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Biology

Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62311
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

Summary

Questo protocollo descrive come studiare tutte le possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento. Questo metodo si basa sul saggio standard di micro diluizione a piastre da 96 pozzi e sul calcolo delle concentrazioni inibitorie frazionarie (COV) per valutare i risultati.

Abstract

Il concetto di terapia a combinazione di farmaci sta diventando molto importante principalmente con il drastico aumento della resistenza ai farmaci. La scacchiera Quadruple, chiamata anche Q-checkerboard, mira a massimizzare il numero di possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento per ridurre al minimo il tempo e il lavoro necessari per ottenere gli stessi risultati con altri protocolli. Questo protocollo si basa sulla semplice tecnica di micro diluizione in cui i farmaci vengono diluiti e combinati insieme in diverse piastre da 96 pozzi.

Nel primo set di piastre da 96 pozzi, viene aggiunto brodo Muller-Hinton seguito dal primo farmaco richiesto (ad esempio, Cefotaxime qui) per diluirlo serialmente. Dopo che il primo passo è stato fatto, un altro set di piastre da 96 po 'viene utilizzato per diluire il secondo farmaco (ad esempio, Amikaci), che verrà trasferito rimuovendo un volume specifico di farmaco 2 e messo nei pozzi corrispondenti nel primo set di piastre a 96 po 'che contengono il farmaco uno. Il terzo passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del terzo farmaco (ad esempio, Levofloxacina), alle piastre appropriate nel set iniziale contenenti combinazione di farmaco 1 e 2. Il quarto passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del quarto farmaco (ad esempio, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nelle piastre appropriate nel primo set. Quindi, L'inoculo batterico E. coli ESBL verrà preparato e aggiunto.

Questo metodo è importante per valutare tutte le combinazioni possibili e ha una gamma più ampia di possibilità da testare inoltre per i test in vivo. Nonostante sia una tecnica stancante che richiede molta attenzione, i risultati sono notevoli e fanno risparmiare tempo dove molte combinazioni possono essere testate in un singolo esperimento.

Introduction

Con l'aumento della resistenza dovuto all'uso eccessivo e all'uso impropriodi antibiotici 1,2, la necessità di sviluppare nuovi farmaci e agenti per trattare le infezioni batteriche è diventata cruciale. Nuovi approcci come lo sviluppo di nuovi farmaci sono molto importanti per superare la crisi di resistenza. Tuttavia, l'industria farmaceutica non è interessata a sviluppare nuovi agenti antimicrobici. Inoltre, se vengono sviluppati nuovi farmaci, i batteri continuerà a evolversi e sviluppare resistenza contro questi nuovifarmaci 3,4. Pertanto, il problema della resistenza non sarà risolto, rendendo la necessità di un altro approccio un must che dovrebbe essere considerato e studiato per superare la resistenza batterica.

La combinazione di farmaci è un concetto molto importante per il trattamento delle infezioni batteriche principalmente quelle causate da agenti patogeni multifarmaco resistenti5,6. Diminuisce il corso del trattamento, diminuisce la dose somministrata; quindi, diminuendo la tossicità del farmaco dato, aiuta a diminuire il tasso di sviluppo della resistenza e, in un certo senso, sensibilizza i batteri ai farmaci dati come descritto nel concetto di sensibilità collaterale5,7,8,9.

Lo sviluppo della resistenza a un farmaco richiede una singola mutazione; tuttavia, lo sviluppo della resistenza a una combinazione di farmaci mirati a percorsi multipli richiede diverse mutazioni indipendenti che sono rallentate da questa combinazione. Un esempio di diminuzione della resistenza durante l'utilizzo della terapia combinata è la diminuzione del tasso di resistenza a Rifampin in Mycobacterium Tuberculosis10. Un altro esempio è uno studio condotto da Gribble et al. Studi hanno dimostrato che lo sviluppo di resistenza agli amminoglicosidi nell'evoluzione dei batteri ha reso questi ceppi sensibili a vari altri farmaci5. La combinazione tra il farmaco di classe beta-lattame amoxicillina e l'inibitore della lattamasi acido clavulanico ha mostrato successo nel trattamento di ceppi battericiresistenti 8.

Diminuire il tempo di trattamento è un buon vantaggio derivante dalle combinazioni di farmaci. Ad esempio, una terapia di penicillina combinata o ceftriaxone con gentamicina per 2 settimane darà la stessa efficacia data dalla penicillina o dal ceftriaxone da solo se somministrata per 4 settimane11. La combinazione di farmaci consente l'uso di dosaggi inferiori di farmaci che non sono efficaci se somministrati da soli come i Sub-CCI. L'esempio dei sulfonamidi può essere fornito quando l'uso di tre solfamidi riduce al minimo, a dosi più basse, la tossicità prodotta che è la formazione di cristalli o cristalli quando si utilizzano solfonamidi insolubili a dosicomplete 12.

Pertanto, diminuendo il dosaggio dato e il tempo di trattamento alla fine diminuirà la tossicità dei farmaci sul corpo. L'idea di sviluppare metodi per valutare l'interazione tra farmaci combinati è molto importante. In uno studio, i risultati hanno dimostrato che la terapia combinata è più efficace per il trattamento di specie resistenti di Acinetobacter e P. aeruginosa8.

Dare farmaci in combinazione
Esistono diversi metodi con cui possiamo studiare le combinazioni di farmaci, come il metodo della scacchiera, il metodo della curva di uccisione del tempo e il metodo di test E13. Il metodo della scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci in questione in un unico esperimento stesso. Inoltre, è stato sviluppato per studiare una combinazione di tre farmaci14. Ora, lo estendiamo a studiare una combinazione di quattro farmaci principalmente per il trattamento di agenti patogeni multirrogatori.

Il test della curva di uccisione del tempo viene solitamente eseguito per testare l'effetto battericida di un certo farmaco. È stato anche usato per testare l'effetto delle combinazioni di farmaci in cui diversi farmaci sono combinati a concentrazioni specifiche. Questo protocollo richiede la preparazione di diversi tubi sterili o tazze in cui in ogni tazza aggiungiamo il brodo, la combinazione di farmaci e il ceppo batterico richiesto. Dopo l'incubazione e la registrazione della densità ottica in diversi punti di tempo, i risultati vengono confrontati con il tasso di crescita normale del ceppo utilizzato per vedere se il tasso di crescita è aumentato, diminuito o non ècambiato 13.

Il metodo di prova elettronica viene solitamente eseguito per verificare la concentrazione inibitoria minima (MIC) in cui una striscia contenente una concentrazione gradiente del farmaco in questione viene messa su una piastra inoculata. È stato anche utilizzato per testare la combinazione tra due farmaci in cui due strisce vengono aggiunte alla piastra in modo perpendicolare intersecandosi ai loroCCI 13.

Secondo la letteratura, non esiste un gold standard per definire e studiare la sinergia; pertanto, è difficile valutare quale dei metodi utilizzati per studiare la combinazione sia migliore e quale produca risultati migliori e più affidabili principalmente13. Tuttavia, il test time-kill richiede molto lavoro, richiede molto tempo ecosta 15,16, mentre il metodo di test E viene sviluppato per studiare una combinazione solo tra due farmaci. La scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci testati ed è per questo che questa tecnica è stata scelta per essere sviluppata.

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Protocol

1. Fasi di preparazione

  1. Preparare il brodo muller-hinton (MHB) aggiungendo 25 g di brodo MH a 1 L di acqua distillata e mescolare. Autoclave a 121 °C per 2,5 h. Quindi, conservare il supporto autoclavato a temperatura ambiente o in frigo.
  2. Sottocultura dei batteri in questione(E. coli ESBL) sul supporto dell'agar utilizzando il metodo di striatura a quattro quadranti e incubare durante la notte a 37 °C.
    1. Usando un ciclo sterile, prendi una colonia e diffondila nella prima metà della piastra di agar MacConkey facendo strette striature parallele.
    2. Usando il loop, diffondere i batteri nel secondo quadrante striature dal primo quadrante.
    3. Dal secondo quadrante, estendere le striature nel terzo quadrante utilizzando striature parallele ravvicinate.
    4. Diffondere i batteri al centro del quarto quadrante striature dal terzo quadrante.

2. Preparazione del pannello

  1. Posizionare quattro piatti da 96 po', uno accanto all'altro, per formare un quadrato. Usando un nastro adesivo, rastresere il fondo insieme.
  2. Ripetere questo passaggio per ottenere quattro pannelli ciascuno contenente 4 piastre e denominarle A1, A2, A3 e A4.
  3. Aggiungere 50 μL di brodo MH ai pozzi tra la colonna 2 e la colonna 11 nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.
  4. Aggiungere 200 μL di brodo MH al pozzo H12 fungendo da pozzo di controllo negativo nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.
  5. Aggiungere 150 μL di brodo MH ai pozzali A1 e H1 fungendo da pozzi di controllo positivi nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.

3. Farmaco 1, Cefotaxime, diluizione seriale

  1. Ad un tubo conico aggiungere 15 ml di dHsterile 2O.
    1. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 15 mL) / C1.
      NOTA: Nel nostro caso, la soluzione di cefotaxime stock è di 105 μg/mL e C2 è di 256 μg/mL; quindi, V1 = 38,4 μL.
  2. Rimuovere il volume calcolato dai 15 mL di dHsterile 2O, quindi aggiungere il farmaco.
  3. Pipetta 50 μL della soluzione farmacologica preparata in ogni pozzo nella colonna 11 e nella colonna 12 ad eccezione di H12.
  4. Iniziare la diluizione seriale rimuovendo 50 μL dalla colonna 11 e inserendola nei pozzi corrispondenti nella colonna 10, quindi da 10 fino a raggiungere la colonna 2 dove i 50 μL prelevati dalla colonna 2 verranno scartati.
  5. Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5 per tutte le 16 piastre da 96 pozzi dei quattro pannelli.

4. Droga 2, Amkacin, diluizione seriale

  1. A un tubo conico aggiungere 10 ml di dHsterile 2O.
  2. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 10 mL) / C1.
    NOTA: Nel nostro caso, la soluzione stock di Amikacin è di 103 μg/mL e C2 è di 64 μg/mL; quindi, V1 = 64 μL.
  3. Rimuovere il volume calcolato dai 10 mL di dHsterile 2O, quindi aggiungere il farmaco.
  4. Prendi otto piatti separati da 96 pozzi.
  5. Ad ogni piastra, aggiungere 100 μL di MHB ai pozzi tra le file G e B.
  6. Aggiungere 100 μL della soluzione di farmaco 2 precedentemente preparata ai pozzi della riga G.
  7. Diluire serialmente dalla riga G alla riga B prendendo 100 μL da ogni pozzo e infine scartare i 100 μL dai pozzi della riga B.
  8. Ripetere i passaggi 4.5, 4.6 e 4.7 per preparare otto piastre.

5. Trasferimento della droga 2 ai quattro pannelli

  1. Pipetta 50 μL di farmaco 2 dai pozzi tra le file G e B nei pozzi corrispondenti in ogni piastra nei quattro pannelli. Una piastra preparata da 96 pozzi contiene 100 μL di farmaco 2 che è sufficiente per due piastre in un pannello.

6. Farmaco 3, Levofloxacina, aggiunta

  1. A quattro diversi tubi conici aggiungere 14 ml di dHsterile 2O.
  2. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 14 mL) / C1.
    NOTA: Nel nostro caso, la levofloxacina viene preparata in quattro diverse concentrazioni da una soluzione stock di 5 x 103 μg/mL.
    C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL
    C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL
    C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL
    C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL
  3. Rimuovere il volume calcolato dai 14 ml di dH2O sterile da ogni tubo, quindi aggiungere il farmaco.
  4. Dopo aver preparato le concentrazioni richieste del terzo farmaco, assumere 50 μL e aggiungerlo ai pozzi corrispondenti tra le file B e G e le colonne 2 e 12 nella piastra corrispondente in ogni pannello in cui C1 corrisponde alle quattro piastre P1 nei quattro pannelli, C2 corrisponde alle quattro piastre P2 nei quattro pannelli , C3 corrisponde alle quattro piastre P3 nei quattro pannelli e C4 corrisponde alle quattro piastre P4 nei quattro pannelli.

7. Farmaco 4, Trimethoprim-sulfamethoxazolo, aggiunta

  1. A un tubo conico aggiungere 14 ml di dHsterile 2O.
  2. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 14 mL) / C1.
    NOTA: Nel nostro caso, il trimethoprim-sulfamethoxazolo viene preparato in quattro diverse concentrazioni da una soluzione stock di 48 x 103 μg/mL.
    C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL
    C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL
    C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL
    C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL
  3. Rimuovere il volume calcolato dai 14 ml di dHsterile 2O di ogni tubo, quindi aggiungere il farmaco.
  4. Dopo aver preparato le concentrazioni richieste del quarto farmaco, assumere 50 μL e aggiungerlo ai pozzi corrispondenti tra le righe B e G e le colonne 2 e 12 nelle quattro piastre nel pannello corrispondente dove C1 corrisponde al pannello 1, C2 corrisponde al pannello 2, C3 corrisponde al pannello 3 e C4 corrisponde al pannello 4.

8. Preparazione e aggiunta di inoculo batterico E. coli ESBL

  1. Utilizzando un anello sterile, trasferire una colonia dell'isolato batterico E. coli ESBL precedentemente coltivato su una piastra in 2 mL di MHB sterile e vortice.
  2. Verificare la torbidità dove dovrebbe essere 0,5 McFarland utilizzando un densitometro.
  3. Aggiungere 80 mL di brodo MH sterile a una tazza di urina sterile.
  4. Aggiungere l'inoculo batterico dall'inoculo di 0,5 McFarland alla tazza di urina dopo C1V1 = C2V2, dove V1 = (106 x 80 mL) / 108 = 800 μL.
  5. Pipetta 50 μL della soluzione di inoculo 106 CFU/mL in ogni pozzo ad eccezione di H12, che è il pozzo di controllo della sterilità.
  6. Incubare i pannelli a 37 °C durante la notte.
  7. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 μL di Iodotetrazolium per registrare la crescita nei pozzi.

9. Protocollo per il modello FIC (file supplementare)

  1. Scrivere la più alta concentrazione del farmaco 1 (Cefotaxime) nella cella gialla nel pannello A.
  2. Scrivi la più alta concentrazione del farmaco 2 (Amikacin) nella cella gialla nel pannello B.
  3. Scrivi la più alta concentrazione del farmaco 3 (Levofloxacina) nella cella gialla nel pannello C.
  4. Scrivi la più alta concentrazione di farmaco 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) nel pannello D.
  5. Traccia la Linea Rossa (interfaccia Crescita/nessuna Crescita) evidenziando i pozzi con crescita in rosso.
  6. Scrivi il MIC del farmaco 1 nella tabella del farmaco 1 (ATB1).
  7. Scrivi il MIC del farmaco 2 nella tabella del farmaco 2 (ATB2).
  8. Scrivi il MIC del farmaco 3 nella tabella del farmaco 3 (ATB3).
  9. Scrivi il MIC del farmaco 4 nella tabella del farmaco 4 (ATB4).
  10. Per calcolare il FIC per ATB1
    1. Determinare i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita.
    2. Nella tabella ATB1, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello A sul primo pozzo selezionato.
    3. Ripetere il passaggio 9.10.2 per ogni pozzo selezionato dove ben 1 corrisponde a FIC1, ben 2 corrisponde a FIC2 e così via.
  11. Per calcolare il FIC per ATB2
    1. Nella tabella ATB2, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello B nel primo pozzo preselezione.
    2. Ripetere il passaggio 9.11.1 per ogni pozzo preselezione.
  12. Per calcolare il FIC per ATB3
    1. Nella tabella ATB3, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello C nel primo pozzo preselezione.
    2. Ripetere il passaggio 9.12.1 per ogni pozzo preselezione.
  13. Per calcolare il FIC per ATB4
    1. Nella tabella ATB4, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello D nel primo pozzo preselezione.
    2. Ripetere il passaggio 9.13.1 per ogni pozzo preselezione.
  14. Nella tabella con l'etichetta ATB1+2+3+4, sommare automaticamente il FIC1 di ogni ATB. Lo stesso accadrà per gli altri TEC (FIC2, FIC3 e così via).
    1. Nella cella contenente FIC ed evidenziata in giallo, fare doppio clic su di essa e selezionare i ΣFIC sommati dalla tabella ATB1+2+3+4.
  15. Ripetere questi passaggi per ciascuno dei nove fogli che rappresentano le nove piastre.
    NOTA: Nel foglio FIC all, la tabella mostrerà il FIC riassunto finale con l'interpretazione del valore ottenuto.

10. Determinazione MIC utilizzando il saggio di microdiluizione per i quattro farmaci

  1. Etichettare quattro righe diverse con l'abbreviazione di ogni farmaco testato. Ad esempio, CTX per Cefotaxime, AMK per Amikacin, LEVO per Levofloxacina e SXT per Trimethoprim-sulfamethoxazolo.
  2. Pipetta 200 μL di brodo sterile Muller Hinton in pozzo numero 1 e pozzo numero 12 in ogni riga usata. Bene, il numero 12 servirà bene come controllo negativo.
  3. Pipetta 100 μL di brodo sterile Muller Hinton ai pozzi da 2 a 11 in ogni fila usata.
  4. Calcolare il volume di ciascun farmaco da aggiungere utilizzando la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 è il volume finale nei pozzi che è di 200 μL, C 1 è la concentrazione dellasoluzione stock, e C2 è la concentrazione iniziale che dobbiamo avere nel primo pozzo.
    NOTA: Qui, usiamo quanto segue:
    Cefotaxime: C1 = 105 μg/mL, dove lo diluiamo a 104 μg/mL, C2 = 256 μg/mL; quindi, V1 = 20,48 μL
    Amikacina: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; quindi, V1 = 51,2 μL
    Levofloxacina: C1 = 5 x 103 μg/mL, dove la diluiamo a 5 x 102 μg/mL, C2 = 16 μg/mL; quindi, V1 = 25,6 μL
    Trimethoprim-Sulfamethoxazolo: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; quindi, V1 = 68,26 μL
  5. Pipettare il volume richiesto per ogni farmaco nel primo pozzo della riga corrispondente dopo aver rimosso lo stesso volume dal brodo da 200 μL per ottenere un volume totale di 200 μL dopo l'aggiunta del farmaco.
  6. Diluire serialmente rimuovendo 100 μL dal pozzo 1 al pozzo 2 e così via fino a raggiungere ben 10 dove i 100 μL rimossi da ben 10 verranno scartati. Si noti che ben 11 funge da pozzo di controllo positivo.
  7. Pipetta 100 μL di 106 inoculo batterico preparato in ogni pozzo in ogni riga utilizzata ad eccezione del pozzo numero 12 che funge da controllo negativo.
  8. Incubare a 37 °C durante la notte.

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Representative Results

La figura 2A rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Notiamo che la quarta piastra non contiene crescita nel quadrante contenente la combinazione. Questo perché in questa piastra abbiamo il MIC di Levofloxacina che inibisce la crescita. In questa figura, possiamo vedere che il MIC del Cefotaxime è ottenuto nel pozzo A8, che è uguale a 32 μg/mL. Il MIC di Amikacin è ottenuto nel pozzo E1, che è uguale a 16 μg/mL. Un effetto di inibizione è visto nella fila contenente 1/2 MIC di Amikacin (riga D) oltre a diversi subMIC di Cefotaxime e Levofloxacina oltre a 1/8 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Questa inibizione della crescita batterica in pozzi contenenti concentrazioni subMIC potrebbe essere una forma di sinergia tra queste concentrazioni dei quattro farmaci.

La figura 2B rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Nel pannello rappresentato da questa figura, possiamo vedere che il modello di inibizione della crescita batterica si è verificato anche nella riga D, dove i pozzi contengono subMIC di Cefotaxime e levofloxacina, 1/2 MIC di Amikacin e 1/4 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazole.

La figura 2C rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Per quanto riguarda il modello di inibizione in questo pannello, possiamo vedere che nelle righe C e D la crescita non è vista. Ciò significa che nei pozzi contengono diversi subMIC di Cefotaxime e Levofloxacina oltre a 1/2 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazole e 1/4 MIC e 1/2 MIC di Amikacin.

La figura 2D rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Possiamo vedere che solo nella riga A e nella colonna 1 abbiamo pozzi colorati che significano crescita. Questo perché in questo pannello abbiamo il MIC di trimethoprim-sulfamethoxazolo che inibisce totalmente la crescita.

Figure 2
Figura 2: Risultati sperimentali ottenuti nella prova 1 per alcune combinazioni testate. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra.

File supplementare. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il metodo Quadruple Checkerboard assomiglia alla scacchiera e alla scacchiera tridimensionale nel suo protocollo. Tuttavia, si dovrebbero prendere in considerazione alcune misure cruciali per evitare errori durante l'esperimento.

Assicurarsi di testare il MIC di ogni farmaco contro l'isolato testato prima di iniziare il protocollo per sapere quali sono le concentrazioni necessarie per avviare le diluizioni con per il farmaco 1 e il farmaco 2 che devono essere diluiti serialmente nelle piastre. Per quanto riguarda il farmaco 3 e il farmaco 4, il MIC dovrebbe anche essere noto per calcolare le concentrazioni necessarie per essere testato (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC e MIC). Ci sono molti metodi per determinare il MIC, ma il meglio è determinarlo con la tecnica di microdiluizione poiché il protocollo Q-checkerboard utilizza anche il test di microdiluizione per la diluizione seriale.

Nel primo passaggio, durante la nastratura delle piastre, assicurarsi che la panca sia pulita e coprire le piastre con coperture sterili per evitare contaminazioni. È importante notare che questo protocollo può essere fatto utilizzando quattro piastre da 96 pozzi che rappresentano i quattro pannelli, dove ogni piastra è divisa in quattro quadranti più piccoli. Tuttavia, il numero di diluizioni sarà ridotto al minimo per il primo e il secondo farmaco. Inoltre, si possono anche utilizzare piastre profonde a 384 pozzi invece di nastrare quattro piastre insieme. Tuttavia, non era disponibile quando abbiamo fatto gli esperimenti. Si noti che quando si sceglie la piastra da utilizzare, assicurarsi di controllare la capacità di ogni pozzo poiché il volume finale nel pozzo sarà di 250 μL.

Inoltre, il numero di piastre in ogni pannello e il numero di pannelli dipende dal numero di diluizioni necessarie per il terzo e il quarto farmaco. Ad esempio, in questo esperimento, sono state richieste quattro diluizioni del terzo farmaco e quattro diluizioni del quarto farmaco (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC e MIC); quindi, avevamo quattro piastre in ogni pannello e quattro pannelli.

La diluizione del primo farmaco si verifica nelle piastre dei pannelli secondo le colonne. Tuttavia, la diluizione del secondo farmaco si verifica in piastre separate in base alle file. Il terzo e il quarto farmaci non vengono diluiti in serie. Tuttavia, ogni concentrazione utilizzata viene preparata in un tubo separato e aggiunta ad ogni pozzo in un volume specifico. È importante notare che i pozzi contenenti i quattro farmaci sono presenti nel quadrante tra le righe G e B e solo le colonne 2 e 12. La scacchiera e i protocolli tridimensionali della scacchiera non sono stati girati o scritti in questo manoscritto perché sono protocolli noti e lo scopo di questo manoscritto è quello di parlare del protocollo Q-checkerboard. Nella tecnica della scacchiera, la riga A contiene solo il farmaco 1; quindi, mostrando il MIC del farmaco 1. La colonna 1 contiene solo il farmaco 2; quindi, mostrando il MIC del farmaco 2.

Questo concetto è mantenuto nel protocollo Q-Checkerboard dove MIC del farmaco 1 è ancora mostrato nella riga A e MIC del farmaco 2 è ancora mostrato nella colonna 1. Inoltre, i due farmaci aggiunti presentano il loro MIC nell'esperimento. Il farmaco 3 ha la piastra P4 in ogni pannello in cui il MIC del farmaco 3 viene aggiunto a tutti i pozzi, quindi non dovremmo osservare la crescita in questa piastra. Allo stesso modo, il farmaco 4 ha pannello A4 in cui il MIC del farmaco 4 viene aggiunto a tutti i pozzi in tutte le piastre nel pannello 4, quindi non dovrebbe essere osservata alcuna crescita in questo pannello.

La crescita delle piastre è registrata in base alla torbidità nei pozzi, dove i pozzi torbidi sono considerati avere crescita. Oltre alla torbidità, 50 μL di Iodotetrazolium vengono aggiunti e lasciati per alcuni minuti. Un cambiamento di colore in rosa significa che c'è crescita.

Questo metodo ha alcune limitazioni. Richiede duro lavoro e concentrazione. Potrebbero verificarsi errori di pipettazione poiché questa tecnica si basa principalmente sulla pipettatura. I calcoli fic sono considerati una limitazione in questo caso poiché abbiamo a che fare con quattro valori non due o tre. L'aggiunta di un valore aumenterà il valore del FIC nel pozzo; pertanto, i valori del FIC che determinano il sinergismo, l'indifferenza e l'antagonismo devono essere riconsiderati.

I valori FIC possono cambiare tra diversi riferimenti riguardanti gli standard con cui sono definiti sinergicismo, antagonismo e indifferenza. Alcuni riferimenti affermano che un FIC di 0,5 e meno è considerato sinergico13, mentre altri affermano che un FIC inferiore a 0,8 è considerato sinergico16. Un altro riferimento afferma che un FIC minore di 1 è considerato sinergico17. A causa dell'instabilità e del conflitto nella definizione di un FIC standard unificato di sinergia, abbiamo considerato 1 come il nostro riferimento.

Il FIC finale è calcolato sommando i valori FIC di ciascuna piastra (9 TEC) e dividendolo per il numero di piastre che è 9. È importante notare che il pannello 4 non è considerato nei risultati poiché contiene il MIC del quarto farmaco, quindi l'inibizione sarà il lavoro di un singolo farmaco. Inoltre, anche la piastra 4 in ogni pannello non viene presa in considerazione poiché contiene il MIC del farmaco 3 in cui l'inibizione in questa piastra sarà l'atto del solo farmaco 3. Quindi, finiamo con 9 piastre (16 - (4 + 3)).

Per ogni piastra, i TEC sono calcolati per i pozzi sull'interfaccia Crescita / nessuna crescita secondo la seguente formula: (MIC del farmaco 1 in combinazione / MIC del solo farmaco 1) + (MIC del farmaco 2 in combinazione / MIC del solo farmaco 2) + (MIC del farmaco 3 in combinazione / MIC del solo farmaco 3) + (MIC del farmaco 4 in combinazione / MIC del solo farmaco 4). Quindi, il numero ottenuto è diviso per 4. Questa formula viene eseguita per ogni pozzo sull'interfaccia Crescita / nessuna crescita nella stessa piastra. Quindi, tutti i TEC della stessa piastra vengono sommati insieme per ottenere il FIC di questa piastra. Infine, come accennato in precedenza, vengono aggiunti e divisi i 9 TEC finali di ciascuna piastra per ottenere il FIC finale che verrà interpretato.

Un FIC minore di 1 è considerato sinergico dove ha un certo grado di sinergia: è leggermente sinergico (vicino a uno) o più sinergico (quando si muove verso 0,5 e meno). Questo calcolo e interpretazione vengono semplicemente eseguiti utilizzando un modello FIC che abbiamo sviluppato. Entriamo solo nelle concentrazioni, scegliamo i pozzi sull'interfaccia Crescita /nessuna Crescita per calcolare i TEC, e otteniamo il FIC finale che viene interpretato secondo i criteri menzionati.

Questo metodo consente di testare tutte le possibili combinazioni che possono essere fatte usando quattro farmaci in un esperimento che possono essere eseguiti in un giorno. I risultati si ottengono il giorno successivo. Mentre, per il saggio della curva di uccisione del tempo, sono necessari più tempo, materiali di lavoro e lavoratori di laboratorio per testare lo stesso numero di combinazioni, poiché ogni insieme di combinazioni viene testato da solo in un singolo tubo o tazza, il che lo rende dispendioso in termini di tempo. Questo metodo può essere utilizzato non solo per testare combinazioni di farmaci antibatterici, ma per testare tutti i tipi di farmaci utilizzati per trattare le malattie e deve essere testato in combinazione. Può essere utilizzato anche per testare una combinazione di farmaci ed estratti vegetali o anche una combinazione di solo estratti vegetali. Il punto è che questo metodo può essere utilizzato per testare non solo farmaci specifici, ma tutto ciò che può essere combinato.

Questo metodo è accompagnato da diverse limitazioni. Le capacità di pipettazione sono molto importanti durante l'esecuzione di questo test e qualsiasi errore che può verificarsi durante la pipettazione e la diluizione seriale può influire negativamente sui risultati e può portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. Pertanto, qualsiasi progresso tecnologico riguardante macchine per pipettatrici e robot sarà di grande aiuto nell'esecuzione di questo saggio. Questo metodo richiede molti calcoli e diluizioni, quindi qualsiasi singolo errore potrebbe modificare il risultato dei risultati. Questa tecnica fornisce approfondimenti solo sull'effetto di inibizione e non sull'effetto di uccisione. Questa tecnica studia l'inibizione in un singolo punto di tempo e non nel tempo.

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Disclosures

nessuno.

Acknowledgments

nessuno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL tips Citotest 4330000402
200 µL tips Citotest 4330-0013-17
50 mL centrifuge tube corning 430828 For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube Falcon 352058 For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes JRZ Plastilab As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates corning 3596 For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France 10177403 Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime) PHARCO Pharmaceuticals 24750/2006 Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar BIO-RAD 64169508 For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) HIKMA Pharmaceuticals 2BXMIA56N-AEF Drug 2
Muller-Hinton Broth BIO-RAD 69444 For making bacterial media
Multichannel Pipette Thermo Scientific GJ54761 For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes Thermo Scientific OH19855 HH40868 For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) sanofi aventis 221937/2009 Drug 3

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References

  1. Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
  2. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
  3. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
  4. Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
  5. Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
  6. Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
  7. Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
  8. Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
  9. Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
  10. Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
  11. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  12. Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
  13. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  14. Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
  15. Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
  16. Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
  17. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).

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Biologia Numero 173 combinazione antibiotica scacchiera interazione con quattro farmaci
Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci
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Isber, C., Stockman, D. L., Daoud, Z. Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations. J. Vis. Exp. (173), e62311, doi:10.3791/62311 (2021).

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