Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62262
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt, 2German Cancer Consortium (DKTK) and DKFZ
* These authors contributed equally

Summary

يعد الفحص القائم على الشظايا بواسطة الرنين المغناطيسي النووي طريقة قوية لتحديد روابط الجزيئات الصغيرة للجزيئات الحيوية بسرعة (الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتينات). يتم تقديم البروتوكولات التي تصف إعداد العينات القائم على الأتمتة وتجارب الرنين المغناطيسي النووي وشروط الاستحواذ وسير عمل التحليل. تسمح هذه التقنية بالاستغلال الأمثل لكل من النوى النشطة 1H و 19F NMR للكشف.

Abstract

الفحص القائم على الشظايا (FBS) هو مفهوم تم التحقق منه وقبوله جيدا في عملية اكتشاف الأدوية في كل من الأوساط الأكاديمية والصناعة. أكبر ميزة لفحص الشظايا القائم على الرنين المغناطيسي النووي هي قدرته ليس فقط على اكتشاف المجلدات التي تزيد عن 7-8 أوامر من حجم التقارب ولكن أيضا لمراقبة النقاء والجودة الكيميائية للشظايا وبالتالي إنتاج ضربات عالية الجودة والحد الأدنى من الإيجابيات الخاطئة أو السلبيات الكاذبة. أحد المتطلبات الأساسية داخل FBS هو إجراء مراقبة الجودة الأولية والدورية لمكتبة الأجزاء ، وتحديد قابلية الذوبان والسلامة الكيميائية للشظايا في المخازن المؤقتة ذات الصلة ، وإنشاء مكتبات متعددة لتغطية سقالات متنوعة لاستيعاب مختلف فئات الجزيئات المستهدفة (البروتينات / الحمض النووي الريبي / الحمض النووي). علاوة على ذلك ، يلزم تحسين بروتوكول الفحص الشامل القائم على الرنين المغناطيسي النووي فيما يتعلق بكميات العينات ، وسرعة الاكتساب والتحليل على مستوى البناء البيولوجي / الفضاء الشظوي ، في مساحة الحالة (العازلة ، والمواد المضافة ، والأيونات ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة) وفي مساحة الرباط (نظائر الربيطة ، تركيز الرباط). على الأقل في الأوساط الأكاديمية ، تم تنفيذ جهود الفحص هذه يدويا حتى الآن بطريقة محدودة للغاية ، مما أدى إلى محدودية توافر البنية التحتية للفحص ليس فقط في عملية تطوير الأدوية ولكن أيضا في سياق تطوير المسبار الكيميائي. من أجل تلبية المتطلبات اقتصاديا ، يتم تقديم مهام سير العمل المتقدمة. إنهم يستفيدون من أحدث الأجهزة المتقدمة ، والتي يمكن من خلالها ملء مجموعة العينات السائلة بطريقة يتم التحكم في درجة حرارتها في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي بطريقة آلية. 1ثم يتم جمع الأطياف القائمة على الرباط H / 19F NMR عند درجة حرارة معينة. يمكن لمبدل العينات عالي الإنتاجية (مبدل العينات HT) التعامل مع أكثر من 500 عينة في كتل يتم التحكم في درجة حرارتها. هذا جنبا إلى جنب مع أدوات البرمجيات المتقدمة يسرع الحصول على البيانات وتحليلها. علاوة على ذلك ، يتم وصف تطبيق إجراءات الفحص على عينات البروتين والحمض النووي الريبي للتعرف على البروتوكولات المعمول بها لقاعدة واسعة من المستخدمين في أبحاث الجزيئات الحيوية.

Introduction

أصبح الفحص القائم على الشظايا الآن طريقة شائعة الاستخدام لتحديد جزيئات بسيطة ومنخفضة الوزن الجزيئي (MW <250 Da) التي تظهر ارتباطا ضعيفا بالأهداف الجزيئية الكبيرة بما في ذلك البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي. تعمل النتائج الأولية من الشاشات الأولية كأساس لإجراء شاشة ثانوية من نظائرها الأكبر المتاحة تجاريا للزيارات ثم استخدام نمو الأجزاء القائمة على الكيمياء أو استراتيجيات الربط. من أجل منصة ناجحة لاكتشاف الأدوية القائمة على الشظايا (FBDD) ، بشكل عام ، هناك حاجة إلى طريقة فيزيائية حيوية قوية للكشف عن وتوصيف الضربات الضعيفة ، ومكتبة شظايا ، وهدف جزيئي حيوي واستراتيجية لمتابعة الكيمياء. أربع طرق فيزيائية حيوية شائعة التطبيق في حملات اكتشاف الأدوية هي مقايسات التحول الحراري ، ورنين البلازمون السطحي (SPR) ، وعلم البلورات ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR).

أظهر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أدوارا متنوعة في المراحل المختلفة من FBDD. بصرف النظر عن ضمان النقاء الكيميائي وقابلية ذوبان الشظايا في مكتبة شظايا مذابة في نظام عازل محسن ، يمكن لتجارب الرنين المغناطيسي النووي المرصودة أن تكتشف ارتباط الشظايا بهدف ذي تقارب منخفض ويمكن لتجارب الرنين المغناطيسي النووي المرصودة الهدف تحديد حاتمة الربط للجزء ، وبالتالي تمكين دراسات مفصلة للعلاقة بين الهيكل والنشاط. ضمن رسم الخرائط ، لا يمكن لتغييرات التحول الكيميائي القائمة على الرنين المغناطيسي النووي تحديد مواقع الربط التقويمي فحسب ، بل أيضا المواقع الخيفية التي قد تكون مشفرة ولا يمكن الوصول إليها إلا في ما يسمى بالحالات التوافقية المثارة للهدف الجزيئي الحيوي. إذا كان الهدف الجزيئي الحيوي يربط بالفعل ليجند داخلي المنشأ ، فيمكن تصنيف ضربات الشظية المحددة بسهولة على أنها خيفية أو تقويمية عن طريق إجراء تجارب المنافسة القائمة على الرنين المغناطيسي النووي. يعد تحديد ثابت التفكك (KD) لتفاعل الرباط والهدف جانبا مهما في عملية FBDD. يمكن إجراء معايرات التحول الكيميائي القائمة على الرنين المغناطيسي النووي ، إما الرباط أو الهدف الملاحظ بسهولة لتحديد KD. الميزة الرئيسية للرنين المغناطيسي النووي هي أن دراسات التفاعل يتم إجراؤها في محلول وبالقرب من الظروف الفسيولوجية. وبالتالي ، يمكن التحقيق في جميع الحالات المطابقة لتحليل تفاعل الرباط / الشظايا مع هدفها. علاوة على ذلك ، لا تقتصر الأساليب القائمة على الرنين المغناطيسي النووي على فحص البروتينات القابلة للذوبان المطوية جيدا فحسب ، بل يتم تطبيقها أيضا لاستيعاب مساحة مستهدفة أكبر بما في ذلك الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات المرتبطة بالغشاء والمضطربةجوهريا 1.

تعد المكتبات المجزأة جزءا لا غنى عنه من عملية FBDD. بشكل عام ، تعمل الشظايا كسلائف أولية تصبح في النهاية جزءا (بنية تحتية) من المانع الجديد الذي تم تطويره لهدف بيولوجي. تم الإبلاغ عن أن العديد من الأدوية (Venetoclax2 ، Vemurafenib3 ، Erdafitinib4 ، Pexidartnib5) قد بدأت كشظايا ويتم استخدامها الآن بنجاح في العيادات. عادة ما تكون الشظايا عبارة عن جزيئات عضوية منخفضة الوزن الجزيئي (<250 دا) ذات قابلية ذوبان مائية عالية واستقرار. يمكن لمكتبة الأجزاء المصممة بعناية والتي تحتوي عادة على بضع مئات من الأجزاء أن تعد بالفعل باستكشاف فعال للفضاء الكيميائي. تطور التكوين العام لمكتبات الأجزاء مع مرور الوقت وغالبا ما تم اشتقاقها عن طريق تشريح الأدوية المعروفة إلى أجزاء أصغر أو مصممة حسابيا. تحتوي مكتبات الأجزاء المتنوعة هذه بشكل أساسي على ذرات عطرية مسطحة أو غير متجانسة وتلتزم بقاعدة Lipinski ل 5 6 ، أو بقاعدة الاتجاه التجاري الحالي 3 7 ، ولكنها تتجنب المجموعات التفاعلية. كما تم اشتقاق بعض مكتبات الأجزاء أو تكوينها من مستقلبات عالية الذوبان ومنتجات طبيعية و / أو مشتقاتها8. التحدي العام الذي تشكله معظم مكتبات الأجزاء هو سهولة الكيمياء النهائية.

مركز الرنين المغناطيسي الجزيئي الحيوي (BMRZ) في جامعة جوته في فرانكفورت ، هو شريك في iNEXT-Discovery (البنية التحتية للرنين المغناطيسي النووي و EM والأشعة السينية للأبحاث الانتقالية - الاكتشاف) ، وهو اتحاد للبنى التحتية للبحوث الهيكلية لجميع الباحثين الأوروبيين من جميع مجالات البحوث البيوكيميائية والطبية الحيوية. ضمن المبادرة السابقة ل iNEXT التي انتهت في عام 2019 ، تم إنشاء مكتبة أجزاء تتكون من 768 جزءا بهدف "الحد الأدنى من الشظايا والحد الأقصى للتنوع" الذي يغطي مساحة كيميائية كبيرة. علاوة على ذلك ، على عكس أي مكتبة أجزاء أخرى ، تم تصميم مكتبة أجزاء iNEXT أيضا بناء على مفهوم "الأجزاء المتوازنة" بهدف تسهيل التوليف النهائي للروابط المعقدة عالية التقارب والمعروفة من الآن فصاعدا باسم المكتبة الداخلية (الماس ، اتحاد الجينوم الهيكلي و iNEXT).

يتطلب إنشاء FBDD بواسطة الرنين المغناطيسي النووي القوى العاملة والمعرفة والأجهزة. في BMRZ ، تم تطوير تدفقات العمل المحسنة لدعم المساعدة الفنية لفحص الأجزاء بواسطة الرنين المغناطيسي النووي. وتشمل هذه مراقبة الجودة وتقييم الذوبان لمكتبة الشظايا 9 ، وتحسين المخزن المؤقت للأهداف المختارة ، والفحص القائم على 1D H أو 19F- المرصود 1D ligand ، وتجارب المنافسة للتمييز بين الربط التقويمي والخيفي ، وتجارب الرنين المغناطيسي النووي المرصودة على الهدف 2D لرسم خرائط الخاتمة ، ولتوصيفالتفاعل مع مجموعة ثانوية من مشتقات ضربات الشظايا الأولية. أنشأت BMRZ إجراءات آلية للتحليل ، كما تمت مناقشته سابقا في الأدبيات 10،11 ، للتفاعلات بين جزيئات البروتين الصغيرة ولديها جميع البنية التحتية الآلية اللازمة لفحص الأجزاء القائمة على الرنين المغناطيسي النووي. وقد نفذت فرق نقل التشبع NMR (STD-NMR) ، وليجند الماء الذي لوحظ عبر التحليل الطيفي المتدرج (waterLOGSY) ، وتجارب الاسترخاء القائمة على Carr-Purcell-Meiboom-Gill (القائمة على CPMG) لتحديد الشظايا ضمن مجموعة واسعة من أنظمة التقارب بالإضافة إلى أحدث أجهزة وبرامج الرنين المغناطيسي النووي الآلية لاكتشاف الأدوية. في حين أن فحص الشظايا القائم على الرنين المغناطيسي النووي راسخ للبروتينات ، فإن هذا النهج أقل استخداما للعثور على روابط جديدة تتفاعل مع الحمض النووي الريبي والحمض النووي. أنشأت BMRZ دليلا على مفهوم البروتوكولات الجديدة التي تمكن من تحديد تفاعلات الجزيئات الصغيرة - الحمض النووي الريبي / الحمض النووي. في الأقسام التالية من هذه المساهمة ، تم الإبلاغ عن تطبيق إجراءات الفحص على عينات البروتين والحمض النووي الريبي لإدراك البروتوكولات المعمول بها لقاعدة واسعة من المستخدمين في أبحاث الجزيئات الحيوية.

Protocol

1. مكتبة الأجزاء

  1. مكتبة الأجزاء الداخلية
    ملاحظة: في إطار أحد الأنشطة البحثية المشتركة ل iNEXT ، تم تطوير مكتبة شظايا قوية وصديقة للكيمياء12 وبعد ذلك تم تجميع جيل ثان من المكتبة بالتعاون مع Enamine وتعرف باسم مكتبة الأجزاء المتوازنة DSI (Diamond-SGC-iNEXT) (من الآن فصاعدا تسمى "المكتبة الداخلية"). يمكن توفير هذه المكتبة في BMRZ لأغراض الفحص.
    1. تقييم مكتبة الأجزاء من حيث سلامتها وقابليتها للذوبان باستخدام بروتوكول9 المستند إلى الرنين المغناطيسي النووي الذي تم الإبلاغ عنه مسبقا.
      ملاحظة: تتكون المكتبة الداخلية من 768 قطعة ذات تنوع كيميائي عال جدا (>200 مفردة). يمكن أن يؤدي إجراء الفحص في مخاليط الشظايا إلى تسريع حملة الفحص بشكل كبير ؛ ومع ذلك ، فإن عدد الأجزاء في المزيج محدود بسبب تداخل الإشارة في طيف 1H-NMR. يسمح التنوع الكيميائي العالي الذي توفره المكتبة الداخلية بإعداد مخاليط تحتوي على 12 شظية مختلفة دون أي تداخل كبير في التحول الكيميائي في أطياف الرنين المغناطيسي النووي المرصودة 1H.
    2. 103 شظايا داخل 768 شظية تمتلك ذرة فلور. لأغراض فحص 19 F ، قسم جميع الأجزاء ال 103 التي تحتوي على مجموعة الفلور إلى 5 خلطات بناء على الحد الأدنى منتداخل التحول الكيميائي 19F. لتقليل تداخل الإشارة في غربلة 19فهرنهايت ، استخدم معلومات الإزاحة الكيميائية من قياسات مركب واحد لتصميم مخاليط مع أقصى عدد من الشظايا والحد الأدنى من تداخل الإشارة. يحتوي كل مزيج على 20-21 شظية مع تحولات كيميائية مميزة 19F مما يسمح بتخصيص لا لبس فيه للشظايا.
  2. مكتبة الأجزاء المحددة / المقدمة من قبل المستخدم
    1. إجراء حملات فحص مع مكتبة الأجزاء المحددة أو المقدمة من قبل المستخدم ؛ ومع ذلك ، يجب أن تسبق الخطوات التالية حملة الفحص.
    2. إذا لم يحددها المستخدم مسبقا ، فقم بإجراء مراقبة الجودة القائمة على الرنين المغناطيسي النووي للشظايا (في BMRZ ، يتم استخدام أدوات برمجية متقدمة لهذا الغرض ؛ 9، الفصل 6-1-1).
    3. تحقق من قابلية ذوبان الشظايا في المخزن المؤقت المفضل للهدف الجزيئي الحيوي ، وسلامة الهيكل ، وتركيز الشظايا قبل الاستخدام.
    4. صمم الخليط لتقليل تداخل الإشارة في أطياف الرنين المغناطيسي النووي ووقت القياس.
    5. تصميم الخلطات وفقا للخطوة 4.2.
    6. قم بفحص أجزاء مفردة أو مجموعة فرعية من المخاليط بدلا من المكتبة بأكملها.

2. إعداد عينة

ملاحظة: يستخدم الفحص عالي الإنتاجية بواسطة الرنين المغناطيسي النووي روبوتا لسحب العينات لإعداد العينة. أطياف الرنين المغناطيسي النووي ، ولكن أيضا الثبات على مدى عدة أيام من اكتساب الإشارات للبروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي حساس للغاية لتقلبات درجات الحرارة ، وبالتالي فإن الأنظمة الآلية التي يتم التحكم في درجة حرارتها ستسهل إلى حد كبير استقرار العينات التي يتم سحبها. لهذا الغرض ، يقترن جهاز إضافي إضافي ، يعمل بين 4 إلى 40 درجة مئوية ، بروبوت السحب لمعالجة السوائل لعينات الرنين المغناطيسي النووي في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها.

  1. إعداد خليط ليجند
    1. تحضير عينات الفحص لقياسات الرنين المغناطيسي النووي باستخدام روبوت تحضير العينة. يسمح التكوين المرن للروبوت بمجموعة واسعة من التطبيقات (على سبيل المثال ، استعادة العينات من أنابيب الرنين المغناطيسي النووي مرة أخرى إلى حاويات التخزين أو مهام معالجة السوائل العامة). يمكن استخدام أنابيب الرنين المغناطيسي النووي بأقطار مختلفة (1.7 و 2.0 و 2.5 و 3.0 و 5.0 مم). يقرأ نظام الروبوت النموذجي جنبا إلى جنب مع برنامج التحكم المتقدم الرمز الشريطي المخصص لكل نوع حاوية وينفذ بروتوكول تعبئة السائل على النحو الأمثل.
    2. لإعداد مخاليط ليجند المكتبة الداخلية ، استخدم قوارير الباركود. تضمن القوارير المشفرة أعلى مستوى من الموثوقية وإمكانية التتبع المثلى للعينات.
    3. توزيع 768 مركبا في 8 أطباق من 96 بئرا. تركيز المخزون لكل جزء على حدة هو 50 mM في d6-DMSO / D2O (9: 1). في المجموع ، قم بإعداد 64 خلطة تحتوي كل منها على 12 جزءا. التركيز النهائي لكل جزء في المزيج هو 4.2 mM.
      ملاحظة: يمكن أن يستوعب روبوت السحب مجموعة متنوعة من أنواع الحاويات ذات الأشكال الهندسية المتنوعة (قوارير أخذ العينات بالتبريد أو السيارات ، وألواح 96 بئرا مستديرة أو مربعة العمق ، وقوارير قياسية مشفرة بالباركود ، وأنابيب طرد مركزي دقيقة) ويساعد على التنفيذ الفعال لنقل السائل إلى مجموعة متنوعة من أنابيب ورفوف الرنين المغناطيسي النووي.

Figure 1
الشكل 1: (أ) تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي عالي الإنتاجية وروبوت تعبئة أنبوب الرنين المغناطيسي النووي المثبت في BMRZ. (ب) مبادل عينات عالي الإنتاجية مع رفوف فردية يتم التحكم في درجة حرارتها مثبتة على مطياف 600 ميجاهرتز في مرفق BMRZ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. فحص تحضير العينة فارغة (طيف الربيطة المرجعية) ومع الهدف (الرباط في وجود الهدف)
    1. لإعداد عينات فحص الرنين المغناطيسي النووي ، في وجود الجزيء الحيوي المستهدف (البروتين / الحمض النووي الريبي / الحمض النووي) وخليط الرباط ، استخدم أنابيب مبدل عينة NMR HT مقاس 3 مم تم اختيارها من مجموعة Bruker NMR لأنابيب الرنين المغناطيسي النووي القياسية.
    2. نقل الهدف الجزيئي الحيوي (على سبيل المثال ، فحص 1H: 10 μM RNA أو البروتين) في مخزن مؤقت محدد للفحص في أنبوب NMR 3 مم (الحجم النهائي 200 ميكرولتر) يدويا أو باستخدام روبوت الماصة.
    3. نقل 10 ميكرولتر (على سبيل المثال ، فحص 1ساعة) من خليط الليجند في الخطوة التالية باستخدام النظام الروبوتي إلى أنابيب الرنين المغناطيسي النووي 3 مم المشفرة التي تحتوي على الجزيء الحيوي المستهدف والخلط باستخدام البروتوكول المدمج لبرنامج التحكم.
      ملاحظة: يتم دمج رقم الباركود لأنبوب الرنين المغناطيسي النووي بشكل ملائم وتلقائي في مجموعة بيانات الرنين المغناطيسي النووي المكتسبة ، وبالتالي ضمان سير العمل الموجه للمعرف دون أي خلط. يسمح ملحق التحكم في درجة حرارة روبوت السحب بالاحتفاظ بالعينات المعدة في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي تحت درجة حرارة ثابتة.
  2. الشروط والمعلمات المحددة داخليا
    1. تهيئة الظروف العازلة المثلى لإجراء فحص الحمض النووي الريبي والبروتين مقابل مكتبة الأجزاء الداخلية. يتم استخدام العينة التالية المشروطة للحمض النووي الريبي في BMRZ: 25 mM KPi ، 50 mM KCl ، pH 6.2. Mg2+ اختياري.
    2. البروتينات حساسة للغاية لظروف الحل. استخدم المخازن المؤقتة المثلى للهدف المختار. لكل من هذه المخازن المؤقتة ، احصل على أطياف مرجعية إضافية من الروابط لتكون فارغة للتحليل.
  3. الشروط المحددة من قبل المستخدم
    ملاحظة: في الحالات التي تكون فيها الظروف المحددة داخليا غير مناسبة لفحص الأهداف من مستخدم محتمل ، يجب تنفيذ الخطوات التالية.
    1. قم بإجراء 1H-NMR من المخزن المؤقت وحده لضمان الحد الأدنى من التداخل من مكونات المخزن المؤقت في إجراء وتحليل تجارب فحص الرباط المرصودة. يمكن استبدال المكونات المتداخلة بشكل مناسب بمكافئات deuteated.
  4. القيود المفروضة على إنتاج العينات (الكميات المستهدفة) / الظروف والتوافر
    ملاحظة: يمكن أن يكون عزل أو إنتاج بعض الجزيئات الحيوية الكبيرة المؤتلف في بعض الحالات أمرا صعبا ويؤدي إلى محدودية توافر الهدف لمتابعة حملة فحص الأدوية الناجحة. وفي حالات التوافر المحدود أو غير المحدود للأهداف، يمكن استخدام البدائل التالية لإجراء فرز ناجح للشظايا استنادا إلى الرنين المغناطيسي النووي.
    1. إذا كان محدودا ، استخدم 19فحصا قائما على F-NMR. الروابط المفلورة النموذجية لها إشارة 19فهرنهايت واحدة. لذلك ، استخدم الكوكتيلات مع 25-30 شظايا دون أي تداخل إشارة. هناك عدد أقل من الإشارات لتحليلها ، ولا يوجد تداخل إشارة من مكونات المخزن المؤقت ، وإشارات أقل للاعتماد عليها لتحديد النتيجة.
    2. إذا كانت غير محدودة ، فاستخدم شاشات أكبر مثل 1H-NMR. يمكن فحص مكتبة الأجزاء الأكبر. عادة ما تتكون الأجزاء من أكثر من بروتون واحد ، مما يعني المزيد من الإشارات التي يمكن الاعتماد عليها في التحليل.

3. شروط الاستحواذ على الرنين المغناطيسي النووي

  1. الشروط المحددة داخليا بشكل عام
    1. مطياف مجهز بمبدل عينات HT (أتمتة)
      1. للفحص عالي الإنتاجية ، استخدم لوحات 96 بئرا لا يمكن قياسها إلا باستخدام مبدل عينة HT. يوفر مبدل العينات HT أيضا إمكانية تهدئة كل رف على حدة.
      2. للحصول على أفضل إشارة إلى ضوضاء ، استخدم مطياف مع مسبار مبرد يتم تبريده إما بالهيليوم أو النيتروجين. تعد وحدة الضبط والمطابقة الآلية (ATM) ضرورية للأتمتة.
    2. مجموعات المعلمات وتسلسل النبض
      ملاحظة: يمكن للعديد من تجارب الرنين المغناطيسي النووي توصيف أحداث الربط. يختلف تحديد النتيجة حسب الإعداد التجريبي. تستخدم التجارب التالية بشكل روتيني في حملات فحص BMRZ. ومع ذلك ، يمكن إجراء تغييرات لحملات الفحص التي يحددها المستخدم ووفقا لمواصفات المستخدم.
      1. إذا كنت تستخدم برنامج TopSpin ، فقم بتضمين مجموعة المعلمات للتجارب المستندة إلى الليجند: SCREEN_STD ، SCREEN_T1R ، SCREEN_T2 ، SCREEN_WLOGSY. تتضمن مجموعة المعلمات جميع المعلمات الضرورية وتسلسل النبض: STD: stddiffesgp.3 ؛ T1ρ: t1rho_esgp2d ؛ T2: cpmg_esgp2d ؛ و waterLOGSY: ephogsygpno.2.
      2. لجميع التجارب المدرجة ، استخدم نحت الإثارة13 كقمع للمياه. كمرجع ، استخدم نحت الإثارة 1D (zgesgp). يعتمد عدد عمليات المسح على حساسية النظام (شدة المجال المغناطيسي ورأس المسبار) وتركيز العينة واختيار التجربة. التوصية هي: 1D مع NS = 64 ، T1ρ و T2 مع NS = 128 ، STD مع NS = 256 و waterLOGSY مع NS = 384 أو 512.
      3. بالنسبة لفحص 19 F ، استخدم كلا من تجارب 1D و T2: 1D: F19CPD (pp = zgig) لرأس مسبار 19 F {1 H} و F19 (pp = zg) لرأس مسبار 19F / 1H ؛ SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp).
      4. استخدم عرضا طيفيا يبلغ 220 جزءا في المليون وتردد إثارة عند -140 جزء في المليون. يتراوح وقت التجربة بين 1 و 5 ساعات (ضمان استقرار الجزيء الحيوي على المدى الطويل) اعتمادا على الأجهزة وتركيز العينة. بالنسبة إلى T2 ، يجب أن يتناوب وقت CPMG بين 0 مللي ثانية و 200 مللي ثانية.
    3. تجهيز
      1. سجل تجارب الأمراض المنقولة جنسيا و T1ρ و T2 على أنها 2D زائفة. لمعالجة اثنين من أطياف 1D واحدة ، يستخدم IconNMR برنامج au proc_std إما مع أو بدون خيار الاسترخاء. يوفر الخيار الأول المرجع 1D والفرق بين طيفين. ينتج عن الخيار الثاني طيفان منفصلان مع وقت استرخاء قصير وطويل. إن waterLOGSY عبارة عن 1D واحد يجب أن يتم على مراحل مع إشارة سلبية للمذيبات.
  2. الشروط الخاصة بالمستخدم
    1. قم بتكييف أي من المعلمات المذكورة سابقا مع الشروط المحددة من قبل المستخدم. على سبيل المثال ، إذا كان البروتين الذي يوفره المستخدم في المنشأة غير مستقر عند درجة الحرارة المستخدمة بشكل عام ، فيمكن إجراء تجارب التحسين في درجات حرارة متفاوتة وتركيز وظروف عازلة وما إلى ذلك.

4. تحليل البيانات

  1. مكتبة الأجزاء QC (d6-DMSO / مخزن مؤقت محدد) والقياس الكمي
    1. سي إم سي كيو
      ملاحظة: مراقبة جودة المكتبات المجزأة ضرورية قبل بدء حملات الفحص. وعلاوة على ذلك، يجب ضمان الاستقرار الطويل الأجل للمكتبة المجزأة من أجل تطبيق العديد من حملات الفرز، ولهذا السبب يجب إجراء تقييم دوري لجودة المكتبة. لهذا الغرض ، يتم استخدام البرنامج المتكامل CMC-q و CMC-a من TopSpin لتقييم الجودة والكمية. CMC-q و CMC-a عبارة عن وحدات برمجية داخل Topspin تتيح الاستحواذ السلس والتحليل بما في ذلك التحقق من الهيكل باستخدام طيف 1H-NMR الذي تم الحصول عليه من جزيئات عضوية صغيرة 9.
      1. من أجل السلامة ، قم بإعداد عينات التقييم بتركيز شظية 1 mM في d6-DMSO. قم بإعداد العينات بطريقة آلية باستخدام روبوت ماصة عن طريق ملء مجموعة عينات سائلة في أنبوب NMR 3 مم.
      2. لتقييم الذوبانية ، استخدم عينة تتكون من مركب 1 mM في محلول فوسفات الصوديوم 50 mM عند الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 90٪ H 2 O / 10٪ D 2 O و 1 mM من 3- (trimethylsilyl) بروبيونيك -2،2،3،3-d4 ملح الصوديوم الحمضي (TMSP-Na).
      3. اجمع أطياف الرنين المغناطيسي النووي عند 298 كلفن أو 293 كلفن باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي 600 ميجاهرتز المجهز بمسبار مبرد ثلاثي الرنين 5 مم TCI ومبدل عينات HT ، والذي يمكنه التعامل مع 579 عينة في وقت واحد.
      4. لإعداد برنامج CMC-q ، اتبع إرشادات دليل المستخدم ، الذي ينفذ إنشاء مستخدم IconNMR ، وتنشيط FastLaneNMR ، وتغيير مغير عينة HT.
      5. قم بمعايرة نبضة 90 درجة واحفظها في جدول Prosol TopSpin.
      6. ضع لوحة بئر العينة 96 في أحد مواضع الرف ال 5 في مبدل عينة HT.
      7. لتحميل ملف SDF (ملف بيانات الهيكل) الذي يجب أن يحتوي على تركيبه الكيميائي المقترح ومعرف فريد وموضع في مبدل عينة HT لكل عينة دفعة واحدة، انتقل إلى استعراض في نافذة إعداد CMC-q وانقر فوق فتح بعد تحديد ملف ينتهي ب .sdf.
      8. في إعدادات أتمتة الدفعات CMC.q ، قم بتعيين نوع التحقق الذي يحدد التجربة التي سيتم قياسها ، ومستخدم IconNMR وتحديد المذيب.
      9. تعريف ملفات SDF لملف مسار SDF ومعرف الجزيء وموضع العينة.
      10. ابدأ عملية الاستحواذ بالنقر فوق ابدأ. انقر فوق بدء الاستحواذ مرة أخرى. يمكن أيضا حفظ إعداد CMC-q بالنقر فوق حفظ.
      11. للحصول على وصف تفصيلي لخطوات إعداد CMC-q، اتبع تعليمات دليل المستخدم من Bruker.
    2. سي إم سي - أ
      1. بالنسبة إلى CMC-a ، استخدم وحدة البرنامج داخل Topspin التي تتيح التحليل بما في ذلك التحقق من الهيكل باستخدام طيف 1H-NMR الذي تم الحصول عليه من جزيئات عضوية صغيرة9.
  2. تصميم الخليط
    ملاحظة: يلعب تصميم الخليط المناسب دورا مهما في الفحص باستخدام الرنين المغناطيسي النووي كمنصة. يسمح عدد كبير من الشظايا لكل مخاليط بفحص أسرع ولكنه يزيد من خطر الإيجابية والسلبية الكاذبة. يقلل العدد الأقل من هذا الخطر ولكنه يزيد من الوقت المستغرق لإجراء الفحص. بشكل عام ، يجب تجنب تداخل الإشارة عند إنشاء مخاليط. باستخدام المكتبة الداخلية ، يمكن إهمال ذلك لفحص 1H حيث تم تصميم المكتبة خصيصا لتكون متنوعة وتظهر القليل من تداخل الإشارات مع الحفاظ على تنوع كيميائي عال. وهذا بدوره يعني أنه لا يجب إجراء أي إجراء تصميم خاص لإنشاء 64 مزيجا.
    1. نظرا لأن فحص 19F يعتمد على أجزاء المكتبة الداخلية التي تحتوي على الفلور ولم يتم إنشاء المكتبة لتقليل تداخل الإشارة لهذه الأجزاء المحددة ، فقم بتصميم خليط مناسب.
    2. قياس الأطياف المركبة المفردة لجميع الشظايا التي تحتوي على 19فهرنهايت.
    3. لاحظ معلومات التحول الكيميائي لكل إشارة.
    4. وفقا لهذه المعلومات ، اختر 20-21 شظايا لكل خليط. وهذا بدوره يعطي 5 مخاليط يحتوي كل منها على 20-21 جزءا بدون تداخل إشارة ويسمح بتحليل شبه آلي للبيانات.
  3. إجراء تحديد الضربة داخل تفاعل الليجند بين الجزيئات الحيوية والرباط المرصود
    ملاحظة: هناك تعريفات مختلفة للضربة بين إجراء الفحص 19F و 1H. تم إعداد تعريفات النتائج التالية من قبلنا واتباع قواعد محددة. موضوع تحديد النتيجة هو طريقة ذاتية للغاية ويمكن أن يختلف من مستخدم لآخر. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان ألا تتغير قواعد تحديد الضربات بمجرد الاتفاق عليها للحفاظ على التحقق والمصداقية.
    1. 1شاشة H
      1. لتحديد الضربات بثقة ، احصل على أطياف 1D 1H و waterLOGSY وتجارب الاسترخاء T2 في وجود وغياب الهدف لتحديد المجلدات. جميع التجارب الثلاث لديها القدرة على إظهار حدث ملزم. إذا كان CSP أكبر من 6 هرتز مرئيا في أطياف العينة مقارنة بالأطياف الفارغة ، فإن هذا يعتبر مؤشرا على حدوث ضربة. وينطبق الشيء نفسه إذا كانت إشارة إيجابية قوية في waterLOGSY بالإضافة إلى أكثر من 30٪ T2 انخفاض في أطياف العينة مرئية. يمكن عرض أحداث الترابط في جميع التجارب الثلاث، عند مقارنة العينة التي تحتوي على أطياف مع أطيافها الفارغة. ومع ذلك ، قد لا تكون الأحداث الملزمة مرئية في جميع التجارب الثلاث. ولهذا السبب تم الاتفاق على أن اثنين على الأقل من الأحداث الموصوفة سابقا يجب أن يحدثا من أجل تصنيف جزء على أنه ضربة ملزمة.
      2. استخدم أداة FBS في TopSpin لتحديد حالة الأجزاء إلى ملزمة وغامضة وغير معروفة ومجاميع وغير ملزمة.
      3. عند الانتهاء من المزيج، قم بالموافقة عليه داخل أداة FBS.
      4. في علامة تبويب الملخص ضمن مشروع FBS، انقر على إنشاء تقرير فحص. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة تنشئ ملف .xlsx. يمكن للمستخدم بعد ذلك اختيار الاختيار بين جميع الروابط ، والربط فقط ، وليس الليجند الملزم فقط والروابط الغامضة التي سيتم الإبلاغ عنها في جدول البيانات.
    2. 19شاشة F
      1. للتمييز بين غير الموثق ، ورابط الأسبوع ، والموثق القوي ، قسم حاصل التكامل بين القياس المستهدف 200 مللي ثانية والقياس الفارغ 200 مللي ثانية على حاصل القياس المستهدف 0 مللي ثانية ويتم استخدام القياس الفارغ 0 مللي ثانية:
        Equation 1
        ملاحظة: يعطي هذا قيما تتراوح من 0 إلى ~ 1 (درجة النتيجة) ، مما يجعل من الممكن تعيين عتبات لكل حالة ربط.
      2. استخدم متوسط القياس المرجعي 200 مللي ثانية كعتبة أساسية، لتمييز الحالات التي تتجاوز فيها درجة النتيجة 1. يمكن أن يحدث هذا ، إذا كانت التكاملات المستوردة تحتوي على قيم سالبة أو كان القياس المرجعي أعلى من القياس الهدف. تعتبر درجة الضربة البالغة ≤ 0.67 ضربة ضعيفة ، < 0.33 ضربة قوية ، وأي شيء > 0.67 على أنه غير ضارب. يظهر مثال في الشكل 2.

Figure 2
الشكل 2: تحديد الهوية لفحص 19F. قسم من 19أطياف F CPMG NMR لمركب مثالي. يشرح هذا التمثيل التصويري خصائص الموثق. 19أطياف F-CPMG لمركب تم الحصول عليه من عينات الخليط في وجود وغياب الحمض النووي الريبي. تمثل القيم القيم المتكاملة المعيارية للذروة المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تحليل البيانات
    1. إعداد البيانات للتحليل
      ملاحظة: من المهم ألا تحتوي البيانات التي تم الحصول عليها على عيوب مرئية. وهذا يعني أن البيانات التي كان فيها التشويش مشكلة ، أو كان قمع المياه غير كاف لا ينبغي النظر فيها للتحليل. بدلا من ذلك ، يوصى بتسجيل البيانات مرة أخرى والتأكد من أن كل شيء على ما يرام مع العينة (على سبيل المثال ، لا توجد فقاعات هواء) ، مع درجة الحرارة ، واللمعان ، وقمع الماء. يمكن دائما تقييم صحة البيانات عند مقارنة إشارات DMSO.
    2. 1فحص H
      1. لتحليل بيانات فحص 1H ، استخدم أداة FBS (تحتاج إلى ترخيص إضافي) في TopSpin 4.0.9.
      2. اتبع التعليمات الواردة في دليل أدوات FBS للبدء بتحليل البيانات. تلخص الخطوات التالية الإجراء المبلغ عنه في الدليل.
      3. قم بتخزين بيانات BMRZ NMR من حملات الفحص بحيث يكون لكل خليط فحص مختلف دليله الخاص الذي يحتوي فيه الدليل الفرعي على التجارب المختلفة التي تم قياسها على العينة.
      4. لاستخدام أداة FBS ، قم بتخزين الأطياف المرجعية التي تحتوي على جميع البيانات المحفوظة من العينات بدون الهدف الجزيئي الحيوي ولكن مع المخاليط بالإضافة إلى المركب الفردي المقاس في أدلة مختلفة / nmr. هذا مهم لأن أداة FBS ستطلب مسار الدليل لكل منها على حدة.
        ملاحظة: ستتعرف أداة FBS على الدليل كمشروع فحص إذا تم تخزين مجموعات البيانات التالية في نفس الدليل حيث يتم تخزين مخاليط عينة الفرز (csv ومستندات FragmentScreen XML وملف BAK).
      5. عند استخدام TopSpin 4.0.9 ، قم بإنشاء مسار مباشر إلى الدليل الذي يحتوي على البيانات المكتسبة ، وهو ما يسمى DIR. اختر الدليل / nmr الذي يجب أن يكون فيه لجميع المخاليط دليل مميز.
      6. لبدء أداة FBS لعينة تم فحصها ، اسحب الرمز FBS project إلى منتصف نافذة TopSpin. في الدليل المختار ، يجب أن يظهر رمز مشروع FBS إذا تم نسخ مجموعات البيانات المذكورة مسبقا فيه.
      7. يجب أن تفتح النافذة خيارات الفرز المستندة إلى الأجزاء تلقائيا عند تحميل مشروع FBS جديد لأول مرة. في هذه النافذة ، اختر ملف كوكتيل. ملف الكوكتيل هو ملف csv يحتوي على تعيين اسم الخلطات واسم كل جزء وتقسيمها إلى المزيج. حدد أيضا مجلد أطياف ligand المرجعي الذي يحتوي على جميع الأطياف المقاسة للأجزاء المفردة. أخيرا ، حدد مجلد تجربة فارغ مرجعي ، والذي عادة ما يكون المجلد الذي يحتوي على مجموعات بيانات المزج بدون الهدف الذي تم التحقيق فيه.
      8. تحتوي خيارات الفحص المستندة إلى الأجزاء على علامة تبويب تسمى أنواع الأطياف التي تتيح للمرء تحديد الأطياف التي تم التحقيق فيها بالإضافة إلى لون عرض الأطياف . قم بتعيين Spectype وفقا للبيانات المعالجة مسبقا. في علامة التبويب تخطيط العرض ، حدد الأطياف التي ستتم مقارنتها مع بعضها البعض وفقا لأنواع المواصفات الخاصة بها.
      9. اضغط على موافق لبدء مشروع FBS.
      10. أثناء النظر إلى البيانات ، سيتم فتح نافذة منفصلة ، تلخص جميع خلطات الكوكتيل وجميع روابط كل مزيج في جدول. بالنقر المزدوج على خلية ، سيتم فتح مجموعات البيانات المعنية ، مقارنة على سبيل المثال أطياف 1H 1D Blank مع مجموعة البيانات التي تحتوي على الهدف.
      11. قبل تعيين المجلدات ، تأكد من أن القمم المرجعية (DMSO لجميع القياسات وكذلك المركبات الفردية) تتطابق مع بعضها البعض ولها نفس التحول الكيميائي. إذا لوحظت اختلافات ، فقم بتصحيحها باستخدام خيار المعالجة التسلسلية من TopSpin.
      12. يوجد خيار المعالجة التسلسلية ضمن علامة التبويب " العملية" ضمن خيارات متقدمة. يطبق التغييرات على جميع الأطياف المحددة من مجموعة البيانات. بهذه الطريقة ، يمكن بسهولة تعيين Spectypes لأرقام التجربة ويمكن إزاحة جميع الأطياف مرة واحدة لتتماشى مع المرجع.
    3. 19F الفحص
      1. للتحليل الأول لمخاليط 19F ، قم بإنشاء ملف تكامل لكل مزيج. لتحديد منطقة التكامل ، انقر فوق وظيفة التكامل في علامة التبويب تحليل . تأكد من أنه لكل جزء في الخليط يتم تحديد منطقة تكامل واضحة ل 19F-singal المقابلة.
      2. استخدم زر حفظ/تصدير مناطق التكامل لتصدير ملف التكامل للاستخدام في المستقبل. احفظ أي ملفات تكامل مستخدمة في C: \ Bruker \ TopSpin4.0.9 \ exp \ stan \ nmr \ lists \ intrng ، أو المسار المقابل لدليل تثبيت TopSpin.
      3. بالنسبة لبيانات 19F ، افتح مجموعة بيانات إما مع أو بدون الهدف الذي تم التحقيق فيه.
      4. لتحميل ملف التكامل في الطيف الحالي ، افتح علامة التبويب تحليل مرة أخرى ، وانتقل إلى التكامل واستخدام زر مناطق تكامل القراءة / الاستيراد ، وقم بتحميل ملف التكامل المقابل. سيؤدي هذا إلى تحميل أي مناطق محددة من هذا الملف في الطيف الحالي.
      5. احفظ وارجع للعثور على قائمة بجميع المناطق المتكاملة في علامة التبويب التكاملات . انسخ هذا في جدول بيانات أو أي أداة أخرى تستخدم لمزيد من التحليل للبيانات.
      6. كرر هذا الإجراء لكل مزيج ، مع وبدون هدف.
    4. إدارة البيانات
      1. لسهولة الاستخدام والإنتاجية ، قم بإعداد تدفق عمل موحد لمزيد من التحليل وتخزين البيانات المكتسبة. بالنسبة لكل من فحص 1H و 19F ، استخدم جدول بيانات مصمما خصيصا لكل منهما.
        ملاحظة: بالنسبة لفحص 1H ، تم استخدام هذا فقط لإدارة البيانات ولتلخيص كل هدف بينما بالنسبة لفحص 19F ، استخدم حاصل القسمة الموضح في الفصل 4.3 لتسمية كل جزء تلقائيا على أنه إصابة / بدون إصابة بعد نسخ البيانات المتكاملة فيه. هذا يقلل من خطر الخطأ البشري أثناء التحليل ، على افتراض أن الملف قد تم إعداده بشكل صحيح ، ويجعل مشاركة المعلومات أسهل ، حيث يتم جمع جميع المعلومات المهمة في مكان واحد في ملف يمكن فتحه من قبل أي شخص تقريبا دون الحاجة إلى مزيد من البرامج لإلقاء نظرة أولية على البيانات.

Representative Results

مراقبة جودة مكتبة الأجزاء
تم تسليم الأجزاء من المكتبة الداخلية كحلول مخزون 50 مللي متر في 90٪ d6-DMSO و 10٪ D 2 O (10٪من D2O يضمن تقليل تدهور المركب بسبب دورات التجميد والذوبان المتكررة14). تتكون العينات المركبة المفردة من 1 mM ligand في 50 mM phosphate buffer (25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2) ، درجة الحموضة 6.0 في 90٪ H 2 O / 9٪ D 2O / 1٪ d6-DMSO. 1تم قياس تجارب H-NMR للشظايا من مكتبة iNEXT على مطياف الرنين المغناطيسي النووي 500/600 ميجاهرتز. تم استخدام هذه البيانات أيضا لتحديد المركبات المفردة في حملات فحص 1H باستخدام برنامج CMC-q الذي يسمح للمستخدم بالحصول على الأطياف بالكامل بطريقة آلية وتم تقييم جودة (قابلية الذوبان والسلامة) للشظايا. تظهر نتائج التحليل الآلي من CMC-a كناتج رسومي مشابه لما هو ممثل في الشكل 3. يظهر الإخراج الرسومي تمثيلا للوحة 96 بئرا. تعني الدائرة ذات اللون الأحمر أن هذه القطعة تظهر عدم تناسق في التركيب أو التركيز. تشير الآبار ذات اللون الأخضر إلى أن الجزء متسق.

Figure 3
الشكل 3: مراقبة جودة مكتبة الأجزاء. تمثيل تخطيطي للإخراج الآلي القائم على CMC-a. يتم تقييم خصائص الشظايا مثل التركيز والسلامة الهيكلية. الأخضر يرمز إلى متسق ، والبرتقالي في هذه الحالة يرمز إلى غير متسق. تتم مراجعة الأجزاء غير المتناسقة يدويا باتباع سير العمل المعروض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تصنيف ما يقرب من 65٪ و 35٪ من الأجزاء على أنها متسقة وغير متسقة ، على التوالي ، في كل من DMSO والمخزن المؤقت. علاوة على ذلك ، أصبحت 30٪ من الروابط المصنفة غير المتسقة متسقة بعد فحص يدوي دقيق للأطياف9.

19F تصميم خليط
تم تقسيم 103 أجزاء تحتوي على مجموعة واحدة أو عدة مجموعات من الفلور من المكتبة الداخلية إلى 5 خلطات (A ، B ، C ، D ، E). يحتوي كل مزيج على 20 إلى 21 جزءا. وفي هذه الحالة، كان لا بد من تصميم المخاليط بعناية لتجنب تداخل الإشارة. 19تم قياس تجارب الاسترخاء المستعرض F لكل خليط يطبق قطارات نبض CPMG. يمكن تعديل هذه التجارب عن طريق تغيير تأخيرات الاسترخاء. يمكن رؤية التحول الكيميائي 19F للخلطات A-E في الشكل 4.

Figure 4
الشكل 4: 19F 1D-NMR أطياف عينات الخليط من المكتبة الداخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

إعداد العينة
تم تحضير العينة في إجراء الفحص 19F إما يدويا أو باستخدام سحب آلي باستخدام روبوت ماصات ماصة . كان تركيز الشظايا في كل خليط 2.5 mM في 90٪ d6-DMSO و 10٪ D2O. كان الحجم النهائي لعينة الفحص 170 ميكرولتر مع 5٪ D2O كعامل قفل. تم سحب كل خليط مرتين ، واحدة في محلول يحتوي على محلول (بدون هدف) والأخرى في هدف يحتوي على محلول عازل. تم ضبط نسبة الهدف والشظية على 1: 1 ، مما أدى إلى تركيز الهدف / الربيطة النهائي 50 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عينات التحكم هي الجزيء الحيوي المستهدف في فحص المخزن المؤقت بدون خليط لضمان سلامة الهدف بالإضافة إلى عينة تحكم مع المخزن المؤقت فقط و D2O لضمان جودة المخزن المؤقت.

كانت بيانات فحص الرنين المغناطيسي النووي ل 19 F-1D و 19F-CPMG-T2 قياسات كما هو موضح في القسم 3.1. على سبيل المثال ، في حالة الحمض النووي الريبي ، تم الحصول على تسلسل صدى القفز والعودة (pp = zggpjrse ، 15) لعينة الهدف الفردي في المخزن المؤقت.

تحليل البيانات
تم تطبيق إجراء الفحص 19 F على TPP riboswitch thiM من E. coli وبروتين التيروزين كيناز (PtkA) من M. السل من بين عدة أهداف أخرى 16. تحتوي مكتبة فحص 19F على 103 أجزاء مقسمة إلى 5 خلطات مصنفة من Mix A إلى E. يمكن إجراء تحضير عينات الفحص يدويا دون استخدام روبوت سحب العينات. تم خلط محلول يحتوي على 40 ميكرومتر من الحمض النووي الريبي (ظروف عازلة) مع 3.2 ميكرولتر من المخاليط. تم تحضير عينات تحكم أخرى تتكون من المخزن المؤقت فقط ، والمخزن المؤقت بنسبة 5٪ من DMSO (يضمن سابقا استقرار الجزيء الحيوي الكبير في وجود تركيز DMSO المطلوب) والمخزن المؤقت مع الحمض النووي الريبي. تم تحضير عينات الفحص ال 13 هذه ونقلها إلى أنابيب NMR مقاس 3 مم. يتم مسح الباركود لأنابيب الرنين المغناطيسي النووي وكل خليط في وجود وغياب الحمض النووي الريبي ، وكذلك تم قياس عينات التحكم وفقا لتجارب الرنين المغناطيسي النووي 19F المذكورة أعلاه التي أجريت عند 298 K. تم إجراء فحص thiM RNA مقابل المكتبة الداخلية عن طريق إجراء قياسات T2 باستخدام CPMGs من 0 مللي ثانية و 200 مللي ثانية لكل عينة مختلفة. تمت مراقبة الشفط السليم وقمع المياه بعد الانتهاء من القياسات من خلال مقارنة جميع قمم DMSO من حيث توسيع الخط وفقدان الشدة لتجارب 1H 1D المقاسة بشكل إضافي لجميع العينات. تم إجراء معالجة أطياف الاسترخاء CPMG T219F التي تم الحصول عليها باستخدام ماكرو معد مسبقا ومؤتمت في TopSpin ، على التوالي. تم إجراء تحليل البيانات باتباع التعليمات الواردة في قسم البروتوكول. يمكن تقييم البيانات المتكاملة التي تم الحصول عليها من TopSpin (باتباع الإرشادات الواردة في البروتوكول) بسرعة وسهولة باستخدام جدول بيانات معد مسبقا أو أي برنامج مشابه ، من خلال تحديد الشروط والعتبات الصحيحة. كما هو موضح سابقا ، تكون العتبات مفيدة في تعريف الموثق أو الموثق الضعيف أو غير الموثق. يوضح الشكل 5 النتائج النموذجية لأطياف CPMG ل thiM RNA و PtkA ، على التوالي. وفي بعض الحالات، يلزم إجراء مزيد من التنقيح من جانب الخبراء. 

Figure 5
الشكل 5: قطع من 19 أطياف F CPMG NMR تظهر تغيرات الشدة التي تم الحصول عليها من أوقات التأخير المختلفة للتجارب القائمة على CPMG . (أ) تمثيل مادة رابطة (ضربة) وغير رابطة في 19F فحص قائم على الشظايا تم إجراؤه على TPP riboswitch thiM RNA من الإشريكية القولونية. (ب) تمثيل مادة رابطة وغير موثقة في فحص قائم على الشظايا 19F تم إجراؤه على PtkA من المتفطرة السلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فحص 1ساعة

تصميم الخليط
المكتبة الداخلية المستخدمة متنوعة للغاية لدرجة أنه لأغراض فحص 1H لم يتم تنفيذ أي تصميم خليط. هذا يعني أنه تم تحضير ٦٤ خلطا باختيار ١٢ خلطا عشوائيا لخلطها في خليط واحد.

تحضير العينة
بالنسبة لفحص 1H ل SARS-CoV-2 RNA المثالي ، تم إجراء سحب آلي باستخدام روبوت ماصة لإعداد العينات. كان تركيز الشظايا في كل خليط 4.2 mM في 90٪ d6-DMSO و 10٪ D2O. كان الحجم النهائي لعينة الفحص 200 ميكرولتر مع 5٪ D2O كعامل قفل. 64 عينة تحتوي كل منها على خليط مختلف في 25 mM KPi ، و 50 mM KCl عند الرقم الهيدروجيني 6.2 تم سحبها بدون الحمض النووي الريبي المستهدف. على التوالي ، تم سحب 64 عينة باستخدام الحمض النووي الريبي المستهدف ، كل منها يحتوي على خليط مختلف. تم ضبط نسبة RNA: Ligand على 1:20 ، مما أدى إلى تركيز RNA يبلغ 10 ميكرومتر وتركيز ليجند يبلغ 200 ميكرومتر.

تحليل البيانات
بالنسبة لتحليل 1H ، تم استخدام أداة FBS في TopSpin. لتحديد ما إذا كانت الشظية ناجحة ، تم إجراء تجارب استرخاء 1D Chemical Shift و waterLOGSY و T2 . بالنسبة لاسترخاء T2 ، تم احتساب انخفاض في الشدة أكبر من 30٪ على أنه ضربة ، بينما بالنسبة للتحول الكيميائي ، كان التحول الأكبر من 6 هرتز هو القطع. كان على waterLOGSY إظهار تغيير كبير في الإشارة (من سلبي إلى إيجابي في هذه الحالة). إذا كان أي من هذه المعايير الثلاثة إيجابيا ، احتساب جزء على أنه ضربة. يمكن رؤية مثالين على ذلك في الشكل 6.

Figure 6
الشكل 6: فحص 1H الذي تم إجراؤه على الحمض النووي الريبي النموذجي ل SARS-CoV-2 الذي يظهر معايير تحديد الضربة. اكتساب ثلاث تجارب مختلفة (1 H T2 CPMG (5/100 مللي ثانية) ، waterLOGSY ، و 1D 1H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر Hit-1 انخفاضا في T2 بنسبة ~ 50٪ و CSP ≥ 6 هرتز. لا يظهر waterLOGSY تغيرا كبيرا بما يكفي في الإشارة ليتم احتسابها أيضا على أنها إيجابية. نظرا لأن تجربتين من أصل ثلاث تجارب إيجابية ، يتم احتساب هذه القطعة على أنها ضربة. بالنسبة ل Hit-2 ، يظهر T2 انخفاضا بنسبة ~ 80٪ من شدة الإشارة ويمكن رؤية تغيير واضح في الإشارة ل waterLOGSY. لا يكفي CSP في هذه الحالة ، ولكن نظرا لأن المعيارين السابقين إيجابيان ، فلا يزال يتم احتسابه على أنه نجاح.

Discussion

براعة فحص الشظايا / المخدرات القائم على الرنين المغناطيسي النووي. نفذت BMRZ بنجاح أحدث أجهزة الرنين المغناطيسي النووي الآلية بالإضافة إلى تجارب STD-NMR و waterLOGSY والاسترخاء لتحديد الشظايا ضمن مجموعة واسعة من نظام التقارب لاكتشاف الأدوية. تشتمل الأجهزة المثبتة على روبوت تحضير عينات عالي الإنتاجية ووحدة تخزين ومبدل ووحدة للحصول على بيانات عالية الإنتاجية مرتبطة بمطياف 600 ميجاهرتز. يضمن المسبار المبرد الذي تم شراؤه مؤخرا ل 1 H و 19 F و 13C و 15 N الحساسية المطلوبة للقياسات المقترحة ويسمح بفصل 1 H (1) أثناء اكتشاف 19F. يتصل هذا المسبار بأحدث جيل من وحدة تحكم الرنين المغناطيسي النووي التي توفر إمكانية استخدام أدوات البرامج المتقدمة من Bruker ، بما في ذلك CMC-q و CMC-assist و CMC-se و FBS (المضمنة في TopSpin). تم تضمين أداة الفحص القائمة على الأجزاء (FBS) في أحدث إصدار من TopSpin وتساعد على تحليل البيانات عالية الإنتاجية التي تتكون من STD و waterLOGSY و T2 / T1r-relaxation experiments. يمكن ملء مجموعة العينات السائلة 1D 1H في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي بطريقة آلية باستخدام روبوت ملء العينة. عادة ، يتم ملء كتلة من 96 أنبوبا (3 مم) في حوالي ساعتين. يتم وضع رفوف 96 لوحة بئر مباشرة في مبدل عينة HT ، الذي يقرأ الرمز الشريطي للكتلة ويعين أنابيب الرنين المغناطيسي النووي للتجارب التي يتحكم فيها برنامج الأتمتة (IconNMR). يمكن تخزين خمسة رفوف ذات 96 بئرا وبرمجتها في مبدل عينات HT في نفس الوقت. يمكن التحكم في درجة حرارة كل من الرفوف الفردية وتنظيمها بشكل منفصل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف كل عينة فردية مسبقا (التسخين المسبق وتجفيف الأنبوب لإزالة الرطوبة المكثفة) إلى درجة الحرارة المطلوبة قبل القياس.

ملاءمة لمجموعة واسعة من التطبيقات. أحد التطبيقات الواسعة لهذا الفحص الآلي القائم على الرنين المغناطيسي النووي هو تحديد وتطوير روابط جديدة مرتبطة بهدف جزيئي حيوي (DNA / RNA / Proteins). يمكن أن تشتمل هذه الروابط على مثبطات تقويم العظام ومثبطات الستيريك التي ترتبط عادة بشكل غير تساهمي. علاوة على ذلك ، عادة ما يتم استخدام FBDD بواسطة الرنين المغناطيسي النووي كخطوة أولى لاختيار المركبات الواعدة ، والمتطلبات التي يجب الوفاء بها هي توافر الهدف الجزيئي الحيوي بكميات كافية. وينقسم هذا الهدف إلى مهمتين رئيسيتين.

المهمة الأولى هي تطوير وتوصيف مكتبة أجزاء داخلية للأسباب التالية: مراقبة الجودة الأولية والدورية ، وتوصيف ، وتحديد كمية أكثر من 1000 جزء ؛ تحديد قابلية ذوبان الشظايا في المخازن المؤقتة المحسنة لكل هدف ، ولا سيما بالنسبة لأهداف البروتين ؛ وإنشاء العديد من المكتبات لاستيعاب سقالات متنوعة وتمتد نحو فئات الجزيئات الكبيرة الأخرى. وتتمثل المهمة الثانية في إدماج تدفقات العمل لتصميم العقاقير المرتكزة على الأجزاء (FBDD) بواسطة الرنين المغناطيسي النووي باستخدام: الفحص الآلي لليجند المرصود 1D (1 H و 19 F المرصود)؛ والفحص الآلي لليجند (1 H و 19 F)؛ والفحص الآلي لليجند (1 H و 19 F المرصود)؛ والفحص الآلي 1D-ligand (1 H و 19 F المرصود)؛ والفحص الآلي لليجند (1H و 19F المر مقايسات الاستبدال الآلي (تجارب المنافسة مع الرباط (الطبيعي)) للتمييز بين الربط التقويمي والخيفي ؛ الفحوصات الثانوية الآلية مع أجزاء متعددة ؛ الفحص الآلي لبروتين 2D ، والفحص الثانوي لمجموعة من المشتقات حول ضربة أولية باستخدام مكتبة EU-OPENSCREEN أو أي مكتبة أخرى ؛ وإعادة فحص التنميط لمكتبة إدارة الغذاء والدواء مقابل الأهداف المختارة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء التمثيل الغذائي لخطوط الخلايا المختلفة (ذات الصلة بالمرض) من أجل كشف الآليات التنظيمية التي تربط التحكم في دورة الخلية والتمثيل الغذائي. أيضا ، هناك توصيف وظيفي لعناصر تنظيم الحمض النووي الريبي / الحمض النووي / البروتين في الجسم الحي وفي المختبر لتحسين البناء / المجال (تحسين الاستقرار للتحقيقات الهيكلية (المخزن المؤقت ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وفحص الملح) ، وتمديد فحص الشظايا القائم على الرنين المغناطيسي النووي إلى البروتينات الغشائية والبروتينات المضطربة جوهريا ، والتي لا يمكن الوصول إليها بشكل عام لتقنيات أخرى.

القيود. استخدام مكتبات أجزاء 19F و 1H له إيجابيات وسلبيات ، سيتم ذكر القليل منها في ما يلي. أكبر فائدة من قياسات 19F مقابل 1H هي سرعة كل من وقت القياس الفعلي والتحليل اللاحق ، حيث تحتوي المخاليط على ضعف عدد الأجزاء تقريبا ويجب إجراء عدد أقل من التجارب. يعد تحليل المتابعة أسهل أيضا لفحص 19درجة فهرنهايت ، حيث لا يوجد تداخل من المخازن المؤقتة ويوفر بالإضافة إلى ذلك نطاق تحول كيميائي أوسع مع عدم وجود تداخل إشارة تقريبا لخليط شظايا مصمم على النحو الأمثل. يتم تبسيط الأطياف نفسها إلى حد كبير ، وعادة ما تحتوي على إشارة واحدة أو اثنتين فقط لكل جزء ، اعتمادا على عدد ذرات الفلور. وبالتالي يمكن أتمتة تحليل هذه الأطياف ، مما يقلل مرة أخرى من الوقت. يأتي هذا على حساب التنوع الكيميائي ، على الأقل بالنسبة للمكتبة المستخدمة في هذه الدراسة. نظرا لأن ~ 13٪ فقط من المكتبة تحتوي على 19 فهرنهايت ، ولكن من الطبيعي أن تكون جميعها قابلة للاستخدام في فحص 1H ، فإن تنوع أجزاء الفحص 19F سيكون أقل. يمكن التحايل على ذلك باستخدام مكتبات 19F المصممة خصيصا مع المزيد من الأجزاء والتنوع الكيميائي الأكبر. عيب آخر لفحص 19F هو انخفاض عدد الإشارات لكل جزء. تتكون الشظايا بشكل عام من أكثر من ذرة هيدروجين واحدة. لذلك ، يمكن أن تعتمد تجارب الفحص المرصودة 1H على إشارات مختلفة لنفس الجزء للكشف عن الارتباط. يعطي هذا درجة أعلى من الثقة عند تحديد النتائج لفحص 1H ، في حين يجب أن يعتمد فحص 19F على إشارة أو إشارتين معطيتين لكل جزء.

وقدم بيان مفصل عن أجهزة فحص الشظايا الآلية الحديثة القائمة على الرنين المغناطيسي النووي، والبرمجيات وأساليب التحليل والبروتوكولات الخاصة بها. تشتمل الأجهزة المركبة على روبوت تحضير عينات عالي الإنتاجية ووحدة تخزين ومبدل واكتساب بيانات عالية الإنتاجية مرتبطة بمطياف 600 ميجاهرتز. يضمن رأس المسبار المبرد الذي تم تركيبه مؤخرا ل 1 H و 19 F و 13C و 15 N الحساسية المطلوبة للقياسات المقترحة ويسمح بفصل 1H أثناء اكتشاف 19F. علاوة على ذلك ، يوفر أحدث جيل من وحدة التحكم NMR إمكانية استخدام برامج تحليلية متقدمة للمساعدة في الاستحواذ والتحليل السريع. يجب أن تعزز التكنولوجيا التي تمت مناقشتها أعلاه وسير العمل والبروتوكولات الموصوفة نجاحا ملحوظا للمستخدمين الذين يتابعون FBS بواسطة الرنين المغناطيسي النووي.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل iNEXT-Discovery ، المشروع رقم 871037 ، بتمويل من برنامج Horizon 2020 التابع للمفوضية الأوروبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker Avance III HD Bruker 600 MHz NMR Spectrometer
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK ThermoFisher Scientific Barcoded Tubes
Matrix SepraSeal und DuraSeal& 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS ThermoFisher Scientific
SampleJet Bruker HT Sample Changer
SamplePro Tube Bruker Pipetting Robot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yanamala, N., et al. NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands. Chemical Biology & Drug Design. 75, 237-256 (2010).
  2. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).
  3. Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus. Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).
  4. Perera, T. P. S., et al. Discovery & pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).
  5. Zhang, C., et al. Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).
  6. Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).
  7. Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery. Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).
  8. Chávez-Hernández, A. L., Sánchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization. Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).
  9. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).
  10. Gao, J., et al. Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex. PLoS One. 9, 88098 (2014).
  11. Peng, C., et al. Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).
  12. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  13. Hwang, T. L., Shaka, A. J. Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients. Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).
  14. Gossert, A. D., Jahnke, W. NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).
  15. Sklenar, V., Bax, A. A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth. Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).
  16. Binas, O., et al. 19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens. ChemBioChem. , (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 172 ، الفحص القائم على الأجزاء ، الأتمتة ، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للحلول ، جمع البيانات وتحليلها ، منصة الفحص ، مكتبة الأجزاء
فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berg, H., Wirtz Martin, M. A.,… More

Berg, H., Wirtz Martin, M. A., Niesteruk, A., Richter, C., Sreeramulu, S., Schwalbe, H. NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode. J. Vis. Exp. (172), e62262, doi:10.3791/62262 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter