Summary
Bu protokol, tek bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen tüm olası kombinasyonların nasıl incelanacağını açıklar. Bu yöntem, sonuçları değerlendirmek için standart 96 kuyu plakası mikro seyreltme testine ve fraksiyonel inhibitör konsantrasyonların (FIC) hesaplanmasına dayanmaktadır.
Abstract
İlaç kombinasyon tedavisi kavramı, esas olarak ilaçlara karşı direncin artmasıyla çok önemli hale gelmektedir. Q-checkerboard olarak da adlandırılan Dörtlü dama tahtası, diğer protokollerle aynı sonuçları elde etmek için gereken zamanı ve çalışmayı en aza indirmek için bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen olası kombinasyonların sayısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Bu protokol, ilaçların seyreltildiği ve birkaç 96 kuyu plakasında birleştirildiği basit mikro seyreltme tekniğine dayanmaktadır.
96 kuyulu tabakların ilk setinde, Muller-Hinton suyu seri olarak seyreltmek için ilk gerekli ilaç (örneğin, buradaki Cefotaxime) eklenir. İlk adım yapıldıktan sonra, belirli bir ilaç 2 hacmini çıkararak aktarılacak ve ilaç içeren ilk 96 kuyu plakaları kümesinde karşılık gelen kuyulara konulacak ikinci ilacı (örneğin Amikaci) seyreltmek için başka bir 96 kuyu plakası seti kullanılır. Üçüncü adım, üçüncü ilacın gerekli konsantrasyonları (örneğin, Levofloksasin), ilaç 1 ve 2 kombinasyonunu içeren ilk sette uygun plakalara eklenerek yapılır. Dördüncü adım, dördüncü ilacın gerekli konsantrasyonları (örneğin, Trimethoprim-sulfamethoxazol) ilk sette uygun plakalara eklenerek yapılır. Daha sonra E. coli ESBL bakteriyel inoculum hazırlanarak eklenecektir.
Bu yöntem, tüm olası kombinasyonları değerlendirmek için önemlidir ve in vivo test için daha fazla test edilmesi gereken daha geniş bir olasılık yelpazesine sahiptir. Çok fazla odaklanma gerektiren yorucu bir teknik olmasına rağmen, sonuçlar dikkat çekicidir ve tek bir deneyde birçok kombinasyonun test edilebildiği zaman tasarrufu sağlar.
Introduction
Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı nedeniyle direncin artmasıyla1,2, bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için yeni ilaçlar ve ajanlar geliştirme ihtiyacı çok önemli hale gelmiştir. Direnç krizinin üstesinden gelmek için yeni ilaçlar geliştirmek gibi yeni yaklaşımlar çok önemlidir. Bununla birlikte, ilaç endüstrisi yeni antimikrobiyal ajanlar geliştirmekle ilgilenmiyor. Ayrıca, yeni ilaçlar geliştirilirse, bakteriler bu yeni ilaçlara karşı gelişmeye ve direnç geliştirmeye devam edecektir3,4. Böylece, direnç sorunu çözülmeyecek ve bakteri direncinin üstesinden gelmek için başka bir yaklaşıma duyulan ihtiyacı dikkate alınması ve çalışılması gereken bir zorunluluk haline getirecektir.
İlaç kombinasyonu, bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde çok önemli bir kavramdır, esas olarak çokdrojenlere dirençli patojenlerin neden olduğu5,6. Tedavinin seyrini azaltır, verilen dozu azaltır; böylece, verilen ilacın toksisitesini azaltmak, direnç gelişme hızını azaltmaya yardımcı olur ve bir şekilde, teminat duyarlılığıkavramındaaçıklandığı gibi bakterileri verilen ilaçlara duyarlı hale verir 5,7,8,9.
Bir ilaca direnç gelişimi tek bir mutasyon gerektirir; bununla birlikte, birden fazla yolu hedefleyen ilaçların bir kombinasyonuna direnç gelişimi, bu kombinasyon tarafından yavaşlatılan birkaç bağımsız mutasyon gerektirir. Kombinasyon tedavisi kullanırken direncin azalmasına bir örnek, Mycobacterium Tuberculosis10'daRifampin'e karşı direncin azalmasıdır. Başka bir örnek Gribble ve ark. tarafından yapılan bir çalışma, piperacillin alan hastalarda dirençli suşların ortaya çıkış oranının karboksipenisilin ve aminoglikozin kombinasyonunu alanlardan daha yüksek olduğunu göstermiştir10. Çalışmalar, gelişen bakterilerde aminoglikozinlere karşı direnç gelişiminin bu suşları diğer çeşitli ilaçlara duyarlı hale getirdiğinigöstermiştir 5. Beta-laktam sınıfı ilaç amoksisilin ve laktamaz inhibitörü clavulanic asit arasındaki kombinasyon dirençli bakteri suşlarının tedavisinde başarı göstermiştir8.
Tedavi süresini azaltmak, ilaç kombinasyonlarından kaynaklanan iyi bir avantajdır. Örneğin, 2 hafta boyunca gentamisin ile kombine penisilin veya seftriakson tedavisi, 4 hafta boyunca verildiğinde sadece penisilin veya sedtriakson tarafından verilen etkinliğin aynısını verecektir11. İlaçların birleştirilmesi, Sub-MIC'ler gibi tek başına verildiğinde etkili olmayan ilaçların daha düşük dozajlarının kullanımına izin verir. Sülfonamidler örneği, üçlü sülfonamidlerin kullanımının en aza indirildiği yerlerde, daha düşük dozlarda, çözünmeyen sülfonamidleri tam dozlarda kullanırken kristal oluşumu veya kristalüri olan toksisiteverilebilir 12.
Böylece verilen dozajın ve tedavi süresinin azaltılması sonunda ilaçların vücuttaki toksisitesini azaltacaktır. Kombine ilaçlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için yöntemler geliştirme fikri çok önemlidir. Bir çalışmada, sonuçlar kombinasyon tedavisinin dirençli Acinetobacter ve P. aeruginosa8 türlerinin tedavisinde daha etkili olduğunugöstermiştir.
İlaçların birlikte verilmesi
Dama tahtası yöntemi, zaman öldürme eğrisi yöntemi ve E-test yöntemi13gibi ilaç kombinasyonlarını inceleyebileceğimiz farklı yöntemler vardır. Dama tahtası yöntemi, söz konusu iki ilaç arasındaki tüm olası kombinasyonları bir deneyin kendisinde inceleyebilir. Ek olarak, üç ilacın bir kombinasyonunu incelemek için geliştirilmiştir14. Şimdi, bunu esas olarak multidrug dirençli patojenlerin tedavisi için dört ilacın bir kombinasyonunu incelemek için genişletiyoruz.
Zaman öldürme eğrisi testi genellikle belirli bir ilacın bakterisidal etkisini test etmek için gerçekleştirilir. Ayrıca, belirli konsantrasyonlarda birkaç ilacın birleştirildiği ilaç kombinasyonlarının etkisini test etmek için de kullanılmıştır. Bu protokol, her fincanda et suyunu, ilaçların kombinasyonunu ve gerekli bakteri suşunu eklediğimiz birkaç steril tüpün veya bardağın hazırlanmasını gerektirir. Optik yoğunluğun birkaç zaman noktasında inkübasyonu ve kaydedilmesi sonrasında, büyüme hızının artıp artmadığını veya değişmediğini görmek için kullanılan suşun normal büyüme hızı ile karşılaştırılmıştır13.
E-test yöntemi genellikle söz konusu ilacın gradyan konsantrasyonu içeren bir şeridin aşılanmış bir plakaya konulduğu minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) test etmek için yapılır. Ayrıca, plakaya iki şeridin MIC13'lerindekesişen dik bir şekilde eklendiği iki ilaç arasındaki kombinasyonu test etmek için de kullanıldı.
Literatüre göre sinerjiyi tanımlamak ve incelemek için altın bir standart yoktur; bu nedenle, kombinasyonu incelemek için kullanılan yöntemlerden hangisinin daha iyi olduğunu ve hangisinin daha iyi ve daha güvenilir sonuçlar ürettiğini değerlendirmek zordur esas olarak13. Bununla birlikte, Time-kill testi emek yoğun, zaman alıcı ve pahalı15,16, E-test yöntemi sadece iki ilaç arasındaki bir kombinasyonu incelemek için geliştirilmiştir. Dama tahtası test edilen iki ilaç arasındaki tüm olası kombinasyonları inceleyebilir ve bu yüzden bu teknik geliştirilmek üzere seçilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık adımları
- 1 L damıtılmış suya 25 g MH suyu ekleyerek Muller-Hinton suyu (MHB) hazırlayın ve karıştırın. 2,5 saat boyunca 121 °C'de otoklav. Ardından, otomatik kapatılmış ortamı oda sıcaklığında veya buzdolabında saklayın.
- Söz konusu bakterileri(E. coli ESBL) dört çeyrek çizgi yöntemini kullanarak agar medyasında alt kültüre koyun ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Steril bir döngü kullanarak, bir koloni alın ve yakın paralel çizgiler yaparak MacConkey agar plakasının ilk yarısına yayın.
- Döngüyü kullanarak, bakterileri ilk çeyrekten itibaren çizgileyerek ikinci çeyrekte yayın.
- İkinci çeyrekten itibaren, yakın paralel çizgiler kullanarak üçüncü çeyrekteki çizgileri genişletin.
- Bakterileri dördüncü çeyreğin ortasına üçüncü çeyrekten itibaren çizerek yayarlar.
2. Panel hazırlığı
- Bir kare oluşturmak için yan yana dört 96 kuyu plakası yerleştirin. Bir bant kullanarak, altlarını birbirine bantlayın.
- Her biri 4 plaka içeren dört panel elde etmek ve bunları A1, A2, A3 ve A4 olarak adlandırmak için bu adımı yineleyin.
- Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasındaki sütun 2 ile sütun 11 arasındaki kuyulara 50 μL MH suyu ekleyin.
- Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasında negatif kontrol kuyusu olarak hizmet veren kuyu H12'ye 200 μL MH suyu ekleyin.
- Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasında pozitif kontrol kuyusu görevi gören A1 ve H1 kuyularına 150 μL MH suyu ekleyin.
3. İlaç 1, Cefotaxime, seri seyreltme
- Konik bir tüpe 15 mL steril dH2O ekleyin.
- C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 15 mL) / C1.
NOT: Bizim durumumuzda, Cefotaxime stok çözeltisi 105 μg / mL ve C2 2 256 μg / mL'dir; böylece V1 = 38,4 μL.
- C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 15 mL) / C1.
- Hesaplanan hacmi 15 mL steril dH2O'dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
- H12 hariç sütun 11 ve sütun 12'deki her kuyuya hazırlanan ilaç çözeltisinin pipet 50 μL'si.
- Sütun 11'den 50 μL çıkararak ve sütun 10'daki ilgili kuyulara koyarak seri seyreltmeye başlayın ve ardından sütun 2'den alınan 50 μL'nin atılacağı sütun 2'ye ulaşana kadar.
- Dört panelin tüm 16 96 kuyu plakası için 3.4 ve 3.5 adımlarını yineleyin.
4. İlaç 2, Amkacin, seri seyreltme
- Konik bir tüpe 10 mL steril dH2O ekleyin.
- C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 10 mL) / C1.
NOT: Bizim durumumuzda, Amikacin stok çözeltisi 103 μg / mL ve C2 64 μg / mL'dir; böylece V1 = 64 μL. - Hesaplanan hacmi 10 mL steril dH2O'dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
- Sekiz ayrı 96 kuyu plakası alın.
- Her tabağa, G ve B sıraları arasındaki kuyulara 100 μL MHB ekleyin.
- Daha önce hazırlanmış ilaç 2 çözeltisinin 100 μL'lik kısmını G sırasının kuyularına ekleyin.
- Her kuyudan 100 μL alarak G satırından B satırına seri olarak seyreltin ve son olarak 100 μL'yi B satırının kuyularından atın.
- Sekiz plaka hazırlamak için 4.5, 4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.
5. İlaç 2'nin dört panele aktarılması
- Pipet 50 μL ilaç 2, G ve B sıraları arasındaki kuyulardan dört paneldeki her plakadaki ilgili kuyulara. Hazırlanan bir 96 kuyu plakası, bir panelde iki plaka için yeterli olan 100 μL ilaç 2 içerir.
6. İlaç 3, Levofloksasin, ilave
- Dört farklı konik tüpe 14 mL steril dH2O ekleyin.
- C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 14 mL) / C1.
NOT: Bizim durumumuzda, Levofloksasin 5 x 103 μg / mL'lik bir stok çözeltisinden dört farklı konsantrasyonda hazırlanır.
C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL
C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL
C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL
C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL - Hesaplanan hacmi her tüpten 14 mL steril dH2O'dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
- Üçüncü ilacın gerekli konsantrasyonlarını hazırladıktan sonra, 50 μL alın ve B ve G satırları ile C1'in dört paneldeki dört P1 plakasına karşılık geldiği her panelde ilgili plakadaki 2 ve 12 sütunları arasındaki ilgili kuyulara ekleyin, C2 dört paneldeki dört P2 plakasına karşılık gelir. , C3 dört paneldeki dört P3 plakasına, C4 ise dört paneldeki dört P4 plakasına karşılık gelir.
7. İlaç 4, Trimethoprim-sulfamethoxazole, ilave
- Konik bir tüpe 14 mL steril dH2O ekleyin.
- C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 14 mL) / C1.
NOT: Bizim durumumuzda trimethoprim-sulfamethoxazole, 48 x 103 μg/mL'lik bir stok çözeltisinden dört farklı konsantrasyonda hazırlanır.
C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL
C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL
C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL
C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL - Hesaplanan hacmi her tüpün 14 mL steril dH2O'sundan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
- Dördüncü ilacın gerekli konsantrasyonlarını hazırladıktan sonra, 50 μL alın ve C1'in panel 1'e, C3'ün panel 3'e ve C4'ün panel 4'e karşılık geldiği ilgili paneldeki dört plakadaki 2 ve 12 sütunları arasındaki ilgili kuyulara ekleyin.
8. Bakteriyel inoculum E. coli ESBL hazırlanması ve eklenmesi
- Steril bir döngü kullanarak, daha önce bir plaka üzerinde kültürlenmiş bakteriyel izole E. coli ESBL'nin bir kolonisini 2 mL steril MHB ve girdap içine aktarın.
- Bir densitometre kullanarak 0.5 McFarland olması gereken yerde bulanıklığı kontrol edin.
- Steril bir idrar kabına 80 mL steril MH suyu ekleyin.
- C 1V 1 = C 2 V2'yitakiben idrar kabına0,5McFarland inokülüsten bakteriyel inokülum ekleyin, burada V 1 =(10 6 x 80 mL) / 108 = 800 μL.
- Pipet 50 μL inoculum çözeltisi 106 CFU/mL sterilite kontrolü iyi olan H12 hariç her kuyuya.
- Panelleri gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, kuyulardaki büyümeyi kaydetmek için 50 μL Iodotetrazolium ekleyin.
9. FIC şablonu için protokol (Ek Dosya)
- A panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 1 (Cefotaxime) konsantrasyonu yazın.
- B panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 2 (Amikacin) konsantrasyonu yazın.
- C panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 3 konsantrasyonu (Levofloksasin) yazın.
- En yüksek ilaç konsantrasyonu 4'ü (Trimethoprim-sulfamethoxazole) panel D'ye yazın.
- Kırmızıda büyüme olan kuyuları vurgulayarak Redline'ı (Büyüme/Büyüme yok arayüzü) takip edin.
- İlaç 1'in MIC'ini ilaç 1 (ATB1) tablosuna yazın.
- İlaç 2'nin MIC'ini ilaç 2 (ATB2) tablosuna yazın.
- İlaç 3'ün MIC'ini ilaç 3 (ATB3) tablosuna yazın.
- İlaç 4'ün MIC'ini ilaç 4 (ATB4) tablosuna yazın.
- ATB1 için FIC hesaplamak için
- Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları belirleyin.
- Atb1 tablosunda, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve A panelinin solundaki sarı hücreyi seçilen ilk kuyuya sürükleyin.
- 9.10.2 adımlarını, kuyu 1'in FIC1'e karşılık geldiği, 2'nin FIC2'ye karşılık geldiği ve benzeri her kuyu için tekrarlayın.
- ATB2 için FIC'yi hesaplamak için
- ATB2 tablosunda, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve B panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.
- Önceden seçilmiş her kuyu için 9.11.1 adımlarını yineleyin.
- ATB3 için FIC'yi hesaplamak için
- Tablo ATB3'te, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve C panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.
- Önceden seçilmiş her kuyu için 9.12.1 adımlarını yineleyin.
- ATB4 için FIC'yi hesaplamak için
- Atb4 tablosunda, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve D panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.
- Önceden seçilmiş her kuyu için 9.13.1 adımlarını yineleyin.
- ATB1+2+3+4 etiketli tabloda, her ATB'nin FIC1'ini otomatik olarak toplar. Aynı durum diğer FIC'ler (FIC2, FIC3 vb.) için de geçerli olacaktır.
- FIC içeren ve sarı ile vurgulanan hücrede, üzerine çift tıklayın ve TABLO ATB1 +2+3+4'ten toplam ΦFIC'leri seçin.
- Dokuz plakayı temsil eden dokuz sayfanın her biri için bu adımları yineleyin.
NOT: Tüm FIC sayfasında, tablo elde edilen değerin yorumlanmasıyla son toplamlı FIC'yi gösterecektir.
10. Dört ilaç için mikrodilütion testini kullanarak MIC tayini
- Test edilen her ilacın kısaltmasıyla dört farklı satırı etiketle. Örneğin, Cefotaxime için CTX, Amikacin için, Levofloksasin için LEVO ve Trimethoprim-sulfamethoxazole için SXT.
- Pipet 200 μL steril Muller Hinton suyu, kullanılan her satırda kuyu numarası 1 ve kuyu numarası 12'ye. 12 numara negatif kontrol kuyusu olarak hizmet edecek.
- Pipet 100 μL steril Muller Hinton suyu kuyulara 2 ila 11 kullanılan her satırda.
- C1V 1 = C 2 V2 formülünü kullanarak eklenecek her ilacın hacmini hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2, 200 μL olan kuyulardaki son hacimdir, C1 stok çözeltisinin konsantrasyonudur ve C2 ilk kuyuda sahip olmamız gereken ilk konsantrasyondur.
NOT: Burada aşağıdakileri kullanırız:
Cefotaxime: C1 = 105 μg/mL, burada 104 μg/mL, C 2 =256 μg/mL'ye seyreltiyoruz; böylece, V1 = 20,48 μL
Amikacin: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; böylece, V1 = 51.2 μL
Levofloksasin: C1 = 5 x 103 μg/ mL, burada 5 x 102 μg / mL, C2 = 16 μg / mL'ye seyreltiyoruz; böylece, V1 = 25,6 μL
Trimethoprim-Sulfamethoxazole: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; böylece, V1 = 68,26 μL - Pipet, ilacın eklenmesinden sonra toplam 200 μL hacim elde etmek için 200 μL et suyundan aynı hacmi çıkardıktan sonra ilgili satırın ilk kuyusundaki her ilaç için gerekli hacmi sağlar.
- 100 μL'yi kuyudan 1'den kuyu 2'ye çıkararak seri olarak seyreltin ve böylece kuyudan çıkarılan 100 μL'nin atılacağı kuyu 10'a ulaşana kadar. 11'in pozitif kontrol olarak iyi hizmet ettiğini unutmayın.
- Pipet 100 μL 106 negatif kontrol görevi gören 12 numara hariç kullanılan her bir kuyuya bakteriyel inoculum hazırladı.
- Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A, Cefotaxime ve Amikacin'in belirli Levofloksasin ve Trimethoprim-sulfamethoxazole konsantrasyonlarıyla birleştirilmesiyle elde edilen sonuçları temsil eder. Şeklin sol kısmında, şeklin sağ kısmındaki ilaçların konsantrasyonları ile şematik olarak sunulan dört plakayı görebiliriz. Oklar Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları temsil eder. Renkli kuyular büyüme içeren kuyulardır. Dördüncü plakanın kombinasyonu içeren kadranda büyüme içermediğini fark ediyoruz. Bunun nedeni, bu plakada büyümeyi engelleyecek Levofloksasin MIC'miz olmasıdır. Bu şekilde, Cefotaxime'nin mikrofonunun 32 μg / mL'ye eşit olan kuyu A8'de elde edildiğini görebiliriz. Amikacin MIC, 16 μg / mL'ye eşit olan E1 kuyusunda elde edilir. Trimethoprim-sulfamethoxazole'nin 1/8 MIC'sine ek olarak Cefotaxime ve Levofloksasin'in birkaç alt MIMIC'ine ek olarak 1/2 Amikacin (D sırası) MİkC'si içeren satırda bir inhibisyon etkisi görülür. SubMIC konsantrasyonları içeren kuyularda bakteri üremesinin bu inhibisyonu, dört ilacın bu konsantrasyonları arasında bir sinerji biçimi olabilir.
Şekil 2B, Cefotaxime ve Amikacin'in belirli Levofloksasin ve Trimethoprim-sulfamethoxazole konsantrasyonlarıyla birleştirilmesiyle elde edilen sonuçları temsil eder. Şeklin sol kısmında, şeklin sağ kısmındaki ilaçların konsantrasyonları ile şematik olarak sunulan dört plakayı görebiliriz. Oklar Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları temsil eder. Renkli kuyular büyüme içeren kuyulardır. Dördüncü plaka için aynı yorumu izleyin. Bu rakamla temsil edilen panelde, bakteri üremesinin inhibisyon paterninin, kuyuların Cefotaxime ve levofloksasin subMIC'leri, Amikacin 1/2 MIKROFONu ve Trimethoprim-sulfamethoxazole'nin 1/4 MIC'si içerdiği D sırasında da meydana geldiğini görebiliriz.
Şekil 2C, Cefotaxime ve Amikacin'in belirli Levofloksasin ve Trimethoprim-sulfamethoxazole konsantrasyonlarıyla birleştirilmesiyle elde edilen sonuçları temsil eder. Şeklin sol kısmında, şeklin sağ kısmındaki ilaçların konsantrasyonları ile şematik olarak sunulan dört plakayı görebiliriz. Oklar Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları temsil eder. Renkli kuyular büyüme içeren kuyulardır. Dördüncü plaka için aynı yorumu izleyin. Bu paneldeki inhibisyon deseni gelince, C ve D satırlarında büyümenin görülmediğini görebiliriz. Bu, kuyularda Trimethoprim-sulfamethoxazole ve 1/4 MIC ve 1/2 Amikacin MIC'nin 1/2 MIC'sine ek olarak birkaç Cefotaxime ve Levofloksasin altMIC içerdiği anlamına gelir.
Şekil 2D, Cefotaxime ve Amikacin'in belirli Levofloksasin ve Trimethoprim-sulfamethoxazole konsantrasyonlarıyla birleştirilmesiyle elde edilen sonuçları temsil eder. Şeklin sol kısmında, şeklin sağ kısmındaki ilaçların konsantrasyonları ile şematik olarak sunulan dört plakayı görebiliriz. Oklar Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları temsil eder. Dördüncü plaka için aynı yorumu izleyin. Sadece A ve sütun 1 satırlarında büyüme anlamına gelen renkli kuyulara sahip olduğumuzu görebiliriz. Bunun nedeni, bu panelde büyümeyi tamamen engelleyecek trimethoprim-sulfamethoxazole MIC'miz olmasıdır.
Şekil 1: Q-checkerboard kurulumunun şeması ve paneller ve ilaçların nasıl eklenme haritası. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Test edilen belirli kombinasyonlar için deneme 1'de elde edilen deneysel sonuçlar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dörtlü Dama Tahtası yöntemi, protokolündeki dama tahtasına ve üç boyutlu dama tahtasına benzer. Ancak, deneme sırasında hataları önlemek için bazı önemli adımlar dikkate alınmalıdır.
Plakalarda seri olarak seyreltilmesi gereken ilaç 1 ve ilaç 2 için seyreltmeleri başlatmak için gereken konsantrasyonların ne olduğunu bilmek için protokole başlamadan önce test edilen izoleye karşı her ilacın MIC'ını test etmeyi unutmayın. İlaç 3 ve ilaç 4 ile ilgili olarak, MIC'nin test edilmesi gereken konsantrasyonları (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC ve MIC) hesaplaması için de bilinmesi gerekir. MIC'yi belirlemek için birçok yöntem vardır, ancak en iyisi mikrodilüsiyon tekniği ile belirlemektir, çünkü Q-checkerboard protokolü seri seyreltme için mikrodilüm testini de kullanır.
İlk adımda, plakaları bantlarken, tezgahın temiz olduğundan emin olun ve kirlenmeyi önlemek için plakaları steril kapaklarla örtün. Bu protokolün, her plakanın dört küçük kadrana ayrıldığı dört paneli temsil eden dört adet 96 kuyu plakası kullanılarak yapılabileceğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, birinci ve ikinci ilaç için seyreltme sayısı en aza indirilecektir. Ek olarak, dört plakayı birbirine bantlamak yerine derin kuyu 384 kuyu plakaları da kullanılabilir. Ancak, deneyleri yaptığımızda mevcut değildi. Kullanılacak plakayı seçerken, kuyudaki son hacim 250 μL olacağından, her kuyunun kapasitesini kontrol ettiğinizden emin olun.
Ayrıca, her paneldeki plaka sayısı ve panel sayısı, üçüncü ve dördüncü ilaç için gerekli olan seyreltme sayısına bağlıdır. Örneğin, bu deneyde, üçüncü ilacın dört seyreltme ve dördüncü ilacın dört seyreltmeleri gerekliydi (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC ve MIC); böylece, her panelde dört plakamız ve dört panelimiz vardı.
İlk ilacın seyreltilmesi, sütunlara göre panellerin plakalarında meydana gelir. Bununla birlikte, ikinci ilacın seyreltilmesi sıralara göre ayrı plakalarda gerçekleşir. Üçüncü ve dördüncü ilaçlar seri olarak seyreltilmez. Bununla birlikte, kullanılan her konsantrasyon ayrı bir tüpte hazırlanır ve her kuyuya belirli bir hacimde eklenir. Dört ilacı içeren kuyuların, sadece G ve B satırları ile 2 ve 12 sütunları arasındaki çeyrekte mevcut olduğunu belirtmek önemlidir. Dama tahtası ve üç boyutlu dama tahtası protokolleri bilinen protokoller olduğu için bu yazıya çekilmemiş veya yazılmamıştır ve bu makalenin amacı Q-dama tahtası protokolü hakkında konuşmaktır. Dama tahtası tekniğinde, A satırı yalnızca 1 ilacı içerir; böylece, ilacın MIC'ini göstermek 1. Sütun 1 yalnızca ilaç 2 içerir; böylece, ilacın MIC gösteren 2.
Bu kavram, ilaç 1'in MIC'inin hala A sırasında ve 2 ilacının MIC'nin hala sütun 1'de gösterildiği Q-Checkerboard protokolünde tutulur. Buna ek olarak, eklenen iki ilaç deneyde MIC'lerini sunar. İlaç 3, ilaç 3'ün MIKROFONunun tüm kuyulara eklendiği her panelde P4 plakasına sahiptir, bu nedenle bu plakada büyüme gözlemlememeliyiz. Benzer şekilde, ilaç 4, panel 4'teki tüm plakalardaki tüm kuyulara ilaç 4'ün MIKROFONunun eklendiği A4 paneline sahiptir, bu nedenle bu panelde büyüme gözlenmemelidir.
Plakalardaki büyüme, bulanık kuyuların büyümesi olarak kabul edildiği kuyulardaki bulanıklığa göre kaydedilir. Bulanıklığa ek olarak, 50 μL Iodotetrazolium eklenir ve birkaç dakika bırakılır. Rengin pembeye değişmesi büyüme olduğu anlamına gelir.
Bu yöntemin belirli sınırlamaları vardır. Sıkı çalışma ve odaklanma gerektirir. Bu teknik esas olarak pipetleme üzerine dayandığından pipetleme hataları oluşabilir. FIC hesaplamaları bu durumda bir sınırlama olarak kabul edilir, çünkü iki veya üç değil dört değerle uğraşıyoruz. Bir değer eklemek kuyudaki FIC değerini artıracaktır; bu nedenle, FIC'nin sinerjiyi, kayıtsızlığı ve düşmanlığı belirleyen değerleri yeniden gözden geçirilmelidir.
FIC değerleri, sinerjinin, düşmanlığın ve kayıtsızlığın tanımlandığı standartlara ilişkin çeşitli referanslar arasında değişebilir. Bazı referanslar 0.5 ve daha az bir FIC'nin sinerji13olarak kabul edilirken, diğerleri 0.8'den küçük bir FIC'nin sinerji olarak kabul olduğunu belirtir16. Başka bir referans, 1'den küçük bir FIC'nin sinerji olarak kabul edilir17. Birleşik bir standart FIC sinerjisinin tanımlanmasındaki istikrarsızlık ve çatışma nedeniyle, 1'i referansımız olarak gördük.
Son FIC, her plakanın (9 FIC) FIC değerleri eklenerek ve 9 olan plaka sayısına bölünerek hesaplanır. Panel 4'ün sonuçlarda dikkate alınmadığını belirtmek önemlidir, çünkü dördüncü ilacın MIC'ini içerir, bu nedenle inhibisyon tek bir ilacın işi olacaktır. Ek olarak, her paneldeki plaka 4 de dikkate alınmaz, çünkü bu plakadaki inhibisyonun tek başına ilaç 3 eylemi olacağı ilaç 3'ün MIKROFONunu içerir. Böylece, 9 plaka (16 - (4 + 3)) ile sonuçlanır.
Her plaka için, FIC'ler büyüme /büyüme yok aralığındaki kuyular için aşağıdaki formüle göre hesaplanır: (ilacın MIC'si 1 kombinasyonda / MIC ilaç 1 tek başına) + (ilacın MIC'si 2 kombinasyonda / ilacın MIC'si 2 tek başına) + (ilacın 3 kombinasyonunda MIC / sadece ilacın MIC'si / sadece ilacın 4'ün MIC'si). Daha sonra elde edilen sayı 4'e bölünür. Bu formül, aynı plakadaki Büyüme /Büyüme yok arabirimindeki her kuyu için yapılır. Daha sonra, aynı plakanın tüm FIC'leri, bu plakanın FIC'sini elde etmek için birlikte toplanır. Son olarak, daha önce de belirtildiği gibi, her plakanın 9 nihai FIC'si eklenir ve yorumlanacak nihai FIC'yi elde etmek için 9'a bölünür.
1'den küçük bir FIC, belirli bir sinerji derecesine sahip olduğu sinerjik olarak kabul edilir: ya hafif sinerjiktir (bire yakın) ya da daha fazla sinerjiktir (0,5 ve daha az hareket ettiğinde). Bu hesaplama ve yorumlama sadece geliştirdiğimiz bir FIC şablonu kullanılarak yapılır. Sadece konsantrasyonlara giriyoruz, FFC'leri hesaplamak için Büyüme / Büyüme yok arayüzündeki kuyuları seçiyoruz ve belirtilen kriterlere göre yorumlanan nihai FIC'yi elde edeceğiz.
Bu yöntem, bir günde yapılabilecek bir deneyde dört ilaç kullanılarak yapılabilecek tüm olası kombinasyonların test edilmesine izin verir. Sonuçlar ertesi gün elde edilir. Oysa, zaman öldürme eğrisi testi, aynı sayıda kombinasyonu test etmek için daha fazla zamana, iş malzemelerine ve laboratuvar çalışanlarına ihtiyaç vardır, çünkü her kombinasyon kümesi tek bir tüpte veya bardakta tek başına test edilir ve bu da zaman alıcı hale getirir. Bu yöntem sadece antibakteriyel ilaç kombinasyonlarını test etmek için değil, aynı zamanda hastalıkları tedavi etmek için kullanılan ve birlikte test edilmesi gereken her türlü ilacı test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca ilaçların ve bitki özlerinin bir kombinasyonunu veya hatta sadece bitki özlerinin bir kombinasyonunu test etmek için de kullanılabilir. Mesele şu ki, bu yöntem sadece belirli ilaçları değil, birleştirilebilen her şeyi test etmek için de kullanılabilir.
Bu yönteme birkaç sınırlama eşlik eder. Pipetleme becerileri bu tahlil yapılırken çok önemlidir ve pipetleme ve seri seyreltme yaparken oluşabilecek herhangi bir hata sonuçları olumsuz yönde etkileyebilir ve yanlış negatif veya yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, pipetleme makineleri ve robotlarla ilgili herhangi bir teknolojik gelişme bu tahlilin gerçekleştirilmesinde büyük yardımcı olacaktır. Bu yöntem çok fazla hesaplama ve seyreltme gerektirir, böylece herhangi bir hata sonuçların sonucunu değiştirebilir. Bu teknik, öldürme etkisi değil, sadece inhibisyon etkisi hakkında içgörüler sağlar. Bu teknik, inhibisyonu zaman içinde değil, tek bir zaman noktasında çalışmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
hiç kimse.
Acknowledgments
hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
- Ibezim, E.
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C.
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S.
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
