Summary
Этот протокол описывает, как изучить все возможные комбинации, которые могут быть получены между четырьмя препаратами в одном эксперименте. Этот метод основан на стандартном анализе микроразбавления пластинок 96 скважин и расчете фракционных ингибирующих концентраций (FIC) для оценки результатов.
Abstract
Концепция лекарственно-комбинированной терапии приобретает очень важное значение в основном с резким повышением резистентности к лекарственным препаратам. Четверная шашь, также называемая Q-checkerboard, направлена на максимизацию количества возможных комбинаций, которые могут быть получены между четырьмя препаратами в одном эксперименте, чтобы минимизировать время и работу, необходимые для достижения тех же результатов с другими протоколами. Этот протокол основан на простой технике микроразбавления, где препараты разбавляются и объединяются вместе в нескольких 96-скважинных пластинах.
В первый набор 96-скважинных пластин добавляется бульон Мюллера-Хинтона, за которым следует первый необходимый препарат (например, цефотаксим здесь), чтобы последовательно разбавлять его. После того, как первая ступень выполнена, другой набор 96-скважинных пластин используется для разбавления второго лекарственного средства (например, Amikaci), который будет перенесен путем удаления определенного объема лекарственного средства 2 и помещен в соответствующие колодцы в первый набор пластин из 96-скважин, который содержит лекарственный один. Третий этап делают путем добавления требуемых концентраций третьего лекарственного средства (например, Левофлоксацина) к соответствующим пластинам в исходном наборе, содержащему комбинацию препарата 1 и 2. Четвертый этап делают путем добавления требуемых концентраций четвертого лекарственного средства (например, Триметоприма-сульфаметоксазола) в соответствующие пластины в первом наборе. Затем будет приготовлен и добавлен бактериальный инокулят E. coli ESBL.
Этот метод важен для оценки всех возможных комбинаций и имеет более широкий спектр возможностей для дальнейшего тестирования in vivo. Несмотря на то, что это утомительная техника, требующая большого внимания, результаты замечательны и экономят время, когда множество комбинаций может быть проверено в одном эксперименте.
Introduction
С увеличением резистентности из-за чрезмерного и неправильного использованияантибиотиков 1,2,необходимость разработки новых лекарств и средств для лечения бактериальных инфекций стала решающей. Новые подходы, такие как разработка новых лекарств, очень важны для преодоления кризиса резистентности. Однако фармацевтическая промышленность не заинтересована в разработке новых противомикробных средств. Более того, если будут разработаны новые лекарства, бактерии будут продолжать развиваться и развивать устойчивость к этим новымпрепаратам3,4. Таким образом, проблема резистентности не будет решена, что делает необходимость другого подхода обязательным, который следует рассмотреть и изучить для преодоления бактериальной резистентности.
Комбинация препаратов является очень важным понятием для лечения бактериальных инфекций преимущественно тех, которые вызваны мультилекарственными возбудителями5,6. Уменьшает курс лечения, уменьшает дозу, вводимую; Таким образом, уменьшая токсичность данного препарата, способствует снижению скорости развития резистентности и, в некотором роде, сенсибилизирует бактерии к данным препаратам, как описано в концепции коллатеральнойчувствительности 5,7,8,9.
Развитие резистентности к одному препарату требует одной мутации; однако развитие резистентности к комбинации препаратов, нацеленных на несколько путей, требует нескольких независимых мутаций, которые замедляются этой комбинацией. Примером снижения резистентности при использовании комбинированной терапии является снижение скорости резистентности к рифампину у МикобактерийТуберкулеза 10. Другим примером является исследование, проведенное Gribble et al., которое показало, что скорость появления резистентных штаммов у пациентов, принимающих только Пиперациллин, выше, чем у тех, кто принимал комбинацию карбоксипенициллина и аминогликозид10. Исследования показали, что развитие устойчивости к аминогликозидам у эволюционирующих бактерий сделало эти штаммы чувствительными к различным другим препаратам5. Комбинация между препаратом класса бета-лактам амоксициллином и ингибитором лактамазы клавулановой кислотой показала успех в лечении резистентных бактериальных штаммов8.
Сокращение времени лечения является хорошим преимуществом, полученным в результате комбинаций препаратов. Например, терапия комбинированным пенициллином или цефтриаксоном с гентамицином в течение 2 недель даст такую же эффективность, как и пенициллин или цефтриаксон в одиночку при 4 неделях11. Комбинирование лекарств позволяет использовать более низкие дозы лекарств, которые не эффективны при одном применении, такие как Суб-МИК. Пример сульфаниламидов может быть приведен там, где применение тройных сульфаниламидов минимизирует при более низких дозах токсичность, возникает кристаллообразование или кристаллурия при использовании нерастворимых сульфаниламидов в полных дозах12.
Таким образом, уменьшение дозировки и времени лечения в конечном итоге уменьшит токсичность лекарств для организма. Идея разработки методов оценки взаимодействия между комбинированными препаратами очень важна. В одном исследовании результаты показали, что комбинированная терапия более эффективна для лечения резистентных видов Acinetobacter и P. aeruginosa8.
Давать препараты в комбинации
Существуют различные методы, с помощью которых мы можем изучать комбинации лекарств, такие как метод шашечки, метод кривой временного убийства и методE-теста 13. Метод шашек может изучить все возможные комбинации между двумя рассматриваемыми препаратами в одном эксперименте. Кроме того, он был разработан для изучения комбинации трех препаратов14. Теперь мы расширяем это для изучения комбинации четырех препаратов в основном для лечения патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.
Анализ кривой временного убийства обычно выполняется для проверки бактерицидного эффекта определенного препарата. Он также использовался для проверки эффекта комбинаций лекарств, где несколько препаратов объединяются в определенных концентрациях. Этот протокол требует приготовления нескольких стерильных пробирок или чашек, куда в каждую чашку мы добавляем бульон, комбинацию препаратов и необходимый бактериальный штамм. После инкубации и регистрации оптической плотности в нескольких временных точках результаты сравнивают с нормальной скоростью роста используемого штамма, чтобы увидеть, увеличилась ли скорость роста, уменьшилась или не изменилась13.
Метод E-теста обычно проводится для проверки минимальной ингибирующей концентрации (MIC), когда полоска, содержащая градиентную концентрацию рассматриваемого лекарственного средства, наносится на инокулированную пластину. Он также использовался для тестирования комбинации между двумя препаратами, где две полоски добавляются к пластине перпендикулярным образом, пересекаясь на их МИК13.
Согласно литературе, не существует золотого стандарта для определения и изучения синергии; Таким образом, трудно оценить, какой из методов, используемых для изучения комбинации, лучше, а какой дает лучшие и более достоверные результаты, главным образом13. Тем не менее, анализ Time-kill является трудоемким, трудоемким и дорогим15,16,в то время как метод E-test разработан для изучения комбинации только между двумя препаратами. Шачка может изучать все возможные комбинации между двумя протестированными препаратами, и именно поэтому эта методика была выбрана для разработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Этапы подготовки
- Приготовьте бульон Мюллера-Хинтона (MHB), добавив 25 г бульона MH в 1 л дистиллированной воды и перемешайте. Автоклав при 121 °C в течение 2,5 ч. Затем храните автоклавные среды при комнатной температуре или в холодильнике.
- Субкультура рассматриваемых бактерий(E. coli ESBL) на агаровой среде с использованием метода четырехквадрантного стрейкинга и инкубируется в течение ночи при 37 °C.
- Используя стерильную петлю, возьмите одну колонию и распределите ее в первой половине агартовой пластины Макконки, сделав близкие параллельные полосы.
- Используя петлю, распространите бактерии во втором квадранте, вытесняя их из первого квадранта.
- Из второго квадранта расширяйте полосы в третьем квадранте, используя близкие параллельные полосы.
- Распространите бактерии в центре четвертого квадранта, вытесняя их из третьего квадранта.
2. Подготовка панели
- Поместите четыре 96-колодезные плиты рядом друг с другом, чтобы сформировать квадрат. Используя ленту, скрепите их дно вместе.
- Повторите этот шаг, чтобы получить четыре панели, каждая из которых содержит 4 пластины, и назовите их A1, A2, A3 и A4.
- Добавьте 50 мкл MH бульона в скважины между колонной 2 и колонной 11 в 16 96-ю плитах четырех панелей.
- Добавьте 200 мкл MH бульона в скважину H12, служащей отрицательной контрольной скважиной в 16 96-ю плитах четырех панелей.
- Добавьте 150 мкл MH бульона в скважины A1 и H1, служащие положительными контрольными скважинами в 16 96-скважинных плитах четырех панелей.
3. Препарат 1, Цефотаксим, серийное разведение
- К конической трубке добавляют 15 мл стерильного dH2O.
- Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С1В1 = С2В2. Таким образом, V1 = (C2 x 15 мл) / C1.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае стандартный раствор цефотаксима составляет 105 мкг/мл, аC2 - 256 мкг/мл; таким образом, V1 = 38,4 мкл.
- Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С1В1 = С2В2. Таким образом, V1 = (C2 x 15 мл) / C1.
- Удаляют рассчитанный объем из 15 мл стерильного dH2O, а затем добавляют препарат.
- Пипетка 50 мкл приготовленного раствора лекарственного средства в каждую скважину в колонке 11 и колонке 12, кроме Н12.
- Начните последовательное разбавление, удалив 50 мкл из колонки 11 и поместив его в соответствующие скважины в колонке 10, а затем с 10 до достижения колонки 2, где 50 мкл, взятые из колонки 2, будут выброшены.
- Повторите шаги 3.4 и 3.5 для всех 16 96-скважинных плит четырех панелей.
4. Препарат 2, Амкацин, серийное разведение
- К конической трубке добавляют 10 мл стерильного dH2O.
- Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С1В1 = С2В2. Таким образом, V1 = (C2 x 10 мл) / C1.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае стандартный раствор амикацина составляет 103 мкг/мл, аC2 - 64 мкг/мл; таким образом, V1 = 64 мкл. - Извлекают рассчитанный объем из 10 мл стерильного dH2О,а затем добавляют препарат.
- Возьмем восемь отдельных плит из 96 скважин.
- К каждой пластине добавьте 100 мкл MHB в скважины между рядами G и B.
- Добавляют 100 мкл предварительно приготовленного раствора препарата 2 в колодцы ряда G.
- Разбавляйте последовательно из ряда G в ряд B, беря 100 мкл из каждой скважины, и, наконец, отбрасывайте 100 мкл из скважин ряда B.
- Повторите шаги 4.5, 4.6 и 4.7, чтобы подготовить восемь пластин.
5. Перенос препарата 2 на четыре панели
- Пипетка 50 мкл препарата 2 из скважин между рядами G и B в соответствующие колодцы в каждой пластине в четырех панелях. Одна подготовленная 96-скважинная пластина содержит 100 мкл препарата 2, чего достаточно для двух пластин в одной панели.
6. Препарат 3, Левофлоксацин, дополнение
- К четырем различным коническим трубкам добавить 14 мл стерильного dH2O.
- Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С1В1 = С2В2. Таким образом, V1 = (C2 x 14 мл) / C1.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае Левофлоксацин получают в четырех различных концентрациях из запасного раствора 5 х 103 мкг/мл.
C1 = 2 мкг/мл, V1 = 5,6 мкл
C2 = 4 мкг/мл, V1 = 11,2 мкл
C3 = 8 мкг/мл, V1 = 22,4 мкл
C4 = 16 мкг/мл, V1 = 44,8 мкл - Из каждой пробирки удаляют рассчитанный объем из 14 мл стерильного dH2O, а затем добавляют препарат.
- После получения требуемых концентраций третьего лекарственного средства берут 50 мкл и добавляют его в соответствующие колодцы между рядами B и G и колонками 2 и 12 в соответствующей пластине в каждой панели, где C1 соответствует четырем пластинам P1 в четырех панелях, C2 соответствует четырем пластинам P2 в четырех панелях. , C3 соответствует четырем пластинам P3 в четырех панелях, а C4 соответствует четырем пластинам P4 в четырех панелях.
7. Препарат 4, Триметоприм-сульфаметоксазол, добавление
- К конической трубке добавляют 14 мл стерильного dH2O.
- Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С1В1 = С2В2. Таким образом, V1 = (C2 x 14 мл) / C1.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае триметоприм-сульфаметоксазол получают в четырех различных концентрациях из запасного раствора 48 х10 3 мкг/мл.
C1 = 512 мкг/мл, V1 = 149,33 мкл
C2 = 1024 мкг/мл, V1 = 298,66 мкл
C3 = 2048 мкг/мл, V1 = 597,33 мкл
C4 = 4096 мкг/мл, V1 = 1 194,66 мкл - Извлекают рассчитанный объем из 14 мл стерильного dH2O каждого пробирки, а затем добавляют препарат.
- После получения требуемых концентраций четвертого лекарственного средства берут 50 мкл и добавляют его в соответствующие колодцы между рядами B и G и колонками 2 и 12 в четырех пластинах в соответствующей панели, где C1 соответствует панели 1, C2 соответствует панели 2, C3 соответствует панели 3, а C4 соответствует панели 4.
8. Получение и добавление бактериального инокулятного E. coli ESBL
- Используя стерильную петлю, перенесите одну колонию бактериального изолята E. coli ESBL, предварительно культивированного на пластине, в 2 мл стерильного MHB и вихря.
- Проверьте мутность там, где она должна быть 0,5 Макфарланда с помощью денситометра.
- Добавьте 80 мл стерильного бульона MH в стерильную чашку для мочи.
- Добавьте бактериальный инокулят из инокулята 0,5 Макфарланда в чашку для мочи после C1V1 = C 2 V2, где V1 =(10 6 x 80 мл) / 108 = 800 мкл.
- Пипетка 50 мкл раствора инокулята 106 КОЕ/мл в каждую скважину, кроме H12, которая является скважиной контроля стерильности.
- Инкубировать панели при 37 °C в течение ночи.
- После инкубации добавляют 50 мкл йодотетразолия для регистрации роста в скважинах.
9. Протокол для шаблона FIC (Дополнительный файл)
- Напишите самую высокую концентрацию препарата 1 (Цефотаксима) в желтой клетке на панели А.
- Напишите наибольшую концентрацию препарата 2 (амикацина) в желтой клетке на панели В.
- Напишите самую высокую концентрацию препарата 3 (Левофлоксацин) в желтой клетке в панели С.
- Напишите наибольшую концентрацию препарата 4 (Триметоприм-сульфаметоксазол) в панели D.
- Проследите красную линию (интерфейс «Рост/отсутствие роста»), выделив скважины с ростом красным цветом.
- Запишите МИК препарата 1 в таблице препарата 1 (АТБ1).
- Впишите МИК препарата 2 в таблицу препарата 2 (АТБ2).
- Впишите МИК препарата 3 в таблицу препарата 3 (АТБ3).
- Впишите МИК препарата 4 в таблицу препарата 4 (АТБ4).
- Расчет СИИ для ATB1
- Определите скважины на интерфейсе «Рост/отсутствие роста».
- В таблице ATB1 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели A к первому выбранному колодецу.
- Повторите шаг 9.10.2 для каждой выбранной скважины, где скважина 1 соответствует FIC1, скважина 2 соответствует FIC2 и так далее.
- Рассчитать СИИ для ATB2
- В таблице ATB2 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели B к первому предварительно выбранному колодецу.
- Повторите шаг 9.11.1 для каждой предварительно выбранной скважины.
- Рассчитать СИИ для ATB3
- В таблице ATB3 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели C к первому предварительно выбранному колодецу.
- Повторите шаг 9.12.1 для каждой предварительно выбранной скважины.
- Расчет СИИ для ATB4
- В таблице ATB4 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели D к первому предварительно выбранному колодецу.
- Повторите шаг 9.13.1 для каждой предварительно выбранной скважины.
- В таблице ATB1+2+3+4 суммируйте FIC1 каждого ATB автоматически. То же самое произойдет и с другими FIC (FIC2, FIC3 и т. д.).
- В ячейке, содержащей FIC и выделенной желтым цветом, дважды щелкните по ней и выберите суммированные ΣФИК из таблицы ATB1+2+3+4.
- Повторите эти шаги для каждого из девяти листов, представляющих девять пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В листе FIC all, таблица покажет окончательный суммированный FIC с интерпретацией полученного значения.
10. Определение МИК с использованием микроразведывного анализа для четырех препаратов
- Маркируйте четыре разных ряда с аббревиатурой каждого тестируемого препарата. Например, CTX для Цефотаксима, AMK для амикацина, LEVO для Левофлоксацина и SXT для Триметоприма-сульфаметоксазола.
- Пипетка 200 мкл стерильного бульона Мюллера Хинтона в скважину No1 и скважину No12 в каждом используемом ряду. Скважина No12 будет служить отрицательным контрольным колодец.
- Пипетка 100 мкл стерильного бульона Мюллера Хинтона в колодцы от 2 до 11 в каждом использованном ряду.
- Рассчитайте объем каждого добавляемого лекарственного средства по формуле С1В1 =С2В2. Таким образом, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 - конечный объем в скважинах, который составляет 200 мкл, C1 - концентрация запасного раствора, а C2 - начальная концентрация, которую мы должны иметь в первой скважине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем следующее:
Цефотаксим:С1 = 105 мкг/мл, где мы разбавляем его до 104 мкг/мл,С2 = 256 мкг/мл; таким образом, V1 = 20,48 мкл
Амикацин: C1 =10 3 мкг/мл, C2 = 64 мкг/мл; таким образом, V1 = 51,2 мкл
Левофлоксацин:С1 = 5 х 103 мкг/мл, где мы разбавляем его до 5х 10 2 мкг/мл,С2 = 16 мкг/мл; таким образом, V1 = 25,6 мкл
Триметоприм-сульфаметоксазол:С1 = 48 х10 3 мкг/мл,С2 = 4096 мкг/мл; таким образом, V1 = 68,26 мкл - Пипетка необходимого объема для каждого лекарственного средства в первой скважине соответствующего ряда после удаления такого же объема из 200 мкл бульона для получения общего объема 200 мкл после добавления препарата.
- Последовательно разбавляйте путем удаления 100 мкл из скважины 1 в скважину 2 и так далее до достижения скважины 10, где 100 мкл, удаленные из скважины 10, будут выброшены. Обратите внимание, что колодец 11 служит положительным контрольным колодец.
- Пипетка 100 мкл из 106 приготовленных бактериальных инокулята в каждую скважину в каждом используемом ряду, за исключением скважины No 12, служащей отрицательным контролем.
- Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фиг.2А представляет результаты, полученные путем комбинирования цефотаксима и амикацина со специфическими концентрациями левофлоксацина и триметоприма-сульфаметоксазола. Мы можем видеть в левой части рисунка четыре пластины, которые схематично представлены с концентрациями лекарств в правой части рисунка. Стрелки представляют скважины на интерфейсе Рост/нет Роста. Цветные колодцы – это колодцы, которые содержат рост. Заметим, что четвертая пластина не содержит роста в квадранте, содержащем комбинацию. Это связано с тем, что в этой пластине у нас есть MIC левофлоксацина, который будет ингибировать рост. На этом рисунке мы видим, что в скважине А8 полученА ВПК цефотаксима, что равно 32 мкг/мл. В скважине Е1 получают МИК Амикацина, что равно 16 мкг/мл. Эффект ингибирования наблюдается в ряду, содержащем 1/2 МИК амикацина (ряд D) в дополнение к нескольким субМИК цефотаксима и левофлоксацина в дополнение к 1/8 МГК триметоприма-сульфаметоксазола. Это ингибирование роста бактерий в скважинах, содержащих субМИК-концентрации, может быть формой синергизма между этими концентрациями четырех препаратов.
На фиг.2В представлены результаты, полученные путем комбинирования цефотаксима и амикацина со специфическими концентрациями левофлоксацина и триметоприма-сульфаметоксазола. Мы можем видеть в левой части рисунка четыре пластины, которые схематично представлены с концентрациями лекарств в правой части рисунка. Стрелки представляют скважины на интерфейсе Рост/нет Роста. Цветные колодцы – это колодцы, которые содержат рост. Следуйте той же интерпретации для четвертой пластины. На панели, представленной на этом рисунке, мы видим, что картина ингибирования роста бактерий происходила и в ряду D, где скважины содержат субМИК цефотаксима и левофлоксацина, 1/2 МИК амикацина и 1/4 МГПК триметоприма-сульфаметоксазола.
Фиг.2С представляет результаты, полученные путем комбинирования цефотаксима и амикацина со специфическими концентрациями левофлоксацина и триметоприма-сульфаметоксазола. Мы можем видеть в левой части рисунка четыре пластины, которые схематично представлены с концентрациями лекарств в правой части рисунка. Стрелки представляют скважины на интерфейсе Рост/нет Роста. Цветные колодцы – это колодцы, которые содержат рост. Следуйте той же интерпретации для четвертой пластины. Что касается паттерна торможения на этой панели, то мы видим, что в рядах C и D роста не наблюдается. Это означает, что в скважинах содержится несколько субСМИК цефотаксима и левофлоксацина в дополнение к 1/2 МГПК триметоприма-сульфаметоксазола и 1/4 МГПК и 1/2 МГПК амикацина.
На рисунке 2D представлены результаты, полученные путем комбинирования цефотаксима и амикацина со специфическими концентрациями левофлоксацина и триметоприма-сульфаметоксазола. Мы можем видеть в левой части рисунка четыре пластины, которые схематично представлены с концентрациями лекарств в правой части рисунка. Стрелки представляют скважины на интерфейсе Рост/нет Роста. Следуйте той же интерпретации для четвертой пластины. Мы видим, что только в строке A и столбце 1 мы имеем цветные колодцы, означающие рост. Это связано с тем, что в этой панели у нас есть МИК триметоприма-сульфаметоксазола, который будет полностью ингибировать рост.
Рисунок 1:Схема установки и панелей Q-checkerboard и карта добавления лекарств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Экспериментальные результаты, полученные в испытании 1 для определенных протестированных комбинаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод четверной шаховой доски напоминает в своем протоколе шаховую доску и трехмерную шакерную доску. Тем не менее, некоторые важные шаги должны быть приняты во внимание, чтобы избежать ошибок во время эксперимента.
Обязательно проверьте MIC каждого лекарственного средства против тестируемого изолята перед началом протокола, чтобы знать, какие концентрации необходимы для начала разведений для препарата 1 и препарата 2, которые необходимо последовательно разбавлять в пластинах. Что касается лекарственного средства 3 и лекарственного средства 4, то следует также знать, что MIC рассчитывает концентрации, которые необходимо протестировать (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC и MIC). Существует множество методов определения MIC, но лучше всего определить его с помощью метода микроразбавления, поскольку протокол Q-checkerboard также использует анализ микроразбавления для последовательного разбавления.
На первом этапе, во время заклеивания пластин, убедитесь, что скамейка чистая и накройте пластины стерильными крышками, чтобы избежать загрязнения. Важно отметить, что этот протокол может быть выполнен с использованием четырех 96-скважинных пластин, представляющих четыре панели, где каждая пластина разделена на четыре меньших квадранта. Однако количество разведений будет сведено к минимуму для первого и второго препарата. Кроме того, можно также использовать глубокие колодезные плиты на 384 скважины вместо того, чтобы склеивать четыре пластины вместе. Тем не менее, он не был доступен, когда мы проводили эксперименты. Обратите внимание, что при выборе плиты для использования обязательно проверяйте емкость каждой скважины, так как конечный объем в скважине составит 250 мкл.
Причем количество пластин в каждой панели и количество панелей зависит от количества разведений, которые требуются для третьего и четвертого препарата. Например, в этом эксперименте требовалось четыре разведения третьего препарата и четыре разведения четвертого лекарственного средства (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC и MIC); таким образом, у нас было четыре пластины в каждой панели и четыре панели.
Разведение первого препарата происходит в пластинах панелей по колонкам. Однако разведение второго препарата происходит в отдельных пластинах по рядам. Третий и четвертый препараты серийно не разбавляются. Однако каждую используемую концентрацию готовят в отдельной пробирке и добавляют в каждую скважину в определенном объеме. Важно отметить, что колодцы, содержащие четыре препарата, присутствуют только в квадранте между строками G и B и столбцами 2 и 12. Протоколы шашек и трехмерных шашек не были сняты на пленку или написаны в этой рукописи, потому что они являются известными протоколами, и цель этой рукописи - рассказать о протоколе Q-checkerboard. В технике шашь ряд А содержит только препарат 1; таким образом, показывая МИК препарата 1. Колонка 1 содержит только препарат 2; таким образом, показывая МИК препарата 2.
Эта концепция сохранена в протоколе Q-Checkerboard, где МИК лекарственного средства 1 по-прежнему показан в строке А, а МИК лекарственного средства 2 по-прежнему показан в колонке 1. В дополнение к этому, два добавленных препарата представляют свой MIC в эксперименте. Препарат 3 имеет пластину P4 в каждой панели, где МИК лекарственного средства 3 добавляется ко всем колодцам, поэтому мы не должны наблюдать рост в этой пластине. Аналогичным образом, лекарственное средство 4 имеет панель А4, где МИК лекарственного средства 4 добавляется ко всем колодцам во всех пластинах на панели 4, поэтому на этой панели не следует наблюдать роста.
Рост плит регистрируется на основе мутности в скважинах, где мутные скважины считаются имея рост. В дополнение к мутности добавляют 50 мкл йодотетразолиума и оставляют на несколько минут. Изменение цвета на розовый означает, что есть рост.
Этот метод имеет определенные ограничения. Это требует тяжелой работы и сосредоточенности. Ошибки пипетирования могут возникать, поскольку этот метод основан главным образом на пипете. Расчеты FIC в данном случае считаются ограничением, поскольку мы имеем дело с четырьмя значениями, а не с двумя или тремя. Добавление стоимости увеличит стоимость СИИ в скважине; таким образом, ценности СИИ, определяющие синергизм, безразличие и антагонизм, должны быть пересмотрены.
Значения FIC могут меняться между несколькими ссылками, касающимися стандартов, с помощью которых определяются синергизм, антагонизм и безразличие. В некоторых ссылках говорится, что FIC 0,5 и менее считается синергизмом13,в то время как другие утверждают, что FIC менее 0,8 считается синергизмом16. В другой ссылке говорится, что FIC менее 1 считается синергизмом17. Из-за нестабильности и конфликта в определении единого стандарта синергизма мы считали 1 нашим ориентиром.
Окончательный FIC рассчитывается путем сложения значений FIC каждой пластины (9 FIC) и деления их на число пластин, которое составляет 9. Важно отметить, что панель 4 не учитывается в результатах, поскольку она содержит МИК четвертого препарата, поэтому ингибирование будет работать одним препаратом. Кроме того, пластина 4 в каждой панели также не рассматривается, поскольку она содержит МИК лекарственного средства 3, где ингибирование в этой пластине будет действовать только лекарственного средства 3. Таким образом, мы в итоге имеем 9 пластин (16 - (4 + 3)).
Для каждой пластины FIC рассчитываются для скважин на границе раздела Growth/no Growth по следующей формуле: (MIC лекарственного средства 1 в комбинации / MIC лекарственного средства 1 только) + (MIC лекарственного средства 2 в комбинации / MIC лекарственного средства 2 только) + (MIC лекарственного средства 3 в комбинации / MIC лекарственного средства 3 только) + (MIC лекарственного средства 4 в комбинации / MIC лекарственного средства 4 только). Затем полученное число делится на 4. Эта формула выполняется для каждой скважины на интерфейсе Growth/no Growth в одной пластине. Затем все FIC одной и той же пластины суммируются вместе, чтобы получить FIC этой пластины. Наконец, как упоминалось ранее, 9 окончательных FIC каждой таблички добавляются и делятся на 9 для получения окончательного FIC, который будет интерпретироваться.
FIC менее 1 считается синергетическим, где он имеет определенную степень синергизма: он либо слегка синергетический (близкий к одному), либо более синергетический (когда он движется к 0,5 и менее). Этот расчет и интерпретация просто выполняются с использованием шаблона FIC, который мы разработали. Мы просто вводим концентрации, выбираем скважины на интерфейсе Growth/no Growth для расчета FIC, и мы получим окончательный FIC, который интерпретируется в соответствии с упомянутыми критериями.
Этот метод позволяет тестировать все возможные комбинации, которые могут быть сделаны с использованием четырех препаратов в одном эксперименте, который может быть сделан за один день. Результаты получаются на следующий день. Принимая во внимание, что к анализу кривой убойного времени требуется больше времени, рабочих материалов и лабораторных работников для тестирования одинакового количества комбинаций, поскольку каждый набор комбинаций тестируется отдельно в одной трубке или чашке, что отнимает много времени. Этот метод может быть использован не только для тестирования комбинаций антибактериальных препаратов, но и для тестирования всех видов препаратов, используемых для лечения заболеваний и необходимо тестировать в комбинации. Его можно использовать также для тестирования комбинации лекарств и растительных экстрактов или даже комбинации только растительных экстрактов. Дело в том, что этот метод можно использовать для тестирования не только конкретных препаратов, но и всего, что можно комбинировать.
Этот метод сопровождается несколькими ограничениями. Навыки пипетирования очень важны при выполнении этого анализа, и любая ошибка, которая может возникнуть при пипетке и последовательном разбавлении, может негативно повлиять на результаты и может привести к ложноотрицательным или ложноположительным результатам. Таким образом, любые технологические достижения, касающиеся пипетки и роботов, будут очень хороши в выполнении этого анализа. Этот метод требует много вычислений и разбавлений, поэтому любая ошибка может изменить результат результатов. Этот метод дает представление только об эффекте торможения, а не об убийственном эффекте. Этот метод изучает торможение в один момент времени, а не во времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
никакой.
Acknowledgments
никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
- Ibezim, E.
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C.
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S.
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
