Summary
نقدم بروتوكولا لبناء نظام توزيع بوغ بسيط يتكون من صندوق تلقيح بشبكة ~ 50 ميكرومتر وغرفة بلاستيكية شفافة. يمكن استخدام هذا لتلقيح النباتات بالتساوي بجراثيم البياض الدقيقي ، وبالتالي تمكين التقييم الدقيق والقابل للتكرار للأنماط الظاهرية للأمراض للنباتات قيد الدراسة.
Abstract
يتطلب الحد من خسائر المحاصيل بسبب الأمراض الفطرية فهما أفضل للآليات التي تحكم مناعة النبات والتسبب في الأمراض الفطرية ، الأمر الذي يتطلب بدوره التحديد الدقيق للأنماط الظاهرية للأمراض للنباتات عند الإصابة بممرض فطري معين. ومع ذلك ، فإن التنميط الظاهري الدقيق للأمراض مع مسببات الأمراض الفطرية الحيوية غير القابلة للزراعة مثل البياض الدقيقي ليس من السهل تحقيقه ويمكن أن يكون خطوة تحد من معدل مشروع بحثي. هنا ، قمنا بتطوير نظام تنميط ظاهري آمن وفعال وسهل التشغيل للمرض باستخدام تفاعل Arabidopsis مع البياض الدقيقي كمثال. يتكون هذا النظام بشكل أساسي من ثلاثة مكونات: (i) صندوق تلقيح خشبي مزود بغطاء قابل للإزالة مثبت بشبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو النايلون من مسام ~ 50 ميكرومتر لتلقيح شقة من النباتات ذات الجراثيم الفطرية ، (ii) غرفة بلاستيكية شفافة ذات فتحة أمامية صغيرة لتقليل هروب البوغ أثناء إجراء التلقيح بالداخل ، و (ج) طريقة إزاحة البوغ وتوزيعها من أجل التلقيح المتساوي والفعال. تتضمن البروتوكولات الموضحة هنا الخطوات والمعلمات لصنع صندوق التلقيح والغرفة البلاستيكية بتكلفة منخفضة ، وعرض فيديو لكيفية استخدام النظام لتمكين التلقيح المتساوي بجراثيم البياض الدقيقي ، وبالتالي تحسين دقة وتكرار التنميط الظاهري للمرض.
Introduction
البياض الدقيقي هو واحد من أكثر الأمراض شيوعا وأهمية للعديد من المحاصيل الغذائية ونباتات الزينة1. حظيت دراسات أمراض البياض الدقيقي بشعبية كبيرة ، كما يتضح من أكثر من 10500 منشور كنتيجة بحث مع "البياض الدقيقي" ككلمة رئيسية في Web of Science (اعتبارا من نوفمبر 2020). في الواقع ، يعتبر البياض الدقيقي (الذي يمثله Blumeria graminis) أحد أفضل 10 مسببات الأمراض الفطرية من قبل مجلة Molecular Plant Pathology2. يعد القياس الكمي للحساسية للأمراض خطوة ضرورية في توصيف الجينات النباتية التي تساهم في مقاومة الأمراض أو قابليتها للإصابة ، أو التحديد الوظيفي للجينات المستجيبة المرشحة في البياض الدقيقي. ومع ذلك ، فإن التنميط الظاهري الموثوق به للأمراض أكثر صعوبة بكثير مع البياض الدقيقي مقارنة بمعظم مسببات الأمراض الفطرية الأخرى ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنه ، على عكس جراثيم الأخير ، تظهر جراثيم أنواع البياض الدقيقي (مثل Golovinomyces cichoracearum UCSC1 بناء على تجربتنا المعملية) قابلية أقل للحياة بعد المرور بعملية تعليق مائي 3,4 . قد يؤدي التلقيح غير الكافي و / أو غير المتكافئ لنباتات الاختبار بممرض البياض الدقيقي إلى نتائج تنميط ظاهري غير دقيقة.
تم الإبلاغ عن عدد من طرق التلقيح لدراسات البياض الدقيقي. وتشمل هذه (i) تنظيف الجراثيم مباشرة من الأوراق المصابة لاختبار النباتات5 ، (ii) رش معلق بوغ لاختبار النباتات6 ، (iii) نفخ الجراثيم باستخدام برج ترسيب يعمل بالفراغ للنباتات الموجودة في أسفل البرج7 ، و (iv) تسليم البوغ عن طريق الاستخدام التوافقي لغشاء شبكة نايلون والاهتزاز القائم على الصوت8 . طريقة تنظيف الأبواغ (أو الغبار) سهلة الأداء ولكنها غير متساوية بطبيعتها ، وبالتالي قد لا تكون دقيقة للتقييم الكمي. يعد رش البوغ مريحا وحتى ، ولكن كما هو مذكور أعلاه قد يؤدي إلى ضعف إنبات البوغ4. والطريقتان الأخيرتان (أي من الثالث إلى الرابع) هما طريقتان محسنة كثيرا وقادرتان على تحقيق التلقيح المتساوي؛ ومع ذلك ، فإن كلاهما ليس مرنا في تعديل قدرة التلقيح الخاصة بهما من حيث عدد النباتات التي سيتم تلقيحها في حدث واحد ، مما يجعل أيا من الجهازين ليس تافها ، ويقتصر تشغيلهما على مناطق المختبر حيث يوجد فراغ و / أو مصدر كهرباء.
يعمل مختبرنا مع تفاعل البياض الدقيقي النباتي لأكثر من 20 عاما 9,10. على مدى العقد الماضي ، اختبرنا عددا من طرق التلقيح وطورنا مؤخرا طريقة بسيطة وفعالة لتلقيح البياض الدقيقي. يمكن أن تضمن طريقة تنظيف الأبواغ القائمة على الشبكة تلقيحا متساويا ، وهي بسيطة وقابلة للتطوير ، وبالتالي يجب اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر يعمل مع البياض الدقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صنع صندوق تلقيح قياسي بغطاء علوي قابل للإزالة مثبت بشبكة
- قم بشراء لفة من شبكة غشاء نايلون 50 ميكرومتر أو شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 48 ميكرومتر (موصى به) من المتاجر. تأكد من طلب ما يكفي للتقطيع إلى قطع متعددة بحجم 14 بوصة × 26 بوصة لاستبدال الشبكة البالية.
- قم بشراء لوح ليفي متوسط الكثافة أو خشب رقائقي 1/4 بوصة × 2 قدم × 4 قدم ، وقم بقطع قطعتين 24-1 / 2 بوصة × 10 قطع واثنتين 12 بوصة × 10 قطع لصنع صندوق تلقيح. استخدم 8 مشابك زاوية لدعم الجوانب الأربعة.
ملاحظة: إذا كانت تواجه الجانب العريض من العلبة ، فإن الجانب الأيسر 12 بوصة × 10 بوصة متصل بشكل دائم والجانب الأيمن 12 بوصة × 10 في الجانب عبارة عن باب قابل للإزالة مثبت في مكانه بواسطة أربعة مقابض مغناطيسية (الشكل 1 أ ، ب). - ضع أربعة أقواس زاوية 2 بوصة اثنين في كل زاوية داخلية من الجانب الأيسر ، بوصة واحدة من الأعلى وبوصة واحدة من الأسفل ، ضع علامة على حفرة وحفرها. استخدم البراغي لربط الجانب القصير الأيسر بشكل دائم بجانبين طويلين (أمامي وخلفي). يجب أن تكون المسافة الداخلية بين الجانبين الطويلين 12 بوصة وليس 11-1 / 2 بوصة.
- مع بقاء مشابك الزاوية في مكانها والمحاذاة الصحيحة للباب الأيمن ، قم بتمييز وحفر موقع 4 مصيد مغناطيسي لتثبيت الباب الصحيح القابل للفصل في مكانه. تثبيت مقبض زر على الباب. يمسك الجزء العلوي من الباب تحت الغطاء العلوي (الشكل 1 أ ، ب).
- لعمل غطاء علوي قابل للإزالة بشبكة ، قم بقص وتد خشبي مربع طويل إلى مجموعتين من 26 بوصة و 12-3 / 4 بوصة. قم بلصق القطع الأربع وتثبيتها بطريقة تتناسب مع الصندوق - الأبعاد الداخلية للإطار أكبر قليلا من الأبعاد الخارجية للصندوق ، حيث سيتم إرفاق شبكة الشاشة بهذا الإطار.
- قص شبكة الشاشة إلى أقل بقليل من 14 بوصة × 26 بوصة. لا تسمح للشاشة بالبروز بعد الإطار لمنع الحواف الحادة. احصل على مساعدة لتمديد الشاشة على الإطار. امسك الشبكة بالإطار بواسطة المشابك (الشكل 1C) واستخدم مسدس دباسة مع الدبابيس اليمنى لتثبيت الشاشة بالإطار.
- اقطع مجموعتين من وتد خشبي مربع أقصر (21 بوصة و 9 بوصات) ، واستخدم مسامير لشطيرة الشبكة بإحكام على طول الإطار باستخدام 4 قطع أقصر من وتد خشبي مربع (الشكل 1C ، D).
2. صنع غرفة التلقيح
- قم بشراء ألواح الأكريليك الشفافة وعناصر الأجهزة من المتاجر المناسبة. قص 7 × 20 في نافذة الفتح على لوح الأكريليك الأمامي للصندوق كما هو موضح في الشكل 2C.
- قم بتجميع الجانبين الأيسر والأيمن ، الأمامي (مع النافذة) وألواح الأكريليك الخلفية في صندوق باستخدام 8 مشابك زاوية كما هو موضح في الشكل 2 أ. تأكد من أن القياسات الداخلية للغرفة تساوي أبعاد الورقة العلوية.
ملاحظة: الجانب الأيمن موجود للدعم ولن يتم توصيله بالأوراق الأمامية أو الخلفية. إنه أقصر بمقدار 1/2 من الأوراق الأخرى عن قصد. سيصبح هذا الجانب الأيمن بابا "سحبا" "رفرفا" مثبتا في مكانه بواسطة مفصلة زاوية قائمة في الأسفل واثنين من المصيد المغناطيسي في الأعلى كما هو موضح في الشكل 2C ، D. - استخدم دعامات الزاوية لتأمين الألواح معا (الشكل 2 ب ، ج). ثبت الأقواس في مكانها ، وقم بتمييزها بعلامة شاربي ، ولكمة مركزية ثم احفر الحفرة.
ملاحظة: حفر الاكريليك يختلف عن حفر أي شيء آخر ، لا قوة أو قد يتصدع جانب الحفرة المقابلة للحفر. استخدم المسامير أو البراغي. لا تفرط في شد البراغي وإلا فقد يتشقق الأكريليك بمرور الوقت. - أدر العلبة على جانبها الخلفي وقم بإزالة مشابك الزاوية 4 وضع الورقة العلوية في مكانها. علامة والحفر.
- قم بتثبيت مفصلة الزاوية اليمنى ، مصنوعة من دعامة زاوية 3/4. استخدم صامولة قفل من النايلون كقضيب مفصلي. لا تشد ، اترك فجوة حتى يدور الباب على هذه المفصلة.
- ضع علامة ، لكمة مركزية ، حفر وإرفاق مغناطيسي الباب المغناطيسي بمسامير رأس عموم # 6-32x3 / 4. ثم قم بتوصيل لوحات الصيد بمسامير رأس مسطحة # 6-32x3 / 8 بوصة ، انظر الشكل 2C ، D.
3. تلقيح النباتات في الشقق
- تحضير جراثيم البياض الدقيقي الطازجة كلقاح (على سبيل المثال ، البياض الدقيقي Arabidopsis Golovinomyces cichoracearum UCSC1). قم بزراعة نباتات متحولة نظيفة من مادة Arabidopsis ضعيفة المناعة 4-1 11 في غرفة نمو (22 درجة مئوية ، رطوبة نسبية 65٪ لمدة 6-8 أسابيع) ، وقم بتلقيح واحد أو نصف مسطح من نباتات pad4-1 لبناء ما يكفي من جراثيم البياض الدقيقي الطازجة (الشكل 3 أ).
- قم بزراعة النباتات لتحديد الأنماط الظاهرية للعدوى في المعيار 11 بوصة × 21 بوصة × 2.5 في الشقق.
ملاحظة: نباتات أرابيدوبسيس التي تزرع تحت يوم قصير (8 ساعات ضوء ، 16 ساعة مظلمة ؛ 22 درجة مئوية) لمدة ستة إلى ثمانية أسابيع جيدة لاختبارات العدوى مع البياض الدقيقي. - عندما تتوفر جراثيم البياض الدقيقي الطازجة من النباتات المصابة في 8-10 أيام بعد التلقيح (dpi) ، انقل شقة من النباتات لاختبار العدوى إلى صندوق التلقيح داخل غرفة التلقيح (الشكل 1B ، 2C).
- قطع 15-20 ورقة أرابيدوبسيس شديدة العدوى (أو 4-6 وريدات مصابة ، اعتمادا على حجم الورقة / الوردة ومستوى التلقيح) ، اترك الأوراق تجف إذا كان هناك ماء مكثف.
- الاستيلاء على 1-2 أوراق أو وردة مع زوج من ملقط طويل باستخدام يد واحدة ووجه الأوراق رأسا على عقب. بعد ذلك ، ضع كلتا يديك من خلال فتحة الحجرة وضرب ذراع الملقط برفق بمقص أثناء تحريك الأوراق / الوردة ببطء فوق الشبكة المثبتة على صندوق التلقيح (الشكل 3 ب). كرر هذا حتى يتم استخدام جميع الأوراق أو الوريدات.
ملاحظة: سوف تزيح الجراثيم الناضجة بسهولة من كونيديوفورات الأوراق المصابة. حاول إزاحة الجراثيم على الشبكة بالتساوي قدر الإمكان. - استخدم فرشاة أو اثنتين من فرش خلاط المروحة الدقيقة لتنظيف الجراثيم برفق عبر الشبكة (الشكل 3 ج). تأكد من تنظيف سطح الشبكة بالكامل في اتجاهات مختلفة لمدة أربع مرات أو أكثر لزيادة التوزيع المتساوي للجراثيم على النباتات في قاع صندوق التلقيح (الشكل 3 د). ربت برفق على الشبكة لعدة مرات باستخدام الفرش للتخلص من الجراثيم العالقة في الشبكة.
- دع الجراثيم تستقر لمدة نصف دقيقة. بعد ذلك ، انقل الشقة التي تحتوي على النباتات الملقحة من صندوق التلقيح. قم بتغطية الشقة بقبة بلاستيكية وضعها في غرفة نمو (22 درجة مئوية ، رطوبة نسبية 65٪). يمكن إجراء التنميط الظاهري للمرض عند 5 ، أو 8 إلى 12 نقطة في البوصة 12.
4. تلقيح النباتات بصناديق تلقيح أصغر
ملاحظة: في الحالات التي يتم فيها تلقيح عدد أقل من النباتات ، لا يزال من الممكن استخدام صندوق التلقيح القياسي. تأكد من وضع النباتات في منتصف الصندوق. قم بإزاحة وفرشاة الجراثيم في منطقة الشبكة التي تغطي النباتات لضمان تلقيح جميع النباتات مع حفظ اللقاح. بدلا من ذلك ، ويفضل ، يمكن استخدام صناديق تلقيح أصغر (كما هو موضح أدناه).
- تحويل صناديق من الورق المقوى إلى صندوق تلقيح. ما عليك سوى إزالة الجانبين العلوي والسفلي للصندوق ، ولصق الزاوية لتثبيتها إذا لزم الأمر ، وتركيب شبكة بحجم مناسب 50 ميكرومتر في الأعلى عن طريق اللصق أو التدبيس (الشكل 4 أ ، ب).
- حرك الشقة التي تحتوي على النباتات داخل غرفة التلقيح ، ضع صندوق التلقيح الأصغر أعلى الشقة لتغطية النباتات.
- قم بإزاحة وفرشاة الجراثيم كما هو موضح أعلاه.
5. تلقيح الأوراق المنفصلة في أطباق بتري
ملاحظة: في الحالات التي تكون فيها (i) جراثيم البياض الدقيقي الطازجة محدودة للغاية و / أو (ii) يجب الحفاظ على نظافة النباتات بينما يجب تقييم الأنماط الظاهرية للمرض و / أو توطين البروتين تحت الخلوي في الخلايا المصابة ، يمكن استخدام الأوراق المنفصلة للعدوى في ألواح MS-agar.
- اصنع صندوق تلقيح صغير أكبر قليلا من طبق بتري.
- تحضير 1/2 قوة موراشيج وسكوج (MS) لوحات أجار متوسطة (1.5 ٪). أضف ثيابندازول (40 مجم / لتر) لتقليل تلوث العفن إذا لزم الأمر. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة حتى الاستخدام.
- قطع واحد أو اثنين من الأوراق الموسعة بالكامل من قاعدة سويقة لكل نبات على حدة ليتم اختبارها. أدخل سويقات الأوراق المنفصلة في وسط أجار بزاوية ~ 30 درجة.
ملاحظة: يمكن أن تحتوي كل لوحة على 20-40 ورقة حسب حجم الأوراق واللوحة المستخدمة (الشكل 4C). - تلقيح الأوراق داخل غرفة التلقيح كما هو موضح أعلاه. انقل اللوحة مع الغطاء إلى غرفة النمو.
- قطع جزء صغير من ورقة والتحقق من توطين تحت الخلوية للبروتينات في نقاط زمنية محددة.
- لتقييم الأنماط الظاهرية للعدوى ، انقل الأوراق إلى صفيحة MS-agar معقمة جديدة عند 4 أو 5 نقاط في البوصة. قطع قاعدة السويقة قبل إدخال الأوراق في وسط أجار طازج. تقييم الأنماط الظاهرية للمرض في 8 أو 9 نقطة في البوصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نقدم طريقة جديدة لتلقيح بوغ البياض الدقيقي سهلة التحضير والتشغيل والضبط. يوضح الشكل 1 تجميع صندوق التلقيح القياسي مع التركيز على صنع الغطاء القابل للإزالة المثبت بشبكة غشائية 50 ميكرومتر. يوضح الشكل 2 تجميع غرفة التلقيح. يوضح الشكل 3 الخطوات الرئيسية لعملية التلقيح باستخدام هذا النظام. يوضح الشكل 4 صناديق تلقيح أخرى يمكن استخدامها لتلقيح نبات مسطح بالكامل أو أقل ، أو أوراق منفصلة على وسط MS-agar. وأخيرا، يقدم الشكل 5 بيانات لتوضيح تساوي التلقيح كما يعكسه توزيع الأبواغ أو الأنماط الظاهرية لعدوى النبات.
الشكل 1. صنع صندوق تلقيح. (أ-ب) صور تظهر الصندوق مع الباب مغلق (A) أو مفتوح لإدخال شقة من نباتات Arabidopsis (B). لاحظ استخدام زوج من المقابض المغناطيسية لباب الخزانة لتثبيت الباب. (ج) صورة توضح تركيب شبكة على إطار المستطيل كخطوة حاسمة لصنع غطاء الصندوق. ملاحظة يتم استخدام المشابك وأقواس الزاوية لوضع الشبكة قبل تثبيتها بواسطة مسامير مشدودة. (دال - ه) صور توضح غطاء الصندوق القابل للإزالة مع شبكة جديدة من الفولاذ المقاوم للصدأ مثبتة (D) أو صندوق مجمع (E). لاحظ أن الشبكة مثبتة بين 3/4 بوصة وتد مربع من الخشب بطول محدد في D و E. تبرز الخطوط الصفراء قياس حجم الصندوق. يمكن أن يؤدي وجود صندوق تلقيح يناسب شقة قياسية إلى تعزيز كفاءة التنميط الظاهري بشكل كبير خاصة عندما يتم تلقيح الكثير من النباتات (على سبيل المثال ، أثناء الفحص الجيني). غطاء قابل للإزالة مثبت بشبكة يجعل تنظيف الشبكة أو استبدالها أسهل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. صنع غرفة التلقيح. (أ) صورة توضح التجميع الأولي لألواح الأكريليك الأربعة باستخدام مشابك الزاوية. (ب) صورة تعطي منظرا من أعلى لأسفل للغرفة البلاستيكية. (جيم - دال) صور تظهر نظام التلقيح المجمع بالكامل (C) ، وأحد المصيدين المغناطيسيين (العلوي) ومفصلات الزاوية اليمنى (السفلية) المثبتة على لوح أكريليك جانبي واحد كباب (D). لاحظ أن نافذة التلقيح مخصصة لإزاحة الجراثيم وتنظيفها بالفرشاة من قبل المستخدم (موضحة بخطوط مزخرفة). تبرز الخطوط الصفراء قياس حجم الصندوق. يعد وجود غرفة تلقيح ميزة إضافية ، ولكن بدونها ، لا يزال من الممكن إجراء التلقيح باستخدام صندوق تلقيح في غرفة أو بيئة صغيرة لا تزال بها الرياح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. رسم توضيحي لعملية التلقيح. (أ) صور توضح البياض الدقيقي الطازج على أوراق النباتات المشار إليها. (ب) صورة توضح كيفية التخلص من الجراثيم الموجودة على الشبكة عن طريق ضرب الملقط الذي يمسك بالأوراق المصابة برفق. (ج) صور توضح فرشتين دقيقتين لخلاط المروحة وفرشاة لطيفة للجراثيم على الشبكة. (د) رسم تخطيطي يوضح اتجاهات تنظيف الأبواغ بالفرشاة على الشبكة التي يمكن أن تساعد في التوزيع المتساوي للأبواغ على النباتات الموجودة أسفل صندوق التلقيح. من المهم الإشارة إلى أن استخدام جراثيم جديدة للتلقيح أمر بالغ الأهمية لنجاح العدوى. بناء على تجربتنا ، فإن الكونيديا المنتجة على الأوراق المصابة بين 8 إلى 12 نقطة في البوصة طازجة ويمكن إزاحتها بسهولة عن طريق الهز. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. صناديق تلقيح بسيطة ومؤقتة من الورق المقوى لاختبارات العدوى. أ: صندوق من الورق المقوى لتلقيح النباتات في مسطح قياسي. ب: صناديق تلقيح متوسطة الحجم لتلقيح عدد أقل من النباتات. (ج) صندوق تلقيح صغير لتلقيح الأوراق المنفصلة في طبق بتري مربع يحتوي على وسط MS-agar. تبرز الخطوط الصفراء قياس حجم الصندوق. يمكن استخدام صناديق Carboard ذات الأحجام الأخرى إذا كانت تناسب الشقق التي تحتوي على نباتات ليتم اختبارها. لا ينبغي استخدام الصناديق البلاستيكية لأن الجراثيم يمكن أن تنجذب إلى السطح البلاستيكي بسبب الكهرباء الساكنة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5. تقييم تكافؤ التلقيح. (أ) رسم تخطيطي يوضح مواضع ست شرائح مجهرية في قاع مسطح. تظهر صورة مجهرية تمثيلية على اليمين توزيعا متساويا للأبواغ على الشريحة بعد التلقيح الكثيف. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) مخطط شريطي يوضح كثافة الجراثيم الموزعة في ستة مواقع (1 إلى 6) كما هو موضح في (أ) بعد ثلاثة تلقيح وهمي بجراثيم من أربعة (للتلقيح الخفيف) أو 15 (للتلقيح الكثيف ) أوراق مصابة ممتدة بالكامل من نباتات pad4-1 . تم حساب الجراثيم في مساحة 4 × 0.25 سم2 محددة بغطاء زجاجي شبكي (من شركة Ibidi USA Inc. أو عصامية) أعلى كل شريحة. لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية في كثافة الأبواغ بين ست شرائح في كل من مخططي التلقيح (اختبار t للطلاب; ص > 0.5). تشير أشرطة الخطأ إلى SD. (C) النباتات التمثيلية ل Arabidopsis Col-0 من النوع البري و pad4-1 الطافرة المصابة ب G. cichoracearum UCSC1 بعد 12 يوما من التلقيح الكثيف. لاحظ أن جميع نباتات pad4-1 أظهرت قابلية معززة للإصابة بالأمراض مقارنة بنباتات Col-0. عوامل متعددة تحدد تساوي التلقيح. بشكل عام ، من الأسهل نسبيا تحقيق التلقيح المتساوي عند استخدام ما يكفي من اللقاح للوصول إلى كثافة > 50 جرثة / سم2. يمكن بسهولة تكسير الكونيديا الطازجة التي يتم إزاحتها عن طريق الهز وتنظيفها بشكل فردي من خلال الشبكة. تميل الكونيديا القديمة أو الميتة إلى تكوين مجاميع ، وبالتالي يصعب إزاحتها وتفريقها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتميز طريقة التلقيح القائمة على الصندوق الشبكي لدينا بالعديد من المزايا مقارنة بطرق التلقيح الأخرى. أولا ، يمكن أن يحقق توزيعا متساويا للجراثيم إذا تم تشغيله بشكل صحيح ، كما هو موضح في الشكل 5. ثانيا ، يمكن أن يؤدي استخدام شبكة ~ 50 ميكرومتر ، بالإضافة إلى إزاحة البوغ عن طريق الاهتزاز اللطيف للأوراق المصابة إلى تقليل عدوى النبات عن طريق تريبس أو الحشرات الأخرى التي تصيب النباتات الموجودة في نباتات المصدر. ثالثا ، يمكن أن يؤدي استخدام صناديق التلقيح ذات الأحجام المختلفة لتلقيح النباتات أو الأوراق المنفصلة داخل الغرفة البلاستيكية (وكلاهما يمكن تنظيفه بسهولة عن طريق رش 75٪ من الإيثانول) إلى استخدام اللقاح بشكل أكثر فعالية وتقليل التلوث المتبادل. وجدنا أنه لم تهرب أي جراثيم فطرية أو عدد قليل جدا من غرف التلقيح خلال عملية التلقيح بأكملها.
صندوق التلقيح عالي الجودة هو المفتاح لضمان التلقيح المتساوي. وجدنا أنه يمكن استخدام صندوق التلقيح القياسي لتلقيح النباتات الصغيرة والناضجة من Arabidopsis (الشكل 1) ، وشتلات الفراولة ، وزرع الشوك و N. benthamiana (غير معروض). يمكن أن يزداد ارتفاع الصندوق إذا كانت النباتات أطول من خمس بوصات لضمان مسافة كافية (> 5 بوصات) من الشبكة إلى النباتات الموجودة تحتها للسماح بتوزيع البوغ بشكل متساو. قد يزداد ارتفاع الغرفة البلاستيكية أيضا وفقا لذلك للسماح بمساحة كافية للمناورة بإزاحة الأبواغ والفرشاة في الجزء العلوي من صندوق التلقيح.
يعد التركيب المتساوي والضيق لشبكة ~ 50 ميكرومتر من الاختيار على غطاء صندوق التلقيح أمرا مهما ويتطلب عناية إضافية. حجم المسام أكبر قليلا من جراثيم البياض الدقيقي التي يبلغ قطرها في الغالب 30-40 ميكرومتر. يمكن تنظيف الغطاء عن طريق الغسيل بماء الصنبور أو الرش بنسبة 75٪ من الإيثانول بعد الاستخدام. نوصي باستخدام شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 48 ميكرومتر ، لأن الشبكة أكثر متانة وستستمر لفترة أطول.
تخلق غرفة التلقيح بيئة لا تزال بها الرياح وتقلل من هروب الأبواغ أثناء إزاحة البوغ و / أو تنظيف الأسنان بالفرشاة. الغرفة مصنوعة من زجاج بلاستيكي شفاف بحيث يمكن للمستخدم أن يرى بالعين المجردة إذا كانت الجراثيم التي تم إزاحتها موزعة بالتساوي إلى حد ما على الشبكة قبل تنظيف الأسنان بالفرشاة. هذا مهم بشكل خاص إذا كان الضوء وحتى التلقيح مطلوبا. يعد تنظيف الأسنان بالفرشاة بلطف ولكن بسرعة في اتجاهات مختلفة أمرا مهما أيضا لأنه يمكن أن يشتت الجراثيم المجمعة ويدفعها عبر المسام بشكل فردي ، مما يحقق توزيعا متساويا بعد سقوط الجراثيم واستقرارها في قاع صندوق التلقيح. لسهولة التعامل ، يجب وضع غرفة التلقيح على طاولة بارتفاع مناسب بحيث يمكن بسهولة إزالة البوغ والفرشاة باليدين من خلال نافذة الغرفة.
يمكن توسيع نطاق التلقيح القائم على الصندوق الشبكي لأعلى أو لأسفل باستخدام صناديق تلقيح مختلفة الأحجام. من السهل صنع صناديق التلقيح الشبكية البسيطة والمؤقتة ويمكن أن تحقق نتائج مرضية إذا تم استخدامها بشكل صحيح. من المسلم به ، مقارنة بالتلقيح باستخدام طريقة برج الترسيب7 التي تعمل بالفراغ ، أن هذه الطريقة قد تستغرق وقتا أطول في إزاحة البوغ وتنظيف الأسنان بالفرشاة. أيضا ، لتلقيح النباتات الكبيرة والطويلة ، قد يكون صندوق التلقيح القياسي الموصوف هنا صغيرا جدا ، وبالتالي يجب استخدام صندوق تلقيح أكبر وغرفة أكبر لتحقيق التلقيح المتساوي. بالنسبة لبعض الأنواع النباتية مثل التبغ والخيار ، يمكن تلقيح الأوراق المنفصلة أو النبتات بهذه الطريقة لتقييم قابلية النبات بأكمله للمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-1901566) إلى S. Xiao. يود المؤلفون أن يشكروا F. Coker و C. Hooks على صيانة مرفق نمو النبات ، وخورخي زامورا على المساعدة الفنية المرتبطة بتصنيع صندوق التلقيح والغرفة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
