Summary
Protokollen præsenteres her beskriver brugen af Spotiton, en ny robot system, til at levere to prøver af interesse på en selvtransporterende, nanowire gitter, der blandes for mindst 90 ms før vitrifikation i flydende cryogen.
Abstract
Fangsten af kortvarige molekylære tilstande udløst af det tidlige møde med to eller flere interagerende partikler fortsætter med at være en eksperimentel udfordring af stor interesse for området kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Et par metodiske strategier er blevet udviklet, der understøtter disse "tid-løst" undersøgelser, hvoraf den ene, Spotiton-en ny robot system-kombinerer udlevering af picoliter mellemstore prøvedråber med præcis tidsmæssig og rumlig kontrol. Den tidsforløste Spotiton-arbejdsgang tilbyder en unik effektiv tilgang til at afhøre tidlige strukturelle omlægninger fra minimal prøvevolumen. Fyret fra uafhængigt kontrollerede piezoelektriske dispensere, to prøver lander og blandes hurtigt på et nanowire EM-gitter, da det kaster mod cryogen. Potentielt hundredvis af gitre kan fremstilles i hurtig rækkefølge fra kun et par mikroliter af en prøve. Her præsenteres en detaljeret trinvis protokol for driften af Spotiton-systemet med fokus på fejlfinding af specifikke problemer, der opstår under gitterforberedelse.
Introduction
Potentialet for cryo-EM til at fange og afsløre forbigående kropsbygningstilstande af proteiner på sub-sekund tidsskala (tid-løst cryo-EM) er blevet realiseret af flere grupper, begyndende med Berriman og Unwin1, hvis teknik bygger på standard springet frysning metode udviklet af Dubochet til fremstilling af cryo-EM gitre2. De tilføjede en forstøver lige over cryogen kop, der anvendes komprimeret nitrogen gas til at sprøjte en fin tåge af en anden prøve på en kaste EM gitter, der indeholder en første prøve, der var blevet anvendt og blottet for et tyndt vandig lag. Selv om dette system kunne opnå blanding gange så lavt som 1 ms, det stadig krævede manuel blotting af den første prøve af brugeren-en teknisk udfordrende opgave-og en relativt høj volumen af den anden prøve. Desuden var det i praksis vanskeligt at vide, hvor blanding af de to prøver var sket, hvilket krævede anvendelse af ferritin nanopartikler som fiducial markør i den blandede prøve. Howard Whites og kollegernes efterfølgende indsats forbedrede kontrollen og reproducerbarheden af denne sprøjteblandingsmetode ved at indarbejde computerkontrol af blotting- og sprøjtningstrin3,4. For at adressere, hvor godt og hvor prøverne blandes, er den samme gruppe5 og andre6,7,8,9,10 flyttet til en blandingssprøjtetilgang11, hvor to prøver blandes enten i smalle kapillærrør under tryk af sprøjtepumper eller i mikrofabricated, mikrofluidiske chips drevet af nitrogengas. Disse forblandingssystemer sikrer ikke kun fuldstændig blanding, men gør det også muligt at finjustere blandingstiderne for at øge opløsningen af tidsforløsede undersøgelser.
Indførelsen af piezoelektriske dispensere som en alternativ måde at anvende prøve på EM-net i Spotiton-systemet gjorde det muligt både præcist at målrette prøveaflejringen og kravet om en meget mindre prøvevolumen for at lave et gitter12. Senere fjernede brugen af nanowire-net og undervejs prøveapplikation ("on-the-fly" spotting) behovet for et blotting-trin og reducerede applikations-til-vitrifikation gange13,14. For den nye tilgang til tidsforklaret cryo-EM beskrevet her, en anden dispenser sammen med de nødvendige kontrol hardware og software opgraderinger blev tilføjet til Spotiton system til at muliggøre levering af en anden prøve på en bevægelig nanowire gitter næsten umiddelbart efter aflejring af de første15. De to overlappende prøver blandes på nettet, da de er onde af nanowires i et tyndt vandigt lag før vitrifikation. Blanding gange så lavt som 90 ms kan opnås. Denne protokol har til formål at give praktiske oplysninger om, hvordan man udfører tidsforsluttet eksperimenter ved hjælp af piezoelektriske dispensering og nanowire net. Da hardwaren og softwaren ændres for at forbedre brugervenligheden, konsistensen og gennemløbet, fungerer denne protokol også som en opdateret beskrivelse af den tidligere rapporterede metode15.
Protocol
1. Opsætning af Spotiton-maskinen og -softwaren
- Klargør systemet til dispensering (Figur 1).
- Åbn hovedventilen på nitrogenforsyningstanken. Sørg for, at systembeholderen er fyldt med afgasset, ultrapurt vand. Tænd computeren. Tænd Spotiton-systemet ved multioutlet powerstrip.
- Klik på skrivebordsikonet (Figur 2A) for at åbne brugergrænsefladen i Spotiton-softwaren (Figur 2B). I menuen Funktioner skal du vælge Initialiser faser for at initialisere og hjemføre 3-aksede robotter (gitterstadie og pipettestadie) og den roterende dispenserhovedsamling (theta-stadiet). Sørg for, at dispenserspidserne peger ned før initialisering og sporing.
- Klik på Gå til Sikkerposition i hovedvinduet for at sende robotterne til SafePosition (Figur 3).
BEMÆRK: Flytning til SafePosition kan gøres med robotter i enhver position uden risiko for kollision. - Vælg Prime under fanen Aspirate for at skylle dispenserhovederne flere gange med vand fra reservoiret. Fortsæt, indtil uafbrudte vandstrømme kan ses på vej ud af de to spidser.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at gentage dette, hvis der kom en betydelig mængde luft ind i væskelinjerne, når spidserne blev skyllet med methanol ved sidste nedlukning.
- Undersøg dispenserens ydeevne
- Send hvert tip til inspektionskameraet under fanen Undersøg, og match mønsteret for dråbeproduktion fra de to dispensere (figur S1).
BEMÆRK: Hvis et tip ikke udløses på grund af en boble (Figur S2A) eller snavs, skal du rengøre spidserne på vaskestationen (Figur S2B) ved hjælp af den ultralydsvaskfunktion, der er adgang til under fanen Aspirat. - Juster affyrings amplituden (enhedløs) for hver dispenser og prøve for at opnå en strøm af diskrete dråber af ensartet størrelse.
- Visuelt bekræfte tilsvarende dråbe produktion af de to dispensere.
- Tryk på knappen Optag i den øverste kameraskærm for at optage en video af Tip 1-affyring. Afspil videoen med Tip 1-affyring i højre skærm, samtidig med at Tip 2 affyres i den øverste kameraskærm (Figur S1).
BEMÆRK: Videoer af hver tip fyring er optaget og gemt.
- Tryk på knappen Optag i den øverste kameraskærm for at optage en video af Tip 1-affyring. Afspil videoen med Tip 1-affyring i højre skærm, samtidig med at Tip 2 affyres i den øverste kameraskærm (Figur S1).
- Dispensere er nu klar til at teste-brand på et gitter.
BEMÆRK: Denne protokol forudsætter, at korrekt justering af gitter- og pipettestadierne på deres respektive dykpositioner er blevet verificeret. Hvis den korrekte justering ikke bekræftes, kan det resultere i en kollision, hvilket beskadiger spidserne eller robotterne.
- Send hvert tip til inspektionskameraet under fanen Undersøg, og match mønsteret for dråbeproduktion fra de to dispensere (figur S1).
- Test-brand vand på et gitter.
- Sørg for, at robotter er på SafePosition.
- Fjern pincet fra holderen på gitterrobotten ved hjælp af den medfølgende Allen-nøgle.
- På en nærliggende bordplade skal du placere et testgitter, nanowire side op, på kanten af gitterblokken. Tag forsigtigt gitterets kant, placer korrekt i pincet(figur S3), og sæt pincet igen.
- Klik på Tip til kamera under fanen Cryo for at flytte tipene ind i synsfeltet for det øverste dykkurvskamera (øverste kamera). Sørg for, at Live er valgt i den øverste kameraskærm, og at det øverste kameralys er tændt (ring foran maskinskabet (Figur 1).
- Monter pincet på gitterrobotten. Placering Tip 1, synlig på den øverste kameraskærm, ved at klikke med musen i skærmen.
BEMÆRK: Kun Tip 1 vil være synligt og flyttes til klikplaceringen. - Klik på Gitter til kamera for at placere gitteret foran det øverste kamera. Juster Tip 1 position som før, hvis det er nødvendigt.
- Vælg enten Tip1, Tip2eller Tip1 og Tip2 for at vælge enten en eller begge dispensere til test-brand.
BEMÆRK: Når du tester spidserne individuelt, skal du bruge musen til at placere Tip 1 i den øverste kameraskærm på forskellige laterale steder på nettet. Dette vil deponere flydende striber fra de to spidser i et ikke-overlappende mønster og giver brugeren mulighed for at bekræfte, at hvert tip har fyret. - Kontroller, at Vitrify Grid ikke er markeret under fanen Cryo, og klik på Kømålog derefter på Dyk.
BEMÆRK: Pipettestadiet vil stige en smule, efterfulgt af gitterstadiet. Gitterrobotten kaster derefter gitteret forbi fyringsdispenserne og øvre og nedre kameraer og kommer til at hvile lige over dækket. Der vises et billedebillede fra det øverste kamera over et billedebillede fra det nederste kamera i venstre side af brugergrænsefladen. - Vurder de øverste og nederste billeder: Skød hvert tip, når det blev valgt? Når fyret sammen, har væsken fra de to spidser overlapper fuldt ud, hvilket skaber en mærkbart tykkere stribe, end når fyret individuelt?
- Hvis en af spidsen ikke kunne affyres, skal du udføre en eller flere ultralydsvaskcyklusser, indtil der observeres klar fyring.
- Hvis prøvestriberne ikke overlapper hinanden helt, justeres den laterale justering af en af dispenserne ved hjælp af en Allen-nøgle for at dreje den laterale justeringsskrue på en af dispenserne en fjerdedel og udføre et prøvedyk. Gentag indtil striberne overlapper fuldt ud.
BEMÆRK: Hvis begge tip affyres med succes og som forventet, er systemet klar til at forberede prøvegitre.
2. Forbered to-prøve, blandede gitre
- Opdater accelerations-, decelerations- og hastighedsværdierne i XML-filen computerparametre for at opnå den blandede tid af interesse.
BEMÆRK: Tabeller, der korrelerer disse værdier til blandingstider, er tidligere blevet rapporteret15. - Gør prøven og gitrene klar.
BEMÆRK: Fra dette tidspunkt i protokollen vil der gå 20-30 min, før det første gitter er forberedt, og prøverne skal opbevares ved en passende temperatur i dette tidsinterval.- Fortynd to prøver (dvs. protein og ligand eller anden interagerende partner) til de ønskede koncentrationer med en passende buffer, ideelt set det samme for begge.
BEMÆRK: Spotiton gitre kræver 1,5-2 gange højere koncentrationer af protein end typisk anvendes til automatiske dyk frysere. Dette kan skyldes den minimale tid proteinet tilbringer i et tyndt vandigt lag på gitteroverfladen under et dyk, hvilket giver partikler mindre mulighed for at koncentrere sig på luft-vand interface. - Fyld cryogenskålen med flydende nitrogen.
- Plasma rengør 3-4 nanowire-gitre. Brug 5 W, brint og ilt, 1,5 min som udgangspunkt.
BEMÆRK: Den mest effektive plasmarensningsvarighed og opskrift kan ændre sig fra dag til dag baseret på omgivelsestemperatur og fugtighed og det parti nanowire-net, der anvendes. Alternative gasblandinger eller en glødeudladningsleder kan også være effektiv, men er ikke blevet testet til dette formål. Da vand og protein i bufferopløsning ofte er onde ved forskellige hastigheder af nanowires, er det bedst praksis at vurdere wicking af de gitre, der skal anvendes den dag på et spring, hvor den faktiske prøve udleveres.
- Fortynd to prøver (dvs. protein og ligand eller anden interagerende partner) til de ønskede koncentrationer med en passende buffer, ideelt set det samme for begge.
- Indstil luftfugtigheden i systemet.
BEMÆRK: Ud over de betingelser, der bruges til både at fremstille og plasmarense gitrene, er fugtighed en anden primær faktor, der påvirker nanowiregitternes svedtransporterende hastighed. Selvom målprocentens fugtighed for en bestemt session bestemmes empirisk for hver dag og batch af gitre, er 90-95% et godt udgangspunkt.- Sørg for, at forstøveren er fyldt tilstrækkeligt med ultrapurt vand. Sæt forstøveren i, og hold øje med dampen, ud af den centrale port på forstøverhætten.
- Overhold skærmen med levende luftfugtighed i hovedvinduet, eller åbn sporingen af omgivende luftfugtighed under Rapporter | Ambient (figur S4). Kontroller luftfugtigheden i de to zoner: Afdeling og Ligklæde.
BEMÆRK: Kammeret omfatter alle områder i Spotiton-kabinettet. Ligklæde er det område, der umiddelbart omfatter "på kamera" positioner af nettet og dispenser tips. Det sorte harpiksklæde opretholder det indstillede fugtighedsniveau, når kabinetdørene åbnes for at indlæse et gitter. - Når værdierne for målfugtens er nået, skal du vedligeholde disse værdier enten automatisk eller manuelt under fanen Fugtighed. Vælg Automatisk kontrolelement, og vælg et setpoint og en tærskel for at bevare setpointet inden for den valgte tærskelgrænse. Du kan også vælge Manuel styringog justere fugtighedsniveauet ved hjælp af de to blæserkontroller: kammerventilator og ligklædeventilator.
BEMÆRK: Hvis du tænder for kammerventilatoren, trækker du dampen gennem et filter i venstre port og forhindrer større vanddråber i at komme ind i kammeret, hvilket forhindrer yderligere stigning i luftfugtigheden. Så længe kammerdørene forbliver lukkede, vil fugtighedsniveauet stabilisere sig med den ønskede procentdel. Ved at tænde ligklædeventilatoren trækker dampen gennem den rigtige port ind i ligklædet. Dette reducerer både damp frigivelse i kammeret og øger luftfugtigheden i ligklædet.
- Læg prøven i dispenserne.
- Der tilsættes 5 μL af hver prøve i prøvekopperne.
BEMÆRK: For at undgå at indføre bobler skal du dispensere lydstyrken meget omhyggeligt på koppens indvendige sidevæg og derefter ryste ned for at tvinge prøven til bunden af koppen. - Læg prøvekopperne i holdebakken, prøven til Tip 1 til venstre, for Tip 2 til højre. Skub bakken tilbage i maskinen, indtil den sidder.
- Vælg 3 μL under fanen Aspirat for det volumen, der skal aspireres af hvert tip. Sørg for, at prøvebakken sidder sikkert, og klik derefter på Aspirate, og hold øje med, hvordan pipettestadiet flytter dispenserhovederne ind i prøvekopperne.
- Kontroller, at begge prøver er vellykket, ved at udtage prøvekopperne og observere et fald i væskeniveauet.
- Send hvert tip til inspektionskameraet under fanen Undersøg for at bekræfte uhindret dispensering. Juster amplituden efter behov for at matche dråbedannelsen fra hvert tip (se afsnit 1.2).
BEMÆRK: Amplituden skal sandsynligvis øges for den spids, der dispenserer proteinprøven. - Systemet er nu klar til at forberede et prøvegitter.
- Der tilsættes 5 μL af hver prøve i prøvekopperne.
- Frys prøvegitre
- Læg et frisk plasmarenset gitter i pincet, men monter ikke pincet endnu. Sørg for, at luftfugtigheden er forhøjet, ~90-95%. Fyld ethanbægeret.
- Udfør en sidste test-brand af begge tips foran inspektionskameraet, hvilket bekræfter ingen hindring. Klik på Tip til kameraunder fanen Cryo .
- Fyld ethan kop. Hvis ethanis dannes, smelte efter behov med yderligere ethangas.
BEMÆRK: Trin 2.5.4 og 2.5.5 bør afsluttes relativt hurtigt (<20 s) for at minimere (i) mætning af nanotråde i kammerets høje luftfugtighed og (ii) sandsynligheden for, at spidsen fyring proteinprøven vil tilstoppe. - Monter pincet med gitteret på gitterstadiet. Klik på Gitter for at kameraunder fanen Cryo . Sørg for, at Tip 1 er placeret korrekt i den øverste kameraskærm (se trin 1.3.4-1.3.5).
- Klik på Vitrify Grid, Kø Target, derefter Springe . Klik på OK, når du bliver bedt om at befale gitterrobotten at hoppe gitteret fra ethan til flydende nitrogen og frigive det på den nedsænkede hylde.
BEMÆRK: Pincet stiger derefter tilbage i kammeret. Efter humle til flydende nitrogen vises en prompt, der spørger, om gitteret faldt fra pincet. Hvis det ikke faldt, skal du klikke på Nej, og pincet åbnes og lukkes flere gange for at løsne gitteret. - Undersøg billeder af gitteret (figur S5) for at afgøre, om det skal opbevares eller kasseres.
- Hvis du beholder gitteret, skal du overføre det til den forkølede gitterkasse. Alternativt kan du spotte efterfølgende gitre og derefter overføre alle gitre på én gang til gitterboksen, idet du sørger for, at hvert gitter kan identificeres ved dets position i hvileområdet.
- For at overføre gitteret til en gitterkasse skal du forkøle fintspidsede sammenkrøpper, forsigtigt gribe gitteret ved kanten og placere det i en gitterboksplads, startende med den første plads tilbage af hakket, der går med uret.
- Når alle gitre er indlæst, fastgør gitterkasselåget til lågværktøjet og forkøles i flydende nitrogen. Skru låget på gitterkassen, og stram med et lågværktøj eller en forkølet skruetrækker.
- Brug store sammenkrumper til hurtigt at overføre den lukkede gitterkasse til en lille dewar til billedbehandling eller langtidsopbevaring.
- Evaluer gitterets egnethed til downstream EM-billedbehandling.
- Vær opmærksom på billederne fra de øvre og nedre dykstier, der vises i venstre side af brugergrænsefladen umiddelbart efter, at et gitter er kastet. Brug disse billeder til at evaluere wicking hastighed, vellykket affyring af begge tips, og omfanget af overlapning af de to prøver striber.
- Gennemgå og sammenlign gitterbillederne fra de øvre og nedre kameraer sammen med maskinens indstillinger og fugtighedsmålinger på tidspunktet for springet ved hjælp af eksperimentfremviseren: Rapporter | Eksperiment.
- Vælg gitre til billeddannelse i elektronmikroskopet, der viser tegn på god wicking.
Representative Results
Figur 4 viser billeder af gitre fremstillet under en enkelt tid løst Spotiton session ved at blande RNA polymerase og en 105 bp DNA oligomer transporterer en promotor sekvens for 150 ms før vitrification15. Set i figuren er billeder taget af de to højhastighedskameraer af seks gitre på to timepoints efter prøve ansøgning. Disse kameraer, unikke blandt fryser i dyk-stil, giver brugeren mulighed for straks at beslutte, om at holde eller kassere et gitter baseret på det observerede omfang af wicking af nanowires og sandsynligheden for, at de flydende prøver blev trukket ind i et vandigt lag tyndt nok til EM-billeddannelse. Selv om et enkelt gitter kan give tilstrækkelig is til et komplet datasæt, når optimale betingelser er opnået, er flere gitre parate til at holde ved hånden, hvis et eller flere går tabt eller forurenes. Af de seks gitre, der er forberedt i denne session, viser billedoptagelserne kun ét med suboptimal wicking (Figur 4F).
De viste gitre blev forberedt (trin 2.5.1 til 2.5.8) i træk over en periode på 40 min efter en time for at klargøre prøverne og maskinen som beskrevet i protokollen (trin 1.1.1 til 2.4.6). Af de seks gitre blev to brugt til dataindsamling, og resten blev gemt til senere analyse, hvis det var nødvendigt. Ismønsteret på et vitrified gitter (Figur 5C) svarer nøje til mønsteret af deponeret væske, der ses i det øverste kamerabillede (Figur 5B). Effektiv wicking af de blandede prøver, der fremgår af manglen på en synlig væskestribe i det nederste kamerabillede (Figur 5A), forekommer langs de nanowire-dækkede gitterstænger, og prøven strømmer sjældent over i firkanter, der støder op til dem, hvor den landede. Inden for isfyldte firkanter er isen typisk tykkest i huller i midten af pladsen og bliver tyndere i huller tættere på gitterstængerne (Figur 5E). Ofte er huller umiddelbart ved siden af gitterstængerne tomme på grund af nærhed til nanotrådene (Figur 5F).
Figur 1: Det tidsfor løste Spotiton-system. 1. Operatørens arbejdsstation; 2. Miljøkammer; 3. Kvælstofforsyning; 4. Ethane forsyning 5. Baggrundsbelysningskontrol til kamera med øverste dykkurve 6. Piezoelektriske dispensere; 7. Sprøjtepumper; 8. Vakuumpumpe; 9. Vask vandforsyning og affaldsflasker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Spotiton software brugergrænseflade. (A) Skrivebordsikon og velkomstbillede. (B) Hovedbrugergrænsefladen består af seks områder: 1. visningsområde for øvre dykbane ("øvre") og tipinspektionskameraer; 2. visningsområde til lavere dykbane ("lavere") kamera 3. Afspilningsområde for tipinspektionsvideoer 4. Multifunktionsfaneområde 5. Overvågning af levende fugtighed 6. Live system logfile. Forkortelse: UI = brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Indvendig visning af Spotiton-kammer (robotter i SafePosition). 1. Gitterrobot (rød); 2. Dispenserrobot (gul); 3. Øvre dyk sti kamera (pink); 4. Lavere dyk sti kamera (lyseblå); 5. Tip inspektion kamera (orange); 6. Fugtighed ligklæde (grøn); 7) prøvebakke 8. Forstøver samling (mørkeblå); 9. System reservoir og vandledninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative systemkamerabilleder fra en tid løst Spotiton-gitterfremstillingssession. (A -F) Øvre (venstre) og nederste (højre) dyk sti kamera billeder af seks gitre, hvorpå RNA polymerase og en promotor DNA-sekvens blev anvendt ved hjælp af Spotiton. Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Mønster af isaflejring på et spotiton-forberedt gitter. Dele af de (A) nederste og(B)øvre kamerabilleder og(C)atlas over gitteret vist i figur 4F. Omtrentlige placeringer af is som følge af prøveaflejring og blanding er farvet lavendel. Områder på pladsen markeret med en gul pilespids er afbildet i (E-G). Det område, der vises i (E), er bokset med gult i (D). Repræsentativ firkant(E), hul (F) og (G) eksponeringsbilleder indsamlet fra gitteret vist i (A-D). De indrammede områder i firkantede og hul billeder svarer til hul og eksponering billeder, henholdsvis. Skalastænger = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Inspektion af tip fyring. En live view af Tip 2 fyring ses i den øverste kameraskærm til venstre for brugergrænsefladen, mens en optagelse lavet tidligere af Tip 1 fyring spiller på en løkke til sammenligning i videoafspilning område til højre. Klik her downloade denne fil.
Figur S2: Ultralydsrensning af dispenserspidser. En luftboble i (A)spidsen vil forstyrre dråbedannelsen og forhindre tipaffyring. (B) Tips nedsænket i vand på ultralydsrensningsstationen for at fjerne en luftboble eller klart tørret protein, der blokerer spidsens åbning. Klik her downloade denne fil.
Figur S3: Lastning gitter i pincet. (A) Et gitter placeret nanowire side op på kanten af gitteret blok. (B) Et gitter placeret korrekt i den selvlukkende pincet. Klik her downloade denne fil.
Figur S4: Fugtighedstracker. Den procent relative luftfugtighed i kammeret (mørkeblå) og ligklæde (lyseblå) som registreret under en typisk gitter-making session. Tiderne for gitterdyk (grønne firkanter) er afbildet på grafen. Klik her downloade denne fil.
Figur S5: Wicking på nanowire gitre under et dyk. Repræsentativ øvre (A, C, E) og lavere (B, D, F) dyk sti kamera billeder af wicking på nanowire gitre, der er for langsom (A, B), ideel (C, D), og for hurtigt (E, F). En let fortykkelse (hvide pilespidser) angiver gitterstænger med nanotråde, der er mættet ved prøve. Firkanter i disse områder indeholder typisk is af passende tykkelse til elektronmikroskopisk billeddannelse. Skalalinje = 500 μm. Klik her downloade denne fil.
Discussion
Denne protokol skitserer brugen af Spotiton robotsystem til at forberede gitre til cryo-EM billeddannelse, der bærer to prøver, generelt et protein af interesse og en aktiverende ligand, der er blevet blandet for 90-500 ms. Selvom arbejdsprocessen er ligetil, er der et par overvejelser, som brugeren skal huske på for at sikre en produktiv gittersession. For det første er det ikke ualmindeligt, at en af de piezoelektriske dispenserspidser bliver tilstoppede eller blokerede, der forhindrer den i at skyde. En sådan fejl vil resultere i en flydende stribe, set på billedoptagelser fra det øvre eller nedre kamera, hvilket er synligt smallere end det, der ses efter begge spidser fyret. En blokering kan skyldes en luftboble logi i spidsen, forstyrre dråbedannelse, eller fra proteinprøve, der er tørret ud og forseglet den smalle spids åbning. Selvom den indsugningsprøve går tabt i processen, kan begge problemer løses ved en ultralydsvask af spidserne og re-aspiration af prøven. For at forhindre efterfølgende tilstopning og prøveaffald er det afgørende at prime væskelinjerne grundigt før prøvehygge og at opretholde et højt og ensartet fugtighedsniveau i kammeret og ligklædet. Derudover kan en proteinprøve med en særlig høj koncentration påvirke tipfyring på trods af velholdt fugtighed. Selvom en forøgelse af affyrings amplituden under fanen Undersøg delvist kan kompensere for svag fyring på grund af høj proteinkoncentration, vil fortynding af prøven mindst 1:2 forbedre tipaffyring og undgå tilstopning.
For det andet kan det være svært at opnå den ideelle wicking hastighed, der er nødvendig for at generere is af optimal tykkelse for den målrettede blanding varighed. Generelt vil hurtigere blandingstider kræve hurtigere wicking, langsommere blandingstider kræver langsommere wicking. For det ideelt onde gitter er en flydende stribe tydeligt synlig i det øverste kamerabillede, mens kun en meget lille fortykkelse af gitterstængerne i striben forbliver synlig i det nederste kamera. Langsom fugttransport, angivet med en mørk stribe på det nederste kamerabillede, efterlader generelt is, der er for tyk til billeddannelse. Fravær af en stribe på begge billeder indikerer hurtigtransport, der måske ikke har efterladt vand i hullerne (Figur S5). Flere faktorer såsom nanowire tæthed, plasma rengøring indstillinger og varighed, og tidspunktet for eksponering for og indstillet niveau af kammer fugtighed kan påvirke svedtransporterende hastighed. Dårlig (langsom) wicking kan være resultatet af en sparsom belægning af nanowires på nettet. Ved at fortynde og øge eksponeringstiden for nanowire-løsningen16vil tætheden og dækningen af nanotråde på gitterstængerne stige, hvilket letter hurtigere fugt. Hvis nanowiretætheden er tilstrækkelig, vil en forøgelse af watt-indstillingen eller varigheden af plasmarensning også forbedre wicking. De indstillinger, der anbefales her, er relativt lav effekt og lang varighed, men kan ændres, hvis det er nødvendigt.
Men hvis både det specifikke parti af gitre og plasmarensningsindstillinger har fungeret godt i en tidligere session, kan der opstå langsom wicking-ydeevne som følge af overdreven eksponering af nanotråde for høj luftfugtighed i kammeret, hvilket fører til mætning med fugt og reduceret væskekapacitet. Den gittermættede effekt af kammerfugtens fugtighed kan reduceres ved enten at minimere den forløbne tid mellem pincetmontering og gitter, der kaster, eller ved at reducere systemets fugtighedsniveau før et dyk. Det skal dog bemærkes, at sidstnævnte bringer den tilhørende risiko for, at spidsen lastet med proteinprøve vil tilstoppe. For at opveje denne risiko kan det øge den tilladte tid at montere pincet, der holder et nyt gitter, hvis der holdes et højt fugtighedsniveau. Endelig skal det bemærkes, at en reduceret dyktid (opnået ved at øge gitteraccelerationen og/eller den maksimale hastighed) kan resultere i gitre med tyndere is uden faktisk at ændre gitterets svedtransporterende egenskaber. Men da blandingstiden for de to prøver også vil blive reduceret, er dyktiden ikke en faktor, der typisk ændres for at løse langsom wicking. For at løse svedtransport, der er for hurtig, hvilket resulterer i is, der enten er for tynd eller fraværende i gitterhullerne, kan det modsatte af de foranstaltninger, der er skitseret ovenfor, træffes.
Spotiton frembyder visse fordele og ulemper sammenlignet med andre teknikker udviklet til subsekund tid-løste undersøgelser. Da den blandede prøvestribe kun indeholder 2-4 nL væske fra hver dispenser, er en enkelt 3 μL-aliquot af hver prøve tilstrækkelig til at forberede mange gitre- en vigtig fordel, når prøven er begrænset. Derudover observation af prøveaflejring ved hjælp af integrerede kameraer, men ikke helt unik for Spotiton17, er ikke en funktion af andre blanding enheder og gør det muligt kastet gitre, der skal underkastes en rå pass / fail evaluering, i høj grad at reducere screening tid. En væsentlig ulempe ved systemet er en minimum blandingstid på 90 ms, begrænset af de fysiske begrænsninger af de mekaniske komponenter, der sætter forhør af hurtigere biologiske reaktioner uden for rækkevidde. Til sammenligning opnås gange mindre end 10 ms rutinemæssigt på eksisterende mikrofluidiske systemer. På Spotiton-baserede, kommercielt tilgængelige kamæleon system, design og konstruktion forbedringer har reduceret den mindste dyktid til 54 ms og øge muligheden for, at tilføjelsen af en anden dispenser kunne tillade hurtigere blanding gange end Spotiton kan i øjeblikket tilbyde.
Til dato er der udført en række eksperimenter for at undersøge tidlige, kortvarige molekylære tilstande ved hjælp af Spotiton, herunder samling af 70S ribosom, calcium-udløste kropsbygningsændringer i en transmembranionkanal og indsnævring af dynamin som reaktion på GTP hydrolyse15. Siden offentliggørelsen af disse resultater, flere ændringer er blevet indarbejdet i systemet for at forbedre gennemløb, reproducerbarhed, og rapportering af Spotiton grid-making sessioner. Disse omfatter blandt andet dual-zone, automatisk fugtighedsovervågnings- og kontrolsystem, eksperimentfremviserfunktionen, side om side tipinspektionsfunktionen og flere mindre opgraderinger til brugergrænsefladen. Det opgraderede system vil bedre støtte fremtidige to-prøve blanding eksperimenter svarende til dem, der tidligere er rapporteret samt hurtige bindende assays såsom mellem en lille-molekyle terapeutisk og dens protein mål eller endda antistof-antigen kompleks dannelse. Mens nuværende og fremtidige tidsfor løste eksperimenter, der involverer to interagerende partnere, helt sikkert vil fortsætte, kan tilføjelsen af en tredje piezoelektrisk dispenser og tilhørende hardware yderligere udvide rækken af mulige eksperimenter. For eksempel kan første aflejring af et vaskemiddel efterfulgt af interesseproteinet efterfulgt af den interagerende eller aktiverende ligand fjerne enhver potentiel negativ indvirkning af udvidet eksponering for vaskemidlet, ofte nødvendigt for at forhindre fælles suboptimale billeddannelsesresultater såsom foretrukken orientering. I lyset af både det allerede offentliggjorte arbejde og potentielle fremtidige anvendelser udgør Spotiton et vigtigt redskab for cryo-EM-samfundet til at lette gennemførelsen af igangværende tidsforberedt undersøgelser.
Disclosures
B.C./C.S.P. har et kommercielt forhold til SPT Labtech, et firma, der producerer et kommercielt tilgængeligt instrument, kamæleon, der er baseret på Spotiton prototypen.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Peter A. Kahn og Terry Rohde på Engineering Arts LLC (Arizona, USA) for indledende design og efterfølgende udvikling af Spotiton-systemet. Vi takker personalet i Simons Electron Microscopy Center på New York Structural Biology Center for hjælp og teknisk support. Det arbejde, der præsenteres her blev udført på National Resource for Automated Molecular Microscopy placeret på New York Structural Biology Center, støttet af tilskud fra NIH (GM103310) og Simons Foundation (SF349247).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al.
- Wei, H., et al.
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
