Summary
يصف هذا التقرير تقنيات عزل وتنقية الجليكوسامينوغليكانات الكبريتية (GAGs) من العينات البيولوجية ونهج إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد لتقريب حجمها. تساهم GAGs في بنية الأنسجة والتأثير على عمليات الإشارات عبر التفاعل الكهروستاتيكي مع البروتينات. يساهم طول البوليمر GAG في تقاربها الملزم للليجانات cognate.
Abstract
الكبريتات الجليكوسامينوغليكان (GAGs) مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) موجودة في كل مكان في الكائنات الحية وتلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الهياكل والعمليات البيولوجية الأساسية. كما البوليمرات، GAGs موجودة كخليط متعدد الأضلاع التي تحتوي على سلاسل البوليساكريد التي يمكن أن تتراوح بين 4000 دا إلى أكثر من 40،000 دا. داخل هذه السلاسل توجد مجالات الكبريت، مما يمنح نمطا من الشحنة السلبية التي تسهل التفاعل مع بقايا مشحونة إيجابيا من ليغند البروتين cognate. يجب أن تكون المجالات الكبريتية من GAGs من طول كاف للسماح لهذه التفاعلات الكهربائية. لفهم وظيفة GAGs في الأنسجة البيولوجية ، يجب أن يكون المحقق قادرا على عزل وتنقية وقياس حجم GAGs. يصف هذا التقرير تقنية عملية ومتعددة الاستخدامات تعتمد على جل البولي أكريلاميد تعتمد على الكهروفورسيس والتي يمكن الاستفادة منها لحل الاختلافات الصغيرة نسبيا في الحجم بين GAGs المعزولة عن مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة البيولوجية.
Introduction
الجليكوسامينوغليكان (GAGs) هي عائلة متنوعة من السكريات الخطية التي هي عنصر في كل مكان في الكائنات الحية وتساهم في العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية1. ويمكن كبريتات GAGs مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) في مواقع متميزة على طول سلسلة البوليساكريد ، مما يضفي مجالات جغرافية من الشحنة السلبية. هذه GAGs، عندما المربوطة إلى البروتينات سطح الخلية المعروفة باسم البروتيوغليكان، المشروع في الفضاء خارج الخلية وربط ليغاندس cognate، مما يسمح لتنظيم كل من رابطة الدول المستقلة- (ligand تعلق على نفس الخلية) وعبر -(ligand تعلق على الخلية المجاورة) عمليات الإشارة2. وعلاوة على ذلك، GAGs أيضا أداء الأدوار الحاسمة كعناصر هيكلية في الأنسجة مثل غشاء الطابق السفلي الكبيبي3،والغليكولايل البطانيةالوعائية 4 والظهارية الرئوية الجليكوكاليك5،وفي الأنسجة الضامة مثل الغضاريف6.
يختلف طول سلاسل الكمامات متعددة الشاريد بشكل كبير وفقا لسياقها البيولوجي ويمكن إطالته بشكل ديناميكي ، وتكبيله ، وتعديله بواسطة نظام تنظيمي أنزيمي معقد للغاية7. الأهم من ذلك ، فإن طول سلاسل البوليمر GAG يساهم بشكل كبير في تقاربها الملزم للليجاند ، وبالتالي ، إلى وظيفتها البيولوجية8،9. ولهذا السبب، فإن تحديد وظيفة GAG الداخلي يتطلب تقديرا لحجمها. لسوء الحظ ، على عكس البروتينات والأحماض النووية ، لا يوجد سوى عدد قليل جدا من التقنيات المتاحة بسهولة للكشف عن GAGs وقياسها ، مما أدى تاريخيا إلى تحقيق محدود نسبيا في الأدوار البيولوجية لهذه العائلة المتنوعة من السكريات المتعددة.
توضح هذه المقالة كيفية عزل وتنقية GAGs من معظم الأنسجة البيولوجية ، وتصف أيضا كيفية استخدام البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (PAGE) لتقييم طول البوليمرات المعزولة بدرجة معقولة من التحديد. وعلى النقيض من النهج الجليكومية الأخرى البالغة التعقيد (والتي غالبا ما تكون قائمة على قياس الطيف الكتلي)، يمكن استخدام هذه الطريقة باستخدام معدات وتقنيات مختبرية قياسية. ولذلك، فإن هذا النهج العملي قد يوسع قدرة المحققين على تحديد الدور البيولوجي لغاغس الأصلية وتفاعلها مع الليجاندات ذات الأهمية السياقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على جميع العينات البيولوجية التي تم تحليلها في هذا البروتوكول من الفئران، بموجب بروتوكولات وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كولورادو.
1. عزل كبريتات الهيباران
- تهذي عينات الأنسجة
ملاحظة: Delipidation هو خطوة اختيارية للأنسجة الغنية بالدهون.- جعل خليط 1:1 من الميثانول وديكلوروميثان. إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل عينة؛ قد تتطلب قطع أكبر من الأنسجة ما يصل إلى 1 مل.
- ضع كل عينة نسيج في وعاء زجاجي صغير مع غطاء للتهذي.
ملاحظة: قد تختلف كتلة العينة حسب الأنسجة ذات الاهتمام والاحتياجات التجريبية. 50 ملغ أو أقل عادة ما تكون كافية لغلة GAG كافية, ولكن قد تكون هناك حاجة إلى بعض الأمثل من قبل المستخدم النهائي. - إضافة 500 ميكرولتر من الميثانول: حل ثنائي كلورو الميثان لكل حاوية زجاجية ومزيج. تأكد من أن جميع عينات الأنسجة الصلبة مغمورة بالكامل في المذيبات.
ملاحظة: استخدام ماصة المصلية أو أنابيب مخروطية بلاستيكية لخلط ومعالجة الميثانول / ثنائي كلورو الميثان؛ قد تذوب المواد البلاستيكية الأخرى. - ضع عينات على شاكر (في حامل آمن) في غطاء أبخرة كيميائي وحرض بلطف لمدة ساعة واحدة.
- حرض العينات على الخلط والطرد المركزي عند 17000 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- ماصة بعناية من كسر المذيبات العضوية (supernatant). هذا هو كسر الدهون - لا يحتوي على GAGs ويمكن التخلص منه.
ملاحظة: حاول عدم إزعاج الأنسجة حيث يمكن فقدان القطع الصغيرة. من الأفضل ترك بعض الطبقة العضوية في حاوية العينة ، بدلا من المخاطرة بفقدان العينة. - اترك غطاء الحاوية الزجاجية مفتوحا واتركه يتبخر بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة. تغيير أنبوب للخطوة التالية لأن تلك الأنابيب لن البقاء على قيد الحياة مزيد من المعالجة.
- بمجرد أن يتبخر خليط المذيبات بالكامل ، انتقل إلى التفكك الميكانيكي (إذا كانت العينة المتبقية >50 ملغ) أو هضم Actinase E (< 50 ملغ).
- التفكك الميكانيكي للأنسجة الصلبة (اختياري؛ لعينات الأنسجة الكبيرة)
ملاحظة: معظم القطع الصغيرة من الأنسجة الصلبة (حوالي 50 ملغ أو أقل) يجب أن تذوب تماما أثناء خطوة الهضم. ومع ذلك، سوف تتطلب عينات أكبر تفكك ميكانيكي.- عينات فلاش تجميد الفائدة عن طريق وضعها في أنبوب البولي بروبلين الحجم المناسب ووضع أنبوب مغلق في النيتروجين السائل. السماح للعينة لتجميد حتى الصلبة تماما.
- باستخدام هاون نظيفة والحشرات، طحن العينات المجمدة في اتساق مسحوق مثل.
- انتقل مباشرة إلى عملية الهضم Actinase E (الخطوة 1.4).
- عينة تحلية وتركيز
ملاحظة: هذه خطوة اختيارية ولا تتطلب سوى عينات الأنسجة السائلة المخففة (على سبيل المثال، سائل الحمم الهوائية القصبي -الحويصلات الهوائية (BALF) أو البلازما).- تجميع عينات سائلة في مجموعات تجريبية مناسبة (على سبيل المثال، عن طريق التكرار البيولوجي، أو المجموعة التجريبية)
- ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع خفض الوزن الجزيئي (MWCO) يبلغ 3000 دا.
- تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود عامل التصفية الطرد المركزي.
- اغسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر من الماء المصفى. تجاهل التدفق من خلال.
- عكس مرشح وتدور لمدة 1 دقيقة في 2000 × ز في أنابيب جمع الطازجة، وصفت بشكل مناسب. تجميد عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
- أكتيناسي E الهضم
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لهضم وإزالة ملوثات البروتين من العينة في نهاية المطاف.- مزيج عينات 1:1 مع أكتيناسي E المؤتلف إلى التركيز المطلوب من 10 ملغم / مل. إضافة حجم مناسب من التركيز العازلة الهضم 10x. التركيز النهائي المطلوب: 0.005 M خلات الكالسيوم و 0.01 M خلات الصوديوم، الأس الحموضة 7.5. على سبيل المثال: 190 ميكرولتر من العينة السائلة، 190 ميكرولتر من 20 ملغم/مل أكتيناسي E، 20 ميكرولتر من خلات الكالسيوم 0.05 م، 0.1 م خلات الصوديوم.
- يهيج عينات بلطف أن يمزج, بعد ذلك هضم ل 48-72 ح في 55 °C (حتى 7 أيام للأنسجة كاملة).
- الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة لتسخين أكتيناسي E.
- تجميد العينة عند -80 درجة مئوية أو الاستمرار في الخطوة 1.5.
- عينة تحلية وتركيز
ملاحظة: إذا كان من المتوقع وجود كتلة منخفضة من GAG ذات الأهمية في العينة البيولوجية، أو إذا كان من المستحسن حفظ الكواشف الاستهلاكية (أي أعمدة فلتر الطرد المركزي)، يمكن تجميع العينات لإنتاج تركيز واحد لكل مجموعة تجريبية (على سبيل المثال، عن طريق التكرار البيولوجي، أو المجموعة التجريبية).- ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع MWCO يبلغ 3000 دا.
- تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة، إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود فلتر الطرد المركزي.
- غسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر deionized، والمياه المصفاة. تجاهل التدفق من خلال.
- عكس مرشح وتدور لمدة 1 دقيقة في 2000 × ز في أنابيب جمع الطازجة ، وصفت بشكل مناسب (المدرجة عموما مع أعمدة تصفية الطرد المركزي). تجميد عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
- الجفاف
- إما وضع عينات المذاب من الخطوة 1.5.5 في التركيز فراغ التناوب بين عشية وضحاها أو lyophilize العينات كما هو مفصل أدناه.
- تجميد العينات جيدا إما بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية أو عن طريق غمس في النيتروجين السائل.
- بيرس عينة الأغطية مع إبرة 18 G ومكان في غرفة الليتوفيلي. إضافة مناشف ورقية للتعبئة حسب الحاجة.
- إصلاح غرفة الليوفيلييزر إلى الليوفيليزر وتجميد الجافة بين عشية وضحاها (على الأقل -40 درجة مئوية، 0.135 تور)
- عمود تبادل Cation
- Resuspend المجففة عينات في ما يصل إلى 400 ميكرولتر من 8 M اليوريا، 2٪ CHAPS الحل (أو، إذا جمع العينات، resuspend إلى حد أقصى (400/n) ميكرولتر، حيث ن = عدد العينات في بركة المطلوب. استخدام أقل قدر ممكن من محلول المنظفات.
- توازن تبادل cation (IEX) العمود مع 400 ميكرولتر من 8 M اليوريا، 2٪ CHAPS الحل. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- تحميل 400 ميكرولتر من عينات عينة / مجمعة في العمود IEX. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × ز.
- غسل 3x مع 400 ميكرولتر من 8 M اليوريا، 2٪ CHAPS الحل. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × ز في كل مرة.
- Elute 3x مع 400 ميكرولتر من 0.2 م NaCl. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × غرام لكل منهما. هذا هو كسر تقارب منخفض - وهذا يمكن الاحتفاظ بها لأغراض مراقبة الجودة إذا رغبت في ذلك.
- Elute 3x مع 400 ميكرولتر من 2.7 M (16٪) NaCl. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × غرام لكل منهما. هذا الكسر سوف تحتوي على الجليكوسامينوغليكان معزولة من الفائدة - الحفاظ على كل ذلك!
- لإزالة كل جزء من الكسور، أضف الميثانول حتى 80 فول٪ واحتضنه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تدور كل عينة لمدة 5 دقائق في 2000 × ز. استرداد بقايا الصلبة كما يتم تجفيف هذا جليكوسامينوغليكان دي المملحة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، تخطي هذه الخطوة ثم انتقل إلى الخطوة 1.8 إلى إزالة الملح eluate بدون الميثانول.
- عينة تحلية وتركيز
- إذا لزم الأمر، تجمع الكسور الملتوية (من 1.7.6) في مجموعات تجريبية مناسبة (على سبيل المثال، عن طريق التكرار البيولوجي، أو المجموعة التجريبية).
- ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع MWCO يبلغ 3000 دا.
- تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة، إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود فلتر الطرد المركزي.
- غسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر deionized، والمياه المصفاة. تجاهل التدفق من خلاله. انتقل مباشرة إلى الخطوة 1.9.
- هضم شوندرويتين
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو إزالة GAGs غير ذات أهمية للمستخدم النهائي. في هذه الحالة، يتم استخدام شوندرويتيناس لإزالة شوندرويتين. في الأنسجة المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية (broncho-alveolar lavage fluid والرئة بأكملها) ، فإن هضم كبريتات شوندرويتين يترك كبريتات الهيباران كغاغة رئيسية متبقية. قد يحتاج المستخدمون النهائيون إلى إضافة خطوات هضم إضافية اعتمادا على أهدافهم التجريبية.- تحميل 350 ميكرولتر من العازلة الهضم (خلات الأمونيوم 50 mM مع 2 mM كلوريد الكالسيوم تعديلها إلى درجة الحموضة 7.0) إلى عمود تصفية الطرد المركزي دون لمس الغشاء.
- إضافة 5 ميكرولتر من chondroitinase ABC المؤتلف.
- ضع أنبوب العينات في فرن 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة ساعة واحدة.
- قم بتحويل العمود ووضعه إلى أنابيب تجميع تحمل تسمية مناسبة. تدور لمدة 1 دقيقة في 2000 x ز.
- عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة لتثبيط chondroitinase ABC.
- عينة تحلية وتركيز
- إذا لزم الأمر، تجمع chondroitin هضم عينات من الخطوة 1.9.5 إلى مجموعات تجريبية مناسبة (على سبيل المثال، عن طريق تكرار البيولوجية، أو مجموعة تجريبية)
- ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع MWCO يبلغ 3000 دا.
- تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود فلتر الطرد المركزي.
- غسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر deionized، والمياه المصفاة. تجاهل التدفق من خلال.
- عكس مرشح وتدور لمدة 1 دقيقة في 2000 × ز في أنابيب جمع الطازجة ، وصفت بشكل مناسب. تجميد عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
- الجفاف
ملاحظة: في هذه الخطوة، الجفاف ضروري بحيث يمكن إعادة إنفاق العينات في أصغر كمية ممكنة من المياه ومخازن مؤقتة قيد التشغيل.- إما وضع عينات chondroitin هضم من الخطوة 1.10.5 مباشرة في التركيز فراغ التناوب بين عشية وضحاها أو lyophilize على النحو التالي:
- تجميد العينات جيدا إما بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية أو عن طريق غمس في النيتروجين السائل.
- بيرس عينة الأغطية مع إبرة 18 G ومكان في غرفة الليتوفيلي. إضافة مناشف ورقية للتعبئة حسب الحاجة.
- إصلاح غرفة الليوفيلييزر إلى الليوفيليزر وتجميد الجافة بين عشية وضحاها (على الأقل 40 درجة مئوية، 0.135 تور)
2. البولي أكريلاميد هلام الكهربائي من الجليكوسامينوغليكان المعزولة والمنقية
- إعداد الحلول اللازمة لداء إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد (PAGE) مقدما (الجدول 1).
ملاحظة: حدد النسبة المئوية من الأكريلاميد لحل محلول الجل اعتمادا على حجم الجليكوسامينوغليكان المتوقع أن تكون في العينة. يوصى ب 15٪ لحل الأجزاء الأكبر (أكبر من 30 وحدة فرعية من وحدات فك الشاريد في الطول)؛ 22٪ للأجزاء الأصغر (<20 وحدة فرعية من فصل الأحرف في الطول). - ضع كاسيت فارغ في خزان PAGE. يلقي هلام حل على النحو التالي: في أنبوب 15 مل، مزيج 10 مل من حل هلام حل، 60 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الأمونيوم (يجب أن تكون مستعدة حديثا)، و 10 ميكروغرام من TEMED (إضافة TEMED الماضي). عكس أنبوب بلطف 2-3x. استخدام ماصة لإضافة بسرعة الحل أعلاه 10 مل إلى كاسيت. تراكب مع 2 مل من المياه المصفاة، deionized والسماح للجل حل لبوليمرة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تم تحسين بروتوكول PAGE التالي لنظام PAGE عمودي باستخدام أشرطة صب سمكها 13.3 × 8.7 سم (العرض × الطول) بحجم 1.0 مم بحجم إجمالي يبلغ 12 مل تقريبا. يمكن استخدام أنظمة كاسيت أخرى ولكن قد تتطلب التحسين من قبل المستخدم النهائي. - بعد حل هلام قد بلمرة تماما، تجاهل الماء مضاف ويلقي هلام التراص على النحو التالي: في أنبوب 15 مل، مزيج 3 مل من محلول هلام التراص، 90 ميكروغرام من 10٪ كبريتات الأمونيوم (يجب أن تكون مستعدة حديثا)، 3 ميكرولتر من TEMED (إضافة TEMED الماضي).
- عكس أنبوب بلطف 2-3x. استخدام ماصة لإضافة بسرعة حل هلام التراص على هلام حل صلبة; ملء كاسيت إلى حافة. إدراج مشط بالكامل المدرجة مع إعداد. السماح للهلام التراص لبوليمرة لمدة 30 دقيقة.
- بمجرد أن يبوليمر الجل ، تأكد من إزالة شريط الشريط من أسفل الكاسيت ، ووضع الكاسيت مرة أخرى في تجميع خزان PAGE.
- املأ الغرف العلوية والسفلية بحاجز الغرفة العلوي والسفلي، على التوالي.
- حل العينات المجففة من الخطوة 1.11.4 في الحد الأدنى من الحجم اللازم من المياه المجففة، وإزالة التأين (على الأكثر، 50٪ من حجم الآبار في هلام PAGE). خلط 1:1 مع عينة تحميل المخزن المؤقت. تحميل العينات وHS oligosaccharide "سلالم" (انظر الجدول 1)في هلام.
- قبل تشغيل هلام لمدة 5 دقائق في 100 V. ثم تشغيل هلام في 200 V لمدة 20-25 دقيقة (ل15٪ هلام حل البولي أكريلاميد)، 40-50 دقيقة (ل18٪ هلام حل البولي أكريلاميد)، 90-100 دقيقة (ل22٪ هلام حل البولي أكريلاميد).
ملاحظة: قد يكون بعض الأمثل من وقت التشغيل 200 V الضرورية. فينول الأحمر يهاجر قبل أوليغوساكاريد الهيبارين التي هي 2 وحدات فرعية البوليمر في الطول (أي درجة البلمرة 2، أو dp2)؛ بروموفينول الأزرق يهاجر قبل dp10-dp14. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم تطبيق الجهد بحيث تهاجر الفرقة الحمراء الفينول تقريبا، ولكن ليس تماما، إلى الجزء السفلي من هلام. ضبط وقت التشغيل وفقا لذلك.
3. بروتوكول تلطيخ الفضة
- إعداد جميع الحلول اللازمة لتلطيخ الفضة مقدما (الجدول 2).
ملاحظة: لا تلمس جل PAGE مباشرة حتى يتم تلطيخه وتطويره ووضعه في محلول الإيقاف. بدلا من ذلك، التعامل مع هلام باستخدام أدوات نظيفة من البلاستيك أو الزجاج. سيؤدي التعامل المباشر مع الجل إلى تشوهات في بصمة الإصبع وغيرها من القطع الأثرية المرئية على الجل بعد التلطيخ. - بمجرد الانتهاء من تشغيل، تفكيك كاسيت واستخراج هلام في وعاء نظيف، متوسطة الحجم مليئة المياه المؤينة، وتصفيتها.
ملاحظة: لتجنب التعامل مباشرة مع الجل، استخدم طرف ماصة أو غيرها من الكائنات البلاستيكية لتقشير بلطف هلام بعيدا عن كاسيت في حين غمرت في الماء. هلام قد تكون هشة - التعامل بعناية.- تجاهل الماء. وصمة عار الجل في محلول تلطيخ الأزرق Alcian لمدة 5 دقائق.
- تجاهل البقعة الزرقاء الألسيان. شطف بسرعة / غسل 2-3x مع المياه المصفاة، deionized حتى تمت إزالة معظم محلول تلطيخ الأزرق Alcian.
- السماح لإزالة وصمة عار في المياه deionized، تصفية بين عشية وضحاها على الروك. تأكد من وجود كمية وافرة من المياه المصفاة والغينة لضمان غسل أي بقعة متبقية بالكامل من الجل بين عشية وضحاها.
- غسل هلام في الميثانول 50٪ (40 دقيقة المجموع، تغيير الحل 2-3x).
- غسل هلام في الماء deionized، تصفية لمدة 30 دقيقة. تجاهل الماء وكرر 3 المزيد من الوقت لما مجموعه 2 ساعة، واستبدال الماء في كل مرة.
- في وعاء نظيف طازج، قم بصبغ الجل لمدة 30 دقيقة في محلول تلطيخ نترات الفضة.
- شطف بسرعة / غسل 2-3x في المياه deionized، تصفية لإزالة تماما الحل تلطيخ الفضة.
- يغسل لمدة 30 دقيقة في الماء المتأين والمصفى. تجاهل الماء وتكرار 2x لما مجموعه 90 دقيقة، واستبدال حمام الماء في كل مرة.
- تجاهل المياه وإضافة حل النامية.
- بمجرد إضافة حل النامية، ومراقبة بعناية هلام ومشاهدة لظهور العصابات. اعتمادا على نوعية وصمة عار وكتلة العينة المحملة، يمكن أن يستغرق التطوير في أي مكان من بضع ثوان إلى عدة دقائق.
- بمجرد أن تكون العصابات المطلوبة مرئية ، تجاهل على الفور تطوير الحل وغسل لفترة وجيزة مع حل التوقف.
- تجاهل وقف غسل محلول واستبدالها مع محلول وقف جديدة. السماح لنقع لمدة 1 ساعة على الروك أو شاكر.
- غسل في المياه deionized، تصفية بين عشية وضحاها (ومع ذلك، يمكن تصوير هلام مباشرة بعد وقف غسل الحل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم الأزرق الألسيان ل وصمة عار GAGs كبريتيد 10; يتم تضخيم هذه الإشارة باستخدام بقعة فضية لاحقة 11. الشكل 1 يوفر عرضا مرئيا لعملية تطوير تلطيخ الفضة. كما هو موضح، يتم تضخيم الإشارة الزرقاء الألسيان تمثل GAGs مفصولة الكهربائي كما وكيل النامية تخترق هلام البولي أكريلاميد. عادة ، فإن عملية تطوير خفض الفضة وGAGs Alcian الأزرق الملطخة بطريقة تعتمد على الكثافة ، مع حواف كل الفرقة الحد أولا في حين أن المناطق الأكثر كثافة تلطيخ في المركز سوف وصمة عار الماضي.
في الأدبيات ، والحد المبلغ عنه من الكشف عن GAGs باستخدام النهج المستندة إلى الصفحة تتراوح بين 0.5-1 ميكروغرام12،13. لتحديد الحد الأقصى للكشف باستخدام نهجنا، تم تحميل كبريتات الهيبارين oligosaccharides من أطوال البوليمر المختلفة (الهيبارين غير المفرخ، dp20، dp10، dp6) على هلام البولي أكريلاميد 22٪، ثم ركض وملطخة كما هو موضح أعلاه. تم تحميل كل أوليغوساكاريد مرتين في كتلتين مختلفتين: 1.0 ميكروغرام و 0.5 ميكروغرام. الشكل 2 يوضح أن تقنيتنا يمكن أن تكشف بسهولة تامة 0.5 ميكروغرام من GAG المنقى. وتجدر الإشارة إلى أن الهيبارين غير المفرخ لم يتم اكتشافه بسهولة من بين أربعة أوليغوساكاريدات مختلفة تم اختبارها، ويرجع ذلك على الأرجح إلى توزيع أوسع لأحجام البوليمر التي تقلل في المقابل من كثافة كل نطاق على حدة.
لتقييم كفاءة تنقية GAG من العينات البيولوجية السائلة ، تم عزل GAGs من عينتين من الحمم الهوائية (BAL). كما هو مبين في الشكل 3، كانت العينة الأولى التي تم وضع علامة عليها على أنها A المستخدمة لعزل GAG 1 مل من سائل BAL الذي تم حصاده من فأر 24 ساعة بعد ذرف شحم الدهون داخل الرخش (LPS) (3 ملغ / كجم) ، الذي تم إعطاؤه للحث على سفك HS الظهارية الحويصلة 5. تمت إضافة 10 ميكروغرام من dp6 المتاحة تجاريا مباشرة إلى هذا السائل BAL لتكون بمثابة "ارتفاع في" السيطرة لتقييم فقدان GAGs خلال عملية العزل. وتألفت العينة الثانية التي تحمل علامة B من 10 مل من سائل BAL المجمع من 3 فئران تم إعطاؤها LPS داخل التراتشي (3 ملغم / كجم) قبل 24 ساعة ، دون ارتفاع GAG خارجي. تمت معالجة كلتا العينتين لعزل GAG في وقت واحد ، وتم الاحتفاظ بجميع الكسور ال 3 التي تم الاحتفاظ بها من عمود التبادل الأيوني ومعالجتها بشكل أكبر من أجل تحديد ما إذا كانت أي GAGs موجودة في كسور التقارب المنخفض والغسيل. تم تشغيل 2 ميكروغرام من dp20 و dp10 و dp6 heparan كبريتات oligosaccharides المشتراة تجاريا في هلام PAGE إلى جانب هذه العينات لتوفير مرجع لتقييم حجم GAGs HS نوعيا في كل جزء من الكسور ، بالإضافة إلى إشارة إلى مقارنة الكثافة مع التحكم "الارتفاع في" 10 ميكروغرام الذي خضع لعزل GAG.
لإثبات استخدام هذه التقنية على الأنسجة الصلبة ، تم عزل كبريتات الهيباران من قطعة 15 ملغ من رئة الماوس المجمدة كما هو موضح أعلاه. أثناء عملية العزل والتنقية، تم الاحتفاظ بكسر التقارب المنخفض (0.2 M NaCl) الذي تم شطبه من عمود التبادل الأيوني ومعالجته جنبا إلى جنب مع كسر التقارب العالي (2.7 M NaCl) وتشغيله على الجل(الشكل 4). 2 ميكروغرام من dp20 شراؤها تجاريا، dp10، و dp6 كبريتات الهيباران oligosaccharides تم تشغيلها جنبا إلى جنب مع هذه العينات لتوفير مرجع لحجم. كما يمكن أن نرى، أسفرت تجانس الرئة كله كمية وافرة من HS معزولة، مع أصغر شظايا تعادل تقريبا dp10 في الحجم. الإثراء النسبي لل Alcian الأزرق / الفضة وصمة عار متعطشا GAGs المحتوى في 2.7 M NaCl كسر يدل على أن كبريتات الهيباران يربط مع تقارب عالية لأعمدة التبادل الأيونية ويمكن أن يكون eluted قبالة العمود مع خصوصية عالية. أسفرت تجانس الرئة بأكمله عن كمية وافرة من كبريتات الهيباران المعزولة (2.7 M NaCl fraction)، مع أصغر الشظايا التي تساوي تقريبا dp10 في الحجم.
الشكل 1: عملية تطوير بقع الفضة. يتم تضخيم تلطيخ الأزرق الألسيان من الهيبارين غير المهتسر (UFH) أو أوليغوساكاريد (dp = درجة البلمرة) التي يفصلها الكهربائي عن طريق تلطيخ الفضة. من اليسار إلى اليمين: UFH، dp20، dp10، dp6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حساسية هلام البولي أكريلاميد وبقعة فضية للكشف عن كبريتات الهيباران. الهيباران كبريتات oligosaccharides من أطوال مختلفة (الهيبارين unfractionated الملقب UFH، dp20، dp10، dp6) كانت على هلام البولي أكريلاميد 22٪ وركض والفضة الملطخة. تم تحميل كل أوليغوساكاريد مرتين في كتلتين مختلفتين: 1.0 ميكروغرام (أقصى اليسار) و 0.5 ميكروغرام (النطاقات في أقصى اليمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:كفاءة تنقية GAG من العينات البيولوجية السائلة. GAGs معزولة عن اثنين من عينات الحمم الهوائية (BAL) ، وصفت هنا باسم "A" و "B" ، تم تشغيلها على هلام البولي أكريلاميد 22 ٪ والفضة الملطخة. تتكون العينة A من 1mL من السائل BAL حصادها من الماوس 24 ساعة بعد العلاج مع 3 ملغ / كغ من شحم الدهون داخل التراتشي (LPS). تمت إضافة 10 ميكروغرام إضافية من dp6 HS إلى هذه العينة كعنصر تحكم "ارتفاع في". تتكون العينة B من 10 مل من سائل BAL المجمع الذي تم جمعه من 3 فئران بعد 24 ساعة من إدارة LPS. تم تشغيل كل عينة جنبا إلى جنب مع كسور من عمود تبادل الأيونات مع إما مخفف ("غسل") أو تركيزات منخفضة من NaCl (0.2 M). 2 ميكروغرام من dp20 شراؤها تجاريا، dp10، و dp6 سلفات الهيباران oligosaccharides استخدمت كمراجع حجم (العصابات أقصى اليسار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:قياس حجم كبريتات الهيباران المعزولة والناقية من الرئة الماوس صحية. محتوى كبريتات الهيبارين معزولة وتنقية من 15 ملغ عينة المجمدة من الرئة معزولة عن فأر صحي وتشغيل على هلام البولي أكريلاميد 22٪. تم تهويد كبريتات الهيباران من عمود التبادل الأيوني إما بتركيزات منخفضة (0.2 M؛ كسر تقارب منخفض) أو تركيزات عالية (2.7 M، 16٪ محلول؛ كسر تقارب عال) من NaCl. 2 ميكروغرام من dp20 شراؤها تجاريا، dp10، و dp6 سلفات الهيباران oligosaccharides استخدمت كمراجع حجم (العصابات أقصى اليسار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ملاحظة: يجب تصفية كافة الحلول (0.22μm) قبل الاستخدام. | |||
| حل | وصفة | تكوين | التعليقات |
| حل هلام / غرفة السفلى تشغيل العازلة (2 لتر أو 4 لتر) | حمض البوريك، MW 61.83 | 2L: 12.36 غرام؛ 4L: 24.76 غرام | التركيز المطلوب: 0.1 م |
| قاعدة تريس، ميغاواط 124.14 | 2L: 24.2 غرام؛ 4L: | التركيز المطلوب: 0.1 م | |
| ديسوديوم EDTA MW 336.21 أو ديهيدرات، ميغاواط 372.36 | 2L: 6.7 غرام أو 7.4 غرام، على التوالي؛ 4L 13.4 غرام أو 14.8 غرام، على التوالي | التركيز المطلوب: 0.01 م | |
| المياه المؤينة | 2L أو 4L | ضبط درجة الحموضة إلى 8.3 بعد حل الكواشف بالكامل | |
| غرفة علوية تعمل بحاجز (1 لتر) | غليسين | 93 غرام | التركيز المطلوب: 1 م |
| قاعدة تريس، ميغاواط 124.14 | 24.2 غرام | التركيز المطلوب: 0.2 م | |
| المياه المؤينة | 1 لتر | ||
| حل هلام، 22٪ مجموع الأكريلاميد (500mL) | أكريلاميد، MW 71.08 | 100.1 غرام | التركيز المطلوب: 20.02٪ ث/v |
| N,N'methylene-bis-أكريلاميد (مكررا، ميغاواط 154.17) | 10 غ | التركيز المطلوب: 2٪ ث/v | |
| سكروز | 75 غرام | التركيز المطلوب: 15٪ ث/v | |
| حل المخزن المؤقت الهلامي | 500 مل | يصل إلى إجمالي حجم 500 مل؛ سيتطلب أقل من 500 مل من إجمالي المخزن المؤقت | |
| حل هلام، 15٪ مجموع الأكريلاميد (400mL) | أكريلاميد، MW 71.08 | 56.3 غرام | التركيز المطلوب: 14.08٪ ث/v |
| N,N'methylene-bis-أكريلاميد (مكررا، ميغاواط 154.17) | 3.7 غرام | التركيز المطلوب: 2٪ ث/v | |
| سكروز | 20.8 غرام | التركيز المطلوب: 15٪ ث/v | |
| حل المخزن المؤقت الهلامي | 400 مل | يصل إلى إجمالي حجم 400 مل؛ سيتطلب أقل من 400mL من إجمالي المخزن المؤقت | |
| جل التراص (100 مل) | أكريلاميد، MW 71.08 | 4.75 غرام | التركيز المطلوب: 4.75٪ ث/v |
| N,N'methylene-bis-أكريلاميد (مكررا، ميغاواط 154.17) | 0.25 غرام | التركيز المطلوب: 0.25٪ ث/v | |
| حل المخزن المؤقت الهلامي | 100 مل | إضافة 80mL العازلة والكواشف حل كامل. ثم ضبط درجة الحموضة إلى 76.3 مع حمض الهيدروكلوريك، دروبوايز. ثم جلب إلى حجم إجمالي قدره 100 مل مع حل هلام العازلة. | |
| عينة تحميل المخزن المؤقت (500 مل) | سكروز | 250 غرام | التركيز المطلوب: 50٪ ث/v |
| فينول الأحمر | 500 ملغ | التركيز المطلوب: 1mg/mL | |
| بروموفينول الأزرق | 250 ملغ | التركيز المطلوب: 0.5mg/mL | |
| المياه المؤينة | 500 مل | يصل إلى إجمالي حجم 500 مل؛ سيتطلب أقل من 500 مل من إجمالي المياه | |
| الهيبارين مشتق أوليغوساشاريد 'سلم' (2mL لكل منهما) | dp6 | 0.1 ملغ | ملاحظة: يوصي باستخدام الهيبارين مشتق oligosaccharides 6 وحدات فرعية البوليمر في الطول (ويعرف أيضا باسم درجة البلمرة 6، أو dp6) لأصغر الفرقة، dp20 لأكبر الفرقة، و dp10 للفرقة الوسطى. ومع ذلك، يمكن استخدام تركيبات أخرى إذا رغبت في ذلك. التركيز المطلوب: 0.05 ملغم/مل |
| dp10 | 0.1 ملغ | ||
| dp20 | 0.1 ملغ | ||
| المياه المؤينة | 3 مل | حل كل أوليغوساكريد في أنابيب منفصلة مع 1mL لكل منهما | |
| عينة تحميل المخزن المؤقت | 3 مل | إضافة 1mL (1:1 خليط) إلى كل محلول أوليغوساكاريد | |
الجدول 1: الحلول اللازمة لداء إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد من الجليكوسامينوغليكانات النقية. يجب تصفية كافة الحلول (0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام.
| ملاحظة: يجب تصفية كافة الحلول (0.22μm) قبل الاستخدام. | |||
| حل | وصفة | تكوين | التعليقات |
| محلول تلطيخ أزرق ألسيان (500 مل) | ألسيان الأزرق 8GX مسحوق | 2.5 غ | التركيز المطلوب: 0.5٪ ث/v |
| 2٪ v/v حمض الخليك الجليدي | 500 مل | ||
| بقعة فضية (200 مل) | المياه المؤينة | 192.7 مل | إعداد محلول وصمة عار جديدة; استخدامها في غضون أسبوع واحد. |
| هيدروكسيد الصوديوم 7.6M | 2 مل | لجعل، إضافة 3.04 غرام من الكريات هيدروكسيد الصوديوم إلى 10 مل من الماء | |
| هيدروكسيد الأمونيوم | 3.3 مل | ||
| 4M محلول نترات الفضة | 2 مل | لجعل، إضافة 3.397 غرام نترات الفضة إلى 5 مل من الماء. إضافة dropwise أثناء التحريك لتجنب هطول الأمطار. | |
| تطوير الحل (501 مل) | المياه المؤينة | 500 مل | يجب أن يتم تطوير حل جديدة واستخدامها في غضون 24 ساعة. |
| 2.5٪ ث/v حمض الستريك | 1 مل | لجعل, إضافة 100mg إلى 4 مل ماء deionized. حمض الستريك يجب أن يصنع طازجا | |
| فورمالدهيد | 250 ميكرولتر | ||
| حل الإيقاف (500 مل) | المياه المؤينة | 300 مل | |
| حمض الخليك الجليدي | 20 مل | ||
| ميثانول | 90 مل | ||
الجدول 2: الحلول اللازمة لتلطيخ الفضة من الجليكوسامينوغليكان مفصولة بالكهروفلوريس هلام البولي أكولاميد. يجب تصفية كافة الحلول (0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تلعب مجموعات GAGs دورا مركزيا في العديد من العمليات البيولوجية المتنوعة. واحدة من الوظائف الرئيسية لغاغات كبريتات (مثل HS و CS) هو التفاعل مع وربط ليغاندس، والتي يمكن أن تغير وظائف الإشارات المصب. محدد مهم لتقارب GAG ملزمة لgnate ligands هو طول سلسلة البوليمر GAG 8،9،14. ولهذا السبب، من المهم للباحثين أن يكونوا قادرين على تحديد حجم سلاسل GAG المعزولة عن العينات البيولوجية ذات الاهتمام بدقة معقولة. وينبغي أن تكون هذه التقنية، لكي تكون عملية، قادرة على القيام بها باستخدام معدات المختبرات والكواشف الشائعة.
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وتنقية GAGs من العينات البيولوجية ، لفصلها حسب الحجم عبر PAGE ، وتصورها باستخدام تقنية تلطيخ الأزرق والفضة Alcian. في حين أن هناك عدة طرق لفصل الجليكوسامينوغليكانات حسب الحجم، نهجنا لديه العديد من نقاط القوة الخاصة بتطبيق هذه التقنية في مختبرات علوم الحياة. أولا، مع حد للكشف عن 0.5 ميكروغرام، هذه التقنية حساسة للغاية في الكشف عن GAGs ذات الأهمية. في تجربتنا، حتى العينات التي تحتوي على تركيزات منخفضة نسبيا من GAGs (أي عينات السائل BAL) ينبغي أن تسفر عن أكثر من كافية GAG للكشف باستخدام هذه الطريقة. في حين أن العائد من عزل وتنقية السائل BAL سوف تختلف حسب التقنية و GAG محددة من الفائدة، فقد كانت تجربتنا أن 10 مل من السائل الخام BAL تسفر عن HS كافية لتكون قابلة للكشف باستخدام هذه التقنية. العائد من الأجهزة الصلبة هو أعلى بكثير, اعتمادا على الأنسجة التي تم حصادها, ولكن تجربتنا أن عينة صلبة الأولية من 10 ملغ سوف تسفر عن HS وافرة للكشف باستخدام هذه التقنية.
من المهم ملاحظة أن التصوير النهائي لهلام PAGE الملون سيختلف وفقا لتقنيات التصوير المتاحة للمستخدم النهائي. ويمكن التقاط صور رقمية للجل باستخدام عدد من الأنظمة المختلفة، بما في ذلك العديد من أنظمة وثائق الجل المتاحة تجاريا أو كاميرا تجارية عادية، اعتمادا على المعدات المتاحة وحساسية الكشف المطلوبة (تمليها عادة كمية العينة المحملة على الجل). وتجدر الإشارة أيضا إلى أن مصدر الضوء المطلوب لتصوير هذا الجل رقميا قد يختلف باختلاف كثافة العينة ومقدار وقت التطوير المطلوب أثناء عملية التلطيخ. المواد الهلامية التي تتطور بسرعة وتنتج عصابات ملطخة بالفضة مرئية بسهولة بالعين المجردة سوف تتطلب نقل الأشعة فوق البنفسجية للحصول على أفضل الصور، كما سيتم امتصاص معظم الضوء من قبل الأزرق الألسي غير منقحة. المواد الهلامية التي تتطلب فترات تطوير أطول (مثل تلك التي تحتوي على كميات صغيرة جدا من العينة) سوف تتطلب إما الإضاءة epi أو transillumination مع ضوء الطيف الكامل العادي، كما سيتم امتصاص هذا أفضل من قبل وصمة عار الفضة.
وهناك قوة أخرى لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكيف بشكل خاص مع مختبرات علوم الحياة ، نظرا لأساسها في تكنولوجيا PAGE البسيطة ، باستخدام المعدات والكواشف المتاحة عادة والتي يتم الحصول عليها بأسعار رخيصة. في حين أن هناك نهج أخرى لقياس طول البوليمرات GAG معزولة (على سبيل المثال، الكهربائي الشعري)، فإنها تتطلب عادة كل من المعرفة والمعدات التي ليست متاحة عادة في معظم مختبرات علوم الحياة15،16. بساطة هذا النهج وطبيعة معقولة نسبيا ومتاحة من الكواشف المطلوبة يجعل هذه التقنية قابلة للتكيف بسهولة من قبل الباحثين علوم الحياة المهتمين في دراسة البيولوجيا GAG في سياق الحقول الفرعية معينة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية بمثابة تكملة أساسية للتقنيات القائمة على قياس الطيف الكتلي للكشف عن GAGs في الأنسجة البيولوجية. في حين أن النهج القائمة على قياس الطيف الكتلي قادرة على الكشف عن GAGs مع حساسية عالية وتمييز الاختلافات الدقيقة في الهيكل من العينات المعقدة17، نظرا لطبيعة التكنولوجيا أنها ليست قادرة على التمييز بين البوليمرات GAG من حيث الحجم. لهذا السبب ، فإن النهج القائم على PAGE ضروري للكشف عن حجم البوليمرات HS في العينات البيولوجية ذات الاهتمام.
ومن المهم ملاحظة أن هناك عدة قيود على التقنيات الموصوفة في هذه الورقة. الأول والأكثر بروزا هو أنه بسبب التفاعل بين الشحنة والتهمة التي تعتبر مركزية لرد فعل تلطيخ الأزرق الألسي ، فإن هذا النهج انتقائي للغاية بالنسبة ل GAGs عالية الكبريت ولن يؤدي إلا إلى وصمة ضعيفة أكثر مويتات مشحونة بشكل محايد (على سبيل المثال ، حمض الهيالورونيكس18). وبالتالي ، من المرجح أن تؤدي هذه التقنية إلى تحيز نتائجها نحو moieties GAG أكثر حمضية. ولهذا السبب، ينبغي استخدام النهج التكميلية لقياس محتوى GAG في العينات البيولوجية ذات الأهمية (مثل التقنيات القائمة على قياس الطيف الكتلي) بشكل مساعد لتوفير صورة أكثر اكتمالا عن مجموعات GAGs الموجودة في العينات التجريبية. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للمستخدمين النهائيين المهتمين على وجه التحديد في قياس حجم hyaluronan، وقد وصف آخرون تقنيات مماثلة على أساس الصفحة التي تستفيد بروتين حمض الهيالورونيكس البيوتينيلية ملزمة (HABP) والتي قد تكون قابلة للتكيف مع التقنية الأساسية الموصوفة هنا19.
باختصار، يمكن استخدام التقنية المعروضة في هذه المقالة لعزل وتنقية واكتشاف GAGs من العينات البيولوجية بقدر كبير من الحساسية و التحديد وكذلك لقياس الطول الأصلي لهذه السلاسل البوليساكريد. يمكن أن تكون هذه المعلومات حاسمة لاختبار الفرضيات حول تفاعلات GAG-ligand بسبب أهمية طول البوليمر GAG في تحديد تقارب الربط ليغاند cognate. هذا النهج له العديد من المزايا ، وأبرزها بساطته النسبية والقدرة على التكيف مع مختبرات أبحاث علوم الحياة ، على الرغم من أنه محدود بسبب تحيزه النسبي نحو MOIETIES GAG المشحونة سلبا. على الرغم من هذا العيب ، تمثل هذه التقنية أداة قوية من شأنها أن تشجع المحققين على دراسة دور GAGs في التوازن والأمراض العضوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل F31 HL143873-01 (WBL) ، R01 HL125371 (RJL و EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
