Summary
ניתוח רשת הוחל כדי להעריך את הקשר של קהילות מיקרוביות אקולוגיות שונות, כגון אדמה, מים וריזוספירה. מוצג כאן פרוטוקול כיצד להשתמש באלגוריתם WGCNA כדי לנתח רשתות שונות של התרחשות משותפת שעלולות להתרחש בקהילות המיקרוביות עקב סביבות אקולוגיות שונות.
Abstract
למיקרוביום השורש יש תפקיד חשוב בצמיחת הצמחים ובהסתגלות סביבתית. ניתוח רשת הוא כלי חשוב לחקר קהילות, אשר יכול לחקור ביעילות את יחסי הגומלין או את מודל ההתרחשות המשותפת של מינים מיקרוביאליים שונים בסביבות שונות. מטרת כתב יד זה היא לספק פרטים על אופן השימוש באלגוריתם רשת המתאם המשוקלל כדי לנתח רשתות שונות של התרחשות משותפת שעלולות להתרחש בקהילות מיקרוביות עקב סביבות אקולוגיות שונות. כל הניתוח של הניסוי מבוצע בחבילת WGCNA. WGCNA היא חבילת R לניתוח רשת מתאם משוקלל. הנתונים הניסיוניים ששימשו להדגמת שיטות אלה היו נתונים קהילתיים מיקרוביאליים ממסד הנתונים של NCBI (המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה) עבור שלוש נישות של מערכת השורשים של האורז (Oryza sativa). השתמשנו באלגוריתם רשת המתאם המשוקלל כדי לבנות רשתות שפע משותף של קהילה מיקרוביאלית בכל אחת משלוש הגומחות. לאחר מכן, זוהו רשתות שפע דיפרנציאליות בין אנדוספירה, ריזופלן ואדמה ריזוספירה. בנוסף, ג'נרי הליבה ברשת הושגו על ידי חבילת "WGCNA", הממלאת תפקיד מוסדר חשוב בפונקציות הרשת. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לנתח את התגובה של רשת מיקרוביאלית להפרעות סביבתיות ולאמת תיאוריות תגובה אקולוגיות מיקרוביאליות שונות. התוצאות של שיטות אלה מראות כי רשתות מיקרוביאליות דיפרנציאליות משמעותיות שזוהו באנוספירה, בריזופלן ואדמה ריזוספירה של אורז.
Introduction
למחקר מיקרוביום יש השלכות חשובות על הבנה ומניפולציה של תהליכים אקולוגיים1,2. אוכלוסיות מיקרוביות מחוברות על ידי רשתות אקולוגיות אינטראקציה, שמאפייניהן יכולים להשפיע על התגובה של מיקרואורגניזמים לשינויים סביבתיים3,4. יתר על כן, המאפיינים של רשתות אלה משפיעים על היציבות של קהילות מיקרוביות, והם קשורים קשר הדוק עם פונקציית הקרקע5. ניתוח רשת מתאם גנים משוקלל מיושם כעת באופן נרחב למחקר על הקשר ביןגניםוקהילות מיקרוביאליות 6 . מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בקשרים בין רשתות של גנים או אוכלוסיות שונות לבין העולם החיצון7. עם זאת, ההבדלים ברשתות המתאם שנוצרו על ידי אוכלוסיות מיקרוביות בתנאים סביבתיים שונים נחקרו בקושי. מטרת המחקר המוצג במאמר זה היא לספק תובנות ופרטים על היישום המהיר של אלגוריתם WGCNA כדי לבנות רשת מופע משותף של דגימות מיקרוביום שנאספו בתנאים סביבתיים שונים. בהתבסס על תוצאות הניתוח, הערכנו את הרכב האוכלוסייה וההבדלים ודנו עוד יותר ביחסים בין אוכלוסיות מיקרוביות שונות. הזרימה הבסיסית הבאה של אלגוריתם רשת מתאם משוקלל8 הוחלה. ראשית, היה צורך לבנות מטריצת דמיון על-ידי חישוב מקדם המתאם של פירסון בין פרופילי הביטויים של יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTU). לאחר מכן, הפרמטרים של פונקציות ההדחה (הכוח או פונקציות ההדחה הסיגמואידית) אומצו עם קריטריון טופולוגי ללא קנה מידה, מטריצת הדמיון הפכה למטריצת סמיכות, וכל רשת מופע משותף התאימה למטריצת סמיכות. השתמשנו באשכולות הירארכיים של הצמדה ממוצעת בשילוב עם השוני מבוסס TOM כדי לקבץ OTUs עם פרופילי ביטוי קוהרנטיים למודולים. יתר על כן, חישבנו את הקשר בין סטטיסטיקה שמרנית לבין מודולי ניתוח הפרמטרים הקשורים, ולבסוף זיהינו את הרכזת OTU במודול. שיטות אלה מתאימות במיוחד לניתוח ההבדלים במבני הרשת בין אוכלוסיות מיקרוביאליות שונות בתנאים סביבתיים שונים. בכתב יד זה תיארנו בפירוט את שיטת פיתוח רשת הביטוי המשותף, ניתוח השונים בין המודולים, וסיפקנו סקירה קצרה של השלבים בהליך החלים להשגת מיני הליבה ברשתות מודול שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הורדת נתונים
- הורד את הנתונים של הגישה PRJNA386367 טופס מסד הנתונים NCBI. מתוך הנתונים של הגישה PRJNA386367, בחר את נתוני המיקרוביום של קנה שורש, קנה שורש ואנדוספירה מצמחי אורז הגדלים במשך 14 שבועות בשדה אורז שקוע בארבקל, קליפורניה בשנת 2014.
הערה: נתוני המיקרוביום של קנה שורש, קנה שורש ואנדוספירה הוצגו על-ידי טבלת ה- OTUs בגישה PRJNA386367.
2. קביעת ערך הספק אופטימלית
הערה: חבילת WGCNA מכילה את כל הפרמטרים הפונקציונליים הבאים. WGCNA היא חבילת R לניתוח רשת מתאם משוקלל. שורות הפקודה של המפתח מפנות לתוספת S1.
- בסביבת שפת R, פתח את תוכנת Rstudio והתקן את חבילת WGCNA.
- טען את הנתונים והשתמש בפונקציה goodSamplesGenes כדי לבדוק את נכונות הנתונים. בצע את שורות הפקודה:
"gsg = goodSamplesGenes(datExpr0, verbose = 3)
gsg$allOK "
לחץ על הפעל. - בדוק אם יש חריגים וחפש דוגמאות העומדות בדרישות. כאשר תוצאת הבדיקה היא TRUE, המשך לשלב הבא. שמור את התוצאה.
- השתמש בפונקציה PickSoftThreshold כדי לחשב את האינדקס R2 ללא קנה מידה של שתי הקבוצות של הנתונים תחת ערכי צריכת חשמל שונים. בצע את שורת הפקודה:
"sft = pickSoftThreshold(datExpr0, powerVector = powers, verbose = 5)"
לחץ על הפעל. - דמיין את התוצאות (איור 1). בצע את שורת הפקודה:
"עלילה(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab ="סף רך (כוח)", ylab ="התאמה מודל טופולוגיה חינם קנה מידה,חתום R^2",type ="n",
main = paste("ES_Scale עצמאות");
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
תוויות=סמכויות, cex =cex1, col ="אדום");
abline(h = 0.9,col = "אדום")
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
xlab ="סף רך (כוח)", ylab = "קישוריות ממוצעת", type ="n",
main = הדבקה("ES_Mean קישוריות"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], תוויות=כוחות, cex=cex1,col="red")"
לחץ על הפעל.
הערה: הנחת היסוד של אלגוריתם רשת המתאם המשוקלל היא שמבנה רשת הביטוי המשותף המבוסס תואם את הסטנדרטים של קריטריון הטופולוגיה ללא קנה מידה, ומגדיל את חוסנו. אינדקס ללא קנה מידה קרוב יותר ל- 1 מציין מבנה רשת הקרוב יותר לרשת נטולת קנה המידה. - בחר את ערך ההספק כאשר האינדקס R2 ללא קנה מידה בריבוע גדול מ- 0.9 והמשיך לשלב הבא של הניתוח.
הערה: כאשר האינדקס ללא קנה מידה קרוב ל- 1, מבנה הרשת קרוב יותר לרשת נטולת קנה המידה. בעת ניתוח שתי רשתות או יותר, יש צורך לבחור להפוך כל רשת קרובה לערך ההפעלה של הרשת נטולת קנה המידה כדי לספק את ההשוואה בין הרשתות המשותפות.
3. בניית רשת ביטוי משותף וזיהוי מודול
הערה: בהתבסס על ערך צריכת החשמל המחושב לעיל, רשת המופעים המשותפים בנויה. שורות הפקודה של המפתח מתייחסות ל- תוספת S2.
- השתמש בפונקציית ההדחה בחבילת WGCNA כדי להוסיף פרמטרים חתומים לבניית רשת מופעים משותפים סמלית. בצע את שורת הפקודה:
"צפיפות = צפיפות(datExpr0, power = softPower)"
לחץ על הפעל. - החל את הפונקציה TOM-דמיון כדי לפתח רשת חופפת טופולוגית ולחשב את רשת השוני. בצע את שורת הפקודה:
"TOM = TOMsimilarity(סמיכות);
dissTOM = 1-TOM"
לחץ על הפעל.
הערה: הפרמטר החתום נוסף כדי להגדיר את סוג הרשת החופף של הטופולוגיה. - השתמש בפונקציה hclust כדי לבחור את שיטת קיבוץ באשכולות הירארכית של ההצמדה הממוצעת עבור קיבוץ באשכולות הירארכיים. בצע את שורת הפקודה:
"geneTree = hclust(as.dist(dissTOM), שיטה = "ממוצע");"
לחץ על הפעל. - השתמש בפונקציה cutreeDynamic כדי לבצע חיתוך ענף דינמי ולהגדיר את הפרמטר minClusterSize ל- 30. השג את תוצאת זיהוי המודול. בצע את שורת הפקודה:
"dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree, distM = dissTOM, deepSplit = 2, pamRespectsDendro = FALSE, minClusterSize = minModuleSize);"
לחץ על הפעל.
הערה: גודל המודול המינימלי לא יכול להיות נמוך מ- 30. - חשב את eigen המודול של כל מודול OTUs על ידי הפונקציה ModuleEigengenes. בצע את שורת הפקודה:
"MEList = moduleEigengenes(datExpr0, colors = dynamicColors)
MEs = MEList$eigengenes"
לחץ על הפעל.
הערה: המודול eigen ייצג את רמת הביטוי הכוללת של OTU במודול. זה לא היה OTU ספציפי, אבל הרכיב העיקרי הראשון של כל אשכול שהושג על ידי פירוק ערך רשת יחיד. - בצע את פונקציית האשכול בהתבסס על מקדם המתאם של מודול eigen. השתמש בפונקציה mergeCloseModules כדי למזג את המודולים עם ערך נמוך מ- 0.25. בצע את שורת הפקודה:
"merge = mergeCloseModules(datExpr0, dynamicColors, cutHeight = MEDissThres, מילולי = 3)"
לחץ על הפעל. - לבסוף, השתמש בפונקציה plotDendroAndColors לתצוגה חזותית כדי להשיג את דיאגרמת התצוגה של הקצאת המודול של כל רשת של ביטויים משותפים (איור 2). השתמש בפונקציית הטבלה כדי לחלץ את ייחוס המודול המתאים לכל OTin טבלת הקצאות המודול. בצע את שורת הפקודה:
"plotDendroAndColors(geneTree, מיזוגColors, "דינמיקה ממוזגת", dendroLabels = FALSE,
לתלות = 0.03,addGuide = TRUE, guideHang = 0.05,
main = "ES_Gene דנדרוגרמה וצבעי מודול""
לחץ על הפעל.
הערה: בדיאגרמת הקצאת המודול של רשת ההבעה המשותפת, צבעים שונים מייצגים מודולים שונים, ואפור מייצג OTUs שלא ניתן לסווגם למודול כלשהו. מספר גדול יותר של OTUs במודול האפור מציין כי איכות עיבוד מוקדם של מטריצת הביטוי היא ירודה.
4. השוואת מודולים
הערה: ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשוות את מודולי הרשת של שתי קהילות מיקרוביאליות אקולוגיות. במאמר זה, השווה את ההבדלים של מודולי רשת מיקרוביאלית בין אנדוספירה וריזופלן, אנדוספירה וריזוספירה, ריזוספירה וריזופלן.
- מבחן שימור
- טען את הפרמטרים והתוצאות של שתי ערכות הנתונים שנשמרו בשלבים הקודמים.
- הגדר את תוצאת הקצאת מודול הרשת של קבוצה של נתונים מיקרוביאליים כקבוצת ההפניות, ואילו הקבוצה האחרת כקבוצת הבדיקה.
- השתמש בפונקציית modulePreservation כדי לחשב את הערכים של הפרמטרים הסטטיסטיים של שמרנות Z_summary ו- medianRank. בצע את שורת הפקודה:
"system.time({mp=modulePreservation(multiExpr,
MultiColor,referenceNetworks=1,
nPermutation=100, randomSeed=1,quickCor=0,verbose=3)})"
לחץ על הפעל.
הערה: תוצאה זו יכולה לכמת את השמרנות בין המודולים. Z_summary>10 מציין כי שני מודולים נשמרים מאוד, בעוד Z_summary<2 מציין מודולים שאינם שמורים. medianRank מבטא את השימור היחסי של המודול המוערך על ידי דירוג. ערכי medianRank גבוהים יותר מציינים מודולים שאינם שמורים. (שורות הפקודה המרכזיות מפנות ל- תוספת S3.) - השתמש בפונקציית ההתוויה כדי להציג את התוצאות באופן חזותי (איור 3). קבל את הפרמטרים Z_summary ו- medianRank (טבלה 1).
הערה: מודולי הרשת המספקים הן את ערך Z_summary פחות מ- 2 והן את ערך הדירוג החציוני בחלק העליון, הוא המודול הכי לא שמור בשתי הקהילות המיקרוביות האקולוגיות. - בהתבסס על התוצאות של שני הפרמטרים הסטטיסטיים הנ"ל כדי לזהות את המודול עם המודול ביותר לא נשמר של שתי הרשתות.
- ניתוח מתאם של חברות במודול
- הגדר את תוצאות הקצאת המודול של שתי הרשתות הוגדרו כהפניה וקבוצת הבדיקה, בהתאמה.
הערה: ההגדרות צריכות להיות זהות לבדיקת שימור. - השתמש בפונקציה corPvalueStudent כדי לחלץ את הערך kME (חברות במודול) של כל OTU במספר מודולים מועמדים.
בצע את שורת הפקודה:
"Pvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix
(מודולהתה), דוגמאות))"
לחץ על הפעל.
הערה: kME מייצג את מידת החברות במודול. ME מייצג את מודול eigen, המייצג את הרמה הכוללת של ביטוי OTU במודול. kME הוא מקדם המתאם בין כל OTU לבין ME. לכמת את החשיבות של OTU ברשת לפי ערך kME של OTU. (שורות הפקודה של המפתח מתייחסות ל- תוספת S4.) - לאחר מכן, השתמש בפונקציה verboseScatterplot כדי לחשב את מקדם המתאם של ערך kME של OTUs המתאים בשתי הרשתות ולצייר את דיאגרמת ניתוח המתאם (איור 4).
בצע את שורת הפקודה:
"verboseScatterplot(abs(TModuleMembership
[TmoduleGenes, Tcolumn]),
abs(NModuleMembership[NmoduleGenes, Ncolumn]),
xlab = paste("kME in", "ES"),
ylab = paste("kME in", "RP"),
main = paste("lightyellow"),
cex.main = 1.7, cex.lab = 1.6, cex.axis = 1.6, col = מודולקולור)"
לחץ על הפעל. - בחר את המודול עם מקדם המתאם הקטן ביותר של ערך kME של ה- OTU של שתי הרשתות. שקול מודול זה יש את ההבדל הגדול ביותר של שתי הרשתות.
- הגדר את תוצאות הקצאת המודול של שתי הרשתות הוגדרו כהפניה וקבוצת הבדיקה, בהתאמה.
5. ניתוח מודול הרשת הדיפרנציאלית המיקרוביאלית
- השג נתונים של פילה החיידק הדומיננטי באמצעות ניתוח סטטיסטי של ערכת רצף OTU של המודול עם ההבדל הגדול ביותר.
הערה: ערכת רצף OTU של המודול עם ההפרש הגדול ביותר מסכמת את טקסונומיה של פילה. החיידק הדומיננטי פילה היווה יותר מ -10%. - לאחר מכן, השתמש בפונקציה exportNetworkToCytoscape כדי להשיג את הקובץ המכיל את מידע קשרי הגומלין של האינטראקציה של OTU במודול הדיפרנציאלי הגדול ביותר.
בצע את שורת הפקודה:
"cyt = exportNetworkToCytoscape(modTOM,
edgeFile = paste("NEW-ES_CytoscapeInput-edges-", מודולים , ".txt", ספטמבר="),
nodeFile = הדבק("NEW-ES_CytoscapeInput-צמתים-", מודולים, ".txt", ספטמבר="),
משוקלל = TRUE,threshold = 0.5, nodeNames = modProbes,
altNodeNames = modGenes, nodeAttr = moduleColors[inModule])"
לחץ על הפעל. - יבא את הקובץ לתוך הנוף. הגדר את הסף ל- 0.5 והתאם פרמטרים אחרים לפי הצורך.
- בנו רשת של מיקרואורגניזמים דיפרנציאליים(איור 5).
- השיג את המידע של סוג הליבה שיש לו את התפקיד הרגולטורי החשוב ביותר ברשת.
הערה: בהתאם לערך kME של OUT, ניתן להגדיר את סוג הליבה. - לבסוף, הפונקציות של סוג הליבה נבדקו והשפעתו על רשת ההבדל כולה נותחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות הייצוגיות במאמר זה הורדו מנתוני המיקרוביום של שורש האורז של קליפורניה 2014 במאגר המידע של NCBI (PRJNA386367)9. הנתונים כוללים את דגימות המיקרוביום של קנה שורש, קנה שורש ואנדוספירה מצמחי אורז הגדלים במשך 14 שבועות בשדה אורז שקוע. השתמשנו באלגוריתם WGCNA כדי לבחור את ערך צריכת החשמל שסיפק את שלוש הרשתות שהיו קרובות לרשת נטולת קנה המידה (איור 1)ופיתחנו שלוש רשתות לביטוי משותף(איור 2). באנטוספירה, ריזופלן, וריזון קרקע פחמן משותף רשת ביטוי, 23, 22, ו 21 מודולים זוהו, בהתאמה. תוצאות אלה מצביעות על כך שמספר רשתות האינטראקציה המיקרוביאלית בשלוש הגומחות היה שווה בעצם.
השווינו עוד יותר את ההבדלים במודולי הרשת המיקרוביאלית בתוך אדמת האנטוספירה, הריזופלן והריזוספירה. תוצאות בדיקת השימור הבאות של המודולים של שלוש קבוצות הגומחות הושגו. שלושה מודולים מאוד לא שמורים היו קיימים בין אדמת הריזוספירה לבין הקרניזופלן(איור 3a,טבלה 1). בנוסף, תשעה מודולים מאוד לא שמורים היו נוכחים בין אדמת הריזוספירה לאנוספירה(איור 3b,טבלה 2)ושישה מודולים מאוד לא שמורים בין קנה ריזופלן לאנוספירה(איור 3c,טבלה 3). יתר על כן, נמצאו מודולים מאוד לא שמורים בין שלוש גושות, המציין את נוכחותם של הבדלים גדולים בהרכב של מיקרואורגניזמים בין שלוש גושות. תוצאות ניתוח מתאם החברות במודול של המודולים הלא-שמרניים המתקבלים מודחות באיור 4. מהאיור, מודול שונה באופן משמעותי עם המתאם הנמוך ביותר בין כל שתי נישות נראה בין שלוש גושות, המייצג את ההבדל המשמעותי ביותר ביניהם.
ברשת הפרשי הריזוספירה-ריזופלן(איור 5a),הפילום הדומיננטי היה פרוטאובקטריה (72.97%). ברשת הפרשי הקרניד-אנדוספירה(איור 5b),הפילה הדומיננטית הייתה פרוטאובקטריה (66.36%), אקטינובקטריה (10.1%), ובקטריואידטים (10.9%). ברשת הפרשי הריזופלן-אנדוספירה(איור 5c),פילה הדומיננטית הייתה פרוטאובקטריה (41.41%), Bacteroidetes (10.10%), Firmicutes (12.12%), ו Verrucomicrobia.
שלושה סוגים מרכזיים (איור 5a), כולל רודובקטר ונובוספינגוביום, שישה סוגים מרכזיים (איור 5b), כולל Blvii28 ו Dechloromonas, וחמישה סוגים הליבה (איור 5c),כולל Cellvibrio ו Geobacter, הפעילו פונקציות רגולטוריות חשובות בשלוש רשתות ההתרחשות המשותפת דיפרנציאלי. כל סוגי הליבה, למעט Dechloromonas, השפיעו על רשת אחת בלבד, המציין את הזמינות של הבדלים ניכרים בשפע היחסי של אוכלוסיות מיקרוביאליות ומינים בין שלוש גורשים של שורשי אורז, אשר השפיעו באופן קריטי על השפע והמגוון של קהילות המיקרוביות השורש הקיימות.
סוג הליבה אזוספירילום, השוכנת ברשת הפרשי הריזוספירה-אנדוספירה של האורז, השתתפה בקיבעון חנקן וקידמה את צמיחת הצמח10. בנוסף, הסוג הגיאובקטרי, אשר הועשר באופן משמעותי ברשת הפרשי rhizoplane-אנדוספירה, עשוי להיות הגורם העיקרי גרימת הפחתת תחמוצות Fe ו- Mn מסיסים בקרקעות רבות משקעים11. מיקרואורגניזמים אלה מתקשרים עם מגוון קהילות מיקרוביאליות בנישות השורש ומשתתפים באופן פעיל ברגולציה של רשתות מיקרוביאליות, שעשויות להיות חשובות ביותר לצמיחה והתפתחות של שורשי אורז.
איור 1. הערכת powerβ במערכות הנתונים. (א) הערכת β צריכת החשמל במערכת הנתונים של ES; (ב) הערכת β צריכת החשמל במערכת הנתונים של RS; (ג) הערכת β צריכת החשמל במערכת הנתונים של RP, התפלגות האינדקס R2 ללא קנה מידה (משמאל), התפלגות הקישוריות הממוצעת (מימין) לאורך מדדי הספק רכים שונים. הערך של הכוח הטוב ביותר הושג כאשר R2 נטה לרוויה ולא היה נמוך מ- 0.8. שלוש רשתות ההבעה המשותפת היו חייבות להיות מוגדרות לאותו ערך צריכת חשמל כדי להבטיח את ההשוואה שלהן. (RS: אדמה ריזוספירה, RP: rhizoplane, ו ES: אנדוספירה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. OTU dendrogram שהושג על-ידי קיבוץ הירארכי ממוצע של הצמדה. (a) OTU dendrogram מרשת ES; (ב) OTU dendrogram מרשת RS; (ג) דנדרוגרמה OTU מרשת RP. שורת הצבע מתחת לדנדרוגרמה מציינת את הקצאת המודול שנקבעה על-ידי האלגוריתם חיתוך עץ דינאמי. (RS: אדמה ריזוספירה, RP: rhizoplane, ו- ES: אנדוספירה) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תוצאות בדיקת השימור. (א) תוצאות הניתוח מבוססות על הקצאת מודול הרשת של ביטוי משותף של RS כקבוצת ההפניות ותוצאות הקצאת מודול הרשת של ביטוי משותף של RP כקבוצת הבדיקה; (ב) תוצאות הניתוח מבוססות על הקצאת מודול הרשת של ביטוי משותף של ES כקבוצת ההפניות ותוצאות הקצאת מודול הרשת של ביטוי משותף של RS כקבוצת הבדיקה; (ג) תוצאות הניתוח מבוססות על הקצאת מודול הרשת של ביטוי משותף של ES כקבוצת ההפניות ותוצאות הקצאת מודול הרשת של ביטויי RP כקבוצת הבדיקה. Z_summary > 10 מציין כי שני מודולים נשמרים מאוד, בעוד Z_summary < 2 מציין מודולים שאינם שמורים. medianRank מבטא את השימור היחסי של המודול המוערך על ידי דירוג. ערכי medianRank גבוהים יותר מציינים מודולים שאינם שמורים. (RS: אדמה ריזוספירה, RP: rhizoplane, ו- ES: אנדוספירה) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. ניתוח מתאם של חברויות המודול. (א) מתאם מודול של ערך kME בין רשת RS ורשת RP; (ב) מתאם מודול של ערך kME בין רשת RS ורשת RP; (ג) מתאם מודול של ערך kME בין רשת RP ו- ES (RS: אדמת ריזוספירה, RP: rhizoplane, ES: אנדוספירה, ו- KME: חברות במודול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. רשת התרחשות משותפת של מיקרוביאלפופולציה דיפרנציאלית בשורש האורז. (א) רשת מופעים משותפים של אוכלוסיות מיקרוביאליות דיפרנציאליות ב- RS-RP; (ב) רשת מופעים משותפת של אוכלוסיות מיקרוביאליות דיפרנציאליות ב-ES-RS; (ג) רשת מופעים משותפת של אוכלוסיות מיקרוביאליות דיפרנציאליות ב-ES-RP. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת Cytoscape. צבעים שונים מייצגים שערים שונים באיור. (RS: אדמת ריזוספירה, RP: rhizoplane, ו- ES: אנדוספירה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מודול | medianRank | זומרי | מודול | medianRank | זומרי |
| גריניאלו | 2 | 14 | צהוב | 13 | 5.2 |
| ורוד | 2 | 17 | אפור60 | 14 | 3.1 |
| בליית חצות | 3 | 10 | תמלוגים | 15 | 2.1 |
| חום | 4 | 18 | שחור | 16 | 2.7 |
| lightcyan | 6 | 8.5 | שיזוף | 17 | 3.2 |
| סגול | 7 | 10 | סלמון | 18 | 1.3 |
| כחול | 7 | 22 | מגנטה | 18 | 2.2 |
| ירוק | 8 | 12 | כהה | 20 | -0.24 |
| ציאן | 10 | 4.8 | זהב | 20 | 14 |
| lightgreen | 11 | 5.1 | גרין כהה | 22 | -1.1 |
| lightyellow | 12 | 5.3 | אָפוֹר | 22 | 0.21 |
| אדום | 12 | 6.1 |
טבלה 1. תוצאה של Zsummary וחציראןראן בין אדמת הריזוספירה ואת rhizoplane.
| מודול | medianRank | זומרי | מודול | medianRank | זומרי |
| סלמון | 1 | 19 | lightcyan | 13 | 1.1 |
| שחור | 3 | 5.3 | אדום | 15 | 0.95 |
| צהוב | 4 | 5.8 | בליית חצות | 15 | -0.0016 |
| lightgreen | 5 | 0.27 | תמלוגים | 16 | 0.83 |
| גריניאלו | 7 | 3 | מגנטה | 16 | 0.52 |
| טורקיז כהה | 7 | 1.2 | גרין כהה | 17 | 0.16 |
| אפור60 | 9 | 1.1 | שיזוף | 18 | 0.64 |
| כחול | 10 | 3.9 | lightyellow | 19 | 0.52 |
| סגול | 10 | 2.3 | כהה | 19 | -0.18 |
| חום | 12 | 2.3 | ורוד | 19 | -0.71 |
| ציאן | 12 | 0.78 | זהב | 21 | 11 |
| ירוק | 13 | 1.7 |
טבלה 2. תוצאה של Zsummary וחציראןראן בין אדמת הריזוספירה ואנדוספירה.
| מודול | medianRank | זומרי | מודול | medianRank | זומרי |
| שחור | 1 | 15 | טורקיז כהה | 13 | 1.7 |
| סלמון | 2 | 27 | בליית חצות | 13 | 1.6 |
| צהוב | 3 | 13 | lightgreen | 13 | 0.64 |
| ציאן | 4 | 5.4 | גרין כהה | 14 | 1.5 |
| כחול | 8 | 3.9 | כהה | 16 | 1.5 |
| lightcyan | 9 | 2.6 | סגול | 17 | 2.3 |
| ורוד | 10 | 3.6 | גריניאלו | 18 | 0.8 |
| תמלוגים | 10 | 1.5 | lightyellow | 18 | 0.42 |
| חום | 12 | 2.9 | מגנטה | 19 | 0.2 |
| ירוק | 12 | 1.9 | זהב | 21 | 18 |
| אדום | 12 | 1.9 | אפור60 | 21 | -0.21 |
| שיזוף | 13 | 2.5 |
טבלה 3. תוצאה של Zsummary וחציראןראן בין rhizoplane ואנדוספירה.
תוספת S1: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תוספת S2: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תוספת S3: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תוספת S4: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רשתות מתאם שימשו יותר ויותר ביישומי ביואינפורמטיקה. WGCNA היא שיטה ביולוגית של מערכות לניתוח תיאורי של היחסים בין אלמנטים שונים של מערכת ביולוגית12. חבילת תוכנה R שימשה בעבודה קודמת על WGCNA13,14,15. החבילה כוללת פונקציות לבניית רשת, זיהוי מודולים, חישובים של מאפיינים טופולוגיים, הדמיית נתונים, ויזואליזציה ויכולת התממשקות עם תוכנה חיצונית. WGCNA כבר מועסק בהרחבה כדי לנתח נתוני ביטוי גנים מסרטן המוח16, מחזור תא שמרים17, גנטיקה של עכבר18,19, רקמת מוח פרימט20,21, סוכרת22, וצמחים23. השתמש בניתוח רשת מתאם הגנים המשוקלל כדי לבנות את הרשת חייבת לכלול לפחות 8 מדגמים. במאמר זה התמקדנו ברשתות ביטוי גנים המתארות את האינטראקציות בין אוכלוסיות מיקרוביות בסביבות שונות. השגנו רשתות דיפרנציאליות בין אוכלוסיות מיקרוביאליות בסביבות שונות וזיהינו את מיני המפתח בכל רשת. הרעיון שמינים מרכזיים חשובים לקהילה היה מועסק באופן נרחב במחקר רשת המזון24. חלק מהמינים בקהילה מיקרוביאלית מורכבת יכולים להיות חיוניים כדי לשמור על היציבות והפונקציונליות של הקהילה, כגון Bacteroides בצמחי המעי25. ניתוח של קהילות מיקרוביות יכול להיות מפושט באופן משמעותי על ידי מיקוד מינים ספציפיים בעלי חשיבות פוטנציאלית.
התוצאות הייצוגיות שלנו מדגישות את ההבדלים בקהילות מיקרוביות, שניתן לזהות בשיטה המתוארת לעיל. כאן, מיקרואורגניזמים בנישות שונות של מערכת שורש האורז היו נתונים WGCNA. ההפרש בין שלוש הגומחות זוהה באמצעות ניתוחי חברות שמרניים ומודולים. קבענו את מינים מרכזיים במודולים ההבדליים וקיבלנו מידע על ההבדלים בהרכב הקהילות המיקרוביות בשלוש הגומחות. בינתיים, רשת המופעים המשותפים חשפה את נוכחותה של אינטראקציה משמעותית בין המיקרואורגניזמים המשתנים בשורשי האורז. הממצאים שלנו מספקים ראיות ישירות למשמעות והיתכנות של WGCNA בהערכת הבדלים קהילתיים מיקרוביאליים בסביבות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
פיתוח כתב יד זה נתמך על ידי כספים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין-גוויג'ואו מחוזי של המדינה קארסט פרויקט המרכז לחקר המדע (U1812401), פרויקט מחקר דוקטורט של אוניברסיטת גוויג'ואו נורמלי (GZNUD[2017]1), פרויקט תמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז גוויג'ואו (QKHZC[2021]YB459) ופרויקט המדע והטכנולוגיה של Guiyang([2019]2-8).
המחברים מבקשים להודות לאדוארדס J.A.A ואח ' על אספקת נתוני מיקרוביום אורז במאגרי מידע ציבוריים ותמיכה מ- TopEdit (www.topeditsci.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R | The University of Auckland | version 4.0.2 | R is a free software environment for statistical computing and graphics. It compiles and runs on a wide variety of UNIX platforms, Windows and MacOS. |
| RStdio | JJ Allaire | version 1.4.1103 | The RStudio IDE is a set of integrated tools designed to help you be more productive with R and Python. |
| Cytoscape | version 3.7.1 | Cytoscape is an open source software platform for visualizing complex networks and integrating these with any type of attribute data. | |
| NCBI database | The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information. |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Jin, J., Wang, G. H., Liu, X. B., Liu, J. D., Chen, X. L., Herbert, S. J. Temporal and spatial dynamics of bacterial community in the rhizosphere of soybean genotypes grown in a black soil. Pedosphere. 19 (6), 808-816 (2009).
- Ma, B., et al. Genetic correlation network prediction of forest soil microbial functional organization. ISME J. 12 (10), 2492-2505 (2018).
- de Vries, F. T., et al. Soil bacterial networks are less stable under drought than fungal networks. Nature Communications. 9 (1), 3033 (2018).
- Colin, C., et al. Correlating transcriptional networks to breast cancer survival: a large-scale coexpression analysis. Carcinogenesis. (10), 2300-2308 (2013).
- Ma, B., Zhao, K., Lv, X., et al. Genetic correlation network prediction of forest soil microbial functional organization. ISME J. 12, 2492-2505 (2018).
- Zhang, B., Horvath, S. A general framework for weighted gene co-expression network analysis. Statistical applications in genetics and molecular biology. 4 (1), (2005).
- Edwards, J. A., et al. Compositional shifts in root-associated bacterial and archaeal microbiota track the plant life cycle in field-grown rice. PLoS Biology. 16 (2), 2003862 (2018).
- Bashan, Y., De-Bashan, L. E. How the Plant Growth-Promoting Bacterium Azospirillum Promotes Plant Growth-A Critical Assessment. Advances in Agronomy. 108, 77-136 (2010).
- Lovley, D. R., et al. Geobacter: The Microbe Electric's Physiology, Ecology, and Practical Applications. Advances in Microbial Physiology. 59, 1 (2011).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Zhang, B., Horvath, S. A General Framework for Weighted Gene Co-expression Network Analysis. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4 (1), 17 (2005).
- Horvath, S., Dong, J. Geometric interpretation of Gene Co-expression Network Analysis. PLoS Computational Biology. 4 (8), 1000117 (2008).
- Langfelder, P., Horvath, S. Eigengene networks for studying the relationships between co-expression modules. BMC Systems Biology. 1, 54 (2007).
- Horvath, S., et al. Analysis of Oncogenic Signaling Networks in Glioblastoma Identifies ASPM as a Novel Molecular Target. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17402-17407 (2006).
- Carlson, M. R., et al. and Sequence Conservation: Predictions from Modular Yeast Co-expression Networks. BMC Genomics. 7 (1), 40 (2006).
- Fuller, T., et al. Weighted Gene Co-expression Network Analysis Strategies Applied to Mouse Weight. Mammalian Genome. 6 (18), 463-472 (2007).
- Yin, L., Wang, Y., Lin, Y., et al. Explorative analysis of the gene expression profile during liver regeneration of mouse: a microarray-based study[J]. Artificial Cells Nanomedicine & Biotechnology. 47 (1), 1113-1121 (2019).
- Oldham, M., Horvath, S., Geschwind, D. Conservation and Evolution of Gene Co-expression Networks in Human and Chimpanzee Brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17973-17978 (2006).
- Oldham, M. C., et al. Functional organization of the transcriptome in human brain. Nature Neuroscience. 11 (11), 1271-1282 (2008).
- Keller, M. P., et al. A gene expression network model of type 2 diabetes links cell cycle regulation in islets with diabetes susceptibility. Genome Research. 18 (5), 706-716 (2008).
- Weston, D., Gunter, L., Rogers, A., Wullschleger, S. Connecting genes, coexpression modules, and molecular signatures to environmental stress phenotypes in plants. BMC Systems Biology. 2 (1), 16 (2008).
- Jorda´n, F. Keystone species and food webs. Biological Sciences. 364, 1733-1741 (2009).
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I.
