Summary
Este protocolo describe cómo estudiar todas las combinaciones posibles que se pueden obtener entre cuatro fármacos en un solo experimento. Este método se basa en el ensayo estándar de micro dilución de placas de 96 pozos y el cálculo de concentraciones inhibitorias fraccionadas (FICs) para evaluar los resultados.
Abstract
El concepto de terapia de combinación de fármacos se está volviendo muy importante principalmente con el aumento drástico de la resistencia a los medicamentos. El tablero de ajedrez cuádruple, también llamado tablero Q, tiene como objetivo maximizar el número de combinaciones posibles que se pueden obtener entre cuatro fármacos en un experimento para minimizar el tiempo y el trabajo necesarios para lograr los mismos resultados con otros protocolos. Este protocolo se basa en la técnica de micro dilución simple donde los fármacos se diluyen y se combinan en varias placas de 96 pozos.
En el primer conjunto de placas de 96 pozos, se agrega caldo Muller-Hinton seguido del primer medicamento requerido (por ejemplo, cefotaxima aquí) para diluirlo en serie. Una vez realizado el primer paso, se utiliza otro conjunto de placas de 96 pozos para diluir el segundo fármaco (por ejemplo, Amikaci), que se transferirá eliminando un volumen específico de fármaco 2 y se colocará en los pozos correspondientes en el primer conjunto de placas de 96 pozos que contiene el fármaco uno. El tercer paso se realiza mediante la adición de las concentraciones requeridas de la tercera droga (por ejemplo, Levofloxacina), a las placas apropiadas en el conjunto inicial que contiene la combinación de la droga 1 y 2. El cuarto paso se realiza mediante la adición de las concentraciones requeridas de la cuarta droga (por ejemplo, Trimetoprima-sulfametoxazol) en las placas apropiadas en el primer conjunto. Luego, se preparará y agregará el inóculo bacteriano E. coli ESBL.
Este método es importante para evaluar todas las combinaciones posibles y tiene una gama más amplia de posibilidades para ser probado además para pruebas in vivo. A pesar de ser una técnica agotadora que requiere mucho enfoque, los resultados son notables y ahorran tiempo donde se pueden probar muchas combinaciones en un solo experimento.
Introduction
Con el aumento de la resistencia debido al uso excesivo y mal uso de los antibióticos1,2, la necesidad de desarrollar nuevos fármacos y agentes para tratar las infecciones bacterianas se ha vuelto crucial. Los nuevos enfoques, como el desarrollo de nuevos fármacos, son muy importantes para superar la crisis de resistencia. Sin embargo, la industria farmacéutica no está interesada en desarrollar nuevos agentes antimicrobianos. Además, si se desarrollan nuevos fármacos, las bacterias seguirán evolucionando y desarrollando resistencia contra estos nuevos fármacos3,4. Por lo tanto, el problema de la resistencia no se resolverá, por lo que la necesidad de otro enfoque es una necesidad que debe ser considerado y estudiado para superar la resistencia bacteriana.
La combinación de fármacos es un concepto muy importante para el tratamiento de las infecciones bacterianas, principalmente aquellas que son causadas por patógenos multirresistentes5,6. Disminuye el curso del tratamiento, disminuye la dosis administrada; así, disminuyendo la toxicidad del fármaco dado, ayuda a disminuir la tasa de desarrollo de resistencia y, de alguna manera, sensibiliza a las bacterias a los fármacos dados como se describe en el concepto de sensibilidad colateral5,7,8,9.
El desarrollo de resistencia a un fármaco requiere una sola mutación; sin embargo, el desarrollo de resistencia a una combinación de fármacos dirigidos a múltiples vías requiere varias mutaciones independientes que se ralentizan por esta combinación. Un ejemplo de disminución de la resistencia durante el uso de la terapia combinada es la disminución de la tasa de resistencia a la rifampicina en Mycobacterium Tuberculosis10. Otro ejemplo es un estudio realizado por Gribble et al. que mostró que la tasa de aparición de cepas resistentes en pacientes que toman Piperacilina sola es mayor que en aquellos que toman una combinación de carboxipenicilina y aminoglucósido10. Los estudios han demostrado que el desarrollo de resistencia a los aminoglucósidos en bacterias en evolución hizo que estas cepas sean sensibles a otros fármacos5. La combinación entre el fármaco de clase beta-lactámico amoxicilina y el inhibidor de la lactamasa ácido clavulánico mostró éxito en el tratamiento de cepas bacterianas resistentes8.
La disminución del tiempo de tratamiento es una buena ventaja resultante de las combinaciones de fármacos. Por ejemplo, una terapia de penicilina o ceftriaxona combinada con gentamicina durante 2 semanas dará la misma eficacia dada por penicilina o ceftriaxona sola cuando se administra durante 4 semanas11. La combinación de fármacos permite el uso de dosis más bajas de fármacos que no son eficaces cuando se administran solos, como los Sub-MICs. El ejemplo de sulfonamidas puede darse cuando el uso de triples sulfonamidas minimiza, a dosis más bajas, la toxicidad producida que es la formación de cristales o cristaluria al utilizar sulfonamidas insolubles a dosis completas12.
Por lo tanto, la disminución de la dosis dada y el tiempo de tratamiento eventualmente disminuirá la toxicidad de los medicamentos en el cuerpo. La idea de desarrollar métodos para evaluar la interacción entre fármacos combinados es muy importante. En un estudio, los resultados mostraron que la terapia combinada es más eficaz para el tratamiento de especies resistentes de Acinetobacter y P. aeruginosa8.
Administrar medicamentos en combinación
Existen diferentes métodos por los que podemos estudiar combinaciones de fármacos, como el método del tablero de ajedrez, el método de la curva de muerte en el tiempo y el método de la prueba electrónica13. El método del tablero de ajedrez puede estudiar todas las combinaciones posibles entre los dos fármacos en cuestión en un solo experimento. Además, se desarrolló para estudiar una combinación de tres fármacos14. Ahora, extendemos esto para estudiar una combinación de cuatro fármacos principalmente para el tratamiento de patógenos multirresistentes.
El ensayo de la curva de tiempo-matanza se realiza generalmente para probar para el efecto bactericida de cierta droga. También se usó para probar el efecto de las combinaciones de fármacos donde se combinan varios fármacos a concentraciones específicas. Este protocolo requiere la preparación de varios tubos o tazas estériles donde en cada taza añadimos el caldo, la combinación de fármacos y la cepa bacteriana requerida. Después de la incubación y registro de la densidad óptica en varios puntos de tiempo, los resultados se comparan con la tasa de crecimiento normal de la cepa utilizada para ver si la tasa de crecimiento aumentó, disminuyó o nocambió 13.
El método de la E-prueba se hace generalmente para probar para la concentración inhibitoria mínima (MIC) donde una tira que contiene una concentración del gradiente de la droga en cuestión se pone en una placa inoculada. También se utilizó para probar la combinación entre dos fármacos donde se añaden dos tiras a la placa de forma perpendicular intersectándose en sus MICs13.
Según la literatura, no existe un patrón oro para definir y estudiar la sinergia; por lo tanto, es difícil evaluar cuál de los métodos utilizados para estudiar la combinación es mejor y cuál produce mejores y más confiables resultados principalmente13. Sin embargo, el ensayo time-kill es intensivo en mano de obra, consume mucho tiempo y es costoso15,16,mientras que el método de prueba E se desarrolla para estudiar una combinación entre dos fármacos solamente. El tablero de ajedrez puede estudiar todas las combinaciones posibles entre los dos fármacos probados y es por eso que se ha elegido desarrollar esta técnica.
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Protocol
1. Pasos de preparación
- Preparar caldo Muller-Hinton (MHB) añadiendo 25 g de caldo MH a 1 L de agua destilada y mezclar. Autoclave a 121 °C durante 2,5 h. Luego, guarde los medios en autoclave a temperatura ambiente o en la nevera.
- Subcultivo de las bacterias en cuestión (E. coli ESBL) en el medio de agar utilizando el método de rayas de cuatro cuadrantes e incubar durante la noche a 37 °C.
- Usando un lazo estéril, tome una colonia y esparcir en la primera mitad de la placa de agar MacConkey haciendo rayas paralelas cercanas.
- Usando el lazo, extienda las bacterias en el segundo cuadrante rayándolas desde el primer cuadrante.
- A partir del segundo cuadrante, extienda las rayas en el tercer cuadrante usando rayas paralelas cercanas.
- Diseminar las bacterias en el centro del cuarto cuadrante rayándolas desde el tercer cuadrante.
2. Preparación del panel
- Coloque cuatro placas de 96 pozos una al lado de la otra para formar un cuadrado. Usando una cinta, tape su parte inferior junta.
- Repita este paso para obtener cuatro paneles cada uno que contenga 4 placas y asígneles el nombre A1, A2, A3 y A4.
- Agregue 50 μL de caldo MH a los pozos entre la columna 2 y la columna 11 en las 16 placas de 96 pozos de los cuatro paneles.
- Agregue 200 μL de caldo MH al pozo H12 que sirve como pozo de control negativo en las 16 placas de 96 pozos de los cuatro paneles.
- Agregue 150 μL de caldo MH a los pozos A1 y H1 que sirven como pozos de control positivo en las 16 placas de 96 pozos de los cuatro paneles.
3. Droga 1, Cefotaxima, dilución en serie
- A un tubo cónico, añadir 15 mL de dH estéril2O.
- Calcular el volumen a eliminar de la solución común de la droga siguiendo la fórmula C1V1 = C2V2. Así, V1 =(C2 x 15 mL) /C1.
NOTA: En nuestro caso, la solución común de cefotaxima es de 105 μg/mL yC2 es de 256 μg/mL; así, V1 = 38,4 μL.
- Calcular el volumen a eliminar de la solución común de la droga siguiendo la fórmula C1V1 = C2V2. Así, V1 =(C2 x 15 mL) /C1.
- Retire el volumen calculado de los 15 mL de dHestéril 2O, y luego agregue el medicamento.
- Pipetear 50 μL de la solución farmacológica preparada en cada pozo en la columna 11 y columna 12 excepto H12.
- Iniciar la dilución en serie retirando 50 μL de la columna 11 y colocándolos en los pozos correspondientes de la columna 10, y luego a partir de 10 hasta llegar a la columna 2 donde se desecharán los 50 μL tomados de la columna 2.
- Repita los pasos 3.4 y 3.5 para todas las 16 placas de 96 pozos de los cuatro paneles.
4. Droga 2, Amkacin, dilución en serie
- A un tubo cónico, añadir 10 mL de dH estéril2O.
- Calcular el volumen a eliminar de la solución común de la droga siguiendo la fórmula C1V1 = C2V2. Así, V1 =(C2 x 10 mL) / C1.
NOTA: En nuestro caso, la solución común de amikacina es de 103 μg/mL yC2 es de 64 μg/mL; así, V1 = 64 μL. - Retire el volumen calculado de los 10 mL de dHestéril 2O, y luego agregue el medicamento.
- Tome ocho placas separadas de 96 pozos.
- A cada placa, agregue 100 μL de MHB a los pozos entre las filas G y B.
- Añadir 100 μL de la solución del fármaco 2 previamente preparado a los pozos de la fila G.
- Diluya en serie de la fila G a la fila B tomando 100 μL de cada pozo y finalmente deseche los 100 μL de los pozos de la fila B.
- Repita los pasos 4.5, 4.6 y 4.7 para preparar ocho placas.
5. Transferencia de la droga 2 a los cuatro paneles
- Pipetear 50 μL de la droga 2 de los pozos entre las filas G y B en los pozos correspondientes en cada placa en los cuatro paneles. Una placa preparada de 96 pozos contiene 100 μL de fármaco 2 que es suficiente para dos placas en un panel.
6. Droga 3, Levofloxacina, adición
- A cuatro tubos cónicos diferentes, añadir 14 mL de dH estéril2O.
- Calcular el volumen a eliminar de la solución común de la droga siguiendo la fórmula C1V1 = C2V2. Así, V1 =(C2 x 14 mL) / C1.
NOTA: En nuestro caso, la levofloxacina se prepara en cuatro concentraciones diferentes a partir de una solución común de 5 x 103 μg/mL.
C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL
C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL
C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL
C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL - Retire el volumen calculado de los 14 mL de dHestéril 2O de cada tubo, y luego agregue el medicamento.
- Después de preparar las concentraciones requeridas del tercer fármaco, tomar 50 μL y añadirlo a los pozos correspondientes entre las filas B y G y las columnas 2 y 12 en la placa correspondiente en cada panel donde C1 corresponde a las cuatro placas P1 en los cuatro paneles, C2 corresponde a las cuatro placas P2 en los cuatro paneles , C3 corresponde a las cuatro placas P3 en los cuatro paneles, y C4 corresponde a las cuatro placas P4 en los cuatro paneles.
7. Droga 4, Trimetoprima-sulfametoxazol, adición
- A un tubo cónico, añadir 14 mL de dH estéril2O.
- Calcular el volumen a eliminar de la solución común de la droga siguiendo la fórmula C1V1 = C2V2. Así, V1 =(C2 x 14 mL) / C1.
NOTA: En nuestro caso, el trimetoprima-sulfametoxazol se prepara en cuatro concentraciones diferentes a partir de una solución común de 48 x 103 μg/mL.
C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL
C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL
C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL
C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL - Retire el volumen calculado de los 14 mL de dHestéril 2O de cada tubo, y luego agregue el medicamento.
- Después de preparar las concentraciones requeridas del cuarto fármaco, tomar 50 μL y añadirlo a los pozos correspondientes entre las filas B y G y las columnas 2 y 12 en las cuatro placas del panel correspondiente donde C1 corresponde al panel 1, C2 corresponde al panel 2, C3 corresponde al panel 3, y C4 corresponde al panel 4.
8. Preparación y adición de inóculo bacteriano E. coli ESBL
- Usando un lazo estéril, transfiera una colonia del aislado bacteriano E. coli ESBL previamente cultivado en una placa en 2 mL de MHB estéril y vórtice.
- Compruebe la turbidez donde debe ser 0.5 McFarland usando un densitómetro.
- Agregue 80 mL de caldo MH estéril a una taza de orina estéril.
- Añadir el inóculo bacteriano del inóculo 0.5 McFarland a la copa de orina siguiendo C1V1 = C2V2, donde V1 = (106 x 80 mL) / 108 = 800 μL.
- Pipetear 50 μL de la solución de inóculo 106 UFC/mL en cada pozo excepto H12, que es el pozo de control de esterilidad.
- Incubar los paneles a 37 °C durante la noche.
- Después de la incubación, añadir 50 μL de Iodotetrazolium para registrar el crecimiento en los pozos.
9. Protocolo para la plantilla FIC (Archivo Suplementario)
- Escriba la concentración más alta de la medicina 1 (Cefotaxime) en la célula amarilla en el panel A.
- Escriba la concentración más alta de la droga 2 (Amikacin) en la célula amarilla en el panel B.
- Escriba la concentración más alta de la medicina 3 (Levofloxacin) en la célula amarilla en el panel C.
- Escriba la concentración más alta de la droga 4 (Trimetoprima-sulfametoxazol) en el panel D.
- Trace la línea roja (interfaz crecimiento / no crecimiento) destacando los pozos que tienen crecimiento en rojo.
- Escriba el MIC de la medicina 1 en la tabla de la medicina 1 (ATB1).
- Escriba el MIC de la medicina 2 en la tabla de la medicina 2 (ATB2).
- Escriba el MIC de la droga 3 en la tabla de la droga 3 (ATB3).
- Escriba el MIC de la droga 4 en la tabla de la droga 4 (ATB4).
- Para calcular FIC para ATB1
- Determine los pozos en la interfaz Crecimiento/sin crecimiento.
- En la tabla ATB1, haga doble clic en la celda situada junto a FIC1 y arrastre la celda amarilla a la izquierda del panel A hasta el primer pozo seleccionado.
- Repita el paso 9.10.2 para cada pozo seleccionado donde el pozo 1 corresponde a FIC1, el pozo 2 corresponde a FIC2, y así sucesivamente.
- Para calcular el FIC para ATB2
- En la tabla ATB2, haga doble clic en la celda junto a FIC1 y arrastre la celda amarilla a la izquierda del panel B hasta el primer pozo preseleccionado.
- Repita el paso 9.11.1 para cada pozo preseleccionado.
- Para calcular el FIC para ATB3
- En la tabla ATB3, haga doble clic en la celda situada junto a FIC1 y arrastre la celda amarilla a la izquierda del panel C hasta el primer pozo preseleccionado.
- Repita el paso 9.12.1 para cada pozo preseleccionado.
- Para calcular el FIC para ATB4
- En la tabla ATB4, haga doble clic en la celda junto a FIC1 y arrastre la celda amarilla a la izquierda del panel D hasta el primer pozo preseleccionado.
- Repita el paso 9.13.1 para cada pozo preseleccionado.
- En la tabla con la etiqueta ATB1+2+3+4, sume automáticamente el FIC1 de cada ATB. Lo mismo ocurrirá para los otros FICs (FIC2, FIC3, etc.).
- En la celda que contiene FIC y resaltada en amarillo, haga doble clic en ella y seleccione los ΣFICs sumados de la tabla ATB1+2+3+4.
- Repita estos pasos para cada una de las nueve hojas que representan las nueve placas.
NOTA: En la hoja FIC all, la tabla mostrará la ficción sumada final con la interpretación del valor obtenido.
10. Determinación de la MIC mediante el ensayo de microdilución para los cuatro fármacos
- Etiquete cuatro filas diferentes con la abreviatura de cada medicamento probado. Por ejemplo, CTX para cefotaxima, AMK para amikacina, LEVO para levofloxacina y SXT para trimetoprima-sulfametoxazol.
- Pipeta 200 μL de caldo muller hinton estéril en el pozo número 1 y el pozo número 12 en cada fila usada. El pozo número 12 servirá como el control negativo bien.
- Pipetear 100 μL de caldo Muller Hinton estéril a los pozos 2 hasta 11 en cada fila usada.
- Calcular el volumen de cada fármaco a añadir utilizando la fórmulaC1V1 = C2V2. Así, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 es el volumen final en los pozos que es de 200 μL,C1 es la concentración de la solución común, yC2 es la concentración inicial que necesitamos tener en el primer pozo.
NOTA: Aquí, utilizamos lo siguiente:
Cefotaxima:C1 = 105 μg/mL, donde la diluimos a 104 μg/mL,C2 = 256 μg/mL; por lo tanto, V1 = 20,48 μL
Amikacina: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; así, V1 = 51,2 μL
Levofloxacina:C1 = 5 x 103 μg/mL, donde la diluimos a 5 x 102 μg/mL,C2 = 16 μg/mL; así, V1 = 25,6 μL
Trimetoprima-Sulfametoxazol: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; así, V1 = 68,26 μL - Pipetear el volumen requerido para cada fármaco en el primer pozo de la fila correspondiente después de eliminar el mismo volumen del caldo de 200 μL para obtener un volumen total de 200 μL después de la adición del fármaco.
- Diluir en serie eliminando 100 μL del pozo 1 al pozo 2 y así sucesivamente hasta llegar al pozo 10 donde se desecharán los 100 μL extraídos del pozo 10. Nótese que el pozo 11 sirve como el control positivo bien.
- Pipetear 100 μL de 106 inóculo bacterianos preparados en cada pozo en cada fila utilizada a excepción del pozo número 12 que sirve como control negativo.
- Incubar a 37 °C durante la noche.
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Representative Results
La Figura 2A representa los resultados obtenidos mediante la combinación de Cefotaxima y Amikacina con concentraciones específicas de Levofloxacina y Trimetoprima-sulfametoxazol. Podemos ver en la parte izquierda de la figura las cuatro placas que se presentan esquemáticamente con las concentraciones de los fármacos en la parte derecha de la figura. Las flechas representan los pozos de la interfaz Crecimiento/sin crecimiento. Los pozos de colores son los pozos que contienen el crecimiento. Notamos que la cuarta placa no contiene crecimiento en el cuadrante que contiene la combinación. Esto se debe a que en esta placa tenemos el MIC de Levofloxacina que inhibirá el crecimiento. En esta figura, podemos ver que el MIC del Cefotaxima se obtiene en el pozo A8, que es igual a 32 μg/mL. El MIC de Amikacina se obtiene en el pozo E1, que es igual a 16 μg/mL. Se observa un efecto de inhibición en la fila que contiene 1/2 MIC de Amikacina (fila D) además de varios subMIC de Cefotaxima y Levofloxacina además de 1/8 MIC de Trimetoprima-sulfametoxazol. Esta inhibición del crecimiento bacteriano en pozos que contienen concentraciones subMIC podría ser una forma de sinergia entre estas concentraciones de los cuatro fármacos.
La Figura 2B representa los resultados obtenidos mediante la combinación de Cefotaxima y Amikacina con concentraciones específicas de Levofloxacina y Trimetoprima-sulfametoxazol. Podemos ver en la parte izquierda de la figura las cuatro placas que se presentan esquemáticamente con las concentraciones de los fármacos en la parte derecha de la figura. Las flechas representan los pozos de la interfaz Crecimiento/sin crecimiento. Los pozos de colores son los pozos que contienen el crecimiento. Siga la misma interpretación para la cuarta placa. En el panel representado por esta figura, podemos ver que el patrón de inhibición del crecimiento bacteriano se produjo también en la fila D, donde los pozos contienen subMIC de Cefotaxima y levofloxacina, 1/2 MIC de Amikacina y 1/4 MIC de Trimetoprima-sulfametoxazol.
La Figura 2C representa los resultados obtenidos mediante la combinación de Cefotaxima y Amikacina con concentraciones específicas de Levofloxacina y Trimetoprima-sulfametoxazol. Podemos ver en la parte izquierda de la figura las cuatro placas que se presentan esquemáticamente con las concentraciones de los fármacos en la parte derecha de la figura. Las flechas representan los pozos de la interfaz Crecimiento/sin crecimiento. Los pozos de colores son los pozos que contienen el crecimiento. Siga la misma interpretación para la cuarta placa. En cuanto al patrón de inhibición en este panel, podemos ver que en las filas C y D no se ve crecimiento. Esto significa que en los pozos contienen varios subMIC de Cefotaxima y Levofloxacina además de 1/2 MIC de Trimetoprima-sulfametoxazol y 1/4 MIC y 1/2 MIC de Amikacina.
La Figura 2D representa los resultados obtenidos mediante la combinación de Cefotaxima y Amikacina con concentraciones específicas de Levofloxacina y Trimetoprima-sulfametoxazol. Podemos ver en la parte izquierda de la figura las cuatro placas que se presentan esquemáticamente con las concentraciones de los fármacos en la parte derecha de la figura. Las flechas representan los pozos de la interfaz Crecimiento/sin crecimiento. Siga la misma interpretación para la cuarta placa. Podemos ver que solo en la fila A y la columna 1 hemos coloreado pozos que significan crecimiento. Esto se debe a que en este panel tenemos el MIC de trimetoprima-sulfametoxazol que inhibirá totalmente el crecimiento.
Figura 1:Esquema de la configuración y los paneles del tablero de ajedrez Q y un mapa de cómo se agregan los medicamentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los resultados experimentales obtenidos en el ensayo 1 para determinadas combinaciones probadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
El método quadruple checkerboard se asemeja al checkerboard y al checkerboard tridimensional en su protocolo. Sin embargo, se deben tener en cuenta ciertos pasos cruciales para evitar errores durante el experimento.
Asegúrese de probar para el MIC de cada droga contra el aislante probado antes de comenzar el protocolo para saber cuáles son las concentraciones que se necesitan para comenzar las diluciones con para la droga 1 y la droga 2 que necesitan ser diluidas en serie en las placas. Con respecto a la droga 3 y a la droga 4, mic se debe también saber para calcular las concentraciones necesitaron ser probadas (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, y MIC). Hay muchos métodos para determinar el MIC, sin embargo, el mejor es determinarlo con la técnica de microdilución, ya que el protocolo Q-checkerboard también utiliza el ensayo de microdilución para la dilución en serie.
En el primer paso, mientras graba las placas, asegúrese de que el banco esté limpio y cubra las placas con cubiertas estériles para evitar la contaminación. Es importante tener en cuenta que este protocolo se puede hacer utilizando cuatro placas de 96 pozos que representan los cuatro paneles, donde cada placa se divide en cuatro cuadrantes más pequeños. Sin embargo, el número de diluciones se minimizará para el primer y segundo fármaco. Además, también se pueden usar placas de 384 pozos profundos en lugar de pegar cuatro placas juntas. Sin embargo, no estaba disponible cuando hicimos los experimentos. Tenga en cuenta que al elegir la placa a utilizar, asegúrese de comprobar la capacidad de cada pozo ya que el volumen final en el pozo será de 250 μL.
Además, el número de placas en cada panel y el número de paneles depende del número de diluciones que se requieren para el tercer y cuarto medicamento. Por ejemplo, en este experimento, cuatro diluciones de la tercera droga y cuatro diluciones de la cuarta droga fueron requeridas (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, y MIC); por lo tanto, teníamos cuatro placas en cada panel y cuatro paneles.
La dilución de la primera droga se produce en las placas de los paneles de acuerdo con las columnas. Sin embargo, la dilución de la segunda droga se produce en placas separadas de acuerdo con las filas. El tercer y cuarto fármacos no se diluyen en serie. Sin embargo, cada concentración utilizada se prepara en un tubo separado y se agrega a cada pozo en un volumen específico. Es importante señalar que los pozos que contienen los cuatro fármacos están presentes en el cuadrante entre las filas G y B y las columnas 2 y 12 solamente. El tablero de ajedrez y los protocolos de tablero de ajedrez tridimensional no fueron filmados o escritos en este manuscrito porque son protocolos conocidos y el propósito de este manuscrito es hablar sobre el protocolo Q-tablero de ajedrez. En la técnica de tablero de ajedrez, la fila A contiene sólo el fármaco 1; así, mostrando el MIC de la droga 1. La columna 1 contiene sólo el medicamento 2; así, mostrando el MIC de la droga 2.
Este concepto se mantiene en el protocolo Q-Checkerboard donde el MIC de la droga 1 todavía se muestra en la fila A y la MIC de la droga 2 todavía se muestra en la columna 1. Además de esto, los dos fármacos añadidos presentan su MIC en el experimento. El fármaco 3 tiene la placa P4 en cada panel donde se añade el MIC del fármaco 3 a todos los pozos por lo que no debemos observar crecimiento en esta placa. Del mismo modo, el fármaco 4 tiene un panel A4 donde el MIC del fármaco 4 se añade a todos los pozos de todas las placas del panel 4 por lo que no se debe observar ningún crecimiento en este panel.
El crecimiento en las placas se registra en base a la turbidez en los pozos, donde se considera que los pozos turbios tienen crecimiento. Además de la turbidez, se añaden 50 μL de Iodotetrazolium y se dejan durante unos minutos. Un cambio de color a rosa significa que hay crecimiento.
Este método tiene ciertas limitaciones. Requiere trabajo duro y concentración. Podrían producirse errores de pipeteo, ya que esta técnica se basa principalmente en la canalización. Los cálculos de FIC se consideran una limitación en este caso ya que se trata de cuatro valores, no dos o tres. Agregar un valor aumentará el valor del FIC en el pozo; por lo tanto, los valores de FIC que determinan el sinergismo, la indiferencia y el antagonismo deben ser reconsiderados.
Los valores fic pueden cambiar entre varias referencias relativas a los estándares por los que se definen el sinergismo, el antagonismo y la indiferencia. Algunas referencias afirman que un FIC de 0,5 y menos se considera sinergismo13,mientras que otros afirman que un FIC menor que 0,8 se considera sinergismo16. Otra referencia afirma que un FIC menor que 1 se considera sinergismo17. Debido a la inestabilidad y el conflicto en la definición de un estándar unificado FIC de sinergismo, consideramos 1 para ser nuestra referencia.
El FIC final se calcula sumando los valores fic de cada placa (9 FICs) y dividiéndolo por el número de placas que es 9. Es importante tener en cuenta que el panel 4 no se considera en los resultados ya que contiene el MIC del cuarto fármaco por lo que la inhibición será obra de un solo fármaco. Además, la placa 4 en cada panel tampoco se considera ya que contiene el MIC de la droga 3 donde la inhibición en esta placa será el acto de la droga 3 sola. Así, terminamos con 9 placas (16 - (4 + 3)).
Para cada placa, los FICs se calculan para los pozos en la interfaz de crecimiento/no crecimiento según la fórmula siguiente: (MIC de la medicina 1 en la combinación / MIC de la medicina 1 solamente) + (MIC de la medicina 2 en la combinación / MIC de la medicina 2 solamente) + (MIC de la medicina 3 en la combinación / MIC de la medicina 3 solamente) + (MIC de la medicina 4 en la combinación / MIC de la medicina 4 solamente). A continuación, el número obtenido se divide entre 4. Esta fórmula se realiza para cada pozo en la interfaz Crecimiento/sin crecimiento en la misma placa. A continuación, se suman todos los FICs de una misma placa para obtener el FIC de esta placa. Finalmente, como se mencionó anteriormente, se suman los 9 FICs finales de cada placa y se dividen por 9 para obtener el FIC final que se interpretará.
Un FIC menor que 1 se considera sinérgico cuando tiene un cierto grado de sinergia: es ligeramente sinérgico (cerca de uno) o más sinérgico (cuando se mueve hacia 0,5 y menos). Este cálculo e interpretación se realizan simplemente utilizando una plantilla FIC que desarrollamos. Simplemente ingresamos las concentraciones, elegimos los pozos en la interfaz Crecimiento/sin Crecimiento para calcular los FICs, y obtendremos el FIC final que se interpreta de acuerdo con los criterios mencionados.
Este método permite la prueba de todas las combinaciones posibles que se pueden hacer usando cuatro drogas en un experimento que se puede hacer en un día. Los resultados se obtienen al día siguiente. Mientras que, para el ensayo de curva de muerte de tiempo, se necesita más tiempo, materiales de trabajo y trabajadores de laboratorio para probar el mismo número de combinaciones, ya que cada conjunto de combinaciones se prueba solo en un solo tubo o taza, lo que lo hace lento. Este método se puede utilizar no sólo para probar combinaciones de fármacos antibacterianos, sino para probar todos los tipos de medicamentos utilizados para tratar enfermedades y necesita ser probado en combinación. Se puede utilizar también para probar una combinación de medicamentos y extractos de plantas o incluso una combinación de sólo extractos de plantas. El punto es que este método se puede utilizar para probar no sólo medicamentos específicos, pero todo lo que se puede combinar.
Este método va acompañado de varias limitaciones. Las habilidades de pipeteo son muy importantes al realizar este ensayo y cualquier error que pueda ocurrir mientras que el pipeteo y la dilución en serie pueden afectar negativamente los resultados y podrían conducir a resultados falsos negativos o falsos positivos. Por lo tanto, cualquier avance tecnológico con respecto a las máquinas de pipeteo y robots será de gran ayuda en la realización de este ensayo. Este método requiere una gran cantidad de cálculos y diluciones por lo que cualquier error único podría cambiar el resultado de los resultados. Esta técnica proporciona información sobre el efecto de inhibición solamente y no el efecto de matar. Esta técnica estudia la inhibición en un solo punto de tiempo y no a lo largo del tiempo.
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Disclosures
ninguno.
Acknowledgments
ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
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