Summary
Стволовые клетки глиомы (GSC) представляют собой небольшую часть раковых клеток, которые играют важную роль в инициации опухоли, ангиогенезе и лекарственной устойчивости при глиобластоме (GBM), наиболее распространенной и разрушительной первичной опухоли головного мозга. Наличие ГСК делает GBM очень рефрактерным к большинству отдельных целевых агентов, поэтому для выявления потенциальных эффективных комбинированных терапевтических средств требуются высокопроизводительный скрининг. Протокол описывает простой рабочий процесс, позволяющий быстро проводить скрининг потенциальной комбинированной терапии с синергетическим взаимодействием. Общие этапы этого рабочего процесса состоят из установления ГСК, помеченных люциферазой, подготовки пластин с матригелевым покрытием, скрининга комбинированных препаратов, анализа и проверки результатов.
Abstract
Стволовые клетки глиомы (GSC) представляют собой небольшую часть раковых клеток, которые играют важную роль в инициации опухоли, ангиогенезе и лекарственной устойчивости при глиобластоме (GBM), наиболее распространенной и разрушительной первичной опухоли головного мозга. Наличие ГСК делает GBM очень рефрактерным к большинству отдельных целевых агентов, поэтому для выявления потенциальных эффективных комбинированных терапевтических средств требуются высокопроизводительный скрининг. Протокол описывает простой рабочий процесс, позволяющий быстро проводить скрининг потенциальной комбинированной терапии с синергетическим взаимодействием. Общие этапы этого рабочего процесса состоят из установления ГСК, помеченных люциферазой, подготовки пластин с матригелевым покрытием, скрининга комбинированных препаратов, анализа и проверки результатов.
Introduction
Глиобластома (ГБМ) является наиболее распространенным и агрессивным типом первичной опухоли головного мозга. В настоящее время общая выживаемость пациентов с ГБМ, получивших максимальное лечение (сочетание хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии), по-прежнему короче 15 месяцев; поэтому срочно необходимы новые и эффективные методы лечения ГБМ.
Наличие стволовых клеток глиомы (GSC) в GBM представляет собой значительную проблему для традиционного лечения, поскольку эти стволовые клетки играют ключевую роль в поддержании микроокружения опухоли, лекарственной устойчивости и рецидива опухоли1. Таким образом, нацеливание на ГСК может быть многообещающей стратегией для лечения ГБМ2. Тем не менее, основным недостатком эффективности препарата при ГБМ является его гетерогенетическая природа, включая, но не ограничиваясь, разницей в генетических мутациях, смешанных подтипах, эпигенетической регуляции и микроокружении опухоли, что делает их очень рефрактерными для лечения. После многих неудачных клинических испытаний ученые и клинические исследователи поняли, что таргетная терапия с одним агентом, вероятно, не способна полностью контролировать прогрессирование высоко гетерогенных видов рака, таких как GBM. Принимая во внимание, что тщательно отобранные комбинации лекарств были одобрены для их эффективности путем синергетического усиления эффекта друг друга, обеспечивая тем самым многообещающее решение для лечения ГБМ.
Хотя существует много способов оценки лекарственно-лекарственного взаимодействия лекарственной комбинации, таких как CI (комбинированный индекс), HSA (самый высокий одиночный агент) и значения Bliss и т. Д.3,4,эти методы расчета обычно основаны на комбинациях нескольких концентраций. Действительно, эти методы могут обеспечить утвердительную оценку лекарственного взаимодействия, но могут быть очень трудоемкими, если они применяются при высокопроизводительном скрининге. Чтобы упростить процесс, был разработан процесс скрининга для быстрого выявления потенциальных комбинаций лекарств, которые ингибируют рост ГСК, полученных из хирургических биопсий пациента GBM. Индекс чувствительности (СИ), который отражает разницу ожидаемого комбинированного эффекта и наблюдаемого комбинированного эффекта, был введен в этот метод для количественной оценки синергетического эффекта каждого лекарственного средства, поэтому потенциальные кандидаты могут быть легко идентифицированы по рейтингу СИ. Между тем, этот протокол демонстрирует пример скрининга для идентификации потенциального кандидата (кандидатов), который может синергизировать эффект антиглиомы с темозоломидом, химиотерапией первой линии для лечения GBM, среди 20 малых молекулярных ингибиторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образец GBM был получен от пациента во время обычной операции после получения полностью информированного согласия комитета по этике исследований человека Первой аффилированной больницы Нанкинскому медицинскому университету.
1. Выделение и культура ГСК, полученных от пациента
- Поместите свежую хирургически резецированную ткань глиобластомы в центрифужную трубку объемом 15 мл, заполненную стерильным PBS, и храните ткань на льду до дальнейшей операции.
- Измерните ткань GBM примерно на куски диаметром от 0,5 до 1 мм с помощью ножниц для рассечения и промывайте образцы тканей нейрональной базальной средой для удаления клеточного мусора в шкафу биобезопасности.
- Переварить фрагменты тканей с 1 мг/мл коллагеназы А при 37 °C в течение 30 мин и центрифугировать при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надносец и подвешивайте гранулу с пустой нейрональной базальной средой и диссоциируют гранулу механически путем повторного пипетирования на льду.
- Культивирует смесь в 6-скважинных культуральная пластины со сверхнизким прикреплением, заполненные питательной средой GSC (см. Таблицу 1 для рецепта) в стерильном клеточном инкубаторе с 5% CO2 и влажностью 90% при 37 °C до образования невросферы.
- При достаточном образовании нейросферы собирают их с помощью пипетки в микропробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Повторно суспендируют гранулы и разделят их на несколько колбы, заполненных вышеуказанной питательной средой для поддержания первичных ГСК.
ПРИМЕЧАНИЕ: ГСК, полученные от пациента, используемые в примере, были получены из хирургических биопсий 34-летнего пациента мужского пола с рецидивирующим ГБМ IV степени ВОЗ. GSC были названы XG387 для будущих экспериментов. Тесты на микоплазму на основе ПЦР были проведены для вышеуказанных ГСК, чтобы подтвердить отсутствие загрязнения микоплазмой. Все эксперименты с участием ГСК, используемые в этом протоколе, проводились <15 проходов.
2. Подготовка ГСК с метками люциферазы
- Соберите ГСК из средней культуры и центрифугьте их при 70 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Удалить надмное, переварить клетки с аккутазой в течение 4 мин при 37 °C. Используйте наконечник и пипетку емкостью 200 мкл несколько раз, чтобы диссоциировать и повторно суспендировать гранулу клетки.
- Разбавьте клетки до 2 х 105 клеток на скважину в 12-ю ямочную культурную пластину и культивируют клетки на ночь.
- Добавьте 30 мкл супернатанта вируса люциферазы-EGFP (титр >108 TU/мл) в каждую лунку в пластине, а затем центрифугируют клетки при 1000 х г в течение 2 ч при 25 °C. Культивь на ночь культивикуют клетки.
- Обновите среду на следующий день и прокайте клетки еще 48 ч.
- Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить появление положительных клеток GFP.
- Используйте сортировщик проточных клеток для сортировки и выбора GSC с высокой флуоресценцией GFP для дальнейшего культивирование клеток.
3. Измерение жизнеспособности клеток на основе биолюминесценции
- Покрытие пластин смесью внеклеточного матрикса (ECM) (например, Matrigel): Добавьте 40 мкл смеси ECM 0,15 мг/мл в каждую скважину и инкубируем пластину в течение 1 ч при 37 °C. Удалите излишки смеси ECM и осторожно промойте один раз PBS.
- Добавьте 100 мкл культуральная среда, содержащая 15 000, 10 000, 8000, 6000, 4000, 2000, 1000 и 500 клеток XG387-Luc вместе с пустой средой 100 мкл в качестве контрольной в каждую скважину для 6 реплиц в 96-скважинной оптической нижней пластине и культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C.
- Удалить супернатант, добавить 50 мкл культуральная среда, содержащая 150 нг/мкл D-люциферина, в каждую лунку и инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C.
- Сделайте снимки клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используйте встроенное программное обеспечение для создания нескольких круговых областей интересуемой области (ROI) и количественной оценки клеточной биолюминесценции.
4. Лечение темозоломидом и комбинированный скрининг
- Предварительно обмазать четыре 96-скважинными пластинами, как описано выше, перед обработкой.
- Засейте клетки XG387-Luc с плотностью 1000 клеток в 100 мкл культуральная среда в каждую скважину 96-скважинной оптической нижней пластины и культивированы клетки в течение ночи.
- Заранее подготовьте темозоломид и целевые средства из запасного раствора. Готовят ряд концентраций, состоящий из 800 мкМ, 600 мкМ, 400 мкМ, 300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ и 50 мкМ темозоломида в культуральная среда для одноагентной обработки. Разбавляют темозоломид и целевые агенты в стоковом растворе в культуральную среду, соответственно, для получения конечных концентраций 200 мкМ и 2 мкМ для скрининга комбинированных лекарственных средств(таблица 2).
- Удалить питательную среду, когда большинство ГСК прилипают к нижней части пластин; добавляют вышеуказанную среду, содержащую темозоломид, в каждую скважину для трех технических реплик за обработку.
- Для лечения Темозоломида и скрининга комбинаций лекарственных средств удаляют заготовленную среду и добавляют вышеприготовленную среду, содержащую либо 200 мкМ темозоломида, либо целевой агент 2 мкМ, либо комбинацию обоих в каждую скважину для трех технических реплик за лечение.
- Инкубировать все пластины при 37 °C, 5% CO2 в течение 3 дней.
- Удалить среду, содержащую лекарство, добавить в каждую скважину 50 мкл заготовки, содержащую 150 нг/мкл D-люциферина, и инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C.
- Сделайте снимки клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используйте встроенное программное обеспечение для создания нескольких круговых ROI и количественной оценки клеточной биолюминесценции.
5. Комбинированное лечение темозоломида и UMI-77 в клеточных линиях XG387-Luc и XG328-Luc
- Предварительно обмазать три 96-скважинные пластины, как описано выше, перед обработкой.
- Засейте клетки XG387-Luc и XG328-Luc с плотностью 1000 клеток соответственно в 100 мкл питательной среды в каждую скважину 96-скважинной оптической нижней пластины и культивированы клетки в течение ночи.
- Готовят серию концентраций, состоящую из 600 мкМ, 400 мкМ, 300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ, 50 мкМ и 0 мкМ темозоломида, и серию концентраций, состоящую из 6 мкМ, 4 мкМ, 3 мкМ, 2 мкМ, 1 мкМ, 0,5 мкМ и 0 мкМ UMI-77 в культуральная среда для матричной обработки шестью дозами.
- Удалите пустой носитель, когда большинство ГСК прилипают к нижней части пластины; добавить выше подготовленную среду в каждую скважину для трех технических реплик за обработку.
- Инкубируют эти пластины в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO2.
- Удалить лекарственно-содержащую среду; добавить в каждую скважину 50 мкл пустой среды, содержащей 150 нг/мкл D-люциферина, и инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C для измерения биолюминесценции.
6. Анализ данных
- Рассчитайте показатель индекса чувствительности (СИ) темозоломида и целевого агента в соответствии с формулой на рисунке 2А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка СИ предназначена для количественной оценки влияния добавления другого лекарственного средства. Он варьировался от -1 до +1, с положительными значениями, указывающими на синергетические эффекты темозоломида. - Рассчитайте значения комбинированного индекса (CI) между темозоломидом и UMI-77 с помощью программного обеспечения CompuSyn для анализа их комбинированных взаимодействий. Значение CI <1 указывает на синергию; Значение CI >1 указывает на антагонизм.
- Рассчитайте высокие значения одного агента (HSA) между темозоломидом и UMI-77 с помощью программного обеспечения Combenefit. Значение HSA указывает на комбинированный ингибирующее действие. Значение HSA >0 указывает на синергию, а значение HSA <0 указывает на антагонизм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки XG387 образовывали невросферы в питательной среде, описанной в таблице 1, в ультранизком прикреплении 6-скважинной культурной пластины или нешерстной пластины5 (фиг.1А). Во-первых, был проведен тест, чтобы проверить, была ли интенсивность биолюминесценции из клеток XG387-Luc пропорциональна количеству клеток. Как показано на рисунке 1B,интенсивность биолюминесценции увеличивалась пропорционально плотности клеток и приводила к линейной коррекции между ними (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Рисунок 1С). Поскольку биолюминесценцию клеток, помеченных люциферазой, легко и быстро измерить, это обеспечивает простой метод измерения плотности жизнеспособных ГСК. Далее оценивали антипролиферативную активность темозоломида. Как показано на рисунке 1D,400 мкМ темозоломида вызывали примерно 20% ингибирование пролиферации клеток XG387-Luc, предполагая, что он полезен, но его анти-GBM эффект может быть дополнительно улучшен. Для комбинированного скрининга была выбрана концентрация 200 мкМ.
Например, 20 мишень-селективных ингибиторов малых молекул использовали для скрининга комбинации лекарственных средств для идентификации потенциального кандидата (кандидатов), который усиливает анти-GBM эффект темозоломида. В результате значения чувствительного индекса (СИ) 13 целевых агентов были выше 0, а 5 из них были выше 0,1(Рисунок 2B,C). В частности, СИ двух ведущих препаратов-кандидатов UMI-77 и A 83-01 были выше 0,25, что свидетельствует об их потенциале синергизма с темозоломидом.
Для подтверждения вышеуказанного вывода были применены классические синергетические модели HSA и Bliss3,4,6 для определения комбинированного эффекта темозоломида и UMI-77 в ГСК. Кроме того, XG328 - еще одна модель GSC, полученная от пациента, созданная на ранней стадии, - использовалась для выполнения той же оценки. Антипролиферативный анализ комбинированного лечения темозоломидом и UMI-77 проводили в матрице титрования доз шесть на шесть. Результаты были проанализированы для получения значений HSA и Bliss, которые являются показаниями для синергетического торможения и отображают разницу между ожидаемым ингибированием и наблюдаемым торможением. Как показано на рисунке 3B-D,значения комбинированного индекса (CI) <1 и высокие значения одного агента (HSA) >0 для большинства комбинаций темозоломида и UMI-77 в разных концентрациях, свидетельствуют об общем синергетическом взаимодействии темозоломида и UMI-77 как в XG387, так и в XG328 GSC.
Рисунок 1:GBM полученные от пациента GSC XG387. (A) Формирование неврозферы. (B) Генерация биолюминесценции люциферазы с меткой GSC. (C) Биолюминесценция, генерируемая клетками XG387-Luc, была пропорциональна плотности клеток. (D)Обработка темозоломидом XG387. Каждое лечение проводилось в трех вариантах с двумя независимыми экспериментами. Данные выражены как среднее ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Скрининг комбинации лекарственных средств с использованием ГСК. (А)Формула для расчета СИ (индекс чувствительности) 20 целевых агентов с темозоломидом (ТМЗ) в комбинированном экране. (B) Распределение значений СИ 20 целевых агентов. Красные точки: пятерка лучших кандидатов на наркотики. (C)Информация о пяти наиболее целевых агентах-кандидатах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Комбинированная обработка темозоломида (TMZ) и UMI-77 в клеточных линиях XG387-Luc и XG328-Luc. (A) Одиночное и комбинаторное титрование темозоломида и UMI-77 в анализе пролиферации в клеточных линиях XG387-Luc и XG328-Luc. (B)Изоболограмма и комбинированный индексный анализ ингибирования пролиферации в клетках XG387-Luc и XG328-Luc, обработанных темозоломидом и UMI-77. CI <1 указывает на синергетический эффект. (С,D) Графики синергии, генерируемые Combenefit, показывающие взаимодействие между темозоломидом и UMI-77. Анализ взаимодействия привел к значениям HSA (высокий уровень одного агента) и значениям Bliss, что указывает на синергетическую эффективность, рассчитанную из ожидаемого. Значения HSA и Bliss >0 указывают на синергетические эффекты. Каждое лечение проводилось в трех вариантах с двумя независимыми экспериментами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании был описан протокол, который может быть применен для идентификации потенциальной комбинированной терапии ГБМ с использованием ГСК, полученных от пациента. В отличие от стандартной метрической модели синергии/аддитивности, такой как методы Loewe, BLISS или HSA, был использован простой и быстрый рабочий процесс, который не требует объединения пары лекарств в нескольких концентрациях полным факториальным образом, как традиционные методы. В этом рабочем процессе СИ (индекс чувствительности), который получен из исследования для оценки сенсибилизирующего эффекта siRNAs в сочетании с небольшим молекулярным ингибитором, был введен для количественной оценки синергетического лекарственного эффекта двух малых молекулярных ингибиторов7. Диапазон значений СИ составляет от -1 до 1, а положительное значение СИ указывает на сенсибилизирующий эффект между каждым из препаратов. Чем выше достигнуто значение СИ, тем сильнее синергия. Хотя значение СИ само по себе не способно дать утвердительный ответ о типе (синергетическом, аддитивном или антагонистическом) лекарственного взаимодействия, эти кандидаты с самым высоким рейтингом имеют высокую вероятность синергии с интересующим препаратом и, следовательно, заслуживают дальнейшей проверки. Для сравнения, большинство современных высокопроизводительных методологий скрининга комбинаций лекарств по-прежнему трудоемки и включают сложные алгоритмы8,9.
Чтобы проиллюстрировать осуществимость этого метода, был выполнен мелкомасштабный тестовый экран. В результате удалось идентифицировать UMI-77, селективный ингибитор MCL1, в качестве основного кандидата среди 20 целевых агентов для синергизма с темозоломидом в подавлении роста ГСК. Фактически, в предыдущем исследовании было также обнаружено, что UMI-77 синергетически усиливает антиглиомную активность темозоломида в установленных клетках GBM10. В текущем исследовании синергетическое взаимодействие между UMI-77 и темозоломидом было вновь одобрено в ГСК с использованием классического комбинированного индекса Чоу-Талалай, методов BLISS или HSA. Еще одним преимуществом этого протокола является использование ГСК, помеченных люциферазой, для измерения жизнеспособной доли клеток. Активность люциферазы клеток может быть легко измерена добавлением люциферина, субстрата люциферазы, и захвата люминесценции любым прибором с функцией люминометрического измерения. Поскольку реакция люцифераза-люциферин быстрая, в настоящем описании она обеспечивает дешевое и быстрое решение по сравнению с традиционным МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид), МТС(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиэтоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н тетразолий) или анализами CCK-8 (набор для подсчета клеток-8), все из которых требуют длительного времени инкубации. Вместе протокол представляет собой высокопроизводительный скрининг потенциальной комбинации лекарств для GBM. Протокол также обеспечивает дополнительное быстрое и простое решение для скрининга комбинации лекарств в дополнение к стандартным методам оценки синергизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим Национальный фонд естественных наук Китая (81672962), Фонд программы инновационной команды провинции Цзянсу и Фонд совместных ключевых проектов Юго-Восточного университета и Нанкинского медицинского университета за их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
- Shi, Y., et al. Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance. Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).
- Tan, X., et al. Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV. Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).
- Jansen, V. M., et al. Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer. Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).
- Malyutina, A., et al. Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer. PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).
- He, L., et al. Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring. Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).
- Chen, C., et al. Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).
