Summary
Ved hjælp af en selvorganiserende metode udvikler vi en protokol med tilføjelse af COCO, der kan øge dannelsen af fotoreceptorer betydeligt.
Abstract
Retinal celletransplantation er en lovende terapeutisk tilgang, som kan genoprette retinal arkitekturen og stabilisere eller endda forbedre de visuelle evner til den degenererede nethinden. Ikke desto mindre står fremskridt inden for celleudskiftningsterapi i øjeblikket over for udfordringerne ved at kræve en hyldevare med høj kvalitet og standardiserede menneskelige nethinder. Derfor er der brug for en nem og stabil protokol til eksperimenterne. Her udvikler vi en optimeret protokol baseret på en selvorganiserende metode med brug af eksogene molekyler og reagens A samt manuel excision til at generere de tredimensionelle humane nethindeorganoider (RO). Den humane pluripotente stamceller (PSC'er) -afledte RO udtrykker specifikke markører for fotoreceptorer. Med tilsætningen af COCO, en multifunktionel antagonist, øges differentieringseffektiviteten af fotoreceptorprækursorer og kegler signifikant. Den effektive anvendelse af dette system, som har fordelene ved cellelinjer og primære celler, og uden de indkøbsproblemer, der er forbundet med sidstnævnte, kunne producere sammenflydende retinale celler, især fotoreceptorer. Differentieringen af kvikskranker til RO giver således en optimal og biorelevant platform for sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og celletransplantation.
Introduction
Pluripotente stamceller (PSC'er) er kendetegnet ved deres selvfornyelse og evne til at differentiere sig i alle slags somatiske celler. Således er organoider afledt af PSC'er blevet en vigtig ressource inden for forskning i regenerativ medicin. Retinal degeneration er kendetegnet ved tab af fotoreceptorer (stænger og kegler) og retinal pigmentepitel. Udskiftning af retinale celler kan være en opmuntrende behandling af denne sygdom. Det er imidlertid ikke muligt at få humane nethinder til sygdomsforskning og -behandling. Derfor er retinale organoider (RO'er) afledt af PSC'er, som effektivt og med succes rekapitulerer flerlags native retinale celler, gavnlige for grundlæggende og translationel forskning 1,2,3. Vores forskning fokuserer på RO-differentiering for at give tilstrækkelige celler af høj kvalitet til at studere retinal degeneration4.
Metoder til differentiering af RO'er dukker løbende op med tredimensionel (3D) suspensionsdifferentiering, der blev banebrydende af Sasai-laboratoriet i 20125. Vi introducerede CRX-tdTomato-mærket i de humane embryonale stamceller (hESC'er) for specifikt at spore fotoreceptorforløbercellerne og ændrede metoden med tilføjelsen af COCO, en multifunktionel antagonist af Wnt-, TGF-β- og BMP-veje6. COCO har vist sig effektivt at forbedre differentieringseffektiviteten af fotoreceptorprækursorer og kegler 6,7.
Alt i alt har vi ved at ændre den klassiske differentieringsmetode udviklet en tilgængelig protokol til at høste rigelige fotoreceptorforstadier og kegler fra humane RO'er til analyse af nethindesygdommen forbundet med fotoreceptorerne gennem laboratorieundersøgelser og til yderligere klinisk anvendelse / transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle etiske komité på Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC'er blev opnået fra WiCell Research Institute og genetisk manipuleret til tdTomato-mærket cellelinje.
1. Generering af menneskelige RO'er
- Kultur hESC'erne under feederfrie forhold.
- Overtræk en brønd af en 6-brønds plade med 1 ml 0,1 mg / ml reagens A (materialetabel) ved 37 ° C i mindst en halv time efter producentens anvisninger. Tø en aliquot på 1x106 hESCs.
BEMÆRK: Forbered 3 ml forvarmet reagens B (materialetabel) og overfør de kryopræserverede celler (1 ml) til 3 ml frisk medium. HESC'erne må ikke pipetteres til enkelte celler. - Centrifuge ved 200 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Cellerne sås i den reagensbelagte plade med 2 ml reagens B, og der skiftes 2 ml reagens B dagligt. Passageceller, når de når ca. 80% sammenløb (normalt omkring 4 dage).
- Overtræk en brønd af en 6-brønds plade med 1 ml 0,1 mg / ml reagens A (materialetabel) ved 37 ° C i mindst en halv time efter producentens anvisninger. Tø en aliquot på 1x106 hESCs.
- Dag 0
- HESC'er adskilles med en encellet suspension ved hjælp af medium I (tabel 1). Forbered medium I ved at blande følgende: 20% (v / v) KnockOut serumudskiftning (KSR), 0,1 mM MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA), 1 mM pyruvat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng / ml COCO, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (PS), 0,1 mM β-mercaptoethanol og Glasgows Eagles minimale essentielle medium (GMEM).
BEMÆRK: Før dissociationens begyndelse skal du forberede medium I og overføre 12 ml medium I med 20 μM Y-27632 til en 10 cm petriskål, 500 μL reagens C (materialetabel) indeholdende 0,05 mg / ml reagens D (materialetabel) og 20 μM Y-27632 i et 1,5 ml rør. Udfør ovenstående trin i mørke, da komponent IWR1e i medium I er lysfølsom. - Vask hESC'erne med forvarmet 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) buffer.
- Tilsæt det tilberedte 500 μL reagens (i 1,5 ml) røret og inkuber hESC'erne i 3,5 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern cellerne ved at svirpe siden og bunden af pladen i et par sekunder, og tilsæt 500 μL tilberedt medium I fra petriskålen i hESC-pladen.
BEMÆRK: Forbered et 1,5 ml rør med 900 μL 1x DPBS og brug et hæmocytometer til celletælling. - Høst cellerne i et nyt 1,5 ml rør og pipetter cellesuspensionen op og ned, og tag derefter 100 μL ud af røret og tilsæt derefter i røret med 900 μL DPBS til celletælling.
- Den venstre 900 μL cellesuspension sperger, og cellerne fortyndes derefter med tilberedt medium I i petriskålen til 9 x 104 celler/ml.
BEMÆRK: Hele mediets volumen er 12 ml; 1,08 x 106 celler er nødvendige i alt. - Der tilsættes 100 μL cellesuspension til hver brønd i en ikke-klæbende, V-bund, 96-brøndplade (materialetabel).
BEMÆRK: Brug en flerkanalspipette til at forkorte tiden og sikre, at hver brønd indeholder et tilsvarende cellenummer. Ryst petriskålen hver gang, inden du fjerner 100 μL portioner. Det er vigtigt, at cellerne er ensartet fordelt. - Drej let ned i 96-brøndspladen i en lavhastighedsryster i 5 minutter og inkuber derefter ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Hold pladen mørk. Indstil dagen som dag 0.
- HESC'er adskilles med en encellet suspension ved hjælp af medium I (tabel 1). Forbered medium I ved at blande følgende: 20% (v / v) KnockOut serumudskiftning (KSR), 0,1 mM MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA), 1 mM pyruvat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng / ml COCO, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (PS), 0,1 mM β-mercaptoethanol og Glasgows Eagles minimale essentielle medium (GMEM).
- Dag 2
- Tilsæt 1% reagens A (materialetabel). Reagens A (proteinkoncentration på 10 mg/ml) fremstilles ved tilsætning af 133,4 μL reagens A til 2 ml medium I.
BEMÆRK: Reagens A holdes ved 4 °C natten over før brug for at opnå fuldstændig og ensartet smeltning. Bemærk produktinformationen, og søg på katalognummeret og partinummeret på virksomhedens officielle hjemmeside for at få proteinkoncentrationen af reagens A, da hver flaske reagens A har en anden proteinkoncentration. Hvis proteinkoncentrationen er lav, ville et øget volumen af reagens A være nyttigt. - Der tilsættes 20 μL forberedt reagens A til hver brønd og pipetteres to gange i midten for at sprede de døde celler.
BEMÆRK: Vedligehold reagens A og 96-brøndspladen under kølige forhold, og gennemfør alle trin på is. Placer pladen i mørke.
- Tilsæt 1% reagens A (materialetabel). Reagens A (proteinkoncentration på 10 mg/ml) fremstilles ved tilsætning af 133,4 μL reagens A til 2 ml medium I.
- Dag 2-12
- Rengør bunden af 96-brøndspladen, og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 indtil dag 6. På dag 6 ændres halvdelen af mediet ved at fjerne 58 μL af mediet fra hver brønd og tilføje 60 μL medium I.
BEMÆRK: Brug en flerkanalspipette til at fuldføre den halve mellemlange ændring. Udfør dette trin forsigtigt for at sikre, at ingen cellepiller fjernes fra brønden. Aspirer mediet til en ren 10 cm petriskål. Hvis der er cellepiller indeni, skal du tilføje dem tilbage til 96-brøndpladen.
- Rengør bunden af 96-brøndspladen, og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 indtil dag 6. På dag 6 ændres halvdelen af mediet ved at fjerne 58 μL af mediet fra hver brønd og tilføje 60 μL medium I.
- Dag 12-18
- Formatet ændres til medium II (tabel 1) på dag 12. Medium II fremstilles ved anvendelse af 1% (v/v) reagens A ved at blande følgende: 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM pyruvat,100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 100 nM SAG-dihydrochlorid og GMEM. Opbevar det under kølige og mørke forhold.
- Høst cellepillerne i et 15 ml konisk rør fra 96-brøndspladen og lad pellets sætte sig naturligt i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Fjern mediet og pellets forsigtigt under overfladen for at undgå bobler. - Fjern supernatanten, mens du tager dig af organoiderne. Celleaggregaterne overføres til en 10 cm ophængt skål indeholdende 18 ml tilberedt medium II med reagens A.
BEMÆRK: Tilsæt ikke det tilberedte medium II i 10 cm skålen på forhånd, da reagens A skal være ved 4 °C. - Inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 indtil dag 18.
- Fra dag 18 og fremefter
- Formatet ændres til medium III (tabel 1). Forbered medium III under mørke forhold ved at blande følgende: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM retinsyre (RA), 100 μM taurin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin og 1: 1 blanding af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) / næringsblanding F-12.
- På dag 18, når der genereres en halvgennemsigtig optisk vesikel, skal du skære organoiderne ved hjælp af en mikrokirurgisk kniv.
BEMÆRK: Spalte organoiden, normalt i fire stykker, i en petriskål med medium II. Hvert stykke skal vokse til en intakt optisk kop i de følgende uger. - Saml alle pellets til midten af skålen. Høst cellerne i et 15 ml konisk falkerør og lad naturlig bundfældning. Fjern derefter forsigtigt supernatanten.
BEMÆRK: På grund af deres størrelser kan organoider aggregeres i midten ved at dreje petriskålen i en retning i 90 ° på et vandret plan et par gange. - Suspender og disperger pellets i to 10 cm petriskåle med 18 ml medium III pr. skål, og overfør forsigtigt opvasken til inkubatoren for at undgå celleaggregering. Dyrkningen i medium III fortsættes ved 37 °C og 5 % CO2 , og mediet skiftes ugentligt. CRX udtrykt efter dag 45 og indtil dag 120 kunne vi registrere fotoreceptorens udsegment.
2. Analyse af menneskelige RO'er
- FACS-analyse
- Saml tre CRX-tdTomato og tre H9 ES-afledte organoider fra opvasken ved hjælp af de skårne 1 ml spidser. Vask organoiderne med 1 ml forvarmet (stuetemperatur) DPBS.
- Fordøjelsesbufferen fremstilles ved at blande 0,25 % trypsin-EDTA-opløsning med 0,05 mg/ml reagens D.
- Dissocier organoiderne i enkeltceller ved hjælp af den forberedte fordøjelsesbuffer i 8 minutter ved 37 °C. Tilsæt derefter det samme volumen DPBS med 10% FBS og 0,05 mg / ml reagens D for at inaktivere reaktionen.
- Suspender og spred cellerne let og filtrer derefter ved hjælp af en 100 μm cellesi og brug et fluorescensaktiveret cellesorteringssystem (FACS) ved 561 nm excitationslaserlinje og 780/60 filter til at analysere CRX-tdTomato positive signaler.
BEMÆRK: CRX udtrykker oprindeligt på dag 45 og stiger med modningen af organoider. Ti tusind celler bruges til hver test, for hvert tidspunkt udfyldes mindst tre gentagelser.
- Fluorescensintensitetskvantificering af RO'er
- Forbered de levedygtige organoider tilfældigt til billeddannelse.
BEMÆRK: Indstil parametrene, og brug de samme filtre og parametre til alle fluorescensintensitetsmonitorer. - Tag billeder og analyser den gennemsnitlige fluorescensintensitet ved hjælp af passende software (f.eks. ImageJ).
- Importer billederne, og konverter derefter til 8-bit ved hjælp af Image | Skriv her.
- Juster tærsklen ved hjælp af standardparametrene efter Billede | Juster | Tærskel.
- Bestem det målte område, og evaluer derefter den grå værdi ved hjælp af Analysér | Mål.
BEMÆRK: Middelværdierne i resultatpanelet er den gennemsnitlige fluorescensintensitet for det målte område.
- Forbered de levedygtige organoider tilfældigt til billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skematiske illustration viser differentieringsprotokollen for at forbedre forløberceller med COCO (figur 1). Fra PSC til RO'er kan mange detaljer forårsage resultatvariationer. Det anbefales at registrere hvert trin og endda katalognummeret og partinummeret på hvert medium for at spore hele proceduren.
Heri leverer vi lyse feltbilleder til dag 6, 12, 18 og 45 (figur 2). På dag 6 er organoiderne normalt omkring 600 μm i diameter i en 96-brøndplade med tætte forbindelser indeni og lys kant (figur 2A). På dag 12 genereres de optiske vesikellignende strukturer oprindeligt (figur 2B). Fra dag 12 til dag 18 er tilstedeværelsen af optiske vesikelstrukturer klar, og de fortsatte med at vokse efter dag 18. Organoiderne uden den vesikellignende arkitektur kasseres (figur 2C). På dag 30 er den vesikellignende arkitektur mere indlysende, og det er lettere at skelne de overlegne RO'er fra de ringere (figur 2D-E). De organoider, der mister den gennemskinnelige struktur (stjerner i figur 2D-E), skal fjernes i de følgende dage.
Organoiderne udtrykker CRX, som er en markør for fotoreceptorprecursorer, fra dag 45 og fremefter (figur 2F, 2I). Andre fotoreceptorforløbermarkører, såsom RCVRN og OTX2, blev også positivt påvist på dag 45 (figur 2G-H). Tilsætningen af COCO fremmer dannelsen af fotoreceptorforstadier.
Figur 1. Tidsplan for trinvis behandling af RO-differentiering fra hESC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Human retinal organoid generation. (A-B) Tidlig fase optisk vesikellignende struktur dannet i en 96-brøndplade. De sorte pile angiver de optiske vesikellignende strukturer. (C) Den første dag med suspensionskultur i en petriskål på dag 18. (D-E) Optiske kopstrukturer observeres på dette stadium. Stjernerne viser de ringere organoider (F) Det lyse feltbillede på dag 45. Skalabjælker = 400 μm. (G-H) Immunostaining resultater af RCVRN (G) og OTX2 (H) på dag 45. Skalastænger = 50 μm. (I) TdTomat-positive signaler indikerer ekspressionen af CRX på dag 45 i (F). Skalabjælker = 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medium I (50 ml) | ||||||||
| KSR | G-MEM | NEAA | Pyruvat | b-ME | IWR1e | COCO | PS | |
| Procentvis % ELLER endelig koncentration | 20 | 78 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 3 μM | 30 ng/ml | 1 |
| Lydstyrke | 10 ml | 39 ml | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μL | 5 μL | 10 μL | 0,5 ml |
| Butikskoncentrationen af IWR1e er 30 mM. COCO er 150 μg/ml. | ||||||||
| Medium II (50 ml) | ||||||||
| FBS | G-MEM | NEAA | Pyruvat | b-ME | SAG | PS | ||
| Procentvis % ELLER endelig koncentration | 10 | 88 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 100 nm | 1 | |
| Lydstyrke | 5 ml | 44 ml | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μL | 2,5 μL | 0,5 ml | |
| Butikskoncentrationen af SAG er 2 mM. | ||||||||
| Medium III (50 ml) | ||||||||
| FBS | DMEM/F12- Glutamax | Tillæg 1 | RA | Taurin | PS | |||
| Procentvis % ELLER endelig koncentration | 10 | 88 | 1 | 0,5 μM | 100 μM | 1 | ||
| Lydstyrke | 5 ml | 44 ml | 0,5 ml | 5 μL | 50 μL | 0,5 ml | ||
| Butikskoncentrationen af RA er 5 mM, og Taurin er 100 mM. | ||||||||
Tabel 1: Medium I, II og II opskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retinal organoid differentiering er en ønskelig metode til generering af rigelige funktionelle retinale celler. RO er en sammensætning af forskellige retinale celler, såsom ganglionceller, bipolære celler og fotoreceptorer, genereret af pluripotente stamceller mod den neurale nethinde 4,5,8,9. Selvom sammenflydende RO'er kan høstes, er det tidskrævende, hvilket kan kræve lange dyrkningsperioder (op til 180 dage). Til fotoreceptortransplantation eller undersøgelse af keglestang eller stangkegledystrofi er det imidlertid fordelagtigt at opnå en relativt høj procentdel af fotoreceptorer i 3D-dyrkningssystemet10.
Det er også udfordrende at overvåge organoidernes udvikling uden at afbryde de normale udviklingsprocesser. Derfor brugte vi CRX, et keglestangshomeoboxprotein, overvejende udtrykt i fotoreceptorprecursorer, som et målgen til at spore fotoreceptorprecursorceller under deres 3D-differentiering. Med tdTomato-systemet kan CRX-ekspressive celler spores spatio-tidsmæssigt af den røde fluorescens uden at afbryde retinalisering under deres 3D-differentiering. Anvendelsen af CRX-tdTomato-systemet kan fremskynde processen med lægemiddelscreening for fotoreceptorprækursordifferentiering i RO'erne.
Ved hjælp af vores metode kunne omkring 70% organoider udvikle sig til retinale organoider, som viser de vesikellignende strukturer. Det er vigtigt, at vi med snittet af overlegne organoider normalt kunne høste omkring 100 retinale organoider fra en 96-brøndsplade. Derudover genereres rigelige fotoreceptorprecursorer i den tidlige fase af RO-modning med COCO-kulturen, hvilket hjælper progression mod direkte differentiering af visse celler gennem vejregulering11,12. Proteinkoncentrationen af reagens A er afgørende for differentieringen. Alt i alt er tilstrækkeligt reagens A med aggregaterne i de tidlige dage samt skæring af organoiderne på dag 18 vigtigt for at høste rigelige RO'er med høj kvalitet. Denne metode fremmer også udviklingen af retningsbestemt differentiering af fotoreceptorceller i 3D-organoider og bidrager til transplantation af fotoreceptorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af 502 laboratoriet for deres tekniske støtte og nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev delvist støttet af Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
