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Biology

Quadruple-Damier : Une modification du Damier tridimensionnel pour l’étude des combinaisons de médicaments

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62311
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

Summary

Ce protocole décrit comment étudier toutes les combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une seule expérience. Cette méthode est basée sur l’essai standard de micro dilution sur plaque de 96 puits et sur le calcul des concentrations inhibitrices fractionnaires (FICs) pour évaluer les résultats.

Abstract

Le concept de polythérapie devient très important, principalement avec l’augmentation drastique de la résistance aux médicaments. Le quadruple damier, également appelé q-damier, vise à maximiser le nombre de combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une expérience pour minimiser le temps et le travail nécessaires pour obtenir les mêmes résultats avec d’autres protocoles. Ce protocole est basé sur la technique simple de micro dilution où les médicaments sont dilués et combinés ensemble dans plusieurs plaques de 96 puits.

Dans la première série de plaques de 96 puits, le bouillon Muller-Hinton est ajouté suivi du premier médicament requis (par exemple, le céfotaxime ici) pour le diluer en série. Une fois la première étape terminée, un autre ensemble de plaques de 96 puits est utilisé pour diluer le deuxième médicament (par exemple, Amikaci), qui sera transféré en enlevant un volume spécifique de médicament 2 et mis dans les puits correspondants dans le premier ensemble de plaques de 96 puits qui contient le médicament un. La troisième étape consiste à ajouter les concentrations requises du troisième médicament (p. ex. lévofloxacine) aux plaques appropriées de l’ensemble initial contenant la combinaison des médicaments 1 et 2. La quatrième étape consiste à ajouter les concentrations requises du quatrième médicament (p. ex. triméthoprime-sulfaméthoxazol) dans les plaques appropriées de la première série. Ensuite, l’inoculum bactérien E. coli ESBL sera préparé et ajouté.

Cette méthode est importante pour évaluer toutes les combinaisons possibles et offre un plus large éventail de possibilités à tester en outre pour les tests in vivo. Bien qu’il s’agisse d’une technique fatigante nécessitant beaucoup de concentration, les résultats sont remarquables et permettent de gagner du temps où de nombreuses combinaisons peuvent être testées dans une seule expérience.

Introduction

Avec l’augmentation de la résistance due à la surutilisation et à la mauvaise utilisation des antibiotiques1,2, la nécessité de développer de nouveaux médicaments et agents pour traiter les infections bactériennes est devenue cruciale. De nouvelles approches telles que le développement de nouveaux médicaments sont très importantes pour surmonter la crise de résistance. Cependant, l’industrie pharmaceutique n’est pas intéressée par le développement de nouveaux agents antimicrobiens. De plus, si de nouveaux médicaments sont développés, les bactéries continueront d’évoluer et de développer une résistance contre ces nouveaux médicaments3,4. Ainsi, le problème de la résistance ne sera pas résolu, ce qui rend la nécessité d’une autre approche indispensable qui devrait être considérée et étudiée pour surmonter la résistance bactérienne.

La combinaison de médicaments est un concept très important pour le traitement des infections bactériennes, principalement celles causées par des agents pathogènes multirésistants5,6. Il diminue le cours du traitement, diminue la dose donnée; ainsi, diminuer la toxicité du médicament donné, aide à diminuer le taux de développement de la résistance et, d’une certaine manière, sensibilise les bactéries aux médicaments donnés comme décrit dans le concept de sensibilité collatérale5,7,8,9.

Le développement d’une résistance à un médicament nécessite une seule mutation; cependant, le développement d’une résistance à une combinaison de médicaments ciblant plusieurs voies nécessite plusieurs mutations indépendantes qui sont ralenties par cette combinaison. Un exemple de diminution de la résistance lors de l’utilisation de la polythérapie est la diminution du taux de résistance à la rifampicine dans Mycobacterium Tuberculosis10. Un autre exemple est une étude réalisée par Gribble et al. qui a montré que le taux d’émergence de souches résistantes chez les patients prenant de la pipéracilline seule était plus élevé que chez ceux prenant une combinaison de carboxypénicilline et d’aminoglycoside10. Des études ont montré que le développement d’une résistance aux aminoglycosides chez les bactéries en évolution rendait ces souches sensibles à divers autres médicaments5. La combinaison entre le médicament de classe bêta-lactamine amoxicilline et l’inhibiteur de lactamase acide clavulanique a montré le succès dans le traitement des souches bactériennes résistantes8.

La diminution du temps de traitement est un bon avantage résultant des combinaisons de médicaments. Par exemple, un traitement de pénicilline ou de ceftriaxone combinée avec de la gentamicine pendant 2 semaines donnera la même efficacité que la pénicilline ou la ceftriaxone seule lorsqu’elle est administrée pendant 4 semaines11. La combinaison de médicaments permet l’utilisation de doses plus faibles de médicaments qui ne sont pas efficaces lorsqu’ils sont administrés seuls, comme les sous-CMI. L’exemple des sulfamides peut être donné lorsque l’utilisation de triples sulfamides minimise, à des doses plus faibles, la toxicité produite qui est la formation de cristaux ou la cristallurie lors de l’utilisation de sulfamides insolubles à pleines doses12.

Ainsi, la diminution de la dose donnée et du temps de traitement finira par diminuer la toxicité des médicaments sur le corps. L’idée de développer des méthodes pour évaluer l’interaction entre les médicaments combinés est très importante. Dans une étude, les résultats ont montré que la thérapie combinée est plus efficace pour le traitement des espèces résistantes d’Acinetobacter et de P. aeruginosa8.

Donner des médicaments en combinaison
Il existe différentes méthodes par lesquelles nous pouvons étudier les combinaisons de médicaments, telles que la méthode en damier, la méthode de la courbe de temps mort et la méthode E-test13. La méthode du damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments en question dans une seule expérience elle-même. En outre, il a été développé pour étudier une combinaison de trois médicaments14. Maintenant, nous étendons cela pour étudier une combinaison de quatre médicaments principalement pour le traitement des agents pathogènes multirésistants.

Le test de la courbe time-kill est généralement effectué pour tester l’effet bactéricide d’un certain médicament. Il a également été utilisé pour tester l’effet des combinaisons de médicaments où plusieurs médicaments sont combinés à des concentrations spécifiques. Ce protocole nécessite la préparation de plusieurs tubes ou tasses stériles où dans chaque tasse nous ajoutons le bouillon, la combinaison de médicaments et la souche bactérienne requise. Après incubation et enregistrement de la densité optique à plusieurs points de temps, les résultats sont comparés au taux de croissance normal de la souche utilisée pour voir si le taux de croissance a augmenté, diminué ou n’a pas changé13.

La méthode de test électronique est habituellement effectuée pour tester la concentration minimale inhibitrice (CMI) où une bandelette contenant une concentration en gradient du médicament en question est posée sur une plaque inoculée. Il a également été utilisé pour tester la combinaison entre deux médicaments où deux bandes sont ajoutées à la plaque de manière perpendiculaire se croisant à leurs CMI13.

Selon la littérature, il n’y a pas d’étalon-or pour définir et étudier la synergie; ainsi, il est difficile d’évaluer laquelle des méthodes utilisées pour étudier la combinaison est la meilleure et laquelle produit des résultats meilleurs et plus fiables principalement13. Cependant, le test Time-kill est laborieux, long et coûteux15,16,tandis que la méthode E-test est développée pour étudier une combinaison entre deux médicaments seulement. Damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments testés et c’est pourquoi cette technique a été choisie pour être développée.

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Protocol

1. Étapes de préparation

  1. Préparer le bouillon Muller-Hinton (MHB) en ajoutant 25 g de bouillon MH à 1 L d’eau distillée et mélanger. Autoclave à 121 °C pendant 2,5 h. Ensuite, rangez le support autoclavé à température ambiante ou au réfrigérateur.
  2. Sous-culture des bactéries en question(E. coli ESBL) sur le milieu de la gélose en utilisant la méthode de stries à quatre quadrants et incuber pendant la nuit à 37 °C.
    1. À l’aide d’une boucle stérile, prenez une colonie et étalez-la dans la première moitié de la plaque de gélose MacConkey en faisant des stries parallèles étroites.
    2. À l’aide de la boucle, étalez les bactéries dans le deuxième quadrant en la striant à partir du premier quadrant.
    3. À partir du deuxième quadrant, étendez les stries dans le troisième quadrant à l’aide de stries parallèles étroites.
    4. Étalez les bactéries au centre du quatrième quadrant en les striant du troisième quadrant.

2. Préparation du groupe spécial

  1. Placez quatre plaques de 96 puits l’une à côté de l’autre pour former un carré. À l’aide d’une bande, collez leur fond ensemble.
  2. Répétez cette étape pour obtenir quatre panneaux contenant chacun 4 plaques et nommez-les A1, A2, A3 et A4.
  3. Ajouter 50 μL de bouillon MH aux puits entre la colonne 2 et la colonne 11 dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.
  4. Ajouter 200 μL de bouillon MH au puits H12 servant de puits témoin négatif dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.
  5. Ajouter 150 μL de bouillon MH aux puits A1 et H1 servant de puits témoins positifs dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.

3. Médicament 1, Céfotaxime, dilution en série

  1. Dans un tube conique, ajouter 15 mL de dH2O stérile.
    1. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 15 mL) /C1.
      REMARQUE: Dans notre cas, la solution mère de céfotaxime est de 105 μg / mL et C2 est de 256 μg / mL; ainsi,V1 = 38,4 μL.
  2. Retirez le volume calculé des 15 mL de dH2O stérile, puis ajoutez le médicament.
  3. Pipetter 50 μL de la solution médicamenteuse préparée dans chaque puits des colonnes 11 et 12 sauf H12.
  4. Commencer la dilution en série en enlevant 50 μL de la colonne 11 et en la plaçant dans les puits correspondants de la colonne 10, puis de 10 jusqu’à atteindre la colonne 2 où les 50 μL prélevés dans la colonne 2 seront éliminés.
  5. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 pour l’ensemble des 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux.

4. Médicament 2, Amkacine, dilution en série

  1. Dans un tube conique, ajouter 10 mL de dH2O stérile.
  2. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 10 mL) /C1.
    REMARQUE : Dans notre cas, la solution mère d’amikacine est de 103 μg/mL etC2 est de 64 μg/mL; ainsi,V1 = 64 μL.
  3. Retirez le volume calculé des 10 mL de dH2O stérile, puis ajoutez le médicament.
  4. Prenez huit plaques distinctes de 96 puits.
  5. À chaque plaque, ajouter 100 μL de MHB aux puits entre les rangées G et B.
  6. Ajouter 100 μL de la solution de médicament 2 préalablement préparée dans les puits de la rangée G.
  7. Diluer en série de la rangée G à la rangée B en prenant 100 μL de chaque puits et finalement jeter les 100 μL des puits de la rangée B.
  8. Répétez les étapes 4.5, 4.6 et 4.7 pour préparer huit assiettes.

5. Transfert de la drogue 2 aux quatre panels

  1. Pipetter 50 μL de médicament 2 des puits entre les rangées G et B dans les puits correspondants dans chaque plaque des quatre panneaux. Une plaque préparée de 96 puits contient 100 μL de médicament 2, ce qui est suffisant pour deux plaques dans un panneau.

6. Médicament 3, Lévofloxacine, addition

  1. À quatre tubes coniques différents, ajouter 14 mL de dH2O stérile.
  2. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 14 mL) /C1.
    REMARQUE: Dans notre cas, la lévofloxacine est préparée en quatre concentrations différentes à partir d’une solution mère de 5 x 103 μg /mL.
    C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL
    C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL
    C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL
    C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL
  3. Retirez le volume calculé des 14 mL de dH2O stériles de chaque tube, puis ajoutez le médicament.
  4. Après avoir préparé les concentrations requises du troisième médicament, prendre 50 μL et l’ajouter aux puits correspondants entre les rangées B et G et les colonnes 2 et 12 dans la plaque correspondante dans chaque panneau où C1 correspond aux quatre plaques P1 dans les quatre panneaux, C2 correspond aux quatre plaques P2 dans les quatre panneaux , C3 correspond aux quatre plaques P3 dans les quatre panneaux, et C4 correspond aux quatre plaques P4 dans les quatre panneaux.

7. Médicament 4, Triméthoprime-sulfaméthoxazole, addition

  1. A un tube conique, ajouter 14 mL de dH2O stérile.
  2. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 14 mL) /C1.
    NOTA : Dans notre cas, le triméthoprime-sulfaméthoxazole est préparé à quatre concentrations différentes à partir d’une solution mère de 48 x 103 μg/mL.
    C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL
    C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL
    C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL
    C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL
  3. Retirez le volume calculé des 14 mL de dH2O stériles de chaque tube, puis ajoutez le médicament.
  4. Après avoir préparé les concentrations requises du quatrième médicament, prendre 50 μL et l’ajouter aux puits correspondants entre les rangées B et G et les colonnes 2 et 12 dans les quatre plaques du panneau correspondant où C1 correspond au panneau 1, C2 correspond au panneau 2, C3 correspond au panneau 3, et C4 correspond au panneau 4.

8. Préparation et ajout de l’inoculum bactérien E. coli ESBL

  1. À l’aide d’une boucle stérile, transférer une colonie de l’isolat bactérien E. coli ESBL précédemment cultivé sur une plaque dans 2 mL de MHB et de vortex stériles.
  2. Vérifiez la turbidité où il devrait être de 0,5 McFarland à l’aide d’un densitomètre.
  3. Ajouter 80 mL de bouillon MH stérile à une tasse d’urine stérile.
  4. Ajouter l’inoculum bactérien de l’inoculum 0,5 McFarland à la tasse d’urine suivantC1V1 =C2V2, oùV1 = (106 x 80 mL) / 108 = 800 μL.
  5. Pipetter 50 μL de la solution d’inoculum 106 UFC/mL dans chaque puits sauf H12, qui est le puits témoin de stérilité.
  6. Incuber les panneaux à 37 °C pendant la nuit.
  7. Après incubation, ajouter 50 μL d’iodotétrazolium pour enregistrer la croissance dans les puits.

9. Protocole pour le modèle FIC (dossier supplémentaire)

  1. Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 1 (céfotaxime) dans la cellule jaune du panneau A.
  2. Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 2 (Amikacine) dans la cellule jaune du panneau B.
  3. Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 3 (Lévofloxacine) dans la cellule jaune du panneau C.
  4. Inscrire la concentration la plus élevée de médicament 4 (triméthoprime-sulfaméthoxazole) dans le panneau D.
  5. Tracez la ligne rouge (interface Croissance/pas de croissance) en mettant en évidence les puits ayant une croissance en rouge.
  6. Écrivez le MIC du médicament 1 dans le tableau du médicament 1 (ATB1).
  7. Écrivez le MIC du médicament 2 dans le tableau du médicament 2 (ATB2).
  8. Écrivez le MIC du médicament 3 dans le tableau du médicament 3 (ATB3).
  9. Écrivez le MIC de la drogue 4 dans le tableau de la drogue 4 (ATB4).
  10. Pour calculer FIC pour ATB1
    1. Déterminez les puits sur l’interface Croissance/Pas de croissance.
    2. Dans le tableau ATB1, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau A vers le premier puits sélectionné.
    3. Répétez l’étape 9.10.2 pour chaque puits sélectionné où le puits 1 correspond à FIC1, le puits 2 correspond à FIC2, et ainsi de suite.
  11. Pour calculer le FIC pour ATB2
    1. Dans le tableau ATB2, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau B vers le premier puits présélectionn.
    2. Répétez l’étape 9.11.1 pour chaque puits présélectionn.
  12. Pour calculer le FIC pour ATB3
    1. Dans le tableau ATB3, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau C vers le premier puits présélectionn.
    2. Répétez l’étape 9.12.1 pour chaque puits présélectioné.
  13. Pour calculer le FIC pour ATB4
    1. Dans le tableau ATB4, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau D vers le premier puits présélectionn.
    2. Répétez l’étape 9.13.1 pour chaque puits présélectionn.
  14. Dans le tableau intitulé ATB1+2+3+4, additionnez automatiquement le FIC1 de chaque ATB. Il en ira de même pour les autres FIC (FIC2, FIC3, etc.).
    1. Dans la cellule contenant FIC et surlignée en jaune, double-cliquez dessus et sélectionnez les ΣFICs additionnés dans le tableau ATB1+2+3+4.
  15. Répétez ces étapes pour chacune des neuf feuilles représentant les neuf plaques.
    REMARQUE: Dans la feuille FIC all, le tableau montrera le FIC final additionné avec l’interprétation de la valeur obtenue.

10. Détermination de la CMI à l’aide du test de microdilution pour les quatre médicaments

  1. Étiquetez quatre rangées différentes avec l’abréviation de chaque médicament testé. Par exemple, CTX pour le céfotaxime, AMK pour l’amikacine, LEVO pour la lévofloxacine et SXT pour le triméthoprime-sulfaméthoxazole.
  2. Pipetter 200 μL de bouillon Muller Hinton stérile dans le puits numéro 1 et le puits numéro 12 dans chaque rangée utilisée. Le puits numéro 12 servira de puits de contrôle négatif.
  3. Pipette 100 μL de bouillon Muller Hinton stérile vers les puits 2 à 11 dans chaque rangée utilisée.
  4. Calculer le volume de chaque médicament à ajouter à l’aide de la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 4 xV2)/C1. V2 est le volume final dans les puits qui est de 200 μL,C1 est la concentration de la solution mère, etC2 est la concentration initiale que nous devons avoir dans le premier puits.
    REMARQUE: Ici, nous utilisons ce qui suit:
    Céfotaxime :C1 = 105 μg/mL, où l’on dilue à 104 μg/mL,C2 = 256 μg/mL ; ainsi, V1 = 20,48 μL
    Amikacine : C1 = 103 μg/mL,C2 = 64 μg/mL; ainsi, V1 = 51,2 μL
    Lévofloxacine :C1 = 5 x 103 μg/mL, où l’on dilue à 5 x 102 μg/mL,C2 = 16 μg/mL ; ainsi, V1 = 25,6 μL
    Triméthoprime-sulfaméthoxazole : C1 = 48 x 103 μg/mL,C2 = 4096 μg/mL; ainsi, V1 = 68,26 μL
  5. Pipetter le volume requis pour chaque médicament dans le premier puits de la rangée correspondante après avoir retiré le même volume du bouillon de 200 μL pour obtenir un volume total de 200 μL après l’ajout du médicament.
  6. Diluer en série en enlevant 100 μL du puits 1 au puits 2 et ainsi de suite jusqu’à atteindre le puits 10 où les 100 μL retirés du puits 10 seront jetés. Notez que le puits 11 sert de puits de contrôle positif.
  7. Pipette 100 μL de 106 inoculum bactérien préparé dans chaque puits de chaque rangée utilisée, à l’exception du puits numéro 12 servant de témoin négatif.
  8. Incuber à 37 °C pendant la nuit.

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Representative Results

La figure 2A représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Les puits colorés sont les puits qui contiennent la croissance. Nous remarquons que la quatrième plaque ne contient pas de croissance dans le quadrant contenant la combinaison. En effet, dans cette plaque, nous avons le MIC de lévofloxacine qui inhibera la croissance. Sur cette figure, on peut voir que le MIC du céfotaxime est obtenu dans le puits A8, qui est égal à 32 μg/mL. Le MIC d’Amikacine est obtenu dans le puits E1, qui est égal à 16 μg/mL. Un effet d’inhibition est observé dans la rangée contenant 1/2 CMI d’amikacine (rangée D) en plus de plusieurs sous-ICM de céfotaxime et de lévofloxacine en plus de 1/8 CMI de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Cette inhibition de la croissance bactérienne dans les puits contenant des concentrations subMIC pourrait être une forme de synergie entre ces concentrations des quatre drogues.

La figure 2B représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Les puits colorés sont les puits qui contiennent la croissance. Suivez la même interprétation pour la quatrième plaque. Dans le panneau représenté par cette figure, nous pouvons voir que le modèle d’inhibition de la croissance bactérienne s’est également produit dans la rangée D, où les puits contiennent des sous-ICM de céfotaxime et de lévofloxacine, 1/2 CMI d’amikacine et 1/4 CMI de triméthoprime-sulfaméthoxazole.

La figure 2C représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Les puits colorés sont les puits qui contiennent la croissance. Suivez la même interprétation pour la quatrième plaque. En ce qui concerne le modèle d’inhibition dans ce panneau, nous pouvons voir que dans les lignes C et D, la croissance n’est pas vue. Cela signifie que dans les puits contiennent plusieurs sous-CISM de céfotaxime et de lévofloxacine en plus de 1/2 CMI de triméthoprime-sulfaméthoxazole et 1/4 CMI et 1/2 CMI d’amikacine.

La figure 2D représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Suivez la même interprétation pour la quatrième plaque. Nous pouvons voir que seulement dans la ligne A et la colonne 1, nous avons des puits colorés signifiant la croissance. En effet, dans ce panneau, nous avons le MIC de triméthoprime-sulfaméthoxazole qui inhibera totalement la croissance.

Figure 1
Figure 1: Schéma de la configuration et des panneaux endamier Q et carte de la façon dont les médicaments sont ajoutés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Résultats expérimentaux obtenus lors del’essai 1 pour certaines combinaisons testées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Fichier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La méthode quadruple damier ressemble au damier et au damier tridimensionnel dans son protocole. Cependant, certaines étapes cruciales doivent être prises en considération pour éviter les erreurs au cours de l’expérience.

Assurez-vous de tester le MIC de chaque médicament contre l’isolat testé avant de commencer le protocole pour savoir quelles sont les concentrations qui sont nécessaires pour commencer les dilutions avec pour le médicament 1 et le médicament 2 qui doivent être diluées en série dans les plaques. En ce qui concerne le médicament 3 et le médicament 4, le MIC devrait également être connu pour calculer les concentrations nécessaires pour être testé (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, et MIC). Il existe de nombreuses méthodes pour déterminer le MIC, mais le mieux est de le déterminer avec la technique de microdilution puisque le protocole Q-damier utilise également le test de microdilution pour la dilution en série.

Dans un premier temps, lors du ruban adhésif des plaques, assurez-vous que le banc est propre et couvrez-les de couvercles stériles pour éviter toute contamination. Il est important de noter que ce protocole peut être fait en utilisant quatre plaques de 96 puits représentant les quatre panneaux, où chaque plaque est divisée en quatre quadrants plus petits. Cependant, le nombre de dilutions sera réduit au minimum pour le premier et le deuxième médicament. De plus, on peut également utiliser des plaques profondes de 384 puits au lieu d’enserrir quatre plaques ensemble. Cependant, il n’était pas disponible lorsque nous avons fait les expériences. Notez que lors du choix de la plaque à utiliser, assurez-vous de vérifier la capacité de chaque puits puisque le volume final dans le puits sera de 250 μL.

De plus, le nombre de plaques dans chaque panneau et le nombre de panneaux dépendent du nombre de dilutions requises pour le troisième et le quatrième médicament. Par exemple, dans cette expérience, quatre dilutions du troisième médicament et quatre dilutions du quatrième médicament ont été requises (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, et MIC); ainsi, nous avions quatre plaques dans chaque panneau et quatre panneaux.

La dilution du premier médicament se produit dans les plaques des panneaux selon les colonnes. Cependant, la dilution du deuxième médicament se produit dans des plaques séparées selon les rangées. Les troisième et quatrième médicaments ne sont pas dilués en série. Cependant, chaque concentration utilisée est préparée dans un tube séparé et ajoutée à chaque puits dans un volume spécifique. Il est important de noter que les puits contenant les quatre médicaments sont présents dans le quadrant entre les rangées G et B et les colonnes 2 et 12 seulement. Le damier et les protocoles en damier tridimensionnel n’ont pas été filmés ou écrits dans ce manuscrit parce qu’ils sont des protocoles connus et le but de ce manuscrit est de parler du protocole Q-damier. Dans la technique du damier, la rangée A ne contient que le médicament 1; ainsi, montrant le MIC de la drogue 1. La colonne 1 ne contient que le médicament 2; ainsi, montrant le MIC du médicament 2.

Ce concept est conservé dans le protocole Q-Checkerboard où le MIC du médicament 1 est toujours indiqué dans la rangée A et le MIC du médicament 2 est toujours indiqué dans la colonne 1. En plus de cela, les deux médicaments ajoutés présentent leur MIC dans l’expérience. Le médicament 3 a la plaque P4 dans chaque panneau où le MIC du médicament 3 est ajouté à tous les puits, nous ne devrions donc pas observer de croissance dans cette plaque. De même, le médicament 4 a un panneau A4 où le MIC du médicament 4 est ajouté à tous les puits dans toutes les plaques du panneau 4, donc aucune croissance ne doit être observée dans ce panneau.

La croissance dans les plaques est enregistrée en fonction de la turbidité dans les puits, où les puits turbides sont considérés comme ayant une croissance. En plus de la turbidité, 50 μL d’iodotetrazolium sont ajoutés et laissés pendant quelques minutes. Un changement de couleur en rose signifie qu’il y a une croissance.

Cette méthode présente certaines limitations. Cela demande beaucoup de travail et de concentration. Des erreurs de pipetage peuvent survenir car cette technique est basée principalement sur le pipetage. Les calculs FIC sont considérés comme une limitation dans ce cas puisque nous avons affaire à quatre valeurs et non à deux ou trois. L’ajout d’une valeur augmentera la valeur du FIC dans le puits; ainsi, les valeurs de FIC qui déterminent la synergie, l’indifférence, et l’antagonisme doivent être reconsidérées.

Les valeurs FIC peuvent changer entre plusieurs références concernant les normes par lesquelles la synergie, l’antagonisme et l’indifférence sont définis. Certaines références indiquent qu’un FIC de 0,5 et moins est considéré comme une synergie13,tandis que d’autres indiquent qu’un FIC inférieur à 0,8 est considéré comme une synergie16. Une autre référence indique qu’un FIC inférieur à 1 est considéré comme synergiste17. En raison de l’instabilité et du conflit dans la définition d’un FIC standard unifié de synergie, nous avons considéré 1 comme notre référence.

Le FIC final est calculé en additionnant les valeurs FIC de chaque plaque (9 FICs) et en la divisant par le nombre de plaques qui est 9. Il est important de noter que le panel 4 n’est pas pris en compte dans les résultats puisqu’il contient le MIC du quatrième médicament, de sorte que l’inhibition sera l’œuvre d’un seul médicament. De plus, la plaque 4 de chaque panneau n’est pas non plus prise en compte puisqu’elle contient la CMI du médicament 3 où l’inhibition dans cette plaque sera l’acte du médicament 3 seul. Ainsi, on se retrouve avec 9 planches (16 - (4 + 3)).

Pour chaque plaque, les FICs sont calculés pour les puits sur l’interface Croissance/pas de Croissance selon la formule suivante : (MIC du médicament 1 en association/MIC du médicament 1 seul) + (MIC du médicament 2 en association/MIC du médicament 2 seul) + (MIC du médicament 3 en association/MIC du médicament 3 seul) + (MIC du médicament 4 en association/MIC du médicament 4 seul). Ensuite, le nombre obtenu est divisé par 4. Cette formule est faite pour chaque puits sur l’interface Growth/no Growth dans la même plaque. Ensuite, tous les FICs d’une même plaque sont additionnés pour obtenir le FIC de cette plaque. Enfin, comme mentionné précédemment, les 9 FICs finaux de chaque plaque sont ajoutés et divisés par 9 pour obtenir le FIC final qui sera interprété.

Un FIC inférieur à 1 est considéré comme synergique lorsqu’il présente un certain degré de synergie : il est soit légèrement synergique (proche d’un) soit plus synergique (lorsqu’il se déplace vers 0,5 et moins). Ce calcul et cette interprétation se font simplement à l’aide d’un modèle FIC que nous avons développé. Il suffit d’entrer les concentrations, de choisir les puits sur l’interface Croissance/pas de croissance pour calculer les FIC, et nous obtiendrons le FIC final qui est interprété selon les critères mentionnés.

Cette méthode permet de tester toutes les combinaisons possibles qui peuvent être faites en utilisant quatre médicaments dans une expérience qui peut être faite en une journée. Les résultats sont obtenus le lendemain. Alors que, au moment de l’analyse de la courbe de mise à mort, plus de temps, les matériaux de travail et les travailleurs de laboratoire sont nécessaires pour tester le même nombre de combinaisons, puisque chaque ensemble de combinaisons est testé seul dans un seul tube ou tasse, ce qui prend du temps. Cette méthode peut être utilisée non seulement pour tester des combinaisons de médicaments antibactériens, mais aussi pour tester tous les types de médicaments utilisés pour traiter des maladies et doit être testée en combinaison. Il peut également être utilisé pour tester une combinaison de médicaments et d’extraits de plantes ou même une combinaison d’extraits de plantes uniquement. Le fait est que cette méthode peut être utilisée pour tester non seulement des médicaments spécifiques, mais tout ce qui peut être combiné.

Plusieurs limitations accompagnent cette méthode. Les compétences en pipetage sont très importantes lors de l’exécution de ce test et toute erreur qui peut survenir lors du pipetage et de la dilution en série peut affecter négativement les résultats et peut conduire à des résultats faussement négatifs ou faussement positifs. Ainsi, toutes les avancées technologiques concernant les machines de pipetage et les robots seront d’une grande aide dans la réalisation de ce test. Cette méthode nécessite beaucoup de calculs et de dilutions, de sorte que toute erreur unique peut modifier le résultat des résultats. Cette technique fournit des informations sur l’effet d’inhibition seulement et non sur l’effet de mise à mort. Cette technique étudie l’inhibition à un seul point de temps et non au fil du temps.

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Disclosures

aucun.

Acknowledgments

aucun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL tips Citotest 4330000402
200 µL tips Citotest 4330-0013-17
50 mL centrifuge tube corning 430828 For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube Falcon 352058 For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes JRZ Plastilab As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates corning 3596 For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France 10177403 Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime) PHARCO Pharmaceuticals 24750/2006 Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar BIO-RAD 64169508 For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) HIKMA Pharmaceuticals 2BXMIA56N-AEF Drug 2
Muller-Hinton Broth BIO-RAD 69444 For making bacterial media
Multichannel Pipette Thermo Scientific GJ54761 For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes Thermo Scientific OH19855 HH40868 For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) sanofi aventis 221937/2009 Drug 3

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References

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Biologie numéro 173 combinaison antibiotique damier interaction de quatre médicaments
Quadruple-Damier : Une modification du Damier tridimensionnel pour l’étude des combinaisons de médicaments
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Isber, C., Stockman, D. L., Daoud, Z. Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations. J. Vis. Exp. (173), e62311, doi:10.3791/62311 (2021).

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