיפות היא באופן ניכר פחות לאחר כביסה ואיסוף הכדור. קירור המהלל עוד יותר והגברת הלחץ ממיכל החנקן צפויים לשפר את ייצור טיפות ה- OFP. טיפות OFP ידועות לשמצה גם אינן יציבות ודורשות טיפול עדין ותנאי אחסון נאותים כדי למזער אידוי ספונטני.

הפעלת לחץ מהירה היא צעד קריטי נוסף בהליך זה. שימוש בשחול בפרוטוקול זה תלוי בהצטברות של לחץ ויישום מיידי של לחץ זה למיקרו-יבלים בתא ההבלטה. בפרוטוקולי שחול שומנים סטנדרטיים, הלחץ מוגבר לאט עד המדגם מתחיל לעבור דרך מסנן הממברנה. תצפיות ניסיוניות הצביעו על כך שיישום איטי של לחץ עלול להוביל לפירוק גז מלטיבה הבועה, ולא עיבוי של בועות לתוך טיפות. לכן, הוחלט "ראש" צינורות הכניסה extruder עם גז חנקן על ידי סגירת שסתום מפרצון הגז והגדרת לחץ המיכל ל 250 פסאיי. לאחר מכן יש לכבות את הטנק לפני פתיחת שסתום הכניסה למחוץ. אי ביצוע חלק זה של ההליך יגרום לגירוש מהיר ואובדן מדגם מהשקע של המהלל. לחצים גבוהים מ 250 פסאיי עלולים גם לגרום לאובדן מדגם עקב גירוש מהיר של המדגם, גם כאשר הטנק נסגר כראוי. בעת הכנה, השלמת שלבים, או באמצעות extruder בכל דרך שהיא, יש לנקוט זהירות כדי לבדוק מדי לחץ ושסתומים. אם הלחץ אינו יורד לאפס או הפתרון אינו יוצא את extruder כצפוי, תחילה לבדוק כי כל השסתומים נמצאים במצב הנכון; שסתום שחרור הלחץ תמיד ניתן לפתוח כדי לשחרר את הלחץ מבלי להשפיע על תוכן התא. חשוב גם להקשיב לבריחה מגז ולצפות במדי הלחץ כאשר הלחץ מוחל על המכבש. בדרך כלל, אם מופעל לחץ, אז או שהפתרון יתחיל לצאת מהצינורות היוצאים, או שיש דליפה במערכת. הקפד תמיד לגבש את המערכת כדי להבטיח שהמאיץ מורכב כראוי לפני הוספת פתרון microbubble לתא. עם הזמן טבעות O יכולות להתיש ולמנוע מהמערכת לאטום כראוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ודא שכל החלקים מתפקדים כראוי ונוצר אטם הדוק. בפרוטוקול המתואר כאן, בוצעה רק שחול אחד. ניתן לצמצם עוד יותר את התפלגות הגודל על ידי שילוב מחדש של דגימת הטיפה לתוך המבלט וביצוע שלבי שחול מרובים (בדרך כלל בין 5 ל -10). שחול מרובה צפוי להפחית את התשואה הכוללת של טיפות. בהתחשב בהפצות הגודל מ- DLS ו- TRSP, שחול יחיד ככל הנראה מספיק עבור רוב היישומים. לבסוף, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור מסנני 200 ננומטר. סביר להניח שיהיה צורך למטב את הלחצים לגדלי מסנן גדולים או קטנים יותר.

לאחר המדגם כבר extruded בהצלחה, זה צריך להיבדק כדי לבדוק אם הבועות היו מרוכזים כראוי לתוך טיפות. טיפות תת-מיקרון אינן נראות באמצעות טכניקות הדמיית אור סטנדרטיות, ולכן יש לאדות תחילה כדי להפוך לגלויות יותר6. עדיין חשוב לדמיין את המדגם לפני אידוי כדי לאמת את היעדר microbubbles או לקבוע את רמת האידוי ספונטני לפני חימום הטיפות. ניתן להשתמש בתוכנת הדמיה כדי לספור ולגודל את המיקרו-יבלות בתמונה כדי לספק נתונים על הננו-טיפות בעקיפין. עם זאת, יש לציין כי לאחר אידוי, הבועות יתמזגו במהירות במהלך ההתחממות. לכן, גודל בועה וספירות מניתוח מיקרוסקופיה סביר אינם משקפים את גדלי טיפת הראשונית וריכוזים. מדידות ישירות של התפלגות טיפות וריכוז מבוצעות בצורה הטובה ביותר באמצעות חישת פעימה התנגדותית (TRPS) אם זמין. נתוני הפצה של טיפות מייצגות מ- TRSP סופקו (איור 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לדומיניק ג'יימס במעבדתו של ד"ר קן הויט על שסיפק ניתוח TRSP של ננו-טיפות פאזה-הסטה בלתי ניתנות לערפדיות

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Centrifuge Tubes Falcon 352095 Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter Whatman 110606 Extruder filters
2-methylbutane Fisher Chemical 03551-4 Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2 Fisher 02-217-002 Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn Branson 101-063-198R Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator Fisher Scientific 15337402 Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform Fisher Bioreagents C298-4 Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas FluoroMed L.P. 1 kg generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice - - Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder NOF America COATSOME MC-8080 Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder NOF America SUNBRIGHT DSPE-020CN Component of lipid film
General Thermometer - - Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes Hamilton 81139 Used to mix lipids in chloroform
Glycerol Fisher Bioreagents BP229-1 Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block VWR Scientific Products Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder Evonik Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer Fisher brand 14-955-151 Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank - - Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline Fisher Scientific Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk Whatman 230600 Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps Fisher Scientific 298417 Used for solution storage
Propylene Glycol Fisher Chemical P355-1 Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials DWK Life Sciences Wheaton 986532 Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer - - Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment Branson 101148070 Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container Medegen 79310 Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator Bel-Art SP Scienceware 08-648-100 Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube Fisher 02682004 Used for concentrating nanodroplets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
  2. Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
  3. Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
  4. Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
  5. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
  6. Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
  7. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
  8. Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
  9. de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
  10. Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
  11. Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
  12. Wu, S. -Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
  13. Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
  14. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
  15. Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
  16. Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
  17. Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).

Tags

Bioengineering בעיה 169 סוכן ניגודיות אולטרסאונד microbubbles nanoporizlets vaporizable טיפות פאזה-shift נקודת רתיחה נמוכה perfluorocarbon decafluorobutane שחול בלחץ גבוה
ייצור של ננו-טיפות דקפלואורובוטן מסוננות פאמברנה ממיקרו-טבלים מעוצבים מראש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Merillat, D. A., Honari, A., Sirsi,… More

Merillat, D. A., Honari, A., Sirsi, S. R. Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles. J. Vis. Exp. (169), e62203, doi:10.3791/62203 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter