Summary
このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。
Abstract
薬物併用療法の概念は、主に薬剤に対する耐性の急激な増加に伴って非常に重要になってきています。Qチェッカーボードとも呼ばれる4倍のチェッカーボードは、他のプロトコルと同じ結果を達成するために必要な時間と作業を最小限に抑えるために、1つの実験で4つの薬物の間で得ることができる可能な組み合わせの数を最大化することを目的としています。このプロトコルは、薬物を希釈し、いくつかの96ウェルプレートで一緒に組み合わせる単純なマイクロ希釈技術に基づいています。
96ウェルプレートの最初のセットでは、ミュラー・ヒントンスープが追加され、その後に最初に必要な薬物(例えば、Cefotaximeはここで)を連続的に希釈する。最初のステップが完了した後、別の96ウェルプレートのセットが第2の薬物(例えば、アミカチ)を希釈するために使用され、これは特定の量の薬物2を除去することによって移され、薬物1を含む96ウェルプレートの最初のセットの対応する井戸に入れられます。第3のステップは、第3の薬物(例えば、レボフロキサシン)の必要な濃度を、薬物1および2の組み合わせを含む初期セットの適切なプレートに添加することによって行われる。第4のステップは、第1セットの適切なプレートに第4の薬物(例えば、トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の必要な濃度を加えることによって行われる。次に、 大腸菌 ESBL細菌接種を調製し、添加する。
この方法は、すべての可能な組み合わせを評価するために重要であり、さらに in vivo テストのためにテストされる可能性の広い範囲を有する。多くの焦点を必要とする疲れた技術であるにもかかわらず、結果は顕著であり、多くの組み合わせを単一の実験でテストできる時間を節約します。
Introduction
抗生物質1,2の過剰使用や誤用による耐性の増加に伴い、細菌感染を治療するための新薬や薬剤の開発が非常に重要になっています。新薬開発などの新しいアプローチは、抵抗危機を克服するために非常に重要です。しかし、製薬業界は新しい抗菌剤の開発には関心がありません。さらに、新薬が開発されれば、細菌はこれらの新薬3,4に対する耐性を進化し、開発し続けるだろう。したがって、抵抗の問題は解決されず、細菌耐性を克服するために考慮され、研究されるべき別のアプローチの必要性を作る。
薬物の組み合わせは、主に多剤耐性病原体5、6によって引き起こされる細菌感染症を治療するための非常に重要な概念である。それは治療の経過を減少させる、与えられた用量を減少させる;したがって、与えられた薬物の毒性を減少させ、抵抗性の発生率を低下させるのに役立ち、そしてある意味では、担保感受性5、7、8、9の概念に記載されているように、与えられた薬剤に細菌を感作する。
1つの薬剤に対する耐性の開発は、単一の突然変異を必要とします;しかし、複数の経路を標的とする薬物の組み合わせに対する耐性の開発には、この組み合わせによって減速されるいくつかの独立した突然変異が必要である。併用療法を使用する間の抵抗の低下の一例は、結核菌10におけるリバンフィンに対する抵抗率の低下である。別の例は、ピペラシリンを単独で服用している患者において抵抗性株の出現率がカルボキシペニシリンとアミノグリコシド10との組み合わせを服用したものよりも高いことを示したGribbleららの研究である。研究は、進化する細菌におけるアミノグリコシドへの耐性の発達がこれらの株を様々な他の薬物に敏感にしたことを示している5。β-ラクタム級薬物アモキシシリンとラクタマーゼ阻害剤のクラクタマーゼ阻害剤との組合せは、耐性菌株8の治療に成功を示した。
治療時間を短縮することは、薬物の組み合わせから生じる良い利点です。例えば、2週間のジェンタマイシンとペニシリンまたはセフトリアキシンを併用する療法は、ペニシリンまたはセフトリアキシン単独で与えられる同じ効力を与える。併用薬は、サブICのような単独で与えられた場合に有効ではない薬物の低用量の使用を可能にする。スルホンアミドの例は、トリプルスルホンアミドの使用が最小限に抑えられるところに、より低い用量で、全用量で不溶性スルホンアミドを使用する場合に結晶形成または結晶化物である毒性を与えることができる。
したがって、与えられた投与量と治療時間を減らすことは、最終的に体内の薬物の毒性を減少させる。併用薬物間の相互作用を評価する方法を開発するという考え方は非常に重要です。ある研究では、併用療法がアシネトバクターおよびP.緑素吸砂の耐性種の治療に対してより効果的であることを示した。
併用して薬を与える
チェッカーボード法、タイムキル曲線法、Eテスト法13など、薬物の組み合わせを調べることができる方法は様々です。チェッカーボード法は、1つの実験自体で問題の2つの薬物の間のすべての可能な組み合わせを研究することができます。また、3つの薬剤14の組み合わせを研究するために開発された。現在、これを拡張して、主に多剤耐性病原体の治療のための4つの薬剤の組み合わせを研究しています。
タイムキル曲線アッセイは、通常、ある薬剤の殺菌効果を試験するために行われる。また、いくつかの薬物が特定の濃度で組み合わされる薬物の組み合わせの効果をテストするために使用されました。このプロトコルは、各カップに我々は、スープ、薬物の組み合わせ、および必要な細菌株を追加するいくつかの無菌チューブまたはカップの調製を必要とする。いくつかの時点で光学密度のインキュベーションと記録後、その結果を、使用された菌株の正常な成長率と比較して、増殖速度が増加したか、減少したか、または13を変化させなかったかを調べる。
E-test法は、通常、対象の薬物の勾配濃度を含むストリップが接種されたプレート上に置かれている最小の阻害濃度(MIC)を試験するために行われる。また、2つのストリップが彼らのMCS13で交差する垂直な方法でプレートに追加される2つの薬物の組み合わせをテストするために使用されました。
文献によれば、相乗効果を定義し、研究するためのゴールドスタンダードはありません。したがって、組み合わせを研究するために使用される方法のどれがより良く、どれがより良く、より信頼性の高い結果を主に13を生成するかを評価することは困難です。しかし、時間殺しの検定は、労働集約的で時間がかかり、高価な15,16であり、Eテスト法は2つの薬物の組み合わせを研究するために開発される。チェッカーボードは、テストされた2つの薬物間のすべての可能な組み合わせを研究することができ、これがこの技術が開発するために選択された理由です。
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Protocol
1. 準備手順
- 蒸留水1Lに25gのMHスープを加えて混ぜ合わせて、ミュラー・ヒントンスープ(MHB)を準備します。121°Cで2.5時間オートクレーブ。次に、オートクレーブされた培地を室温または冷蔵庫に保管します。
- 4象限ストリーキング法を用いて寒天培地上で問題の細菌(大腸菌 ESBL)をサブ培養し、37°Cで一晩インキュベートする。
- 滅菌ループを使用して、1コロニーを取り、近い平行筋を行うことによって、マッコンキー寒天プレートの前半にそれを広げます。
- ループを使用して、第1象限からバクテリアをストリークして第2象限に広げる。
- 2 番目の象限から、3 番目の象限のストリークを平行な近い縞を使用して延長します。
- 第4象限の中央に細菌を広げ、第3象限からストリークする。
2. パネルの準備
- 4つの96ウェルプレートを隣り合わせて正方形にします。テープを使用して、底をテープでつなぎます。
- この手順を繰り返して、4 枚のプレートを含む 4 つのパネルを取得し、A1、A2、A3、および A4 という名前を付けます。
- 4つのパネルの16個の96ウェルプレートの列2と列11の間の井戸にMHスープの50 μLを加えます。
- 4つのパネルの16 96ウェルプレートで負のコントロールとして役立つウェルH12にMHスープの200 μLを加えます。
- 4つのパネルの16 96ウェルプレートで正の制御井戸として機能する井戸A1とH1にMHスープの150 μLを追加します。
3. 薬物1、セフォタキシム、連続希釈
- 円錐形の管に、生殖不能dH2Oの15 mLを加える。
- 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 15 mL)/C1.
注:当社の場合、セフォタキシムストックソリューションは105 μg/mL、C2 は256 μg/mLです。したがって、V1 = 38.4 μL。
- 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 15 mL)/C1.
- 15 mLの無菌dH2Oから計算された容積を取り除き、薬剤を加える。
- 調製した薬物溶液のピペット50μLは、H12を除くカラム11およびカラム12の各ウェルに入る。
- 列 11 から 50 μL を取り出して列 10 の対応するウェルに入れてシリアル希釈を開始し、10 から 2 列目から取り出した 50 μL が廃棄される列 2 まで続きます。
- 4 つのパネルのすべての 16 96 ウェル プレートについて、手順 3.4 と 3.5 を繰り返します。
4. 薬物2、アムカシン、連続希釈
- 円錐形の管に、生殖不能dH2Oの10 mLを加える。
- 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 10 mL)/C1.
注:当社の場合、アミカシンストックソリューションは103 μg/mL、C2 は64 μg/mLです。したがって、V1 = 64 μL。 - 10 mLの無菌dH2Oから計算された容積を取り除き、薬剤を加える。
- 8つの別々の96ウェルプレートを取ります。
- 各プレートに、行 G と B の間のウェルに MHB の 100 μL を追加します。
- 前に調製した薬物2溶液の100μLを行Gのウェルに加える。
- 各ウェルから100 μLを取って行Gから行Bに連続して希釈し、最後に行Bのウェルから100 μLを捨てます。
- 8枚のプレートを準備するために、ステップ4.5、4.6、および4.7を繰り返します。
5. 4つのパネルへの薬物2の移入
- ピペット50μLの薬物2は、行GとBの間のウェルから、4枚のパネルの各プレートの対応するウェルに入る。1つの準備された96ウェルプレートには、1つのパネル内の2つのプレートに十分な100 μLの薬物2が含まれています。
6. 薬物3、レボフロキサシン、追加
- 4つの異なる円錐形の管に、生殖不能dH2Oの14 mLを加える。
- 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 14 mL)/C1.
注:当社の場合、レボフロキサシンは5 x 103 μg/mLのストック溶液から4つの異なる濃度で調製されます。
C1 = 2 μg/mL、V1 = 5.6 μL
C2 = 4 μg/mL、V1 = 11.2 μL
C3 = 8 μg/mL、 V1 = 22.4 μL
C4 = 16 μg/mL、 V1 = 44.8 μL - 各チューブから14mLの無菌dH2Oから計算された体積を取り除き、薬剤を加えます。
- 3番目の薬剤の必要な濃度を準備した後、50 μLを取り、C1が4つのパネルの4つのP1プレートに対応する各パネルの対応するプレートのBとGと列2と列12の間の対応する井戸に追加し、C2は4つのパネルの4つのP2プレートに対応します、C3は4つのパネルの4つのP3版に対応し、C4は4つのパネルの4つのP4版に対応する。
7. ドラッグ4、トリメトプリム-スルファムトキサゾール、追加
- 円錐形の管に、生殖不能dH2Oの14 mLを加える。
- 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 14 mL)/C1.
注:当社の場合、トリメトプリム-スルファメトキサゾールは、48 x 103 μg/mLのストック溶液から4つの異なる濃度で調製されます。
C1 = 512 μg/mL、V1 = 149.33 μL
C2 = 1024 μg/mL、 V1 = 298.66 μL
C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597.33 μL
C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194.66 μL - 各チューブの14mLの無菌dH2Oから計算された体積を取り除き、薬剤を加えます。
- 第4の薬剤の必要な濃度を調製した後、50μLを取り、C1がパネル1に対応し、C2がパネル2に対応し、C2がパネル3に対応し、C4がパネル4に対応する対応する4つのプレートの4つのプレートのBとGと列の間の対応する井戸に加える。
8. 細菌性菌の調製と添加
- 滅菌ループを使用して、以前にプレート上で培養した細菌分離物 大腸菌 ESBLの1コロニーを滅菌MHBおよび渦の2mLに移す。
- 密度計を使用して0.5マクファーランドでなければならない濁度を確認してください。
- 滅菌尿カップに80 mLの無菌MHスープを加えます。
- 0.5マクファーランド内液から尿カップに細菌接種を加え、C 1 V1= C2V2に続く尿カップに V1 = (106 x 80 mL) / 10 8 =800 μL.
- 管内管内溶液106CFU/mLのピペット50μLは、H12を除く各ウェルに、これは滅菌制御が良好である。
- パネルを一晩で37°Cでインキュベートします。
- インキュベーション後、50 μLのヨウドテトラゾリウムを加えて、ウェルの成長を記録します。
9. FIC テンプレートのプロトコル (補足ファイル)
- パネルAの黄色い細胞に薬物1(セフォタキシム)の最高濃度を書く。
- パネルBの黄色の細胞に薬物2(アミカシン)の最高濃度を書く。
- パネルCの黄色の細胞に薬物3(レボフロキサシン)の最高濃度を書く。
- パネルDに薬物4(トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の最高濃度を書く。
- 赤で成長している井戸を強調することによって、レッドライン(成長/成長なしインターフェイス)をトレースします。
- 薬物1(ATB1)の表に薬物1のMICを書く。
- 薬物2(ATB2)の表に薬物2のMICを書く。
- 薬物3の表に薬物3のMICを書く(ATB3)。
- 薬物4(ATB4)の表に薬物4のMICを書く。
- ATB1 の FIC を計算するには
- 成長/成長なしインターフェイスのウェルを決定します。
- 表 ATB1 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル A の左側にある黄色のセルを最初に選択したウェルにドラッグします。
- 井戸 1 が FIC1 に対応し、ウェル 2 が FIC2 に対応する、など、選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.10.2 を繰り返します。
- ATB2 の FIC を計算するには
- 表 ATB2 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル B の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。
- 事前に選択したすべてのウェルについて、ステップ 9.11.1 を繰り返します。
- ATB3 の FIC を計算するには
- 表 ATB3 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル C の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。
- 事前に選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.12.1 を繰り返します。
- ATB4 の FIC を計算するには
- 表 ATB4 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル D の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。
- 事前に選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.13.1 を繰り返します。
- ATB1+2+3+4 というラベルのテーブルで、各 ATB の FIC1 を自動的に合計します。他の FICs(FIC2、FIC3 など)でも同じことが起こります。
- FIC を含み、黄色で強調表示されているセルで、それをダブルクリックし、テーブル ATB1+2+3+4 から合計された ΣFICs を選択します。
- 9 枚のプレートを表す 9 枚のシートのそれぞれに対して、これらの手順を繰り返します。
注: シート FIC all では、テーブルは得られた値の解釈と最終的な合計 FIC を示します。
10. 4つの薬物のマイクロ希釈アッセイを用いたMICの決定
- 各試験薬の略称で4つの異なる行にラベルを付けます。例えば、セフォタキシム用CTX、アミカシンのAMK、レボフロキサシンのLEVO、トリメトプリムスルファメトキサゾールのSXTが挙げられない。
- ピペット200 μLの無菌ミュラーヒントンスープは、使用された各行でウェル番号1とウェル番号12にスープします。まあナンバー12はネガティブコントロールとしてうまく機能します。
- ピペット100μLの無菌ミュラーヒントンは、各使用列のウェル2〜11にスープを入れる。
- C1V1=C2V2を用いて添加する各薬剤の体積を計算する。したがって、V1=(C 2 x 4 x V2)/C1.V2はウェルの最終容積で、C1はストック溶液の濃度、C2は最初の井戸に必要な初期濃度です。
注: ここでは、次の項目を使用します。
セフォタキシム:C1 = 105 μg/mL、そこで104 μg/mL、C2 = 256 μg/mLに希釈します。したがって、V1 = 20.48 μL
アミカシン: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL;したがって、V1 = 51.2 μL
レボフロキサシン:C1 = 5 x 103 μg/mL、そこで5 x 102 μg/mL、C2 = 16 μg/mLに希釈します。したがって、V1 = 25.6 μL
トリメトプリム-スルファムトキサゾール:C1 = 48 x 103 μg/mL、C2 = 4096 μg/mL;したがって、V1 = 68.26 μL - ピペットは、200 μLのスープから同じ体積を除去した後、対応する行の第1ウェルの各薬物に必要な体積を、薬剤の添加後に200μLの総体積を得た。
- ウェル1からウェル2に100 μLを取り除いて連続希釈し、ウェル10から取り出した100μLが廃棄されるウェル10に達するまで。井戸11は正のコントロールとしてうまく機能していることに注意してください。
- ピペット100 μLの106 は、ネガティブコントロールとして役立つ十分な番号12を除き、使用される各行の各ウェルに細菌接種を調製した。
- 一晩で37°Cでインキュベートする。
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Representative Results
図2A は、セフォタキシムとアミカシンをレボフロキサシンおよびトリメトプリム-スルファメトキサゾールの特異的濃度と組み合わせた結果を表す。図の左側には、図の右側に薬物の濃度を模式的に提示した4つのプレートが見られます。矢印は、成長/成長なしインターフェイスのウェルを表します。色付きの井戸は成長を含む井戸です。第4版は組合せを含む象限の成長を含んでいないことに気づく。これは、このプレートに我々は成長を阻害するレボフロキサシンのMICを持っているからです。この図では、セフォタキシムのMICが32μg/mLに等しいウェルA8で得られていることがわかります。アミカシンのMICは、16 μg/mLに等しいウェルE1で得られます。阻害効果は、トリメトプリムスルファメトキサゾールの1/8 MICに加えて、セフォタキシムおよびレボフロキサシンのいくつかのサブMICに加えて、アミカシン(行D)の1/2 MICを含む行で見られる。サブMIC濃度を含むウェルにおける細菌増殖の阻害は、これら4つの薬物濃度間の相乗作用の一形態である可能性がある。
図2B は、セフォタキシムとアミカシンをレボフロキサシンおよびトリメトプリム-スルファメトキサゾールの特異的濃度と組み合わせた結果を表す。図の左側には、図の右側に薬物の濃度を模式的に提示した4つのプレートが見られます。矢印は、成長/成長なしインターフェイスのウェルを表します。色付きの井戸は成長を含む井戸です。4番目のプレートの同じ解釈に従ってください。この図に示されるパネルでは、細菌増殖の阻害パターンが行Dでも起こり、ウェルにはセフォタキシムとレボフロキサシンのサブMIC、アミカシンの1/2 MIC、トリメトプリム・スルファメトキサゾールの1/4 MICが含まれていることがわかります。
図2C は、セフォタキシムとアミカシンをレボフロキサシンおよびトリメトプリム-スルファメトキサゾールの特異的濃度と組み合わせた結果を表す。図の左側には、図の右側に薬物の濃度を模式的に提示した4つのプレートが見られます。矢印は、成長/成長なしインターフェイスのウェルを表します。色付きの井戸は成長を含む井戸です。4番目のプレートの同じ解釈に従ってください。このパネルの阻害パターンについては、行CとDの成長が見られないことがわかります。これは、ウェルにトリメトプリムスルファメトキサゾールの1/2 MICとアミカシンの1/4 MICと1/2 MICに加えて、セフォタキシムとレボフロキサシンのいくつかのサブMICが含まれていることを意味します。
図2D は、セフォタキシムとアミカシンをレボフロキサシンおよびトリメトプリム-スルファメトキサゾールの特異的濃度と組み合わせた結果を表す。図の左側には、図の右側に薬物の濃度を模式的に提示した4つのプレートが見られます。矢印は、成長/成長なしインターフェイスのウェルを表します。4番目のプレートの同じ解釈に従ってください。行 A と列 1 でのみ、成長を意味する色のウェルがあることがわかります。これは、このパネルに、完全に成長を阻害するトリメトプリム-スルファメトキサゾールのMICがあるためです。
図1: Qチェッカーボードのセットアップとパネルの模式図と、薬の追加方法の地図を表示します。
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Discussion
4倍のチェッカーボード法は、そのプロトコルのチェッカーボードと3次元チェッカーボードに似ています。ただし、実験中のエラーを避けるために、特定の重要な手順を考慮する必要があります。
試験された分離株に対して各薬物のMICをテストし、プレートで連続希釈する必要がある薬物1および薬物2の希釈を開始するために必要な濃度を知るためにプロトコルを開始してください。薬物3および薬物4に関して、MICは、検査に必要な濃度(1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、およびMIC)を計算するためにも知られるべきです。MICを決定する方法はたくさんありますが、Qチェッカーボードプロトコルはシリアル希釈用のマイクロ希釈アッセイも使用しているため、マイクロ希釈技術でそれを決定するのが最善です。
最初のステップでは、プレートをテーピングしながら、ベンチが清潔であることを確認し、汚染を避けるために無菌カバーでプレートを覆います。このプロトコルは、4つのパネルを表す4つの96ウェルプレートを使用して行うことができることに注意することが重要であり、各プレートは4つの小さな象限に分かれています。しかし、希釈の数は、第1および第2の薬物のために最小化されます。さらに、4枚のプレートを一緒にテーピングするのではなく、深い井戸384ウェルプレートを使用することもできます。しかし、実験を行った時は利用できませんでした。使用するプレートを選択する際は、ウェルの最終容積が250μLになるので、各ウェルの容量を確認してください。
さらに、各パネルのプレート数とパネル数は、第3および第4の薬剤に必要な希釈剤の数に依存する。例えば、この実験では、第3の薬物の4つの希釈と4番目の薬物の4つの希釈が必要であった(1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、およびMIC)。したがって、各パネルには4枚のプレートと4つのパネルがありました。
最初の薬物の希釈は、列に従ってパネルのプレートで起こる。しかしながら、第2の薬物の希釈は、行に従って別々のプレートで起こる。第3および第4の薬物は連続的に希釈されない。しかし、使用される各濃度は別々の管で調製され、特定の容積の各ウェルに加える。4つの薬物を含む井戸は、行GとBと列2と12の間の象限にのみ存在することに注意することが重要です。チェッカーボードと3次元チェッカーボードプロトコルは、既知のプロトコルであり、この原稿の目的はQチェッカーボードプロトコルについて話すことであるため、この原稿では撮影または書かれていませんでした。チェッカーボードのテクニックでは、行 A には薬物 1 のみが含まれています。したがって、薬物1のMICを示す。列 1 には薬物 2 のみが含まれます。したがって、薬物2のMICを示す。
この概念はQ-Checkerboardプロトコルに保持されており、薬物1のMICは依然としてA行目に示されており、薬物2のMICは依然としてコラム1に示されている。これに加えて、2つの追加された薬物は実験でMICを提示する。薬物3は、薬物3のMICがすべての井戸に添加される各パネルにP4プレートを有するので、このプレートの成長を観察してはならない。同様に、薬物4はA4パネルを有し、パネル4のすべてのプレート内のすべてのウェルに薬物4のMICが添加されるので、このパネルでは成長が観察されるべきではない。
プレートの成長は、濁った井戸が成長していると考えられている井戸の濁りに基づいて記録されます。濁りに加えて、50μLのヨウドテトラゾリウムを加え、数分間放置する。ピンク色に変化は成長があることを意味します。
この方法には、いくつかの制限があります。それはハードワークと焦点を必要とします。この手法は主にピペット処理に基づいているため、ピペット処理エラーが発生する可能性があります。FIC 計算は、2 または 3 ではなく 4 つの値を扱うため、この場合は制限と見なされます。値を追加すると、井戸の FIC の値が増加します。したがって、相乗作用、無関心、および拮抗を決定するFICの価値を再考しなければならない。
FIC 値は、相乗作用、拮抗、および無関心が定義される標準に関するいくつかの参照間で変化する可能性があります。ある参照では、FIC が 0.5 以下の FIC は相乗効果13と見なされ、他の例では 0.8 未満の FIC は相乗効果16と見なされます。別の参照では、FIC が 1 未満の場合は相乗効果17と見なされます。相乗効果の統一された標準FICを定義する際の不安定さと対立のために、我々は1を我々の参考と考えた。
最終的な FIC は、各プレート(9 FIC)の FIC 値を追加し、9 個のプレート数で除算することで計算されます。パネル4は第4の薬物のMICを含んでいるので、阻害が単一の薬物の働きとなるので、結果には考慮されないことに注意することが重要である。また、各パネルのプレート4は、このプレートにおける阻害が薬物3単独の行為となる薬物3のMICを含むため、考慮も行わない。したがって、9プレート(16-(4+3))で終わります。
各プレートについて、次の式に従って成長/成長なし界面上のウェルについてFICが計算される:(薬物1単独の薬剤1の組み合わせにおける薬物1のMIC/MIC)+(薬物2の組み合わせにおける薬物2のMIC/薬物3のMICのみ)+(薬物4の組み合わせ/薬物4のMIC)を併用する。そして、得られた数を4で割った。この式は、同じプレートの成長/成長なしインタフェース上の各ウェルに対して行われます。次に、同じプレートのすべてのFICsを合計して、このプレートのFICを得ます。最後に、前述したように、各プレートの9つの最終的なFICsを追加して9で分割して、解釈される最終的なFICを得る。
1未満のFICは、ある程度の相乗効果を持つ相乗的であると考えられます:それはわずかに相乗的(1に近い)または相乗的(0.5以下に向かって移動する場合)のいずれかです。この計算と解釈は、我々が開発したFICテンプレートを使用して行われます。濃度を入力し、成長/成長なしインターフェイスで井戸を選択して FICs を計算し、上記の基準に従って解釈される最終的な FIC を取得します。
この方法は、1日で行うことができる1つの実験で4つの薬物を使用して行うことができるすべての可能な組み合わせのテストを可能にする。結果は翌日に得られます。一方、カーブアッセイを殺す時間によって、組み合わせの各セットが単一のチューブまたはカップで単独でテストされるため、同じ数の組み合わせをテストするために、より多くの時間、作業材料、およびラボの労働者が必要です。この方法は、抗菌薬の組み合わせをテストするだけでなく、病気の治療に使用されるすべてのタイプの薬物をテストするために使用することができ、組み合わせてテストする必要があります。また、薬物と植物抽出物の組み合わせ、あるいは植物抽出物のみの組み合わせをテストするためにも使用できます。ポイントは、この方法は、特定の薬物だけでなく、組み合わせることができるすべてのものをテストするために使用することができるということです。
この方法には、いくつかの制限があります。このアッセイを行う際にピペット化のスキルは非常に重要であり、ピペット処理およびシリアル希釈中に発生する可能性のあるエラーは結果に悪影響を及ぼし、偽陰性または偽陽性の結果を招く可能性があります。したがって、ピペットマシンとロボットに関する技術の進歩は、このアッセイを実行する上で大きな助けになるでしょう。この方法では、多くの計算と希釈が必要なので、単一のエラーによって結果が変わる可能性があります。この技術は、阻害効果に関する洞察のみを提供し、殺す効果は提供しない。この技術は、時間の経過ではなく、単一の時点での阻害を研究します。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
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