Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.
Abstract
הרעיון של טיפול בשילוב תרופות הופך להיות חשוב מאוד בעיקר עם עלייה דרסטית בהתנגדות לתרופות. לוח השחמט Quadruple, המכונה גם Q-checkerboard, שואפת למקסם את מספר השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד כדי למזער את הזמן והעבודה הדרושים כדי להשיג את אותן תוצאות עם פרוטוקולים אחרים. פרוטוקול זה מבוסס על טכניקת דילול מיקרו פשוט שבו התרופות מדוללות ומשולבים יחד בכמה צלחות 96-באר.
בסט הראשון של צלחות 96-באר, מרק מולר-הינטון מתווסף ואחריו התרופה הנדרשת הראשונה (למשל, Cefotaxime כאן) כדי לדלל אותו באופן סדרתי. לאחר הצעד הראשון נעשה, קבוצה נוספת של צלחות 96-באר משמש כדי לדלל את התרופה השנייה (למשל, Amikaci), אשר יועברו על ידי הסרת נפח מסוים של תרופה 2 ולשים את בארות המקבילה בסט הראשון של צלחות 96-באר המכיל תרופה אחת. השלב השלישי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית (למשל, Levofloxacin), ללוחות המתאימים בסט הראשוני המכיל שילוב של תרופה 1 ו -2. השלב הרביעי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית (למשל, Trimethoprim-sulfamethoxazol) לתוך הצלחות המתאימות במערכה הראשונה. לאחר מכן, אי קולי ESBL אינוקולום חיידקי יהיה מוכן והוסיף.
שיטה זו חשובה כדי להעריך את כל השילובים האפשריים ויש לו מגוון רחב יותר של אפשרויות להיבדק יתר על כן עבור בדיקות vivo. למרות היותו טכניקה מעייפת הדורשת הרבה מיקוד, התוצאות הן מדהימות וחיסכון בזמן שבו הרבה שילובים ניתן לבחון בניסוי אחד.
Introduction
עם העלייה בהתנגדות עקב שימוש יתר ושימוש לרעה שלאנטיביוטיקה 1,2, הצורך לפתח תרופות חדשות וסוכנים לטיפול בזיהומים חיידקיים הפך חיוני. גישות חדשות כגון פיתוח תרופות חדשות חשובות מאוד כדי להתגבר על משבר ההתנגדות. עם זאת, תעשיית התרופות אינה מעוניינת לפתח סוכנים מיקרוביאלית חדשים. יתר על כן, אם תרופות חדשות מפותחות, חיידקים ימשיכו להתפתח ולפתח עמידות נגד תרופות חדשות אלה3,4. לכן, בעיית ההתנגדות לא תיפתר, מה שהופך את הצורך בגישה אחרת חובה שיש לשקול וללמוד כדי להתגבר על עמידות חיידקים.
שילוב תרופות הוא מושג חשוב מאוד לטיפול בזיהומים חיידקיים בעיקר אלה הנגרמים על ידי פתוגנים עמידים multidrug5,6. זה מקטין את מהלך הטיפול, מקטין את המינון שניתן; לכן, הפחתת הרעילות של התרופה הנתונה, מסייעת בהפחתת קצב התפתחות ההתנגדות, ובמובן מסוים, רגישה את החיידקים לתרופות הנתונות כמתואר במושג רגישות בטחונות5,7,8,9.
פיתוח התנגדות לתרופה אחת דורש מוטציה אחת; עם זאת, פיתוח ההתנגדות לשילוב של תרופות המכוונות למסלולים מרובים דורש מספר מוטציות עצמאיות המואטות על ידי שילוב זה. דוגמה לירידה בהתנגדות בעת שימוש בטיפול משולב היא ירידה בשיעור ההתנגדות לריפאמפין בשחפת מיקובקטריום10. דוגמה נוספת היא מחקר שנעשה על ידי Gribble et al. שהראה את קצב הופעתם של זנים עמידים בחולים הנוטלים פייפרצילין לבד להיות גבוה יותר מאשר אלה הנוטלים שילוב של carboxypenicillin ו aminoglycoside10. מחקרים הראו כי התפתחות ההתנגדות aminoglycosides בחיידקים מתפתחים עשה זנים אלה רגישים לתרופות שונות אחרות5. השילוב בין אמוקסיצילין תרופה ברמה בטא לקטם לבין חומצה clavulanic מעכב לקטמה הראההצלחהבטיפול זנים חיידקיים עמידים 8 .
הפחתת זמן הטיפול היא יתרון טוב הנובע משילובי תרופות. לדוגמה, טיפול של פניצילין משולב או ceftriaxone עם gentamicin במשך 2 שבועות ייתן את אותה יעילות שניתנה על ידי פניצילין או ceftriaxone לבד כאשר ניתנת במשך 4 שבועות11. שילוב תרופות מאפשר שימוש במינונים נמוכים יותר של תרופות שאינן יעילות כאשר ניתנות לבד כגון תת MICs. הדוגמה של sulfonamides ניתן לתת שבו השימוש של sulfonamides משולש ממזער, במינונים נמוכים יותר, הרעילות המיוצרת שהיא היווצרות גביש או crystalluria בעת שימוש sulfonamides מסיס במינונים מלאים12.
לכן, הפחתת המינון שניתן ואת זמן הטיפול בסופו של דבר להקטין את הרעילות של התרופות על הגוף. הרעיון של פיתוח שיטות להערכת האינטראקציה בין תרופות משולבות חשוב מאוד. במחקר אחד, התוצאות הראו כי טיפול משולב יעיל יותר לטיפול במינים עמידים של Acinetobacter ו P. aeruginosa8.
מתן תרופות בשילוב
ישנן שיטות שונות שבאמצעותן אנו יכולים ללמוד שילובי תרופות, כגון שיטת לוח השחמט, שיטת עקומת זמן להרוג, ואת שיטת E-test13. שיטת לוח השחמט יכולה לחקור את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות המדוברות בניסוי אחד עצמו. בנוסף, הוא פותח כדי ללמוד שילוב של שלוש תרופות14. עכשיו, אנו מרחיבים את זה כדי ללמוד שילוב של ארבע תרופות בעיקר לטיפול של פתוגנים עמידים multidrug.
הבדיקה עקומת להרוג זמן מבוצעת בדרך כלל כדי לבדוק את ההשפעה bactericidal של תרופה מסוימת. זה שימש גם כדי לבדוק את ההשפעה של שילובי סמים שבו מספר תרופות משולבות בריכוזים ספציפיים. פרוטוקול זה דורש הכנה של כמה צינורות סטריליים או כוסות שבו בכל אנו מוסיפים את המרק, שילוב של תרופות, ואת הזן החיידקי הנדרש. לאחר הדגירה והרישום של הצפיפות האופטית במספר נקודות זמן, התוצאות מושוות לקצב הצמיחה הרגיל של הזן המשומש כדי לראות אם קצב הצמיחה גדל, ירד או לא השתנה13.
שיטת בדיקה אלקטרונית נעשית בדרך כלל כדי לבדוק את הריכוז המעכב המינימלי (MIC) שבו רצועה המכילה ריכוז שיפוע של התרופה המדוברת הוא לשים על צלחת מחוסן. זה שימש גם כדי לבדוק את השילוב בין שתי תרופות שבו שתי רצועות מתווספים לצלחת באופן ניצב מצטלבים ב MICs שלהם13.
על פי הספרות, אין תקן זהב להגדיר וללמוד סינרגיה; לכן, קשה להעריך איזו מהשיטות המשמשות ללימוד שילוב היא טובה יותר ואיזה מהם מייצר תוצאות טובות ואמינות יותר בעיקר13. עם זאת, זמן להרוג assay הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ויקר15,16, בעוד שיטת E-test מפותחת ללמוד שילוב בין שתי תרופות בלבד. Checkerboard יכול ללמוד את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות שנבדקו ולכן טכניקה זו נבחרה להיות מפותחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שלבי הכנה
- הכן מרק מולר-הינטון (MHB) על ידי הוספת 25 גרם מרק MH ל 1 L של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלאב ב 121 °C (69 °F) עבור 2.5 שעות. לאחר מכן, לאחסן את המדיה autoclaved בטמפרטורת החדר או במקרר.
- תת-תרבות החיידקים המדוברים(E. coli ESBL) על מדיה אגר באמצעות שיטת פסים ארבעה רבעים דגירה לילה ב 37 °C (69 °F).
- באמצעות לולאה סטרילית, לקחת מושבה אחת ולהפיץ אותו במחצית הראשונה של צלחת אגר MacConkey על ידי ביצוע פסים מקבילים קרובים.
- באמצעות הלולאה, להפיץ את החיידקים ברביע השני על ידי פסים אותו מהרביע הראשון.
- מהרביע השני, הארך את הפסים ברבע השלישי באמצעות פסים מקבילים קרובים.
- להפיץ את החיידקים במרכז הרבע הרביעי על ידי פסים אותו מן הרבע השלישי.
2. הכנת פאנל
- מניחים ארבעה צלחות 96-באר אחד ליד השני כדי ליצור ריבוע. באמצעות קלטת, הדבק את תחתיתם יחד.
- חזור על שלב זה כדי להשיג ארבעה לוחות שכל אחד מהם מכיל 4 לוחות ותן להם שם A1, A2, A3 ו- A4.
- הוסף 50 μL של מרק MH לבארות בין עמודה 2 ועמודה 11 ב 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.
- הוסף 200 μL של מרק MH לבאר H12 המשמש היטב שליטה שלילית 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.
- הוסף 150 μL של מרק MH לבארות A1 ו- H1 המשמשים בארות בקרה חיוביות ב 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.
3. סמים 1, Cefotaxime, דילול סדרתי
- לצינור חרוט, להוסיף 15 מ"ל של dH סטרילי2O.
- לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 15 מ"ל) / C1.
הערה: במקרה שלנו, פתרון מניית Cefotaxime הוא 105 מיקרוגרם / מ"ל ו C2 הוא 256 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 38.4 μL.
- לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 15 מ"ל) / C1.
- הסר את הנפח המחושב מ 15 מ"ל של dHסטרילי 2O, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
- פיפט 50 μL של פתרון התרופה מוכן לתוך כל באר בעמודה 11 וטור 12 למעט H12.
- התחל את הדילול הטורי על-ידי הסרת 50 μL מעמודה 11 והכנסתו לבארות המתאימות בעמודה 10 ולאחר מכן מ- 10 עד להגעה לעמודה 2 שבה 50 μL שנלקח מעמודה 2 יימחקו.
- חזור על שלבים 3.4 ו- 3.5 עבור כל 16 לוחות 96-באר של ארבעת הלוחות.
4. סמים 2, אמקאצ'ין, דילול סדרתי
- לצינור חרוט, להוסיף 10 מ"ל של dH סטרילי2O.
- לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 10 מ"ל) / C1.
הערה: במקרה שלנו, פתרון מלאי Amikacin הוא 103 מיקרוגרם / מ"ל ו C2 הוא 64 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 64 μL. - הסר את הנפח המחושב מ 10 מ"ל של dHסטרילי 2O, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
- קח שמונה צלחות נפרדות של 96 באר.
- לכל צלחת, להוסיף 100 μL של MHB לבארות בין שורות G ו- B.
- הוסף 100 μL של התרופה שהוכנה בעבר 2 פתרון בארות של שורה G.
- לדלל באופן סדרתי משורה G לשורה B על ידי לקיחת 100 μL מכל באר ולבסוף להשליך את 100 μL מן בארות שורה B.
- חזור על שלבים 4.5, 4.6 ו- 4.7 כדי להכין שמונה צלחות.
5. העברת תרופה 2 לארבעת הפאנלים
- פיפטה 50 μL של תרופה 2 מן הבארות בין שורות G ו- B לתוך בארות המקביל בכל צלחת בארבעת הלוחות. צלחת אחת מוכנה 96-באר מכיל 100 μL של תרופה 2 זה מספיק עבור שתי צלחות בפאנל אחד.
6. תרופה 3, לבופלוקסאצין, תוספת
- לארבעה צינורות חרוט שונים, להוסיף 14 מ"ל של dH סטרילי2O.
- לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 14 מ"ל) / C1.
הערה: במקרה שלנו, Levofloxacin מוכן בארבעה ריכוזים שונים מפתרון מלאי של 5 x 103 מיקרוגרם / מ"ל.
C1 = 2 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 5.6 μL
C2 = 4 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 11.2 μL
C3 = 8 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 22.4 μL
C4 = 16 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 44.8 μL - הסר את הנפח המחושב מ 14 מ"ל של dH סטרילי2O מכל צינור, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
- לאחר הכנת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית, לקחת 50 μL ולהוסיף אותו בארות המתאימות בין שורות B ו- G ועמודות 2 ו 12 בצלחת המתאימה בכל פאנל שבו C1 מתאים לארבעת לוחות P1 בארבעת הלוחות, C2 מתאים לארבעת לוחות P2 בארבעת הלוחות C3 מתאים לארבעת לוחות ה-P3 בארבעת הלוחות, ו-C4 מתאים לארבעת לוחות ה-P4 בארבעת הלוחות.
7. תרופה 4, טרימתופרים-סולפטוקסזול, בנוסף
- לצינור חרוט, להוסיף 14 מ"ל של dH סטרילי2O.
- לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 14 מ"ל) / C1.
הערה: במקרה שלנו, trimethoprim-sulfamethoxazole מוכן בארבעה ריכוזים שונים מפתרון מלאי של 48 x 103 מיקרוגרם / מ"ל.
C1 = 512 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 149.33 μL
C2 = 1024 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 298.66 μL
C3 = 2048 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 597.33 μL
C4 = 4096 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 1 194.66 μL - הסר את הנפח המחושב מ 14 מ"ל של dH סטרילי2O של כל צינור, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
- לאחר הכנת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית, לקחת 50 μL ולהוסיף אותו בארות המתאימות בין שורות B ו- G ועמודות 2 ו 12 בארבע הצלחות בלוח המתאים שבו C1 מתאים פאנל 1, C2 מתאים פאנל 2, C3 מתאים פאנל 3, ו C4 מתאים פאנל 4.
8. הכנה ותוספת של אינקולום חיידקי E. קולי ESBL
- באמצעות לולאה סטרילית, להעביר מושבה אחת של איזולט חיידקי E. coli ESBL בעבר תרבית על צלחת לתוך 2 מ"ל של MHB סטרילי ומערבולת.
- בדוק את עכירות שבו זה צריך להיות 0.5 מקפרלנד באמצעות מד צפיפות.
- מוסיפים 80 מ"ל של מרק MH סטרילי לתוך כוס שתן סטרילית.
- הוסף inoculum חיידקי מן 0.5 מקפרלנד inoculum לתוך כוס השתן בעקבות C1V1 = C2V2, שבו V1 = (106 x 80 מ"ל) / 108 = 800 μL.
- פיפטה 50 μL של פתרון inoculum 106 CFU / mL לתוך כל באר למעט H12, שהוא בקרת סטריליות היטב.
- דגירה הלוחות ב 37 °C (60 °F) לילה.
- לאחר הדגירה, להוסיף 50 μL של Iodotetrazolium כדי לרשום את הצמיחה בבארות.
9. פרוטוקול עבור התבנית FIC (קובץ משלים)
- כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 1 (Cefotaxime) בתא הצהוב בלוח A.
- כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 2 (Amikacin) בתא הצהוב בלוח B.
- כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 3 (Levofloxacin) בתא הצהוב בלוח C.
- כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) בפאנל D.
- עקוב אחר הקו האדום (ממשק צמיחה/ללא צמיחה) על-ידי הדגשת הבארות שיש להן צמיחה באדום.
- כתוב את המיקרופון של תרופה 1 בטבלה של תרופה 1 (ATB1).
- כתוב את המיקרופון של תרופה 2 בטבלה של תרופה 2 (ATB2).
- כתוב את המיקרופון של תרופה 3 בטבלה של תרופה 3 (ATB3).
- כתוב את המיקרופון של תרופה 4 בטבלה של תרופה 4 (ATB4).
- כדי לחשב FIC עבור ATB1
- קבע את הבארות בממשק הצמיחה/ללא צמיחה.
- בטבלה ATB1, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב בצד שמאל של לוח A לבאר הראשונה שנבחרה.
- חזור על שלב 9.10.2 עבור כל באר שנבחרה כאשר גם 1 מתאים FIC1, גם 2 מתאים FIC2, וכן הלאה.
- כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB2
- בטבלה ATB2, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח B לבאר הראשונה שנבחרה מראש.
- חזור על שלב 9.11.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.
- כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB3
- בטבלה ATB3, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח C לבאר הראשונה שנבחרה מראש.
- חזור על שלב 9.12.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.
- כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB4
- בטבלה ATB4, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח D לבאר הראשונה שנבחרה מראש.
- חזור על שלב 9.13.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.
- בטבלה הנקראת ATB1+2+3+4, סכם את ה- FIC1 של כל ATB באופן אוטומטי. אותו הדבר יתרחש עבור FICs האחרים (FIC2, FIC3 וכן הלאה).
- בתא המכיל FIC ומודגש בצהוב, לחץ עליו פעמיים ובחר את ה- ΣFICs המסוכמת מהטבלה ATB1+2+3+4.
- חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתשעת הגליונות המייצגים את תשעת הלוחות.
הערה: בגיליון FIC כל, הטבלה תציג את FIC סיכם הסופי עם הפרשנות של הערך המתקבל.
10. קביעת מיקרופון באמצעות מבחני microdilution עבור ארבע התרופות
- תווית ארבע שורות שונות עם הקיצור של כל תרופה נבדקה. לדוגמה, CTX עבור Cefotaxime, AMK עבור אמיקצין, LEVO עבור Levofloxacin, ו SXT עבור Trimethoprim-sulfamethoxazole.
- פיפטה 200 μL של מרק מולר הינטון סטרילי לתוך מספר טוב 1 וגם מספר 12 בכל שורה משומשת. ובכן מספר 12 ישמש כשליטה שלילית היטב.
- פיפטה 100 μL של מרק מולר הינטון סטרילי לבארות 2 עד 11 בכל שורה משומשת.
- לחשב את הנפח של כל תרופה שיש להוסיף באמצעות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 הוא הנפח הסופי בבארות שהוא 200 μL, C1 הוא הריכוז של פתרון המניה, ו C2 הוא הריכוז הראשוני שאנחנו צריכים להיות בבאר הראשונה.
הערה: כאן, אנו משתמשים במילים הבאות:
Cefotaxime: C1 = 105 מיקרוגרם / מ"ל, שבו אנו מדללים אותו ל 104 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 256 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 20.48 μL
אמיקצין: C1 = 103 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 64 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 51.2 μL
Levofloxacin: C1 = 5 x 103 מיקרוגרם / מ"ל, שבו אנו מדללים אותו ל 5 x 102 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 16 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 25.6 μL
טרימתופרים-סולפטוקסזול: C1 = 48 x 103 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 4096 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 68.26 μL - פיפטה את הנפח הנדרש עבור כל תרופה בבאר הראשונה של השורה המתאימה לאחר הסרת אותו נפח מן מרק 200 μL כדי להשיג נפח כולל של 200 μL לאחר הוספת התרופה.
- באופן סדרתי לדלל על ידי הסרת 100 μL מבאר 1 לתוך גם 2 וכן הלאה עד להגיע גם 10 שבו 100 μL הוסר מבאר 10 יושלכו. שים לב כי גם 11 משמש היטב שליטה חיובית.
- פיפטה 100 μL של 106 inoculum חיידקי מוכן לתוך כל באר בכל שורה משומשת למעט גם מספר 12 המשמש כפקד שלילי.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2A מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בארות צבעוניות הן בארות המכילות צמיחה. אנו מבחינים כי הלוח הרביעי אינו מכיל צמיחה ברביע המכיל את השילוב. הסיבה לכך היא כי בצלחת זו יש לנו את MIC של Levofloxacin כי יעכב את הצמיחה. באיור זה, אנו יכולים לראות כי MIC של Cefotaxime מתקבל בבאר A8, אשר שווה 32 מיקרוגרם / מ"ל. המיקרופון של אמיקאיצ'ין מתקבל בבאר E1, השווה ל-16 מיקרוגרם/מ"ל. אפקט עיכוב נראה בשורה המכילה 1/2 מיקרופון של אמיקצין (שורה D) בנוסף למספר subMICs של Cefotaxime ו Levofloxacin בנוסף 1/8 מיקרופון של Trimethoprim-sulfamethoxazole. עיכוב זה של צמיחת חיידקים בבארות המכילות ריכוזי subMIC עשוי להיות סוג של סינרגטיות בין ריכוזים אלה של ארבע התרופות.
איור 2B מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בארות צבעוניות הן בארות המכילות צמיחה. בצע את אותה פרשנות עבור הצלחת הרביעית. בפאנל המיוצג על ידי נתון זה, אנו יכולים לראות כי דפוס העיכוב של צמיחת חיידקים התרחשה בשורה D גם, שם הבארות מכילות subMICs של Cefotaxime ו levofloxacin, 1/2 MIC של אמיקצין ו 1/4 MIC של Trimethoprim-sulfamethoxazole.
איור 2C מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב של Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו- Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בארות צבעוניות הן בארות המכילות צמיחה. בצע את אותה פרשנות עבור הצלחת הרביעית. באשר לתבנית העיכוב בפאנל זה, אנו יכולים לראות כי בשורות C וצמיחה D לא נראה. משמעות הדבר היא כי בבארות מכילים מספר subMICs של Cefotaxime ו Levofloxacine בנוסף 1/2 מיקרופון של Trimethoprim-sulfamethoxazole ו 1/4 MIC ו 1/2 MIC של אמיקצין.
איור 2D מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בצע את אותה פרשנות עבור הצלחת הרביעית. אנו יכולים לראות כי רק בשורה A וטור 1 יש לנו בארות צבעוניות כלומר צמיחה. הסיבה לכך היא כי בפאנל זה יש לנו את המיקרופון של trimethoprim-sulfamethoxazole כי יהיה לחלוטין לעכב את הצמיחה.
איור 1: סכמטי של הגדרת לוחות וועדות Q-checkerboard ומפה של אופן הוספת התרופות.
איור 2: תוצאות הניסוי שהושגו בניסוי 1 לשילובים מסוימים שנבדקו.
קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת לוח השחמט המרובע דומה ללוח השחמט ולוח השחמט התלת-ממדי בפרוטוקול שלו. עם זאת, יש לקחת בחשבון צעדים חיוניים מסוימים כדי למנוע שגיאות במהלך הניסוי.
הקפד לבדוק את ה- MIC של כל תרופה נגד איזולט נבדק לפני תחילת הפרוטוקול כדי לדעת מה הם הריכוזים הדרושים כדי להתחיל את הדילול עם תרופה 1 ותרופה 2 כי צריך להיות מדולל באופן סדרתי בצלחות. לגבי תרופה 3 ותרופה 4, MIC צריך להיות ידוע גם כדי לחשב את הריכוזים הדרושים כדי להיבדק (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, ו MIC). ישנן שיטות רבות כדי לקבוע את MIC, עדיין הטוב ביותר הוא לקבוע את זה עם טכניקת microdilution מאז פרוטוקול Q-checkerboard גם משתמש בבדיקה microdilution לדילול סדרתי.
בשלב הראשון, תוך כדי הדבקת הצלחות, ודא הספסל נקי לכסות את הצלחות עם כיסויים סטריליים, כדי למנוע זיהום. חשוב לציין כי פרוטוקול זה יכול להיעשות באמצעות ארבעה לוחות 96-באר המייצגים את ארבעת הלוחות, שבו כל צלחת מחולקת לארבעה רבעים קטנים יותר. עם זאת, מספר הדילולים יצומצם עבור התרופה הראשונה והשנייה. בנוסף, ניתן גם להשתמש עמוק היטב 384-באר צלחות במקום הקלטת ארבע צלחות יחד. עם זאת, זה לא היה זמין כאשר עשינו את הניסויים. שים לב כי בעת בחירת הצלחת לשימוש, הקפד לבדוק את הקיבולת של כל באר מאז הנפח הסופי בבאר יהיה 250 μL.
יתר על כן, מספר הצלחות בכל פאנל ומספר הלוחות תלוי במספר הדילולים הנדרשים לתרופה השלישית והרביעית. לדוגמה, בניסוי זה נדרשו ארבעה דילולים של התרופה השלישית וארבעה דילולים של התרופה הרביעית (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC ו- MIC); לכן, היו לנו ארבע צלחות בכל פאנל וארבעה לוחות.
הדילול של התרופה הראשונה מתרחשת בצלחות של הלוחות על פי העמודים. עם זאת, הדילול של התרופה השנייה מתרחשת בצלחות נפרדות על פי השורות. התרופות השלישית והרביעית אינן מדוללות באופן סדרתי. עם זאת, כל ריכוז בשימוש מוכן בצינור נפרד ונוסף לכל באר בנפח מסוים. חשוב לציין כי בארות המכילות את ארבע התרופות נמצאות ברבע בין שורות G ו- B ועמודות 2 ו -12 בלבד. לוח השחמט ופרוטוקולי לוח השחמט התלת מימדיים לא צולמו או נכתבו בכתב יד זה מכיוון שהם פרוטוקולים ידועים ומטרת כתב היד הזה היא לדבר על פרוטוקול לוח השחמט. בטכניקת לוח השחמט, שורה א' מכילה רק תרופה 1; לכן, מראה את המיקרופון של תרופה 1. עמודה 1 מכילה רק תרופה 2; לכן, מראה את המיקרופון של סמים 2.
מושג זה נשמר בפרוטוקול Q-Checkerboard שבו MIC של תרופה 1 עדיין מוצג בשורה A ו- MIC של תרופה 2 עדיין מוצג בעמודה 1. בנוסף לכך, שתי התרופות הנוספות מציגות את ה-MIC שלהן בניסוי. תרופה 3 יש את צלחת P4 בכל פאנל שבו MIC של תרופה 3 מתווסף לכל בארות ולכן אנחנו לא צריכים לצפות צמיחה בצלחת זו. באופן דומה, תרופה 4 יש פאנל A4 שבו MIC של תרופה 4 מתווסף לכל בארות בכל הצלחות בלוח 4 ולכן אין צמיחה יש לראות בפאנל זה.
הגידול בלוחות נרשם על סמך עכירות בבארות, שם נחשבות לבארות עכורות כבעלות צמיחה. בנוסף עכירות, 50 μL של Iodotetrazolium מתווסף ונשאר במשך כמה דקות. שינוי בצבע לוורוד פירושו שיש צמיחה.
לשיטה זו יש מגבלות מסוימות. זה דורש עבודה קשה ומיקוד. שגיאות Pipetting יכול להתרחש מאז טכניקה זו מבוססת בעיקר על pipetting. חישובי FIC נחשבים למגבלה במקרה זה מכיוון שאנו עוסקים בארבעה ערכים ולא שניים או שלושה. הוספת ערך תגדיל את ערך ה- FIC בבאר; לפיכך, יש לשקול מחדש את הערכים של FIC הקובעים סינרגיזם, אדישות ואנטגוניזם.
ערכי FIC יכולים להשתנות בין מספר הפניות בנוגע לסטנדרטים שבהם מוגדרים סינרגיזם, אנטגוניזם ואדישות. הפניות מסוימות קובעות כי FIC של 0.5 ופחות נחשב סינרגיזם13, בעוד שאחרים קובעים כי FIC פחות מ 0.8 נחשב סינרגיזם16. התייחסות נוספת קובעת כי FIC פחות מ 1 נחשב סינרגיזם17. בשל חוסר היציבות והקונפליקט בהגדרת FIC סטנדרטי מאוחד של סינרגיזם, ראינו 1 כנקודת התייחסות שלנו.
FIC הסופי מחושב על-ידי הוספת ערכי FIC של כל לוח (9 FICs) וחלוקתו במספר הלוחות שהוא 9. חשוב לציין כי פאנל 4 אינו נחשב בתוצאות שכן הוא מכיל את ה- MIC של התרופה הרביעית ולכן העיכוב יהיה עבודה של תרופה אחת. בנוסף, צלחת 4 בכל פאנל גם לא נחשב שכן הוא מכיל את MIC של תרופה 3 שבו העיכוב בצלחת זו יהיה מעשה של תרופה 3 לבד. לכן, אנחנו בסופו של דבר עם 9 צלחות (16 - (4 + 3)).
עבור כל צלחת, FICs מחושבים עבור הבארות על ממשק צמיחה / לא צמיחה על פי הנוסחה הבאה: (MIC של תרופה 1 בשילוב / MIC של תרופה 1 לבד) + (MIC של תרופה 2 בשילוב / MIC של תרופה 2 לבד) + (MIC של תרופה 3 בשילוב / MIC של תרופה 3 לבד) + (MIC של תרופה 4 בשילוב / MIC של תרופה 4 לבד). לאחר מכן, המספר המתקבל מחולק ב- 4. נוסחה זו נעשית עבור כל באר בממשק צמיחה/ללא צמיחה באותה צלחת. לאחר מכן, כל FICs של אותה צלחת מסוכמים יחד כדי לקבל את FIC של צלחת זו. לבסוף, כפי שהוזכר קודם לכן, 9 FICs הסופי של כל צלחת מתווספים ומחולקים על ידי 9 כדי להשיג את FIC הסופי כי יתפרש.
FIC פחות מ 1 נחשב סינרגטי שבו יש לו מידה מסוימת של סינרגיזם: זה גם סינרגטי מעט (קרוב לאחד) או יותר סינרגטי (כאשר הוא נע לכיוון 0.5 ופחות). חישוב ופרשנות אלה נעשים פשוט באמצעות תבנית FIC שפיתחנו. אנחנו פשוט להיכנס לריכוזים, לבחור את הבארות על ממשק צמיחה / לא צמיחה כדי לחשב את FICs, ואנחנו נקבל את FIC הסופי כי הוא פירש על פי הקריטריונים שהוזכרו.
שיטה זו מאפשרת בדיקה של כל השילובים האפשריים שניתן לעשות באמצעות ארבע תרופות בניסוי אחד אשר ניתן לעשות ביום אחד. התוצאות מתקבלות למחרת. בעוד שעד שהם הורגים את העקומה, יש צורך ביותר זמן, חומרי עבודה ועובדי מעבדה כדי לבדוק את אותו מספר שילובים, שכן כל קבוצה של שילובים נבדקת לבדה בצינור אחד או בגביע אחד, מה שהופך אותה לגוזלת זמן. שיטה זו יכולה לשמש לא רק כדי לבדוק שילובי תרופות אנטיבקטריאליות, אבל כדי לבדוק את כל סוגי התרופות המשמשות לטיפול במחלות צריך להיבדק בשילוב. זה יכול לשמש גם כדי לבדוק שילוב של תרופות ותמציות צמחים או אפילו שילוב של תמציות צמחים בלבד. הנקודה היא כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לבדוק לא רק תרופות ספציפיות, אבל כל מה שניתן לשלב.
מספר מגבלות מלוות שיטה זו. כישורי Pipetting חשובים מאוד בעת ביצוע בדיקה זו וכל שגיאה שעלולה להתרחש בעת pipetting ודילול סדרתי יכול להשפיע לרעה על התוצאות ועלול להוביל תוצאות חיוביות שליליות או כוזבות. לכן, כל התקדמות טכנולוגית לגבי מכונות צנרת ורובוטים יהיה לעזר רב בביצוע בדיקה זו. שיטה זו דורשת הרבה חישובים ודילולים כך שכל שגיאה בודדת עשויה לשנות את תוצאת התוצאות. טכניקה זו מספקת תובנות על אפקט העיכוב בלבד ולא על אפקט ההרג. טכניקה זו חוקרת את העיכוב בנקודת זמן אחת ולא לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
ללא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
- Ibezim, E.
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C.
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S.
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
