Summary
Denne protokollen beskriver bruken av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll supplert med sanntidsovervåking og et alarmsystem for to-trinns kollagennaseperfusjonsprosedyre for å forbedre konsistensen i levedyktigheten, utbyttet og funksjonaliteten til isolerte primærrottehedopatocytter.
Abstract
Primære hepatocytter er mye brukt i grunnleggende forskning på leversykdommer og for toksisitetstesting in vitro. Den to-trinns kollagennasperfusjonsprosedyren for primær hepatocytisolasjon er teknisk utfordrende, spesielt i portal venekannasjon. Prosedyren er også utsatt for sporadisk forurensning og variasjoner i perfusjonsforhold på grunn av vanskeligheter med montering, optimalisering eller vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Her presenteres en detaljert protokoll for en forbedret to-trinns kollagenalenperfusjonsprosedyre med multiparameterperfusjonskontroll. Primær rottehpopatocytter ble vellykket og pålitelig isolert ved å ta de nødvendige tekniske forholdsreglene ved kritiske trinn i prosedyren, og ved å redusere driftsvansker og redusere variasjonen av perfusjonsparametere gjennom vedtakelse av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll og sanntidsovervåking og alarmsystem. De isolerte primærrottene hepatocytter viser konsekvent høy celle levedyktighet (85% -95%), utbytte (2-5 x 108 celler per 200-300 g rotte) og funksjonalitet (albumin, urea og CYP aktivitet). Prosedyren ble supplert med et integrert perfusjonssystem, som er kompakt nok til å settes opp i laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.
Introduction
Primære hepatocytter er viktige verktøy for leverrelatert grunnforskning, sykdomsbehandling og anvendelse som legemiddeltesting. Den nåværende gullstandarden for primær hepatocytisolasjon er den to-trinns kollagenære perfusjonsprosedyren 1,2,3 introdusert av Seglen på 1970-tallet4. Imidlertid er denne prosedyren teknisk utfordrende og har en høy feilfrekvens når den utføres av nybegynnere kirurger. Selv når en perfusjon anses som vellykket, kan drastiske forskjeller i hepatocytt levedyktighet (vanligvis 60% -95%) og utbytte (0,5-5 x 108 per 200-300 g rotte) observeres mellom isolasjoner. Dette påvirker kvaliteten og omfanget av nedstrømseksperimenter. Bortsett fra den tekniske prosedyren, er perfusjonsoppsettet som brukes til isolasjonen, enten kommersielt tilgjengelig eller spesialbygget, en medvirkende faktor. Det må tas hensyn til montering, optimalisering og vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Formålet med denne protokollen er å forbedre suksessraten og stabiliteten mellom isolasjoner av primærrotter hepatocytter gjennom multiparameterperfusjonskontroll av den tekniske prosedyren og perfusjonsoppsettet for totrinns kollagenalusperfusjonsprosedyren.
Fra det tekniske aspektet er det vanskeligste trinnet i prosedyren portalvenekannasjonen. Når det gjelder de andre trinnene, hvis god praksis overholdes og generelle forholdsregler tas, kan isolasjonens stabilitet forbedres. Derfor er forståelse av resonnementet for hvert trinn viktig slik at kirurgen kan reagere på ulike variabler som kan oppstå under prosedyren.
Ulike protokoller for isolering av hepatocytter og lever ikke-parenchymale celler fra rotte og mus har blitt publisert 1,2,5,6,7,8,9. Perfusjonsoppsettene som ble brukt i disse protokollene hadde flere ulemper, som inkluderer gjenbruk av perfusjonsrør, problemer med temperaturkontroll, behov for rutinemessig optimalisering av perfusjonsparametere og / eller bruk av uegnet type intravenøst (IV) kateter for portalvennekannasjon. Gjenbruk av perfusjonsrør vil øke sjansene for forurensning, spesielt hvis slangen ikke ble rengjort og desinfisert riktig. Gjenbruk av rør uten rutinemessig utskifting vil også utsette perfusjonsoppsettet for problemer som lekkende rør eller kontakter, tilstoppet boblefelle og innsnevret rør, som alle vil redusere perfusattrykket og strømningshastigheten betydelig, og dermed påvirke leverfordøyelighetseffektiviteten. Uten en konstant varmekilde i noen oppsett for temperaturkontroll, vil forhåndsvarmede buffere avkjøles over tid, noe som fører til lav kollagenaktivitet og fordøyelse. Selv om andre oppsett bruker en jakket glasskondensator koblet til en vannsirkulasjon for å varme bufferen, er de store og krever forsiktig rengjøring. Temperatur, trykk og strømningshastighet for buffer som går ut av kateteret må måles og optimaliseres før starten av isolasjonen for å sikre stabil perfusjonstilstand. Selv etter optimalisering kan parametrene fortsatt endres halvveis under isolasjon på grunn av operatørens handlinger, og dermed føre til suboptimal perfusjon og fordøyelse. De fleste typer IV kateter er ikke egnet for portal vene kannasjon fordi de ikke tillater kontinuerlig perfusjon under kannasjon. De er ikke i stand til umiddelbart å informere kirurgen når kannasjonen er vellykket. Videre er det utfordrende å sikre portalvenen på det myke kateteret uten å deformere det.
Her løser vi disse problemene ved hjelp av standardiserte sterile rør til engangsbruk, en silikonvarmerjakke for presis og stabil temperaturkontroll, sanntidsovervåking og alarmsystem med datalagring og styring og bruk av et spesielt IV-kateter, som tillater kontinuerlig perfusjon mens du punkterer portalvenen under kanalisering. Så vidt vi vet, er vi den første gruppen som kombinerer alle disse funksjonene i et integrert perfusjonssystem (IPS) som er kompakt, noe som gjør det svært bærbart og i stand til å passe inn i en laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og dyrehus ble utført under protokollnummer R15-0027 og R19-0669 i samsvar med kravene i Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National University of Singapore.
1. Utarbeidelse av løsninger og kirurgiske instrumenter
- Klargjør buffere og cellekulturmedier i tabell 1 ved hjelp av ultrarent vann.
- Forvarm den kalsiumfrie bufferen og kollagenalensbufferen til 37 °C i et vannbad før bruk.
- Autoklaver følgende kirurgiske instrumenter og laboratorieutstyr: et par skarpe stumpe kirurgiske saks, et par stump-stump kirurgisk saks, et par buede kirurgiske saks, to par tannvevs tang, to par buede tang, to veneklips, en 5 cm lang 3-0 silke kirurgisk sutur, et 100 μm nylonnettfilter, et 400 ml beger, en 400 mL beger, en 100 μm nylonnettfilter, en 400 maker og et trinn (flytende mikrosenterrørstativ).
2. Sette opp IPS (se figur 1)
- Tørk av laminær strømningshette med 70% etanol. Tørk av IPS med 70% etanol og flytt det inn i laminær strømningshette. Steriliser med UV i >15 minutter før du slår på hetten.
FORSIKTIG: Eksponering for UV-lys kan forårsake smertefulle øyne og hudforbrenninger. Kontroller at rammen er helt lukket når UV-lyset er slått på. - Monter et nytt sett med engangsslanger på IPS. Vikle slangen nedstrøms for den peristaltiske pumpen i en silikonvarmerjakke. Monter perfusjonsmonitoren på slangen nedstrøms silikonvarmerjakken.
- Påse at rulleklemmene for begge slangeinntakene løsnes helt. Koble hvert slangeinntak til den koniske enden av en steril 2 ml aspirasjonspipette. La begge aspirasjonspipettene (innløpene) og IV-kateteret (utløpet) stå i en 1 L flaske med kalsiumfri buffer for å tillate resirkulering av bufferen under påfølgende påfyllingstrinn.
Figur 2: Selvtestgrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Slå på IPS. Utfør følgende operasjoner på kontrollpanelet på berøringsskjermen. Programvaren vil utføre en omfattende selvtest hver gang den startes.
FORSIKTIG: IPS er et elektrisk utstyr som er koblet til en ekstern strømkilde. Væskesøl på IPS eller strømkabler kan medføre elektriske farer.- Kontroller at selvteststatus vises på skjermen (figur 2). Komponenter som har bestått selvtesten, vises i grønt. De som har mislyktes, vises i rødt. Etter korrigering trykker du på Test-ikonet for å gjenta selvtesten igjen eller trykker på Enter System-ikonet for å gå direkte inn i operasjonsgrensesnittet.
- Trykk hvor som helst på skjermen for å logge på betjeningsgrensesnittet.
- Trykk på et av de sirkulære pilikonene øverst til venstre i betjeningsgrensesnittet (figur 3) for å angi rotasjonsretningen for den peristaltiske pumpen. I høyre panel på grensesnittet trykker du på pil opp / ned-ikonene for å angi verdier for de tilsvarende parametrene. Sett flyten i konstant strømningsmodus. temperatur på varmejakken til 42 °C (justeres for å sikre at temperaturen på perfusatet opprettholdes ved 37 °C); pumpehastighet til 38 o/min for en strømningshastighet på ~33 ml/min.
- Kontroller statusen til boblealarmen, perfusjonsstoppalarmen og dempeikonet nederst til høyre i betjeningsgrensesnittet.
- Kontroller temperaturen, trykket og strømningshastigheten til perfusatet i venstre panel. Angi intervallene manuelt ved å klikke på pil opp-ned øverst og nederst i kolonnene. Se etter sanntidsdataene som vises som verdier midt i kolonnene. Fargen på kolonnen endres fra grønt til rødt hvis sanntidsdataene flyttes utenfor det angitte området.
- Finn ikonene for å starte, stanse midlertidig og stoppe perfusjonen, og ikonet for å bytte fra sanntidsdatavisning til diagrammodus i det midterste panelet. Trykk på startikonet for å starte perfusjonen og klargjøre slangen med kalsiumfri buffer. Det opprettes en ny logg. Skriv inn filnavnet og brukernavnet i popup-vinduet (figur 4).
Figur 3: Betjeningsgrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Popup-vindu som ber om filnavn og brukernavn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Fyll dryppkammeret til halvfullt. Pass på at det ikke er noen fangede luftlommer i slangen under påfylling.
- Fjern eventuelle bobler som dannes nedstrøms for boblefilteret ved å flikke på slangen for å løsne boblen og la den skylles ut.
MERK: Det kan dannes bobler langs slangen når bufferen varmes opp av varmejakken. - Fyll et 400 ml beger med 200 ml kollagenalissebuffer. Sett scenen på toppen av begeret. Uten å introdusere luft i slangen, stram rulleklemmen helt til en av slangeinntakene og flytt aspirasjonspipetten for innløpet inn i begeret.
3. Dyreprosedyre
- Forbered en ung voksen mannlig Wistar rotte rundt 200-300 g i kroppsvekt.
MERK: Denne protokollen ble optimalisert for rotter rundt 200-300 g i kroppsvekt. Mannlige rotter er foretrukket siden hormonelle endringer under østrogensyklusen hos kvinnelige rotter vil påvirke hepatocyttfunksjonen. - Anestesi
- Lag det nødvendige volumet av antikoagulerende heparin (5000 IE / ml; 0,2 ml/100 g kroppsvekt) og rottebedøvelse ketamin/xylazincocktail (37,5 mg/ml ketamin, 5 mg/ml xylazin; 0,2 ml/100 g kroppsvekt) i 1 ml sprøyter med 27 G nål.
FORSIKTIG: Anestesi og heparin er skadelige stoffer. Vær forsiktig når du håndterer skarpe. - Hold tilbake rotten. Intraperitoneally injisere heparin etterfulgt av ketamin / xylazine cocktail i nedre høyre kvadrant i magen.
MERK: Kaecumet har større sannsynlighet for å være plassert til venstre. Unngå punktering av caecum under injeksjon for å redusere risikoen for forurensning. - Etter 10 min, kontroller dybden av anestesi ved å vurdere pedalrefleks på begge rottens føtter. Fortsett å sjekke fra tid til annen og vent til rotten ikke lenger reagerer på tåklemmer. Ytterligere anestesi kan injiseres etter behov.
- Lag det nødvendige volumet av antikoagulerende heparin (5000 IE / ml; 0,2 ml/100 g kroppsvekt) og rottebedøvelse ketamin/xylazincocktail (37,5 mg/ml ketamin, 5 mg/ml xylazin; 0,2 ml/100 g kroppsvekt) i 1 ml sprøyter med 27 G nål.
- Plasser rotten i en liggende stilling med lemmer utstrakt på en aluminiumsfoliedekket polystyrenplattform på toppen av et brett. Tape føttene på rotten og fest båndet sikkert på plattformen med 27 G nåler.
- Desinfiser brystet og magen ved å sprøyte og tørke dem med 70% etanol. Barbering før desinfeksjon er valgfritt. Sett rotten i panseret. Fortsett neste trinn mens pelsen fortsatt er våt.
MERK: Drenching med 70% etanol holder også dander og pelsstøv til et minimum. - Skill huden fra muskelen.
- Med et par tannvevs tang i den ene hånden, løft huden nær bunnen av magen. Med et par skarpe stumpe kirurgiske saks i den andre hånden, kutt telthuden. Skyv den skarpe enden av saksen under huden og lag et midtlinje snitt på huden fra like over bakbenene til like under forbenene.
- Mens du trekker opp og strekker huden lett med tangene, kutt eventuelt bindevev som holder huden på muskelen i brystet og magen. For å redusere risikoen for forurensning, forhindre at løs pels faller på muskelen. For å fjerne oppbygd løs pels på saksen, tørk dem av på den desinfiserte ytre siden av huden.
- Gjør laterale snitt på huden, fra midtlinje til begge sider av rotten på litt over bakbenene og litt under forbenene. Skyv hudklaffene til sidene for å eksponere muskelen.
- Klipp åpne magemuskelen for å eksponere organene.
- Med et nytt par tannvevs tang i den ene hånden, løft muskelen nær bunnen av magen. Med et par stumpe stumpe kirurgiske saks i den andre hånden, kutt forsiktig gjennom muskelen uten å nicking noen av organene. Lag et midtlinje snitt på muskelen fra litt over bakbenene til brystbenet.
- Gjør laterale snitt på muskelen, fra midtlinje til begge sider av rotten på litt over bakbenene og like under ribbeburet, uten å nicking noen av organene. Skyv muskelklaffene til sidene for å eksponere organene. Forsikre deg om at de laterale snittene i huden og muskelen når sidene av rotten for å tillate blod og buffere å strømme ut fra bukhulen ved senere trinn.
- Portal vene kannulation
- Med baksiden av buede tang skyver tarmene forsiktig til høyre. Vend forsiktig opp leverlobene for å eksponere portalvenen.
- Bruk en 3-0 silke kirurgisk sutur for å lage en veldig løs ligatur rundt portalvenen nær leveren, like før vengrenene venstre og høyre inn i forskjellige leverlober. Ikke stram ligaturen for å unngå å forstyrre blodstrømmen gjennom portalvenen. En veldig tynn membran under gallekanalen må brytes gjennom med spissen av de buede tangene før suturen kan passere under og sløyfes rundt portalvenen (og gallekanalen).
- Bruk spissene på to par buede tang, punkter forsiktig et hull gjennom vevet under portalvenen, uten å skade portalvenen. Gjør dette ca 2-3 cm oppstrøms for den første ligaturen, like før magevenen grener av fra portalvenen. Vevet er tynnere på dette bestemte stedet.
- Strekk forsiktig hullet større med tangene. Dette hullet vil tillate tang å støtte opp portalvenen under kannasjon.
- Reduser pumpehastigheten til 4 o/min for en strømningshastighet på ~3 ml/min. Påse at utstrømningen av kalsiumfri buffer fra IV-kateteret reduseres til et sakte drypp.
MERK: Trykkoppbygging i leveren vil føre til hepatocyttdød. En lavere strømningshastighet bør redusere trykkoppbyggingen i leveren ved vellykket innsetting av kanylen i portalvenen på et senere tidspunkt. - Støtt portalvenen forsiktig ved hjelp av tang. Med den andre hånden, hold på IV-kateteret med nålens skråkant vendt opp. Rett nålen inn i portalvenen i en 10-20° vinkel og gå sakte frem til hele skråkanten er inne i venen. Når nålen er satt riktig inn i portalvenen, vil leveren begynne å blanchere og miste sin mørkerøde farge.
MERK: Hele nålens skråkant må settes inn i venen for å skape et hull som er stort nok til innsetting av kanylen. Men ikke sett nålen for dypt inn for å unngå over punktering av venen. - Før kanylen over nålen og inn i venen. Trekk deretter nålen tilbake til den er 2-3 mm bak kanylen; akkurat nok slik at den skarpe spissen er trygt innenfor kanylen. Bruk tommelen og langfingeren til å holde fast på kateteret og bruk pekefingeren til å trekke tilbake vingen for å trekke nålen tilbake.
- Fest portalvenen raskt på kateteret med en veneklemme. Ikke klips direkte på kanylens sidehull for å unngå å forstyrre perfusatstrømmen. Klipp i stedet under den.
- Klipp umiddelbart den infrahepatiske dårligere vena cava (IVC) for å forhindre trykkoppbygging i leveren. Nå vil den infrahepatiske IVC og tilstøtende blodårene bli skjult av blod fra portalvenen. For å sikre at IVC ble riktig kuttet og kuttet, observere for blod sprute ut i pulser; blod vil bare dryppe ut fra tilstøtende kar.
MERK: Hvis du bruker for lang tid på å kutte den infrahepatiske IVC etter kannasjon eller unnlatelse av å kutte den før du går videre til neste trinn, vil det føre til hepatocyttdød. Dyret er euthanized under anestesi ved exsanguination (gjennom kutting av IVC) i løpet av dette trinnet. Prosedyren bør fortsette mens blodtap pågår. Døden kan bekreftes ved visuell observasjon av opphør av hjerteslag/respirasjon når brysthulen åpnes på et senere tidspunkt. - Øk pumpehastigheten til 38 o/min for en strømningshastighet på ~33 ml/min. Skyll leveren tre ganger ved å lukke IVC med tang i 2-3 s (men ikke for lenge) og åpne den igjen.
MERK: Under spyling vil leveren ekspandere litt før den går tilbake til det normale. Spyling letter permeasjonen av perfusat gjennom hele leveren. Etter rødme skal leveren være helt lysebrun i fargen. - Forsikre deg om at kanylespissen er plassert på før det punktet hvor portalvenen forgrener seg i forskjellige leverlober, for å sikre perfusjon av alle leverlober. Om nødvendig løsner du portalvenen og justerer kanylens posisjon. Klipp på nytt etterpå.
- Stram den løse ligaturen rundt portalvenen, litt oppstrøms forgreningspunktet. Lag tre knop på hvor den myke kanylen støttes av den harde metallnålen, mellom skråkanten og sidehullet. Påse at knutene fester kanylen på plass, fester den til portalvenen og forhindrer tilbakestrømning av buffere.
- Resect hele leveren intakt.
- Forvreng leveren med kalsiumfri buffer med strømningshastighet på ~33 ml/min i de neste 12 min (se figur 5A). I mellomtiden, utfør lever reseksjon. Perfusjonstiden kan forlenges om nødvendig, men sørg for at den kalsiumfrie bufferen ikke går tom.
- Bruk et par buede saks, løsne portalvenen forsiktig fra tarmene ved å kutte mesenteriet som forbinder dem sammen. Ikke nick mage-tarmkanalen (spiserøret, magen og tynn og tykktarmen) for å sikre at ingen forurensning oppstår.
MERK: Dette for å forhindre at portalvenen rives når leveren beveges rundt under reseksjon. - Løsne leveren fra mage-tarmkanalen ved å kutte bindevev, bukspyttkjertel og mesenteri som forbinder leveren med mage-tarmkanalen. For å løsne, kutt alltid med saks og ikke trekk for å rive. Igjen, ikke nick eller kutt mage-tarmkanalen.
- Vend forsiktig ned leveren for å eksponere membranen. Klipp membranen etter ribbens vegger. Forsikre deg om at det meste av membranen forblir koblet til leveren. Vær forsiktig så du ikke stikker eller blåmerker leveren.
- Når brysthulen er åpnet, kan to kanaler ses: den hvite suprahepmatiske IVC til venstre, og den gulaktige spiserøret til høyre. Klipp den suprahepatic IVC og kutt den like over klippet. Klipping av suprahepatic IVC er valgfritt. Det forhindrer at brysthulen blir oversvømmet.
MERK: Observer visuelt for opphør av hjerteslag/åndedrett for å bekrefte dyredød. - Spiserøret er omgitt av membranen. For å isolere spiserøret fra membranen, kutt gjennom membranen fra høyre mot spiserøret. Klipp eventuelle gjenværende bindevev som forbinder spiserøret og magen til leveren og membranen.
- Skyv mage-tarmkanalen til høyre. Overfør veneklippet fra suprahepatic IVC til infrahepatic IVC; bufferen vil nå parfyme ut fra den suprahepatic IVC.
MERK: Under perfusjon vil kanylen og infrahepatisk IVC bli dekket av leveren. Sterk bufferutgang fra den suprahepatic IVC vil hjelpe kirurgen til å utelukke perfusjonslekkasjer. - Klipp eventuell gjenværende membran som forbinder leveren til brysthulen. Klipp av vev som forbinder leveren med bukhulen. Pass på at du ikke kutter den infrahepatiske IVC over klipsen for å unngå å løsne klippet fra leveren.
- For å sikre at leveren er fullstendig resected, løft leveren forsiktig ved å holde fast på membranen med tang. Hvis det er gjenværende vev som forbinder leveren med bukhulen, kutt dem av. Hvis nyrene og milten fortsatt er koblet til leveren, løsne dem.
4. Leverperfusjon og fordøyelse
- Hvis reseksjonen ble fullført tidlig, vent til leveren har blitt perfundert med kalsiumfri buffer i 12 minutter.
- Endre perfusjonsbufferen til kollagenalusbufferen. Løsne rulleklemmen helt for kollagenalbufferen før du strammer rulleklemmen helt for kalsiumfri buffer (se figur 5B). Når kollagenasebufferen når leveren gjennom slangen, skyll leveren tre ganger ved å lukke den suprahepmatiske IVC i 2-3 s og åpne den på nytt.
- Flytt leveren forsiktig til scenen på toppen av begeret for resirkulering av kollagenmosebuffer. Flytt leveren ved å holde fast på membranen med tang mens du støtter kateteret. Unngå å tråkke på kateteret for å forhindre utilsiktet kateteravløsning.
MERK: Hvis kateteret løsner og portalvenen er for skadet for re-cannulation, kanylere suprahepatic IVC og la bufferen parfyme ut fra portalvenen. Kontroller at den infrahepatiske IVC forblir beskåret. - Fordøye leveren i 12 min. Vær oppmerksom på utseendet på gjennomsiktige flekker / nettverk når leveren begynner å miste sin glatte brune tekstur. Leveren blir større og mykere etter hvert som den fordøyes. Når leveren har en grøtaktig konsistens, stopp perfusjonen. Fordøyelsestiden kan forlenges om nødvendig.
MERK: Hvis Glissons kapsel er ødelagt, kan kollagenmosebufferen i begeret bli overskyet på grunn av rømte leverceller.
5. Hepatocytisolasjon
- Fjern kanylen forsiktig ved å kutte av portalvenen. Fjern klipsen forsiktig. Overfør leveren til en 150 mm tallerken som inneholder 60 ml kald Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Trykk forsiktig på leveren ved hjelp av baksiden av de buede tangene for å bryte og skrelle av Glissons kapsel. Deretter svinger du forsiktig leveren fra side til side i DMEM for å frigjøre leverceller. Fortsett å gjøre dette til leverceller er fullstendig dissosiert inn i DMEM.
MERK: Av og til vil hele leveren eller visse lober bare bli delvis fordøyd. Ved ikke å skrape leveren som vil tvinge fjerne, og skade udisosierte hepatocytter, kan en høyere og mer konsistent celle levedyktighet oppnås. - Gyng forsiktig 150 mm parabolen til levercellene er fordelt godt i DMEM. For å fjerne vevstykker og celleklumper, hell cellefjæringen gjennom et 100 μm porestørrelse nylonnettfilter plassert over en ny 150 mm tallerken. Skyll den gamle retten med 30 ml DMEM og overfør suspensjonen til nettfilteret. Trykk forsiktig på maskefilteret for å la fanget enkeltleverceller passere gjennom.
- Fjern nettfilteret og rock forsiktig den nye 150 mm parabolen til levercellene er fordelt godt. Del suspensjonen likt i 4 x 50 ml rør. Skyll fatet med 30 ml DMEM og del suspensjonen likt i de samme rørene. Forsikre deg om at hvert rør har et likt volum celleoppheng.
- Sentrifuger 4 x 50 ml rør av celle suspensjon ved 50 x g i 2 min ved 4 °C. Aspirer forsiktig supernatanten uten å forstyrre den løse pelletsen. Kast supernatanten. Tilsett 20 ml DMEM i hvert rør og rock forsiktig rørene for å resuspendere cellepelleten. Kombiner cellefjæringen fra fire rør til to.
- Sentrifuger de 2 x 50 ml rørene ved 20 x g i 2 min ved 4 °C. Aspirer og kast supernatanten. Tilsett 20 ml DMEM i hvert rør og rock forsiktig rørene for å resuspendere cellepelleten. Kombiner cellefjæring fra to rør til ett. Hold cellene på is til bruk.
- Forbered trypan blå oppløsning ved å blande 400 μL 1x PBS med 50 μL trypan blå. Tilsett 50 μL hepatocyttfjæring i trypanblå oppløsningen. Tell antall levedyktige og døde hepatocytter med et hemocytometer under lysmikroskopet.
6. Hepatocyte kultur
- Utfør alle cellekulturtrinnene i hetten. Tilsett 1 ml kollagenbeleggoppløsning i en 35 mm tallerken og inkuber i 4 timer. Skyll oppvasken tre ganger med 1x PBS.
- Fortynn hepatocytt suspensjon i hepatocyttkultur middels til en konsentrasjon på 0,8 millioner celler / ml. Tilsett 1 ml fortynnet hepatocyttfjæring i 35 mm parabolen.
MERK: Hepatocytter er følsomme for skjærspenning under pipettering. Vurder å bruke brede pipettespisser. - Rock parabolen for å distribuere hepatocytter jevnt. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 3–4 timer slik at hepatocyttene kan festes.
- For sandwichkultur.
- Fjern hepatocyttkulturmediet. Skyll en gang med 1 ml hepatocyttkulturmedium for å fjerne uattrerte celler. Tilsett 1 ml kollagenoverleggsløsning. Tilsett kollagenoverleggsløsning på veggene på parabolen for å unngå å introdusere bobler i løsningen.
- Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 for over natten for å tillate kollagengelering.
- Tilsett 1 ml friskt hepatocyttkulturmedium. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- For monolayer kultur.
- Etter trinn 6.3 fjerner du hepatocyttkulturmediet. Skyll en gang med 1 ml hepatocyttkulturmedium for å fjerne de uattrerte cellene.
- Tilsett 1 ml friskt hepatocyttkulturmedium. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- Vurdere hepatocyttrenhet og funksjon ved å utføre immundempende for hepatocyttspesifikk markør og funksjonelle analyser som beskrevet tidligere10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kirurg kan fortelle om leverperfusjon skjer jevnt ved å observere utfallet etter visse trinn. Det første utfallet kan observeres ved kannasjon, kutting av infrahepatisk IVC og gjenoppretting av perfusjonsstrømningshastigheten. Leveren skal ha endret farge helt fra mørk rød til brun, samtidig som volumet opprettholdes. Hvis leveren ser litt deflatert ut og har en rødaktig fargetone eller flekker av rødt, betyr det at perfusjonsstrømmen ble satt feil (for lav), eller portalvenen ble ikke kanylert riktig. Hvis leveren ikke bare blir brun, men blir oppblåst og stiv, betyr det at strømningshastigheten ble satt feil (for høy), eller den infrahepatiske IVC ble ikke kuttet riktig. Hvis bare noen få lober ikke blir perfundert godt, betyr det at kateteret ble satt inn for dypt og bare parfymerer en gren av portalvenen. Det andre utfallet kan observeres etter reseksjon og klipping av infrahepatic IVC. Hvis utstrømningen fra den suprahepmatiske IVC er langsom og svak, kan det bety at kateteret hadde løsnet under reseksjon, eller at den infrahepatiske IVC ikke ble klippet ordentlig. Det tredje utfallet kan observeres under fordøyelsen. På den brune leveren skal gjennomsiktige flekker / nettverk vises og forstørres. Leveren skal miste sin fjærende konsistens og bli myk og grøtaktig. Vi optimaliserer vår kollagennaskonsentrasjon slik at denne tilstanden kan nås innen 12 min. Når du prøver ut en ny masse kollagenaliser, bør fordøyelsestiden forlenges til denne tilstanden er nådd. Det fjerde utfallet kan observeres når celler frigjøres fra leveren. Når cellene slippes, skal mediet se overskyet ut. Hvis mye kornete tekstur observeres, kan det bety at leveren ikke ble tilstrekkelig fordøyd. Hvis fordøyelsen er fullført, bør bare hvite weblike fartøy være igjen. Selv om fordøyelsen er delvis (figur 6),er det fortsatt mulig å skaffe seg gode celler.
Vår protokoll beskrevet her genererer konsekvent høyere celleutbytte på opptil 5 × 108 hepatocytter per isolasjon fra rotter som veier 200-300 g og celle levedyktighet mellom 88% -94,8% som bestemt av trypan blue teller 12,13,14,15,16 (tabell 2). Hepatocyttrenhet oppnådd som bestemt ved immunstaining av albumin var 96,8 ± 2,0%11 (figur 7). Hepatocytter i sandwichkultur dannet distinkt galle canaliculi og hadde god cellecellekontakt (figur 8). Hepatocyttene har høy funksjonalitet som vist av albumin, urea og CYP-analysene10 (tabell 3).
Figur 1: Skjematisk diagram for IPS. Perfusatet starter i perfusatposen eller flasken (1, 2). To strømningsregulatorer (3, 4) arbeider sammen for å kontrollere passasjen av perfusat. Perfusate fortsetter til en boblefelle (5). Etterfølgende prosesser styres av LCD-berøringsskjermen (6) på hovedsystemet. Perfusate trekkes deretter av en peristaltisk pumpe (7) og passerer gjennom en silikonjakket elektronisk varmeapparat (8), som varmer opp perfusatet til ønsket temperatur. Silikonvarmerjakken (8) kobles til hovedsystemet med en kontakt (9). Ved behov kan en engangstrykksensor (10) kobles til hovedsystemet med en kontakt (11), for å tillate måling av perfusjonstrykket. Perfusatet passerer deretter gjennom en perfusjonsmonitor (12), som måler temperaturen på perfusatet og oppdager tilstedeværelsen av bobler. Skjermen kan også avgjøre om perfusatet har gått tom. Skjermavlesninger overføres til hovedsystemet via LoRa. Perfusatet går deretter videre til et boblefilter (13) og går inn i leveren gjennom portalvenekanylen (14). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk diagram over totrinns kollagenalisseperfusjon for primær rottehepatocytisolasjon. (A) Perfusjon av kalsiumfri buffer. Rulleklemmen er helt løsnet for innløp 1 og helt strammet for innløp 2. (B) Lever fordøyelse med kollagenalisse buffer. Resected leveren overføres til toppen av et beger for å tillate buffer resirkulering. Rulleklemmen er helt løst for innløp 2 og helt strammet for innløp 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Lever etter kollagenal fordøyelse og hepatocytisolasjon. Vist er en delvis fordøyd leverlober. Ufordøyde deler av leveren forble brun. I fordøyde deler av leveren ble bare hvite kar igjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Immunostaining av hepatokytisk markør for kvantifisering av hepatocyttrenhet. (A) Sandwich kultur av unyttifisert levercelle suspensjon (før differensial sentrifugering; venstre) og renset hepatocyt suspensjon (etter differensial sentrifugering; høyre) frø ved lav celle tetthet. (B) Representative bilder viser celler farget med DAPI (kjerne, blå) og antistoff mot albumin (hepatocyttspesifikk markør; grønn). (C) Kvantifisering av hepatocytt renhet. Renheten ble bestemt ved å telle albumin positive fluorescerende fargede celler i forhold til det totale cellenummeret visualisert av DAPI kjernefysisk farging. Bilder i falske farger ble vist. Albumin (grønn), kjerne av celler med albumin (blå), kjerne av celler uten albumin (rød). Skalastenger 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Fasekontrastbilde av isolerte primærrotter hepatocytter fra totrinns kollagenalusperfusjon i sandwichkultur på dag 3. Skalalinje 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på buffere/medier | Endelig konsentrasjon | Beløp | Kommentarer/beskrivelse |
| Hepatocyte kulturmedier | |||
| Williams E-medier | 500 ml | Legg til alle reagenser i Williams E-medier. Filtrer gjennom 0,22 μm filter. Oppbevars ved 4 °C. | |
| Bsa | 1 mg/ml | 0,5 g | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 1X | 5 ml | |
| Insulin (20 mg/ml) | 0,5 μg/ml | 12,5 μL | |
| Deksametason (1 mM) | 100 nM | 50 μL | |
| Linolsyre (7,5 μg/ml) | 50 ng/ml | 3,33 μL | |
| Glutamax (100X) | 1X | 5 ml | |
| Collagenase buffer | |||
| NaCl | 0,100 g | Løs opp i 380 ml ultrarent vann. Juster til pH 7,49 - 7,51 med NaOH. Fyll opptil 400 ml med ultrarent vann. Filtrer gjennom 0,22 μm filter. Oppbevars ved 4 °C. | |
| KCl | 0,789 g | ||
| Kollagen av type IV | 80 - 200 U/ml | ||
| CaCl2·2H2O | 0,140 g | ||
| HEPES | 4.800 g | ||
| Kalsiumfri buffer | |||
| KH2Po4 | 0,0815 g | Løs opp i 900 ml ultrarent vann. Juster til pH 7,49-7,51 med HCl. Fyll opptil 1 L med ultrarent vann. Filtrer gjennom 0,22 μm filter. | |
| NaHCO3 | 1.0500 g | ||
| NaCl | 3,4480 g | ||
| KCl | 0,1750 g | ||
| DMEM for celleisolasjon | |||
| DMEM | 1 pose | Fyll opptil 1 L med ultrarent vann. Filtrer gjennom 0,22 μm filter. Oppbevars ved 4 °C. | |
| NaHCO3 | 1,5 g | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 1X | 10 ml | |
| Kollagenoverlegg (1 ml) | |||
| 0,1 M NaOH | 1 del | 20,8 μL | Forbered deg på nytt. Legg til kollagen sist. |
| 10X PBS | 1 del | 20,8 μL | |
| 1X PBS | 6 deler | 125 μL | |
| Hepatocyte kulturmedier | 32 deler | 667 μL | |
| Type I bovine kollagen | 8 deler | 167 μL | |
| Kollagenbeleggløsning (1 ml) | |||
| Type I bovine kollagen | 1 del | 0,5 ml | Forbered deg på nytt. |
| 0.01 N HCl | 1 del | 0,5 ml | |
Tabell 1: Oppskrifter på buffere og løsninger.
| Hepatocytt levedyktighet (%) | Hepatocyttutbytte (x 108 celler) | Levedyktig hepatocyttutbytte (x 108 celler) |
| 91.4 ± 3.4 | 4.39 ± 1,58 | 4.04 ± 1.48 |
Tabell 2: Celle levedyktighet og utbytte. Verdier ± SD fra 18 forskjellige eksperimenter vises.
| Urea (μg/millioner celler/dag) | Albumin (μg/millioner celler/dag) | CYP1A2-aktivitet (μg/millioner celler/dag) | CYP2B1/2-aktivitet (μg/millioner celler/dag) | CYP3B2-aktivitet (μg/millioner celler/dag) | |
| Dag 1 | 124 ± 2,6 | 39.0 ± 3.6 | |||
| Dag 3 | 65.7 ± 3.8 | 516.0 ± 95.1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93.7 ± 0,6 |
Tabell 3: Funksjonelle nivåer av isolert primærrotte hepatocytt i sandwichkultur. Verdier ± SD av urea, albumin, CYP1A2, CYP2B1/2 og CYP3B2-analyser fra tre forskjellige eksperimenter vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er noen få punkter som er spesielt viktige å observere for to-trinns kollagenalusperfusjonsprosedyre generelt. For det første må spesiell forsiktighet gis når du resecting leveren. Forsikre deg om at mage-tarmkanalen ikke er skadet, da lekkasje av innholdet vil føre til bakteriell forurensning. I tillegg, unngå å skade Glissons kapsel, som dekker overflaten av leveren under dyreprosedyren. Hvis tåren er stor nok, kan det tillate for tidlig frigjøring av disassosierte hepatocytter i kollagenalissebufferen. For det andre kan kollagenasens evne til å fordøye leveren samtidig som den sikrer god hepatocytt levedyktighet variere fra parti til parti. Mengden kollagenalus som brukes må optimaliseres for hver nye masse kollagenalus5. Det anbefales å teste noen få masse kollagenaliser og velge det beste partiet før du kjøper i bulk. Kontroller at vannet er ultrarent, og at pH er riktig. Urenheter i vannet som jernholdige og jernioner og feil pH kan påvirke kollagensaktiviteten, noe som deretter vil påvirke kvaliteten på de isolerte cellene drastisk. Selv om collagenase buffer resirkulering i denne protokollen kan være valgfritt, er det ikke tilrådelig fordi volumet av kollagenalissebufferen som trengs vil øke til >400 ml. Til slutt bør perfusjonstrykk og strømningshastighet være i et passende område. Høyt trykk og strømningshastighet vil føre til levercelledød, mens lavt trykk og strømningshastighet vil føre til utilstrekkelig bufferflyt gjennom de mindre fartøyene10. Under kalsiumfri bufferperfusjon vil trykket i utgangspunktet stige. Men ved kollagenalissebufferperfusjon vil trykket sakte falle over tid siden fordøyelsen av kollagenalus reduserer strømningsmotstanden. Hvis trykkfallet ikke ble observert, kan fordøyelsestiden forlenges etter behov. Siden IPS har den valgfrie trykksensoren, er det mulig å variere gjennomstrømningshastigheten til perfusatet for å kompensere for trykkvariasjoner. På et annet notat, selv om spyling av kretsen med en oksygenator ble brukt i noen protokoller 2,5, fant vi ut at det ikke var kritisk for hepatocytt levedyktighet og utbytte. Dermed inkluderer enheten vår ikke en oksygenator.
I motsetning til den vanlige praksisen med lever fordøyelse før reseksjon, innebærer denne protokollen reseksjon av leveren før fordøyelsen. Tilnærmingen i denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med vanlig praksis. For det første kan over fordøyelsen av leveren unngås. Avhengig av kirurgens dyktighet, lever reseksjon kan ta alt fra 5-10 min. Etter vanlig praksis, selv om perfusjonen er stoppet, tilsvarer dette fortsatt ytterligere 5-10 min der leveren er utsatt for kollagen. Overfordøyelse kan redusere celle levedyktighet og redusere hepatocytt vedlegg og funksjon. For det andre kan denne tilnærmingen potensielt redusere hepatocytttap. Glissons kapsel er mindre sannsynlig å rive når leveren fortsatt er fjærende før fordøyelsen, sammenlignet med når den er myk og grøtaktig etter fordøyelsen. Til slutt muliggjør reseksjon av leveren før fordøyelsen muligheten for kollagenasere resirkulering. Collagenase resirkulering eliminerer forekomsten av mislykkede isolasjoner på grunn av utilstrekkelig volum av kollagenaliser som utarbeides. Vår tilnærming gjør at fordøyelsestiden kan forlenges etter behov. Det har også en liten fordel å redusere mengden kollagenalus som trengs per isolasjon. Den største ulempen ved denne tilnærmingen er at den introduserer et nytt problem med kateteravløsning halvveis under perfusjon, men som kan løses med noen tekniske forholdsregler. En annen forskjell er at denne protokollen ikke innebærer bruk av tetthetsgradient som Percoll. Ved å fjerne døde celler har Percoll blitt rapportert å øke den endelige levedyktigheten til celler med noe tap av utbytte, fra 20% -50%16. Vår celle levedyktighet er høy fordi vi tester og velger kollagenaliser. Fra vår erfaring gir noen kollagenaliser konsekvent lavere levedyktighet. Uten tetthet sentrifugering, vil det være nødvendig å unngå dårlig kollagenalisere mye gjennom tidligere testing. For de som ikke har slik frihet og må vurdere tetthet gradient, omsorg bør gis under Percoll fortynning for å unngå valg av hepatocyt subpopulations med en litt annen metabolsk profil17,18.
Vår tilnærming til å bruke en IPS for primær rotte hepatocyte isolasjon løser flere problemer med eksisterende perfusjonsoppsett 1,2,5,6,7,8,9. Bruk av sterile slanger til engangsbruk sparer tid ved å fjerne behovet for å rengjøre og desinfisere perfusjonsslanger før og etter hver isolasjon. Det reduserer brannfare siden perfusjonsslangen ikke må fylles med brannfarlig 70% etanol når den ikke er i bruk for å opprettholde sterilitet. Risikoen for forurensning på grunn av feil desinfeksjon og lagring kan også elimineres. Viktigst av alt, behovet for rutinemessig utskifting av gamle slanger kan omgås; Denne prosessen er viktig, men er ofte komplisert og tidkrevende. Tilsetningen av et boblefilter til slangen nær kateteret gjør at bobler kan unnslippe før de når kateteret og forhindrer at luft passerer gjennom når perfusjonsbufferen går tom. Bruk av silikonvarmerjakke da temperaturkontrollsystemet tillater presist og stabilt vedlikehold av perfusattemperatur under fordøyelsen, i motsetning til forvarmede buffere som vil avkjøles betydelig over tid. I tillegg er silikonvarmerjakken kompakt og kan enkelt vedlikeholdes, i motsetning til en glassjakke koblet til en vannbadsirkulasjon. Bruk av overvåkingssensorer for temperatur og trykk erstatter optimaliseringstrinnet før isolasjon. Temperaturvariasjon kan oppstå under eller mellom eksperimenter. Trykk (og dermed strømningshastighet) kan også endres på grunn av problemer med perfusjonsrør. Plassering av sensorer i nærheten av kanylen gir mer nøyaktig avlesning av temperaturen på bufferen som parfymerer inn i leveren. Sensoralarmer kan minne brukeren på å iverksette korrigerende tiltak. Den registrerte loggen gjør det også mulig å feilsøke. Bruk av et spesielt IV-kateter for kannkulasjon forenkler kannasjonen av portalvenen. I motsetning til andre typer IV-kateter, tillater kateteret som er beskrevet her væskekommunikasjon mellom kanylen og slangen i både punktering og trukket nålposisjon på grunn av et hull på siden av nålen. Dermed kan kirurger bruke fargeendring av leveren som et tegn på vellykket kannasjon. Ved vellykket kanylering kan nålespissen trekkes tilbake bak kateterspissen for å forhindre repiercing av portalvenen. Den tilbaketrukne nålen kan også fungere som et grunnlag for ligaturen for å sikre portalvenen på den myke kanylen og forhindre at den deformeres. Dette kateteret kan betjenes med en hånd; Derfor kan den ikke-dominerende hånden brukes til å støtte portalvenen med tang. Den kompakte integrerte designen gjør at hele perfusjonsanordningen kan settes inn i laminær hetten, noe som reduserer risikoen for forurensning og sparer plass. Dette er spesielt viktig hvis dyreprosedyren skal utføres i et dedikert dyreanlegg der romtilgjengelighet kan være en utfordring.
Sammenlignet med tidligere rapporterte rotte hepatocytisolasjonsprotokoller ved hjelp av to-trinns kollagenalusperfusjonsprosedyren1, genererer forholdene beskrevet konsekvent høyere celleutbytte på opptil 5 x 108 hepatocytter per isolasjon, celle levedyktighet mellom 88% -94,8% og god hepatocyttspesifikk funksjon.
Denne protokollen kan samtidig brukes til å isolere andre ikke-parenchymale leverceller som Kupffer-celler, leverendotelceller og lever stellate celler fra samme rotte. Denne protokollen kan også modifiseres for isolering av leverceller fra mus ved å bruke et mindre IV-kateter for kannasjon og redusere perfusjonsstrømningshastigheten til et område som passer for musearter6. Perfusjonsprosedyren for mus kan forenkles ved å resecting leveren etter fordøyelsen.
IPS-enheten som brukes i dette eksperimentet kan også brukes til ex vivo leverperfusjonsapplikasjon som eksperimenter på levertransplantasjon samt decellularisering av gnagere og kasserte menneskelige lever19,20. IPS har en fordel der leveren må perfunderes i lange perioder fordi IPS kan overvåke perfusjonsforhold i sanntid og tillate seponering av perfusjonen ved ferdigstillelse enten automatisk eller manuelt med fjernkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zhou Yan og Hanry Yu erklærer konkurrerende interesser når de har egenkapital i Vasinfuse, som produserer og markedsfører det integrerte perfusjonssystemet. Hanry Yu har egenkapital i Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate og Synally Futuristech som ikke har konkurrerende interesser med informasjonen som rapporteres her.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis av MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); og Institutt for bioingeniør og nanoteknologi, Biomedisinsk forskningsråd, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Prosjektnummer IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 og MedCaP-LOA-18-02) finansiering til Hanry Yu. Ng Chan Way er forsker ved National University of Singapore. Vi vil takke Confocal Microscopy Unit &Flow Cytometry Unit ved National University of Singapore for hjelp og råd i hepatocyte renhetsanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
