Kryostrukturert belysning mikroskopisk datainnsamling fra kryogenisk bevarte celler

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan man kan avbilde biologiske kryokonserverte prøver ved hjelp av kryostrukturert belysningsmikroskopi. Vi demonstrerer metodikken ved å avbilde cytoskjelettet til U2OS-celler.

Abstract

Tredimensjonal (3D) strukturert belysningsmikroskopi (SIM) gjør det mulig å avbilde fluorescerende merkede cellulære strukturer med høyere oppløsning enn konvensjonell fluorescensmikroskopi. Denne superoppløsningsteknikken (SR) muliggjør visualisering av molekylære prosesser i hele celler og har potensial til å bli brukt sammen med elektronmikroskopi og røntgentomografi for å korrelere strukturell og funksjonell informasjon. Et SIM-mikroskop for kryogenisk bevarte prøver (cryoSIM) har nylig blitt bestilt på den korrelative kryoavbildningsstrålelinjen B24 ved den britiske synkrotronen.

Den ble designet spesielt for 3D-avbildning av biologiske prøver ved kryogeniske temperaturer på en måte som er kompatibel med etterfølgende avbildning av de samme prøvene ved røntgenmikroskopimetoder som kryomyk røntgentomografi. Denne videoartikkelen inneholder detaljerte metoder og protokoller for vellykket avbildning ved hjelp av cryoSIM. I tillegg til instruksjoner om driften av cryoSIM-mikroskopet, er det inkludert anbefalinger om valg av prøver, fluoroforer og parameterinnstillinger. Protokollen er demonstrert i U2OS celleprøver hvis mitokondrier og tubulin har blitt fluorescerende merket.

Introduction

SR-avbildningsteknikker har blitt allment tilgjengelige for biologer det siste tiåret¹. De tillater høyoppløselig avbildning av fluorescerende merkede prøver utover diffraksjonsgrensen. Det har imidlertid vært utfordrende å tilpasse SR-mikroskopimetoder for å jobbe med prøver ved kryogeniske temperaturer². Dette vil være fordelaktig for korrelativ avbildning i kombinasjon med elektron- eller røntgentomografi. Nylig har SIM blitt tilpasset for bruk med kryogenprøver og har vist seg å muliggjøre korrelative studier av biologiske celler i forbindelse med myk røntgentomografi (SXT)³ ved den korrelative kryoavbildningsstrålelinjen B24 ved Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan doble oppløsningen til konvensjonell bredfeltmikroskopi ved å belyse prøven med stripete lysmønstre (Moiré-frynser) i tre vinkler og i fem faser. Interferensen mellom disse lysmønstrene og prøvefluorescensen kan brukes til å avdekke ekstra informasjon om underdiffraksjonsstrukturer^4,5.

Det er flere fordeler med SIM i forhold til andre SR-teknikker for kryogene applikasjoner. For det første kan det fungere uten spesialdesignede blinkende fluoroforer; konvensjonelle fluoroforer kan brukes, noe som gir tilgang til et bredere spekter av potensielle fluorescerende merkingsmidler⁶. I tillegg krever det bare 15 bilder per z-stykke (i 3D; 9 bilder for 2D), mens andre SR-metoder tar omtrent 1000 bilder per stykke, noe som øker sjansen for at prøven blir oppvarmet og dermed øker risikoen for iskrystalldannelse, noe som kan forårsake gjenstander. Til slutt kan denne teknikken bilde tykkere biologiske prøver på over 10 μm, slik at hele celler kan avbildes i sin nesten innfødte tilstand⁶. CryoSIM er bygget ved hjelp av standard optiske komponenter og med programvare for åpen tilgang for avbildning, noe som gjør det enkelt å dokumentere og duplisere om ønskelig⁶. CryoSIM har et 100x /0,9 numerisk blenderåpningsmål (se materialtabellen); ytterligere informasjon om dens optiske komponenter, designparametere og ytelse har blitt beskrevet av Phillips et al.⁶ Her demonstrerer denne protokollen hvordan du bruker cryoSIM-mikroskopet, inkludert hvordan du laster inn og fjerner prøver på det kryogene stadiet, hvordan du samler inn data på mikroskopet, og hvordan du rekonstruerer SIM-bildene.

Protocol

MERK: Denne protokollen gjelder prøver som inneholder celler som er dyrket eller avsatt på transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 3 mm flate gullgitter med en hullete karbonstøttefilm som har blitt vitrifisert ved dypfrysing eller høytrykksfrysing. Denne protokollen forutsetter at prøver allerede er avbildet ved hjelp av en konvensjonell epifluorescens og brightfield mikroskop for å kartlegge steder av interesse for avbildning i cryoSIM. Se figur 1 hvis du vil ha en oversikt over hele protokollen.

1. Forberedelse av kryo-scenen

1. Forbered isfritt flytende nitrogen (LN₂) ved å sende LN₂ gjennom en trakt foret med standard vitenskapelige tørrpapirservietter.
   MERK: Ettersom LN₂ forårsaker brannskader, bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert kryobeskyttende hansker og vernebriller, når du håndterer det. Slike væsker kan fortrenge oksygen og forårsake rask kvelning og bør håndteres i et riktig ventilert område.
2. Fjern overflatestøv fra kryo-scenen med trykkluft. Fjern væske fra den trykksatte luftbeholderen før du bruker den.
3. Kontroller at prøvelastingspatronen er på plass med riktig kammer sampleholder (kontroller at det ikke er noe rutenett igjen i prøveholderen fra et tidligere eksperiment) (Figur 2).
4. Fjern lokket fra den ytre dewar av kryo-scenen, og hell filtrert LN₂ til ca. 1/4^th full. Vent til den første kokingen avtar før du heller mer; fyll fartøyet til ca 2/3^rd full. Sett lokket forsiktig på plass, pek munnstykket bort fra håndtereren og scenen/optikken mens LN₂ koker ut av stikkontakten.
5. Når LN₂ har sluttet å komme ut av utløpet, plasserer du utløpsrøret over scenedewaren på kryo-scenen.
6. Koble til strømkilden på scenen, og koble USB-kabelen til kryotrinnet. Kontroller at det oppvarmede prøvekammerlokket er koblet til. Koble den eksterne dewaren til scenen.
   MERK: Ikke koble til den ytre dewaren før utløpsrøret er plassert over scenedewaren på kryotrinnet. Hvis LN₂ flyter over (eller for å forhindre at den flyter over), trekker du ut USB-kabelen i ca. 10 s, lar den likevekte og kobler til USB-kabelen på nytt for å aktivere sensoren på nytt.
7. Etter at LN₂ er levert inn i scenedewaren, trykker du på utløserknappen på kryotrinnet slik at LN₂ kan komme inn i prøvekammeret.
   MERK: Ikke la systemet stå uten tilsyn mens LN₂ fyller kammeret.
8. Vent i ~ 30-45 min for å la systemet avkjøles og stabilisere seg før du begynner å kjøpe bilder. Kontroller med jevne mellomrom den eksterne dewaren, og fyll på med filtrert LN₂ hvis den er mindre enn en fjerdedel full (omtrent hver time).

2. Overføring av prøvelagringsboksen til kryo-scenen

MERK: Senk prøveoppbevaringsboksen, holderen og spissene på eventuelle instrumenter (f.eks. tang) inne i filtrert LN₂ for å avkjøle dem før du berører kalde overflater som prøven eller gjenstander inne i prøvekammeret. Bruk laboratoriebelegg og hansker ved håndtering av biologiske prøver.

1. Sørg for at vitrifiserte prøver er i en kryokompatibel beholder, og ta dem med til mikroskopet. Trykk på den tilsvarende knappen på kryotrinnet for å slå på lyset i prøvekammeret.
2. Bruk sekskantnøkkelen på kassettverktøyet til å åpne de to platene på prøveoverføringskassettet. Åpne platene bredt nok til å falle i gitteret mellom de to platene, men unngå å åpne til maksimal åpen posisjon for å forhindre at gitteret faller gjennom den andre siden.
3. Bruk lange tang til å løfte prøvegitterboksen ut av LN₂, vri den der hakket stemmer overens med plasseringen av lagringsposisjonen inne i scenen, og plasser den på scenen. Bruk riktig enhet (f.eks. en skrutrekker) for å åpne lokket på oppbevaringsboksen til riktig prøveposisjon.
4. Bruk inverterte tang (eller fine-tip kirurgiske tang), fjern TEM-rutenettet fra prøveholderen, senk det inne i LN₂, og slipp det på plass i prøveoverføringskassett, og hold det nær LN₂ under overføringsprosessen. Sørg for at karbonfilmsiden er plassert slik at den til slutt vender mot målet på prøvebroen.
5. Lukk prøvepatronen ved hjelp av sekskantnøkkelen på kassettverktøyet. Lukk og fjern oppbevaringsboksen sammen med eventuelle gjenværende prøver.
6. Bruk magnetpunktet på kassettverktøyet til å løfte og montere patronen som inneholder rutenettet på prøvebroen. Hold den nedsenket/nær LN₂ under overføringsprosessen. Forsikre deg om at orienteringen passer for broen (de to magnetene vil komme i kontakt med magnetene på broen). Plasser kassetten flatt innenfor broens plasseringspinner, og skyv forsiktig for å sikre at den er festet.
   MERK: En prøvekassett for avkuttede gitter som er klargjort for etterfølgende fokusert ionstrålefresing er også tilgjengelig på CryoSIM-anlegget ved bjelkelinje B24.

3. Scenedokking og fokusering

1. Flytt kryotrinnlokkåpningen til bildeposisjon, og slå av prøvekammerlyset. Skyv scenen mot optikken for å justere den under objektivlinsen. Slipp forsiktig målet på plass ved hjelp av spaken, og sørg for at den hviler i lokket på kryo-scenen, men berører den ikke.
   MERK: Sørg for at det eksterne Dewars utløpsrør ikke berører sceneforvarselet på kryo-scenen når som helst under datainnsamlingen.
2. Dekk scenen og optikken med en ugjennomsiktig svart gardin. Start kontrollprogramvaren Cockpit på cryoSIM PC (Figur 3 og Figur 4).
3. Klikk på lesemodusknappen for hvert kamera, og sett den til CONV 3 MHz. Kontroller at temperaturen på hvert kamera er -80 °C, og at kameraviften er slått av.
4. Slå på det reflekterte kameraet. Under Lysvelger du omgivelsestemperatur (eksponering 20 ms), og under linkamklikker du kondensator. Klikk på Videomodus-knappen.
5. Zoom ut (muserulling) i mosaikkvisningsvinduet for å se rutenettomrisset. Klikk på Finn scenen hvis den ikke kan sees. Midtstill rutenettet ved å dobbeltklikke midt i sirkelen.
6. Fokuser prøven til rutenettstøttefilmen (eller en annen relevant eksempelfunksjon) er i fokus, bruk opp- og nedtastene til å flytte kryotrinnet opp og ned, og bruk 9- og 3-tastene på det numeriske tastaturet til å endre z-trinnet (sett det til 20 μm for første fokusering).
   MERK: Hvis brukeren går tom for reise i z, kan scenen flyttes manuelt opp eller ned ved hjelp av hjulet under kryo-scenen. Snu den med ett hakk om gangen, og sjekk om prøven er innenfor synsområdet. Endre retningen igjen hvis fokuset forverres.

4. Brightfield mosaikk oppkjøp

1. Når scenen er sentrert, slår du av videomodusog samler en synlig lysmosaikk (klikk på Kjør mosaikk i Mosaikk-visningen for å produsere fliser med synlige lysbilder som spiraler utover fra midten). Hvis rutenettet er bøyd, kan du prøve forskjellige posisjoner på rutenettet (dobbeltklikke i mosaikkvisning), fokusere på nytt og klikke Kjør mosaikk på nytt for å samle delvis mosaikk. Alternativt kan du slippe inn et fokusert bilde på toppen av mosaikken ( Figur3).
2. Lagre visningen ved å klikke på Lagre mosaikk. Gi det et kort filnavn som inneholder informasjon om lagringsboksen og respektive rutenettnummer (et tidsstempel legges automatisk til filnavnet).

5. Identifisering av interesseområder

1. Inspiser brightfield mosaikken sammen med tidligere fluorescens "kart" bilder for hvor celler eller biologiske egenskaper av interesse tidligere har vært plassert. Sjekk om disse områdene produserer passende fluorescens.
   1. Slå av omgivelseslyset og kondensatoren samt videomodusen hvis den er aktiv. Slå på den nødvendige eksitasjonslaseren (405, 488, 561 eller 647), og velg det tilsvarende kameraet og filteret, først ved 50 mW, i 50 ms eksponeringstid.
      MERK: Øk/reduser disse kamera- og filterinnstillingene avhengig av fluorescenssignalet.
   2. Trykk 0 for å forankre et bilde og * for å kontrastere automatisk. Du kan også justere kontrasten manuelt ved hjelp av glidebryteren nederst i bildet.
      MERK: Slå på laserpåloggingsskiltet for rommet.
   3. Når biologisk interessante celler med passende fluorescens er funnet, markerer du posisjonene deres ved hjelp av Mark-områdeknappen i Mosaikkvisning.
      MERK: Disse merkede nettstedene vises i den vedlagte listen og kan nås ved å dobbeltklikke på koordinatene. Når du går tilbake til et merket område, zoomer du inn i området før du dobbeltklikker.
   4. Fortsett å merke alle potensielle nettsteder før du starter bildeinnhentingen. Lagre mosaikken på nytt med de merkede stedene; klikk Lagre områder i fil.
      1. For å sy mosaikkbildene sammen ved hjelp av StitchM-programvaren (utviklet internt ved beamline B24), dra og slipp .txt mosaikkfilen inn i StitchM-filen med utvidelse .bat og lagre det kombinerte tiffbildet av mosaikkfliser i samme mappe. Hvis du vil lagre et bilde med de merkede områdene, drar og slipper du mosaikken.txt filen og merkene.txt fil i ikonet samtidig.
         MERK: Balanser datainnsamlingen mot prosjektets behov (f.eks. hvis korrelativ avbildning vil bli gjort, sjekk hvor mange bilder som kan tas med partneravbildningsmodaliteten, og velg riktig antall nettsteder for cryoSIM-avbildning). I tillegg, hvis den eksterne dewar krever påfylling med LN₂ , vil kryo-trinnsystemet endre posisjon, og de merkede stedene vil sannsynligvis ikke gå tilbake til de samme stedene; Vurder derfor dette når du velger antall områder som skal avbildes.

6. Strategi for datainnsamling

1. Still inn lasereksponeringstiden basert på tellingene i det dynamiske området i fluorescensbildet (nederst i kameravisningsvinduet). Velg hvilket filter som skal brukes, og optimaliser disse innstillingene for hver bølgelengde av eksitasjonslys som skal brukes, og slå på hver laser separat.
   MERK: Selv om 10 000-20 000 tellinger er optimale, er lavere tellinger akseptable hvis det er god kontrast. Ideelt sett bør du kontrollere filterinnstillingene før hver bildestakk anskaffes fordi celler i forskjellige områder av rutenettet kan ha variable fluorescensnivåer.

7. Datainnsamling

1. Klikk på begge kameraene for å slå dem på. Gå tilbake til et av de merkede områdene, og fokuser på ønsket dybde igjen. Når du er i fokus i et interesseområde, beveger du deg ut av fokus oppover (↑ -tasten) i XY-vinduet i makrofasen for å velge høyden på z-stakken som skal anskaffes, og klikker Lagre øverst. Flytt ut av fokus nedover(↓ tasten), klikk på Lagre nederst og deretter på Gå til midten, og kontroller at bildet fortsatt er i fokus.
   MERK: Prøvehøyden vises i vinduet.
2. Høyreklikk på slm (romlig lysmodulator) i Cockpit-vinduet, og kontroller at vinkelen er satt til 0,41. Velg Eksperiment med ett områdei Cockpit -vinduet.
   MERK: Ikke klikk på slm på; Cockpiten slår den automatisk på under bildeanskaffelse.
   1. Velg Strukturert belysningfra rullegardinlisten. Endre stakkhøyden slik at den er lik z-høyden + 1 μm.
      MERK: Tilsetningen av 1 μm sikrer fangst av hele prøven i z og minimerer rekonstruksjonsgjenstander.
   2. Angi eksponeringstidene (ms) for 405 nm- og 488 nm-laserne i den øvre raden (for det reflekterte kameraet) og eksponeringstidene for 561 nm- og 647 nm-laserne i den nedre raden (for det overførte kameraet).
      MERK: Verdiene for eksponeringstid må samsvare med verdiene som er bestemt tidligere og vist i hovedvinduet i Cockpit.
   3. Skriv inn et filnavn (navnekonvensjon: boks number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescens) eller BF (brightfield) avhengig av hvilken type bildebehandling som gjøres). Klikk Oppdater for å opprette en ny fil som inneholder dato og klokkeslett uten å overskrive tidligere filer. Klikk deretter på Start.
3. Kontroller kameravisningen mens data samles inn. Ta bildene på nytt hvis det er noen xy forskyvning. Hvis LN₂ dewar fyller på kryo-scenen under bildeinnhenting, avbryter du prosessen ved å klikke på Avbryt-knappen i Cockpit-programvaren.
   1. Når den eksterne dewar er ferdig med å fylle på trinndewaren, gjentar du eksperimentet fordi påfyllingen fortrenger prøven vertikalt. Fokuser bildet på nytt for å midtstille det på nytt i z, og gjenta enkeltområdeeksperimentet. Gjenta enkeltstedseksperimentet for alle kombinasjoner av lasere og filtre som trengs.
      MERK: Det tar ca. 30 s-1 min å fullføre påfyllingen. Under avbildningen av ett rutenett vil påfylling skje ~ 4-8x.
4. Ved hver posisjon samler du en z-stabel ved hjelp av synlig lys.
   1. Slå av laserne, og slå på Omgivelseslys og kondensator. Under Eksperiment med ett områdevelger du Z-stack, setter omgivelseslyset til 20 ms eksponering og holder z-høyden som ovenfor.
5. Gjenta trinn 7.2 til 7.4 for alle områder som er merket på rutenettet.
6. Før du flytter til et annet eksempel, sletter du mosaikken ved å klikke Slett fliser.
   1. Tegn en firkant rundt alle flisene for å slette dem. Slett markørene også ved å merke dem alle i listen og deretter klikke Slett valgte områder.
7. Slå av omgivelseslyset og kondensatoren før du fortsetter å bytte rutenett. Følg trinnene i avsnitt 4 i omvendt rekkefølge for å løsne fasen fra under målsettingen og endre rutenettet.

8. Etter avbildning

1. Når avbildningen er fullført, kobler du fra fasen og fjerner alle eksemplene. Slå av prøvekammerlyset. Koble den eksterne dewaren, og dekanter eventuell gjenværende LN₂ i en annen kryokompatibel beholder, slik at dewar trygt kan gå tilbake til en normal temperatur.
2. Sett lokkpluggen på kryo-scenen. Vent til muligheten til å bake ut kryo-scenedisplayet blir tilgjengelig etter at ikke mer LN₂ forblir i scenedewaren. Trykk på bakeknappen for å gå inn i oppvarmingsmodus, og fjern eventuell fuktighet fra kryo-scenen for å unngå isdannelse.

9. Rekonstruksjon

1. Overfør RAW SIM-datafiler til riktig arbeidsstasjon for rekonstruksjon. Kjør behandling i grupper gjennom vinduet Processing Task builder ved hjelp av kanalspesifikke optiske overføringsfunksjoner (OTFS) (beregnet fra multi-fluorescerende perler punktspredningsfunksjoner) og K₀ vinkler (0,29278, -1,8028, 2,3786) med et konstant Wiener-filter for alle kanaler på 0,004 og en biasforskyvning på 200.
2. I Tilleggsalternativer-panelet må du kontrollere at negative intensiteter forkastes ved å ikke fjerne merket for andre alternativer. Lagre SIR-bildene i en mappe med navnet "behandlet".
   MERK: Kommersiell SIM-rekonstruksjonsprogramvare produserer vanligvis rekonstruerte SIM-data og beholder filnavnet, men legger til SIR.dv på slutten. Det opprettes også en loggfil som inneholder behandlingsprotokollen, trinnene og statistisk informasjon om rekonstruksjonssuksess.

10. Kromatisk skiftkorreksjon

1. Last ned programvaren Chromagnon⁷ for å korrigere for det kromatiske skiftet.
2. Bruk referansematrisen for kromatisk skift som tilsvarer fluorescensbølgelengdene til dataene som samles inn (levert av strålelinjen).
   MERK: Referansefilen er en 'chromagnon.csv' fil, som inneholder justeringsparametrene og er hentet fra kalibreringsbilder ved hjelp av multi-fluorescerende nanopartikler. Den kan brukes til å gruppebehandle flere datasett samtidig.
   1. Velg riktig referansefil som samsvarer med laserbølgelengden og filteret som brukes til å ta bilde av prøven, og legg den til i referansefeltet. Legg til de rekonstruerte SIR-dataene som skal justeres i kildefeltet, og klikk Kjør.
   2. Kontroller at fluorescenssignalet nå er justert på bildene. For satsvis behandling plasserer du alle SIR-bilder som skal justeres i kildefeltet og referansefilen i referansefeltet, og trykker Kjør alle.

Representative Results

En prøve som inneholder U2OS-celler ble farget med en blanding av grønn mikrotubul cytoskeletonfargestoff og rødt mitokondrierfargestoff, noe som resulterte i farging av mikrotubulkomponenten i cytoskjelettet (grønn) og mitokondriene (rød). Etterfølgende avbildning viste lokalisering av mitokondrier i cellen, samt arrangementet av mikrotubulene, og fremhevet det strukturelle rammeverket de gir til cellen og monteringen av cytoskjelettet rundt organeller som kjernen. Oppløsningen i cryoSIM er betydelig høyere enn i standard epifluorescensmikroskopi (figur 5). Figur 6 viser hvordan det fluorescerende "kartet" fra et konvensjonelt epifluorescensmikroskop kan brukes til å lokalisere interesseområder for avbildning og det tilsvarende kryoSIM-rekonstruerte bildet fra et sted på rutenettet.

Figur 1: Flytskjema som viser stadiene i cryoSIM-bildebehandlingsprotokollen. Forkortelse: cryoSIM = Kryostrukturert belysningsmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Kryo-scenen. (A) Kryo-sceneoppsettet. (B) Et prøverutenett vist med inverterte tang. (C) Komponenter i kryo-scenen. Tilkoblingsportene er merket, med fargene som tilsvarer oransje: strømforsyning, gul: oppvarmet scenelokk, blå: ekstern dewar, grønn: tilkobling til PC. Forkortelser: PC = personlig datamaskin; LN₂ = flytende nitrogen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Visninger av paneler for cockpitprogramvare. (A) Hovedpanel, (B) makrotrinn XY, (C) mosaikkvisning, (D) kameravisninger. Forkortelse: SLM = romlig lysmodulator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Visninger av Cockpit-programvarepanelene. (A) Z stable enkeltområdeeksperiment. (B) SI enkelt nettsted eksperiment. (C) Hurtigtaster for cockpitprogramvaren som brukes under bildeanskaffelse. (D) CryoSIM-mikroskopet er på stedet ved strålelinje B24 ved diamantlyskildesynkrotronen. Forkortelse: cryoSIM = Kryostrukturert belysningsmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Oppløsning av kryoSIM. (A) Mosaikkvisning av et rutenett under undersøkelse. (B) Brightfield-bilde av et interesseområde (AOI). (C) Pseudo-widefield-bilde sammenlignet med DET (D) SIM-bildet som viser økningen i oppløsningen. Den hvite pilen angir SIM-rekonstruksjonsartefakter. (E) Modulasjonskontrastkart som kombinerer pikselintensitetsinformasjonen for det rekonstruerte bildet med fargeinformasjonen for de respektive MCNR-verdiene (contrast-to-noise ratio) for de rå dataene som genereres av SIMCheck². De lyse og mørke områdene viser henholdsvis høy og lav kontrast. Skalastang = 10 μm. KryoSIM-bildebehandlingsinnstillinger: eksitasjons-/utslippsbølgelengder: 488/525 nm, 50 mW lasereffekt, 50 ms eksponeringstid og 647/655 nm, 20 mW lasereffekt, 5 ms eksponeringstid. Forkortelse: cryoSIM = Kryostrukturert belysningsmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Bilderekonstruksjon i cryoSIM fra et sted på rutenettet i et fluorescenskart fra et konvensjonelt epifluorescenskart. (A,B) Overlegg av lysfelt- og fluorescensbildekart generert med et konvensjonelt epifluorescensmikroskop. Dette kartet brukes til å finne områder av interesse for senere bilde i cryoSIM. (C) Det rekonstruerte cryoSIM-bildet som er oppnådd på stedet som vises i (B). Forkortelse: cryoSIM = Kryostrukturert belysningsmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

3D SIM ved kryogeniske temperaturer har mange fordeler i forhold til andre SR-avbildningsteknikker for avbildning av vitrifisert biologisk materiale. Det krever betydelig færre bilder per z-skive sammenlignet med andre SR-metoder, noe som resulterer i mindre bestråling og lavere sjanse for iskrystalldannelse for vitrifiserte prøver. Det er også i stand til å avbilde hele celler og kan korreleres med røntgentomografi for å matche struktur med funksjon. Interessant nok bleker de fleste kommersielt tilgjengelige fluoroforer og fluorescenskoder mindre under kryogene forhold enn ved romtemperatur. Men gitt det høye kvanteutbyttet av de vanligste fluoroforene ved romtemperatur (mer enn 80% i noen tilfeller), skyldes den absolutte gevinsten som oppdages i fotoner ikke endringer i kvanteutbyttet, men på grunn av en reduksjon i de komplekse blekingsprosessene. Mer informasjon om utbyttet av fluoroforer ved kryogeniske temperaturer finnes i ⁸.

Det er viktig at prøver som ankommer cryoSIM, er forhåndstilordnes ved hjelp av et konvensjonelt kryofluorescensmikroskop med brightfield-evne til å produsere et rutenett "kart" som inkluderer utheving av alle potensielle AOIer for videre avbildning (figur 5). Tilgangstid på cryoSIM tildeles via en konkurransedyktig prosess som innebærer innlevering av et forslag, som senere evalueres for teknikk gjennomførbarhet og biomedisinsk innvirkning. Tid på utstyret er derfor alltid "på en premie", og forhåndstilordnede rutenett tillater mest effektiv bruk av en tildeling. Det er også viktig at prøven holdes vitrified, spesielt under prøveoverføring fra prøveholderen til bildeplattformen, for å minimere dannelsen av iskrystaller og påfølgende prøveskader. Prøven bør være av god kvalitet for å produsere de beste SIM-bildene. En godt forberedt prøve vil bli preget av følgende egenskaper: (a) den vil ikke ha iskrystallforurensning, (b) rutenettet som brukes vil være et finnergitter, (c) bæreren vil være flat, (d) rutenettet og substratoverflaten vil ikke være auto-fluorescerende, og (e) det vil ikke være noen brudd i støttemembranen. Disse forutsetningene kan oppnås ved nøye prøvehåndtering og sikre at prøvene alltid forblir vitrifisert.

Det er viktig å sjekke på forhånd om foreslåtte prøvefluoreforer vil gi nok signal i cryoSIM-mikroskopet. Verktøy som SPEKCheck⁹ kan hjelpe deg med å velge optimal fluorofor og filterkombinasjoner. Hvis det er problemer med rå datainnsamlingen eller rekonstruksjonsprosessen, kan gjenstander vises i bildene etter rekonstruksjon. Eksempler på ulike gjenstander er dokumentert av Demmerle et al.¹⁰ Bilderekonstruksjonsparametrene kan gjennomgås i SoftWoRx-loggfilen hvis rekonstruksjonen ikke er optimal ved å åpne sammendragsfilen for rekonstruksjon. Det bør være konsekvent linjeavstand på tvers av vinkler i en gitt kanal og relativt konsistent amplitude. Variasjon av mer enn 30% og verdier betydelig over 1 (hvis perlestørrelse kompensasjon brukes) bør undersøkes nærmere og vil sannsynligvis indikere mislykkede rekonstruksjoner. I tillegg kan SIMcheck^{2-programvaren} i Fiji også brukes til å utføre ulike kontroller av rå og rekonstruerte data for å diagnostisere årsaken til feil i innstillingene for bildebehandling eller rekonstruksjonsparameter. SIM-kontroll og dets modulasjonskontrastkart kan også hjelpe til med å vurdere kvaliteten på rekonstruerte data ved å tolke hvilke områder av et bilde som sannsynligvis vil være reelle strukturer kontra gjenstander.

Lav modulasjonskontrast (vist med mørk farge, i figur 5E) innenfor atomområdet betyr at denne regionen kommer til å være mer utsatt for rekonstruksjonsartefakter, noe som innebærer at hashmønstrene som vises i kjernen, kan klassifiseres (Figur 5D) som en gjenstand. Sterke fluorescenssignalområder er mer sannsynlig å nøyaktig reflektere innfødte strukturer i de bearbeidede dataene. I områder med svakt signal der fluoroforer er fordelt over bredere områder, for eksempel den totale overflaten av en vesicle, er det sannsynlig at reelt signal sameksisterer med behandling av gjenstander, og det bør tas hensyn til tolkningen av disse dataene. Etter inspeksjon av rekonstruerte data i hele spekteret for å sikre at det ikke er noen merkelige artefakter, og at bakgrunnen generelt er gaussisk og sentrert nær null, blir dataene vanligvis kuttet til null, eller den modale verdien - toppen av bakgrunnssignalet - bør være svært nær null. Dette sikrer at det dynamiske området i bildet som vises, ikke domineres av negative bakgrunnsartefakter. Når et svakere signal forventes, bør det tas ekstra hensyn til å analysere funksjonene og sikre at de er reelle strukturer i stedet for rekonstruksjonsgjenstander.

Det er noen begrensninger i bildesystemet. Fordi prøvestadiet er flatt, er ikke prøver med variabel tykkelse eller rutenett som ikke er flate, ideelle motiver for avbildning. I tillegg, hvis korrelativ avbildning vil bli gjort ved hjelp av myk røntgentomografi, bør celler nær rutenettgrenser ikke avbildes, da disse ikke vil være synlige i røntgenmikroskopet under oppkjøp av tilt-serien. Til slutt har mengden blotting av prøven før dypfrysing en betydelig innvirkning på bildekvaliteten; for lite blotting resulterer i prøver som er for tykke, noe som gir suboptimale SIM-bilder med høy bakgrunnsstøy, mens for mye blotting kan føre til at celler blir feilformet og derfor mer utsatt for varmeskader fra hendelsen laserstråle. Oppsummert er cryoSIM et kraftig fluorescensmikroskopiverktøy for avbildning av biologiske prøver i 3D i et nesten innfødt stadium og har omfattende applikasjoner på mange områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auto grids	FEI
Autogrids	Thermo Fisher Scientific	1036173
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Sigma-Aldrich	SCT142
Cockpit Software	Oxford University		https://github.com/MicronOxford/cockpit
cryo compatible polyurethane container	Jena bioscience	CC-FD-800
Cryo TEM grid storage box	Thermo Fisher Scientific	Model#AutoGrid
cryo-SIM microscope	Custom made	N/A	Custom made, see following reference for the design:  Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.
Cryostage system	Linkam Scientific Instruments	CMS196
Fine tip surgical forceps	Ted Pella	38125
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426
Python Microscope Software	Oxford University		https://www.python-microscope.org/
Scientific dry paper wipes	Kimberly-Clark 7551	2
SIM Reconstruction Software	softWoRx, GE Healthcare	Version  6.5.2
StitchM Software	Diamond Light Source		https://github.com/DiamondLightSource/StitchM
TEM grids for samples	Quantifoil Micro Tools	G200F1