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Developmental Biology

मानव पूर्व वीवो घाव मॉडल और पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण सही त्वचा की मरंमत का मूल्यांकन करने के लिए

Published: February 17, 2021 doi: 10.3791/62326
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Atherothrombosis and Metabolic Disease, Hull York Medical School, University of Hull

Summary

यहां हम एक पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण के साथ संयुक्त पूर्व वीवो मानव त्वचा का उपयोग कर घाव की मरंमत का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित तकनीक प्रदर्शित करता है । यह पद्धति संभावित घाव उपचारों के मूल्यांकन के लिए एक पूर्व-नैदानिक मंच प्रदान करती है।

Abstract

क्रोनिक गैर-उपचार घाव, जो मुख्य रूप से बुजुर्गों और मधुमेह को प्रभावित करते हैं, नैदानिक अपूरित आवश्यकता का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र हैं। दुर्भाग्य से, वर्तमान पुराने घाव उपचार अपर्याप्त हैं, जबकि उपलब्ध पूर्व नैदानिक मॉडल खराब नए उपचारों की नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करते हैं। यहां हम मानव त्वचा की मरम्मत प्रतिक्रिया के कई पहलुओं का आकलन करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट, प्री-क्लीनिकल मॉडल का वर्णन करते हैं। आंशिक मोटाई घाव मानव पूर्व वीवो त्वचा में बनाए गए थे और एक उपचार समय पाठ्यक्रम में सुसंस्कृत थे। त्वचा घाव बायोप्सी पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया के लिए फिक्सेटिव में एकत्र किए गए थे। फिक्स्ड नमूनों को अवरुद्ध किया गया था और प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसमें फ्लोरोसेंटली संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के माध्यम से प्राप्त पता लगाया गया था। प्रत्येक बायोप्सी में प्रतिशत घाव बंद होने (पुनः-एपीथेलिलाइजेशन) की गणना करने से पहले घावों को जवाबी दाग दिया गया था और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से चित्रित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को लागू करने, हमें पता चलता है कि स्वस्थ दाता त्वचा में बनाए गए 2 मिमी एक्ससिओनल घावों को 4-5 के बाद घायल होने के बाद पूरी तरह से फिर से एपिथेलाइज्ड किया जाता है। इसके विपरीत, मधुमेह त्वचा के घावों की बंद करने की दर काफी कम हो जाती है, बेफिक्र बाधा सुधार के साथ। मानव त्वचा को एक उपन्यास पूरे-माउंट धुंधला दृष्टिकोण के साथ घायल करने के संयोजन से पूर्व वीवो घाव की मरम्मत की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तेजी से और प्रजनन योग्य विधि की अनुमति देता है। सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल संभावित घाव उपचारों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने, पूर्व-नैदानिक परीक्षण और सत्यापन को बदलने के लिए एक मूल्यवान मानव मंच प्रदान करता है।

Introduction

क्रोनिक, गैर-उपचार घाव, जो बुजुर्गों और मधुमेह में अत्यधिक प्रचलित हैं, नैदानिक अपूरित आवश्यकता का एक प्रमुख रूप से सराहना क्षेत्र हैं। ये घाव रोगियों के लिए एक बड़ा शारीरिक और मनोवैज्ञानिक बोझ प्रस्तुत करते हैं और 1 के इलाज के लिए हर साल स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं को अरबों खर्चकरतेहैं । घाव जीव विज्ञान और प्रौद्योगिकी में प्रगति की बेहतर समझ के बावजूद, पुराने घावों का 40% तक अभी भी सबसे अच्छा मानक देखभाल2के बाद ठीक करने में विफल रहता है। इस प्रकार, मधुमेह पैर अल्सर के साथ रोगियों के 14-26% बाद में विच्छेदन3की आवश्यकता होती है, जबकि 5 साल के बाद विच्छेदन मृत्यु दर लगभग 70%4पर खड़ा है। नतीजतन, खराब चिकित्सा घावों द्वारा लगाए गए पर्याप्त स्वास्थ्य देखभाल बोझ को कम करते हुए जीवन की रोगी की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए प्रभावोत्पादक नए उपचार विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है। खराब भविष्य कहनेवाला पूर्व नैदानिक मॉडल प्रभावी नए उपचारों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बने हुए हैं।

घाव की मरम्मत एक गतिशील और बहुमुखी प्रक्रिया है जिसमें सेल प्रकारों की विविध श्रृंखला, संचार के अनगिनत स्तर और एक ऊतक वातावरण शामिल है जिसे अस्थायी रूप से फिर से तैयार किया गया है। त्वचा उपचार चार प्रमुख रिपारेटिव चरणों पर टिकी है: हेमोसेसिस, सूजन, प्रसार और मैट्रिक्स रीमॉडलिंग। ये चरण अंततः रक्त हानि और संक्रमण को रोकने के लिए कार्य करते हैं, घाव की सतह (एक प्रक्रिया को फिर से एपिथेलिलाइजेशन कहा जाता है) को बंद कर देते हैं और त्वचा को एक अघायल राज्य5में वापस कर देते हैं। पुराने घाव विविध एटियोलॉजी और उपचार प्रक्रियाओं के लिए व्यापक क्षोभ के साथ जुड़े रहे हैं6,आगे चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान उलझी हुई है । फिर भी, घाव विकृति के आणविक और सेलुलर ड्राइवरों को स्पष्ट करने और नए चिकित्सीय दृष्टिकोण7का परीक्षण करने के लिए मॉडलों की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित की गई है।

सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला घाव मरम्मत मॉडल माउस में तीव्र घायल है। चूहे मशीनी अध्ययन के लिए अत्यधिक पथिक होते हैं और वृद्धावस्था औरमधुमेहके मान्य मॉडल प्रदान करते हैं । माउस और मानव चिकित्सा के बीच दिखाई गई सामान्य समानताओं के बावजूद, त्वचा संरचना और उपचार गतिशीलता में प्रजातियों के बीच अंतर रहते हैं। इसका मतलब यह है कि अधिकांश मुरीन घाव अनुसंधान आसानी से क्लिनिक9में अनुवाद नहीं करता है। नतीजतन, उच्च प्रयोज्यता और अनुवादशीलता10, 11के साथ मानव इन विट्रो और पूर्व वीवो प्रणालियों की ओर एक धक्का दिया गया है ।

यहां हम पूर्व वीवो मानव त्वचा में आंशिक मोटाई उत्तेजना घावों के प्रदर्शन के लिए एक गहन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम पूर्व वीवो मानव त्वचा उपचार का मूल्यांकन करने की एक अत्यधिक प्रजनन विधि के रूप में हमारे पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण को भी रेखांकित करते हैं। हम एपिडर्मल रिपेयर (री-एपिथेलिलाइजेशन) और बाद में बाधा गठन के प्रक्षेपवक्र को दिखाते हैं, जो स्वस्थ बनाम मधुमेह मानव त्वचा में घाव बंद होने की दर का मूल्यांकन करते हैं। अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि चिकित्सा प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए एंटीबॉडी की एक श्रृंखला के साथ उपयोग के लिए पूरे माउंट धुंधला कैसे अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

मानव त्वचा कैसल हिल अस्पताल और पतवार रॉयल इनफर्मरी (पतवार, ब्रिटेन) में पूर्ण सूचित, लिखित रोगी सहमति, संस्थागत दिशा निर्देशों, और नैतिक अनुमोदन (LRECs: 17/SC/0220 और 19/NE/0150) के तहत पुनर्निर्माण सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया गया था । गैर मधुमेह त्वचा नियमित सर्जरी (मतलब आयु = ६८) के दौर से गुजर रोगियों से एकत्र किया गया था । मधुमेह त्वचा दानदाताओं जो प्रकार द्वितीय मधुमेह और अल्सर का एक इतिहास (मतलब आयु = ८१) की स्थापना की थी से चुना गया था । सर्जरी से नमूनों को मीडिया को पकड़ने में ले जाया गया और प्रयोगशाला में पहुंचने पर तुरंत कार्रवाई की गई । एक वर्ग द्वितीय लैमिनार फ्लो बायोसेफ्टी कैबिनेट में बायोसेफ्टी लेवल-2 (बीएसएल-2) में अनिर्धारित मानव ऊतक का उपयोग करने वाले सभी प्रायोगिक कदम किए गए थे।

1. त्वचा संस्कृति मीडिया और धुंधला अभिकर् ता की तैयारी

नोट: सभी अभिकर्ण और उपभोग्य विवरण सामग्री की तालिका में प्रदान किए जाते हैं। सुनिश्चित करें कि मानव ऊतक की प्रसंस्करण और संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्दक और उपकरण बाँझ हैं। उपयोग से पहले उपकरणों को स्टरलाइज करें और ऊतक के साथ संपर्क के बाद कीटाणुनाशक के साथ दूषित करें। निपटान से पहले अपशिष्ट उत्पादों को 1% कीटाणुनाशक में दूषित करें।

  1. होल्डिंग मीडिया: 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 4% (v/v) एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ उच्च ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) को पूरक करें।
  2. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ हांक का संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस): एचबीएसएस में 4% (v/v) एंटीबायोटिक-एंटीमायकोटिक समाधान जोड़ें। उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. दुल्बेको का फॉस्फेट बफर नमकीन (डीपीबीएस): प्रति लीटर आसुत पानी (डीएच2ओ) को भंग करके डीपीबीएस तैयार करें। उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टरलाइज और स्टोर करने के लिए ऑटोक्लेव।
  4. मानव त्वचा विकास मीडिया: 2 m L-ग्लूटामाइन, 1% (v/v) एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान और 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम का पूरक। उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. त्वचा फिक्स्डिव: डीएच2ओ के 450 एमएल में फॉर्मेल्डिहाइड सॉल्यूशन की 40 एमएल, हिमनदों का 10 एमएल एसिटिक एसिड, 4.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड और 0.25 ग्राम एल्किलट्राइमेथालाममोनियमेनियम ब्रोमाइड जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें और कुछ दिनों के भीतर उपयोग करें।
    सावधानी: फिक्सेटिव खतरनाक (अड़चन और ज्वलनशील) है। देखभाल के साथ संभाल और एक उपयुक्त मार्ग के माध्यम से निपटाने।
  6. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस): फॉस्फेट बफर समाधान के 100 मिलीएल और डीएच2ओ के 900 मिलीएल में 6 ग्राम सोडियम क्लोराइड जोड़कर पूरे माउंट धुंधला के लिए पीबीएस तैयार करें।
  7. स्टेनिंग वॉश बफर: पीबीएस में 0.5% (v/v) ट्राइटन एक्स-100 को भंग करें।
  8. ब्लॉकिंग बफर: धुंधला धोने बफर के लिए ०.२% (w/v) सोडियम azide और 2% (v/v) पशु सीरम जोड़ें । दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी मेजबान प्रजातियों के सीरम में ब्लॉक करें। सोडियम एजाइड इनक्यूबेशन के दौरान बैक्टीरियल ग्रोथ को रोकेगा।
  9. DAPI वर्किंग सॉल्यूशन: डिमेथिल सल्फॉक्साइड में 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिलडोल (डीएपीआई) का 5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक तैयार करें। एक 5 μg/mL DAPI काम समाधान देने के लिए धुंधला धोने बफर में शेयर 1:1,000 पतला ।
  10. पेरोक्सिडेज ब्लॉक: धुंधला धोने बफर के लिए 0.3% (v/v) हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ें। उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अपघटन को रोकने के लिए अंधेरे में रखें।
  11. एबीसी-एचआरपी किट:
    1. एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी: धुंधला बफर के 5 एमएल में बायोटिनाइलेटेड खरगोश विरोधी बकरी आईजीजी की 1 बूंद। दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: किट/माध्यमिक इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों पर निर्भर करेगा ।
    2. एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) रिएजेंट: 5 एमएल में रिएजेंट ए की 2 बूंदें और 2 बूंदें रिएजेंट बी की। एबीसी रिएजेंट को उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट तैयार किया जाना चाहिए। दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  12. पेरोक्सिडेज सब्सट्रेट: रिएजेंट 1 की 3 बूंदें, रिएजेंट 2 की 2 बूंदें, रिएजेंट 3 की 2 बूंदें और डीएच 2 ओ पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट के 5 एमएल में हाइड्रोजन पेरोक्साइड की2बूंदें उपयोग से तुरंत पहले ताजा तैयार की जानी चाहिए और संग्रहीत नहीं किया जा सकता है।

2. घायल करने के लिए त्वचा की तैयारी

नोट: ये कदम द्वितीय वर्ग के लेमिनार प्रवाह जैवसेफ्टी कैबिनेट में किए जाने चाहिए।

  1. बीएसएल-2 कैबिनेट के लिए मीडिया और परिवहन रखने में त्वचा ले लीजिए।
  2. त्वचा डर्मिस साइड को 90 मिमी बाँझ पेट्री डिश के भीतर नीचे रखें और बाँझ कैंची के साथ एडीपोज़ ऊतक को हटा दें।
  3. त्वचा को 50 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें एचबीएसएस की 25 एमएल की एंटीबायोटिक्स के साथ आरटी में 10 मिनट तक रखें। किसी भी अवशिष्ट रक्त और एडीपोज टिश्यू को हटाने के लिए रुक-रुक कर हिलाएं।
  4. एक नई 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करके चरण 2.3 दोहराएं।
  5. त्वचा को एचबीएसएस के 25 एमएल युक्त ताजा 50 एमएल ट्यूब में रखें, इस बार बिना एंटीबायोटिक्स के 10 मिनट के लिए आरटी शेक में स्टेप 2.3 के रूप में मिलाएं।
  6. डीपीबीएस के 25 एमएल के साथ एक नई ट्यूब में त्वचा रखकर एक अंतिम त्वचा कुल्ला प्रदर्शन करें। त्वचा अब घाव करने के लिए तैयार है।

3. पूर्व वीवो मानव त्वचा घावों का निर्माण

नोट: ये कदम द्वितीय वर्ग के लेमिनार प्रवाह जैवसेफ्टी कैबिनेट में किए जाने चाहिए।

  1. घायल होने से पहले त्वचा संस्कृति व्यंजन तैयार करें। एक 60 मिमी पेट्री डिश में, दो बाँझ शोषक पैड ढेर और पकवान के पक्ष के माध्यम से मानव त्वचा मीडिया के 4 एमएल जोड़ें। शोषक पैड स्टैक पर एक बाँझ नायलॉन फिल्टर झिल्ली रखें।
    नोट: त्वचा मीडिया आवश्यक उपचार की स्थिति के आधार पर बदला जा सकता है। प्रत्येक स्टैक पर तीन घाव के पौधों को सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  2. अवशिष्ट डीपीबीएस को हटाने के लिए 90 मिमी पेट्री डिश में बाँझ धुंध पर त्वचा के डर्मल साइड को सुखाएं।
    नोट: यह त्वचा को घायल होने पर चारों ओर फिसलने से रोकता है।
  3. त्वचा डर्मिस साइड को एक साफ 90 मिमी पेट्री डिश ढक्कन पर रखें और ताजा बाँझ धुंध के साथ एपिडर्मिस सूखी को डब करें।
    नोट: आधार की तुलना में पेट्री डिश ढक्कन में त्वचा को घाव करना आसान है। त्वचा को सूखने से रोकने के लिए बाद का काम जल्दी से किया जाना चाहिए।
  4. त्वचा को तना हुआ पकड़े हुए, त्वचा के खिलाफ 2 मिमी बायोप्सी पंच दबाएं और धीरे-धीरे मोड़ें। त्वचा के माध्यम से पूरी तरह से पंच न करें।
    नोट: आंशिक मोटाई घावों को एपिडर्मिस के माध्यम से और आंशिक रूप से डर्मिस में पंच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। आंशिक मोटाई घाव बनाने के लिए आवश्यक बल में दाता-से-दाता और साइट-टू-साइट परिवर्तनशीलता हो सकती है।
  5. घुमावदार दांतेदार ऊतक संदंश का प्रयोग करें 2 मिमी घाव के प्रत्येक पक्ष को लेने के लिए और 2 मिमी घाव के नीचे घुमावदार आईरिस कैंची हुक इसे समान रूप से काटने के लिए।
  6. केंद्र में आंशिक मोटाई 2 मिमी घाव के साथ 6 मिमी एक्सप्लांट बनाने के लिए 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके केंद्रीय 2 मिमी घाव के आसपास बायोप्सी।
    नोट: त्वचा को स्कोर करने के लिए 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग किया जा सकता है जहां प्रत्येक 2 मिमी घाव होना चाहिए। ऊतक के माध्यम से पूरी तरह से छेदन न करें। बर्बादी को कम करने के लिए हनीकॉम्ब पैटर्न में घाव के एक्सप्लांट बनाएं।
  7. नायलॉन फिल्टर झिल्ली ढेर (चरण 3.1 में तैयार) पर घाव एक्सप्लांट एपिडर्मिस साइड रखें।
    नोट: घाव के पौधों को संभालते समय, सावधान रहें कि केंद्रीय घाव को नुकसान न पहुंचाएं। छोटे संदंश का उपयोग करें और विपरीत पक्षों पर प्रत्येक एक्सप्लांट उठाएं।
  8. 1-7 दिनों के लिए आर्द्र वातावरण (90-95%) में 32-37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर घावों को इनक्यूबेट करें। हर 2-3 दिन में मीडिया को बदलें।

4. पूर्व वीवो घावों के पूरे माउंट धुंधला

नोट: यह खंड इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इम्यूनोपेरोक्सीडास धुंधला तरीकों का वर्णन करता है। उपयोग से पहले सभी अभिकर् ती को अच्छी तरह मिलाएं।

  1. फ्लोरोसेंट धुंधला विधि
    1. रात 4 डिग्री सेल्सियस पर त्वचा फिक्सेटिव और इनक्यूबेट के 500 माइक्रोल युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में घाव एक्सप्लांट ्स लीजिए।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला फिक्सेटिव वर्णित एंटीबॉडी के लिए अच्छी तरह से काम करता है। अन्य एंटीबॉडी के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। 24 घंटे से अधिक समय तक ऊतक निर्धारण से अधिक निर्धारण हो सकता है।
    2. अगले दिन फिक्सेटिव को हटा दें और 1 एमएल स्टेनिंग वॉश बफर के साथ बदलें। बायोप्सी को धुंधला करने से 2 सप्ताह पहले तक 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला धोने बफर में संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: सभी धोने बफर चरणों के लिए, घाव को नुकसान न पहुंचाने के लिए ध्यान रखते हुए, एक सीरोलॉजिकल पिपेट या पिपेट टिप का उपयोग करें।
    3. धुंधला धोने बफर को एस्पिरेट करें और 1 एमएल धुंधला धोने बफर के साथ एक और कुल्ला करें।
    4. चरणों के लिए आवश्यक बफर को अवरुद्ध करने की मात्रा की गणना करें 4.1.5-4.1.6 (नमूनों की संख्या x 300 μL = μL में बफर को अवरुद्ध करने की राशि)। जरूरत पड़ने पर अतिरिक्त बफर बनाएं।
    5. प्रत्येक नमूने में बफर को अवरुद्ध करने और आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग बफर के 150 माइक्रोन जोड़ें। सभी धुंधला चरणों के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना पर्याप्त रूप से कवर किया गया है और बायोप्सी घाव की सतह को कवर करने वाले कोई बुलबुले नहीं हैं।
      नोट: यह कदम आगे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में या 48 अच्छी प्लेट में किया जा सकता है। यदि एक 48 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर, घावों को प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे चेहरा इनक्यूबेट।
    6. शेष अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
      नोट: बफर को रोकने में एंटी-माउस केराटिन 14 (K14) पतला 1:1,000 अच्छी तरह से काम करता है। अन्य एंटीबॉडी या कई जांच के साथ उपयोग के लिए इस चरण का अनुकूलन करें।
    7. अवरुद्ध बफर को एस्पिरेट करें और 150 माइक्रोल प्राथमिक एंटीबॉडी प्रति अच्छी तरह से जोड़ें/ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी में घाव निकालता है।
    8. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें और आरटी (प्रति नमूना 500 माइक्रोल) में 1 एच के लिए 0.2% सोडियम एजाइड युक्त धुंधला धोने बफर में कुल्ला करें।
    9. धुंधला धोने बफर (30 मिनट प्रति वॉश, प्रति नमूना 500 μL) का उपयोग करके तीन और कुल्ला चरणों का प्रदर्शन करें।
    10. धुंधला धोने बफर में फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी माउस 488 1:400 कमजोर पड़ने पर)।
    11. माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यक मात्रा की गणना करें (नमूनों की संख्या x 150 μL = राशि μL में)।
    12. प्रत्येक अच्छी तरह से/माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में माध्यमिक एंटीबॉडी के 150 माइक्रोल जोड़ें। आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन चरणों में प्रदर्शन करें 4.1.10 - 4.1.16 अंधेरे में क्योंकि द्वितीयक एंटीबॉडी प्रकाश संवेदनशील है।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो यह चरण रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जा सकता है। पर्याप्त संकेत और सीमित पृष्ठभूमि धुंधला के लिए आवश्यक माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता का अनुकूलन करें।
    13. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और धुंधला धोने बफर (प्रति नमूना 500 μL) के साथ 3 x 30 मिनट कुल्ला प्रदर्शन करते हैं।
    14. बचे हुए वॉश बफर को छोड़ दें और आवश्यक DAPI वर्किंग सॉल्यूशन की मात्रा की गणना करें (चरण 4.1.11 के अनुसार)।
    15. आरटी में 10 मिनट के लिए DAPI काम समाधान के 150 माइक्रोन के साथ प्रत्येक एक्सप्लांट काउंटर्स।
      नोट: DAPI कोशिका नाभिक नीले दाग होगा। Hoechst डाई DAPI के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    16. धुंधला धोने बफर (नमूना प्रति 500 μL) के साथ दो अंतिम 30 मिनट धोते प्रदर्शन करते हैं। बायोप्सी इमेजिंग से दो सप्ताह पहले तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला धोने बफर में संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. ब्राइटफील्ड धुंधला विधि।
    1. चरण 4.1.1 - 4.1.3 प्रदर्शन करें।
    2. रात 4 डिग्री सेल्सियस पर पेरोक्सिडेस ब्लॉक के साथ एंडोजेनस पेरोक्सिडेस गतिविधि को बुझाें।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है जब एक HRP-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए ऊतक से गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला कम । अत्यधिक संवहनी ऊतक में अधिक अंतर्जात पेरोक्सिडास गतिविधि होगी।
    3. पेरोक्सिडेज ब्लॉक को छोड़ दें और स्टेनिंग वॉश बफर में 30 मिनट के लिए दो बार कुल्ला करें।
    4. चरण 4.1.4 - 4.1.8 प्रदर्शन करें।
      नोट: कदम 4.1.7 के बाद धोता नमूनों से सोडियम अजीमाइड को हटाने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। यदि सोडियम एजाइड को पर्याप्त रूप से हटाया नहीं जाता है, तो यह एचआरपी को निष्क्रिय कर देगा और धुंधला पता लगाने में हस्तक्षेप करेगा।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से/माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 150 माइक्रोनल एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और आरटी में 4 डिग्री सेल्सियस या 1 घंटे पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    6. सेकेंडरी एंटीबॉडी निकालें और धुंधला वॉश बफर में 3 x 30 मिनट वॉश करें।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से/माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 150 माइक्रोल एबीसी रिएजेंट जोड़ें और आरटी में 4 डिग्री सेल्सियस या 1 घंटे में रात भर इनक्यूबेट करें।
    8. एबीसी रिएजेंट को एस्पिरेट करें और स्टेनिंग वॉश बफर में 3 x 30 मिनट वॉश करें।
    9. एक एक्सप्लांट में 150 माइक्रोन पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट जोड़ें और एक ध्यान देने योग्य रंग परिवर्तन का पता लगाने के लिए आवश्यक समय निर्धारित करें।
      नोट: एक नमूना चुनें जहां मजबूत धुंधला होने की उम्मीद है। इस मामले में, माइग्रेट एपिडर्मिस (K14) दिखाने के लिए एक लाल अंगूठी। 3,3'-डाइमिनोबेन्ज़िडीन-4, या किसी अन्य उपयुक्त क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग इस पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट के प्रतिस्थापन के रूप में किया जा सकता है।
    10. एक बार रंग परिवर्तन देखे जाने के बाद, पेरोक्सिडास सब्सट्रेट को हटा दें, और डीएच 2 ओ के1एमएल के साथ बदलें।
    11. अन्य एक्सप्लांट्स के लिए पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट डिटेक्शन दोहराएं, जो चरण 4.2.11 में निर्धारित समय के लिए इनक्यूबेटिंग करें।
    12. अवशिष्ट पेरोक्सिडास सब्सट्रेट को हटाने के लिए डीएच 2 ओ के1एमएल के साथ सभी एक्सप्लांट कुल्ला। यद्यपि एक्सप्लांट्स को इमेजिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन समय के साथ डीएच 2 ओ में पेरोक्सिडास सब्सट्रेट की लीचिंग को रोकने के लिएजितनीजल्दी हो सके उन्हें छवि बनाना बेहतर होता है।

5. इमेजिंग और मात्राकरण

  1. फ्लोरोसेंट इमेजिंग
    नोट: फ्लोरोसेंट इमेजिंग एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाता है। हालांकि, घाव बंद करने की दरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए 2D छवियों को प्राप्त करने के लिए एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर्याप्त हो सकता है। माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करते समय, यह सुनिश्चित करें कि चुने हुए फ्लोरोक्रोम उपलब्ध माइक्रोस्कोपी उपकरणों के उत्तेजन और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ संगत हैं।
    1. 2.5x, 10x और 20x उद्देश्य, एक्स-वाई-जेड मोटराइज्ड स्टेज, डिजिटल कैमरा और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रत्येक बायोप्सी के आसान दृश्य की अनुमति देने के लिए और कुल घाव बंद होने की माप को सक्षम करने के लिए प्रेषित प्रकाश डिटेक्टर (टीपीएमटी) पर स्विच करें। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरेसेंस इमेजिंग के बाद ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रत्येक घाव को मापें।
    2. इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर 60 एमएम पेट्री डिश बेस रखें और डीपीबीएस की एक पतली परत (लगभग 1 एमएल) जोड़ें।
      नोट: यदि बहुत अधिक डीपीबीएस का उपयोग किया जाता है, तो बायोप्सी इमेजिंग के दौरान घूम जाएगी। यदि प्लेट धारक उपलब्ध है तो वैकल्पिक रूप से 48 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें।
    3. कुओं/माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों से डीपीबीएस युक्त पेट्री डिश में घाव के एक्सप्लांट को स्थानांतरित करने के लिए छोटे ऊतक संदंश का उपयोग करें । बायोप्सी घाव पक्ष पेट्री डिश में नीचे रखें।
    4. घाव का पता लगाने और ध्यान केंद्रित करने के लिए आईपीस और फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग करें। यदि देखने के क्षेत्र में नमूने के नीचे बुलबुले फंस जाते हैं, तो घाव को ऊतक संदंश और पुनर्पोजिशन के साथ उठाएं।
    5. इमेजिंग सॉफ्टवेयर सेट करें, इष्टतम कॉन्फोकलिटी के लिए चैनलों के बीच समान पिनहोल आकार सुनिश्चित करें। इसके लिए हर चैनल के लिए एक-एक हवादार यूनिट की वैल्यू चेक करें और सबसे ज्यादा वैल्यू सिलेक्ट करें। स्कैन गति, छवि की गुणवत्ता और औसत का चयन करें।
      नोट: संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और चुने हुए काउंटरदाग (जैसे, DAPI) के फ्लोरोक्रोम आवश्यक चैनलों को निर्देशित करेंगे।
    6. लाइव अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर स्विच करें और लेजर शक्ति को समायोजित करें और प्रत्येक चैनल के लाभ को धुंधला कल्पना करने के लिए आवश्यक स्तरों पर समायोजित करें। डिजिटल ऑफसेट बढ़ाकर बैकग्राउंड शोर को कम करें।
    7. इमेजिंग विमान के केंद्र में घाव की स्थिति।
      नोट: यदि घाव एक छोटे उद्देश्य का उपयोग करने या एक बड़ा घाव बनाने के कारण पूरी छवि को नहीं भरता है, तो छवियों का एक पैनल लें और उन्हें एक साथ सिलाई करें (मैन्युअल रूप से या प्रासंगिक इमेजिंग सॉफ्टवेयर में एक टाइलिंग फ़ंक्शन के साथ)।
    8. घाव बायोप्सी की छवियां प्राप्त करें। एक्सप्लांट्स के बीच एक ही इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करें।
      नोट: उच्च शक्ति छवियों ऊतक संरचनाओं और सेलुलर मार्कर अभिव्यक्ति और स्थान के आकलन की अनुमति होगी ।
    9. घाव के माध्यम से धारावाहिक जेड ढेर ले लीजिए, खासकर जहां ऊतक पेट्री डिश के खिलाफ पूरी तरह से फ्लैट नहीं है। एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि में जेड स्टैक को ध्वस्त करने के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  2. ब्राइटफील्ड इमेजिंग
    नोट: इम्यूनोपेरोक्सीडैस दाग बायोप्सी की ब्राइटफील्ड इमेजिंग कई तरीकों से की जा सकती है।
    1. उल्टे माइक्रोस्कोप इमेजिंग: इमेजिंग के लिए घाव के पौधों को पेट्री डिश में रखकर तैयार करें/साथ ही चरण 5.1.2-5.1.3 में वर्णित है । डिजिटल कैमरे से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर ब्राइटफील्ड रोशनी के तहत डिजिटल छवियों का अधिग्रहण करें। यदि आवश्यक हो तो कई छवियों को एक साथ सिलाई करें।
    2. वायरलेस डिजिटल माइक्रोस्कोप इमेजिंग: लागत प्रभावी तरीके से उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए फोन या लैपटॉप से जुड़े वायरलेस डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। कुछ ऊतकों पर घाव को रखें और नमूना भंडारण से किसी भी अवशिष्ट डीएच2ओ (या धुंधला धोने बफर) को हटा दें। देखने के माइक्रोस्कोप क्षेत्र के केंद्र में घाव एक्सप्लांट की स्थिति। कनेक्टेड कैमरा का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
  3. प्रमात्रीकरण
    नोट: प्रतिशत घाव बंद होने की मात्रा किसी भी सॉफ्टवेयर में निर्धारित की जा सकती है जो फ्रीहैंड आकार को तैयार और मापा जा सकता है। इमेजजे का उपयोग इस प्रकार मात्राकरण करने के लिए किया जा सकता है:
    1. इमेजजे सॉफ्टवेयर में मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि खोलें।
    2. फ्रीहैंड आकार उपकरण का उपयोग फिर से एपिथेलियलाइज्ड घाव के बाहर के आसपास आकर्षित करने के लिए जहां यह सामान्य त्वचा से मिलता है। प्रेस एम (या | विश्लेषण उपाय)एक 'बाहरी' क्षेत्र माप प्राप्त करने के लिए।
      नोट: पुनः एपिथेलियलाइज्ड घाव ऊतक बनावट सामान्य त्वचा से अलग है। छवियों को इस प्रकार के विश्लेषण से पहले स्केल करने की आवश्यकता नहीं है।
    3. खुले घाव क्षेत्र के चारों ओर आकर्षित करने के लिए फ्रीहैंड आकार उपकरण का उपयोग करें। यह वह जगह है जहां खुला घाव फिर से एपिथेलाइजिंग ऊतक के अंदर के किनारे से मिलता है। प्रेस एम (या | विश्लेषण उपाय)एक 'आंतरिक' क्षेत्र माप प्राप्त करने के लिए।
    4. प्रतिशत घाव फिर से epithelialization/बंद करने के लिए परिणाम निकालना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का प्रयोग करें:
      % बंद = (बाहरी घाव क्षेत्र - आंतरिक घाव क्षेत्र) / (बाहरी घाव क्षेत्र) x 100
      नोट: एंटीबॉडी के प्रतिशत क्षेत्र कवरेज को उसी तरह (जैसे, K14) या कुल घाव क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में कम किया जा सकता है। प्रतिशत तीव्रता भी ब्याज के मार्कर के ऊतक स्तर अभिव्यक्ति के बारे में अर्द्ध मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि उच्च शक्ति इमेजिंग सेलुलर स्तर पर अभिव्यक्ति डेटा प्रस्तुत करता है ।

Representative Results

इस रिपोर्ट में, हम मानव त्वचा की मरम्मत प्रतिक्रिया को प्रभावित करने वाले कारकों का आकलन करने के लिए एक उपन्यास पूर्व वीवो त्वचा घायल और पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण पेश करते हैं। चित्रा 1A प्रक्रियात्मक पाइपलाइन का एक योजनाबद्ध दिखाता है, जिसे 3-10 दिनों में किया जा सकता है, जो घाव इनक्यूबेशन बार पर निर्भर करता है। आंशिक मोटाई घाव हवा में झिल्ली के ढेर पर सुसंस्कृत होते हैं: झिल्ली इंटरफ़ेस और पूरे माउंट धुंधला के लिए एकत्र किया जा सकता है, सामान्य हिस्टोलॉजी के लिए पैराफिन या OCT माध्यम में एम्बेडेड, या जैव रासायनिक विश्लेषण(चित्रा 1 बी)के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए। हम आम तौर पर 6 मिमी एक्सप्लांट के केंद्र में 2 मिमी आंशिक मोटाई घाव बनाते हैं। हालांकि, घाव और आसपास के एक्सप्लांट के आकार को आवश्यकताओं के आधार पर बदला जा सकता है। पूरे माउंट प्रक्रिया को इम्यूनोपेरोक्सीडेस और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग विधियों(चित्रा 1C)दोनों के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस कई एंटीबॉडी के साथ ऊतक की जांच के लिए अनुमति देता है। इसके लिए, हम विभिन्न प्रजातियों में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं, और प्रजातियों से मिलान किए गए फ्लोरोसेंटी ने क्रॉस-प्रजाति प्रतिक्रियाशीलता को सीमित करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी को संयोजित किया। एंटीबॉडी सांद्रता और इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। यदि पृष्ठभूमि धुंधला देखा जाता है, तो एंटीबॉडी सांद्रता को कम करें, धोने के कदम बढ़ाएं, और द्वितीयक एंटीबॉडी में अवरुद्ध बफर जोड़ें। ताजा ऊतक व्यवहार्यता सीधे वाणिज्यिक व्यवहार्यता रंगों के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें)। हम यह भी बताते हैं कि जब यह व्यावहारिक रूप से उपयुक्त है तो ऊतक को व्यवहार्यता धुंधला और सफलतापूर्वक चित्रित किया जासकताहै।

Figure 1
चित्र 1:मानव पूर्व वीवो घायल और पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण । (A)पाइपलाइन त्वचा एकत्र करने और पूर्व वीवो घायल प्रदर्शन से प्रक्रियात्मक कार्यप्रवाह का चित्रण, ऊतक धुंधला और डेटा का विश्लेषण करने के लिए । (ख)ऊतक पर नियमित रूप से किए गए विश्लेषणों के साथ मानव पूर्व वीवो त्वचा घाव संस्कृति प्रणाली का प्रदर्शन करने वाला आरेख। (ग)पूरे माउंट धुंधला दोनों इम्यूनोपेरोक्सिडेस और इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग कर नियोजित किया जा सकता है । K14 = केराटिन 14। (घ)लाइव ऊतक वाणिज्यिक व्यवहार्यता रंगों के साथ दाग सकता है और सफलतापूर्वक निर्धारण के बाद छवि । बार = 100 माइक्रोन। यह धुंधला गैर मधुमेह त्वचा में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घावों के पूरे माउंट धुंधला के लिए सबसे व्यापक रूप से लागू उपयोग हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के माध्यम से प्रदान की जा सकती है की तुलना में अधिक प्रजनन तरीके से घाव बंद करने की दर निर्धारित करना है। प्रतिशत बंद करने को घाव की सतह के प्रतिशत पुनः epithelialization के रूप में निर्धारित किया गया था, जैसा कि चित्र 2 एमें प्रदर्शित किया गया था । विशिष्ट मार्कर के प्रतिशत क्षेत्र कवरेज को कुल घाव क्षेत्र से या पुनः-एपिथेलाइज्ड घाव के प्रतिशत के रूप में मापा जा सकता है। हम सात दिनों के एक समय पाठ्यक्रम में स्वस्थ (गैर मधुमेह) बनाम मधुमेह त्वचा में उपचार की विशेषता है, प्रत्येक दिन के बाद घायल (प्रतिनिधि छवियों, चित्रा 2B)पर घावों का संग्रह । स्वस्थ त्वचा घावों की उम्मीद के अनुसार समय के साथ बंद कर दिया, पूर्ण बंद दिन 4-5 द्वारा सबसे नमूनों में मनाया के साथ । इसके विपरीत, मधुमेह त्वचा के घाव सात दिन के विश्लेषण अवधि(चित्रा 2C)के भीतर पूरी तरह से बंद करने में विफल रहे । घाव बंद करने में एक महत्वपूर्ण देरी स्वस्थ और मधुमेह त्वचा घावों के बीच देखा गया था जब हर समय बिंदु के बाद चोट(पी < ०.००१ दिन 6, पी < ०.०५ दिन में ०.०५ और पी < ०.०५ < पी पर उपचार दरों की तुलना 7 दिन में ०.००१) ।

समग्र घाव बंद करने की दरों के आकलन के बाद; हमने पूरे घाव क्षेत्र (चित्रा 2 एमें बाहरी क्षेत्र) का प्रतिशत मापा जहां K14 सकारात्मक कोशिकाओं की कल्पना की जा सकती है (चित्रा 2 बीमें हरी धुंधला)। दिलचस्प बात यह है कि हमने देखा कि स्वस्थ पूर्व वीवो त्वचा घावों में, K14 धुंधला 2 दिन में नुकीला और फिर तेजी से गिरावट आई (हर समय बिंदु बनाम दिन 2 पीक, चित्रा 2D)पर महत्व) । यह संभावित रूप से प्रारंभिक एपिडर्मल बैरियर के फिर से गठन को दर्शाता है, जिसमें विभेदित एपिडर्मल परतों के माध्यम से K14 एंटीबॉडी प्रवेश को छोड़कर (चित्रा 2E योजनाबद्ध देखें)। पुनः एपिथेलाइजेशन प्रक्रिया के दौरान, बेसल परत (K14+ve) केराटिनोसाइट्स खुले घाव पर अंदर की ओर माइग्रेट करते हैं ताकि बाहरी घाव किनारे के करीब एपिडर्मिस आंतरिक घाव किनारे (सामने माइग्रेट) के करीब एपिडर्मिस से पहले रूपों। जबकि नवगठित एपिडर्मिस का सामने का किनारा शेष खुले घाव को बंद करने के लिए स्थानांतरित करना जारी रखता है, बाहरी किनारे एपिडर्मिस अन्य एपिडर्मल परतों में सुधार करने के लिए अंतर करना शुरू कर देता है। प्रारंभिक चिकित्सा में, हम इस प्रकार अधिकांश पुनः-एपिथेलियलाइज्ड क्षेत्र को बेसल (K14 + ve) कोशिकाओं के होते हुए देखने की उम्मीद करेंगे, जबकि बाद में मरम्मत K14 धुंधला खो जाता है क्योंकि एपिडर्मिस बाहर की ओर से अलग होता है (चित्रा 2Eमें पूरे माउंट छवियां देखें)। इसलिए, चित्रा 2डी (नीचे के तीर) में दिखाए गए K14 धुंधला में गिरावट बढ़ी हुई एपिडर्मल भेदभाव से संबंधित है। दिलचस्प बात यह है कि दिखाई देने वाले K14 धुंधला स्वस्थ (दिन 2) बनाम मधुमेह (दिन 4) घावों में पहले नुकीला, आगे का प्रदर्शन है कि फिर से epithelialization और बाद में एपिडर्मल भेदभाव मधुमेह त्वचा घावों में देरी कर रहे हैं ।

Figure 2
चित्रा 2:पूरे माउंट धुंधला मधुमेह बनाम स्वस्थ त्वचा में बेफिक्र चिकित्सा दरों से पता चलता है । (क)बाहरी और आंतरिक घाव माप से घाव बंद होने की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली विधि । ब्राइटफील्ड छवियां लाल रंग में केराटिन 14 (K14) धुंधला दिखाती हैं । बार = 300 माइक्रोन(ख)स्वस्थ और मधुमेह त्वचा में समय के साथ उपचार की प्रतिनिधि छवियां (दिन के बाद घायल) । बार = 500 μm. K14 = ग्रीन। DAPI = नीली नाभिक। (ग)घाव बंद करने की दरों का मात्राकरण (प्रतिशत पुनः epithelialization) दिखा रहा है कि स्वस्थ त्वचा से पूर्व वीवो घाव मधुमेह त्वचा से पूर्व वीवो घावों की तुलना में काफी तेजी से बंद हो जाते हैं । एच = स्वस्थ। डीबी = मधुमेह। (घ)प्रतिशत K14 धुंधला चोटियों पहले स्वस्थ बनाम मधुमेह त्वचा में और फिर वृद्धि हुई एपिडर्मल भेदभाव (नीचे तीर) के साथ लाइन में गिरावट आती है । (ई)K14 (बेसल एपिडर्मल सेल) धुंधला हो जाता है क्योंकि एपिडर्मिस अंतर करता है। D = विभेदित। ND = विभेदित नहीं। सफेद बिंदीदार रेखाएं आंतरिक और बाहरी घाव किनारों को दर्शाती हैं। सफेद तीर = प्रवास की दिशा। n = प्रति दाता 6 घाव, प्रति समय बिंदु। मतलब +/-SEM. * = पी < ०.०५, ** = पी < ०.०१ और ***= पी < ०.००१ । स्वस्थ और मधुमेह सी में प्रत्येक चिकित्सा समय बिंदु पर तुलना (कम से कम महत्वपूर्ण तुलना के लिएपी मूल्य)। डीमें प्रत्येक दाता के लिए चोटी की तुलना में K14 धुंधला में लौकिक परिवर्तन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हम अगले ऊतक अभिव्यक्ति और गैर मधुमेहत्वचा (चित्रा 3)में अंय घाव प्रासंगिक मार्कर के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए पूरे माउंट धुंधला इस्तेमाल किया । उपयोग किए जाने वाले सभी एंटीबॉडी और उनकी कार्य सांद्रता सामग्री की तालिकामें प्रदान की जाती है। खुले घाव में रक्त वाहिकाओं अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (ए-SMA) एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक दाग, K14 के साथ संयोजन में इस्तेमाल के लिए कम बिजली छवियों(चित्रा 3A)में एपिडर्मल किनारों चित्रित । डर्मल मैट्रिक्स कोलेजन प्रकार मैं (कर्नल 1) और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ था। यहां कोलेजन प्रचुर मात्रा में मोटी फाइबर के रूप में मनाया गया था, जबकि फाइब्रोनेक्टिन फाइबर विरल, लहराती, और पतली(चित्रा 3A)थे । हमारा संपूर्ण-माउंट धुंधला दृष्टिकोण भी धुंधला के सेल स्तर के संकल्प प्रदान करने में सक्षम है, जैसा कि K14-सकारात्मक केराटिनोसाइट्स(चित्रा 3B)के लिए प्रदर्शित किया गया है।

अंत में, हम बताते है कि मानव पूर्व वीवो घावों निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अधिकारी, Langerhans कोशिकाओं के साथ दिन में नवगठित एपिडर्मिस के आसपास का पता चला 3 के बाद घायल(चित्रा 3C)। दरअसल, इन परिणामों से पता चलता है कि सूजन, प्रसार और एक्सपेरिअल मैट्रिक्स(चित्रा 4A)सहित चिकित्सा प्रतिक्रिया की प्रमुख विशेषताओं की जांच करने के लिए पूरे माउंट धुंधला का उपयोग किया जा सकता है। एक साथ लिया, हमारे डेटा से पता चलता है कि संयुक्त पूर्व वीवो त्वचा घायल और पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया स्वस्थ और मधुमेह (रोग) मानव त्वचा की मरंमत के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए एक वैध तरीका है ।

Figure 3
चित्रा 3:अन्य एंटीबॉडी के साथ उपयोग के लिए पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण का अनुकूलन। (ए)रक्त वाहिकाओं अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (α-SMA, हरे रंग) और keratin 14 (K14, लाल) के साथ दाग थे, जबकि मैट्रिक्स फाइबर कोलेजन मैं (COL 1, लाल) और फाइब्रॉनेक्टिन (Fn, हरे) के साथ दाग थे । (ख)पूरे माउंट प्रक्रिया स्थानीयकरण के सेल स्तर के संकल्प (K14, हरे रंग के लिए प्रदान करता है; K1, लाल) । (ग)CD1a + ve Langerhans कोशिकाओं (हरे) नवगठित एपिडर्मिस में मनाया । DAPI = नीली नाभिक। बार = 100 माइक्रोन। सफेद बिंदीदार रेखाएं भीतरी और बाहरी घाव किनारों और एपिडर्मिस से अलग घाव दिखाती हैं। यह धुंधला गैर मधुमेह त्वचा में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:घाव भरने का आकलन करने के लिए पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया की वैधता। (ए)चित्रण यह दर्शाता है कि कैसे पूरे माउंट धुंधला तकनीक घाव-प्रासंगिक प्रक्रियाओं का मूल्यांकन कर सकती है। एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया = लाल पाठ। K14 = केराटिन 14। कर्नल 1 = कोलेजन 1. एफएन = फाइब्रोनेक्टिन। (ख)संपूर्ण माउंट धुंधला प्रक्रिया (नीले तीर) मानक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (लाल तीर) की तुलना में बंद माप घाव करने के लिए कम परिवर्तनशीलता का परिचय देता है । S1 = धारा 1. हम = घाव किनारे। बार = 300 माइक्रोन। यह धुंधला गैर मधुमेह त्वचा में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, हम पूरे माउंट ऊतक धुंधला का उपयोग कर मानव पूर्व वीवो त्वचा में घाव बंद करने का मूल्यांकन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं। यह संभावित घाव उपचार के महत्वपूर्ण मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए और मानव घाव की मरम्मत प्रतिक्रिया की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन है। हमने पूर्व वीवो त्वचा घावों में उपचार मूल्यांकन पहले12,13प्रकाशित किया है, फिर भी इन रिपोर्टों में घाव बंद करने को मापने के लिए पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग नहीं किया गया था। पूरे माउंट धुंधला अभी तक आसान है और मानक हिस्टोलॉजी की तुलना में कम तकनीकी अनुभव की आवश्यकता है, जिसमें पैराफिन या OCT एम्बेडिंग और नमूनों की अनुभागिंग शामिल है। पूरे माउंट प्रक्रिया भी प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम कर देता है, पूरे घाव की मात्रा की अनुमति और ऊतक के भीतर एक परिभाषित स्थिति में सिर्फ एक भी ट्रांसवर्स अनुभाग नहीं (तुलनात्मक चित्रण के लिए चित्रा 4B देखें) । हम पूरी तरह से पूरे गैर सममित घाव संरचना के उपचार की मात्रा के महत्व का समर्थन करते हैं, जैसा कि स्पष्ट रूप से रिया और डनवाल्ड द्वारा मुरीन तीव्र घावों के लिए रेखांकित किया गया है14। इन लेखकों ने घाव आकृति विज्ञान के प्रजनन योग्य और सटीक माप के लिए वीवो एक्सिसिओनल घावों में क्रमिक रूप से खंडित होने के महत्व को दिखाया। धारावाहिक खंड समान रूप से मानव पूर्व वीवो घावों पर लागू किया जा सकता है; हालांकि, घाव बंद होने और पुनः-एपीथिलाइजेशन के सटीक मात्राकरण के लिए, उच्च थ्रूपुट पूरे-माउंट धुंधला पसंदीदा तरीका होना चाहिए। हम ध्यान दें कि इस पूरे माउंट धुंधला प्रोटोकॉल भी पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए बाद के प्रसंस्करण (मोम या OCT) के साथ संगत होना चाहिए ।

पूरे माउंट धुंधला नुकसान के बिना नहीं है । हालांकि यह घाव उपचार प्रयोगों में उच्च प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, यह मानक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों की तुलना में विश्लेषण के लिए और अधिक ऊतक के उपयोग की आवश्यकता है । यह एक ऐसा मुद्दा हो सकता है जहां ऊतक का उपयोग सीमित है, विशेष रूप से जहां कई एंटीबॉडी का आकलन करने की आवश्यकता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक चीरा घाव विधि को नियोजित करना होगा जहां घाव की चौड़ाई अपेक्षाकृत समान हो और परिवर्तनशीलता कम हो (जैसा कि माउस और मानव घावों में दिखाया गया है15,16)। हालांकि, एक्सिसिओनल घाव अधिकांश रोगीय घाव प्रकारों पर अधिक लागू रहते हैं17।

इस अध्ययन में, 6 मिमी त्वचा के विस्तार के केंद्र के भीतर 2 मिमी आंशिक मोटाई घाव बनाए गए थे। इस विधि को वैकल्पिक उत्तेजना घाव और विभिन्न त्वचा की गहराई18पर एक्सप्लांट आकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, घाव उत्पन्न करने के लिए आवश्यक बल दाताओं के बीच भिन्न होगा, जहां वृद्ध त्वचा को बायोप्सी के लिए कम बल की आवश्यकता होगी। हम प्रमुख खिंचाव के निशान या अन्य संरचनात्मक परिवर्तन प्रदर्शित करने वाली त्वचा का उपयोग करने से भी बचेंगे। हमने पूर्व वीवो हीलिंग प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं पर विचार करने के लिए एंटीबॉडी की एक श्रृंखला को मान्य किया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य त्वचा-प्रासंगिक एंटीबॉडी के साथ भी किया जा सकता है, जहां एंटीबॉडी सांद्रता और इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। फिर भी, हमारा मानना है कि हमारा प्रोटोकॉल कुल घाव बंद होने के पूर्ण मात्राकरण के लिए सबसे उपयुक्त है, जिसके बाद ब्याज के विशिष्ट प्रोटीन का स्थानिक आकलन किया जाता है । जबकि पूरे माउंट ऊतक वर्गों के मानक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण बनाम इम्यूनोलोकलाइजेशन का कम संकल्प प्रदान करता है, यह अतिरिक्त 3डी जानकारी प्रदान करता है जो मानक 2डी हिस्टोलॉजी से गायब है।

वीवो मॉडल में बनाम पूर्व वीवो त्वचा में उपचार का आकलन करने की एक चेतावनी यह है कि इसमें प्रणालीगत प्रतिक्रिया का अभाव है। घाव की मरम्मत का एक महत्वपूर्ण पहलू सूजन और बाद में ऊतक दाने है, जो वक्यूलेचर19से भड़काऊ कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं की आमद के कारण होता है। इस सीमा के बावजूद, पूर्व वीवो त्वचा अभी भी सेल-आधारित घाव परख की तुलना में नैदानिक उपचार का बेहतर पुनर्पूंजीकरण प्रदान करती है। सामान्य रूप से इन विट्रो प्रयोगों में ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर उगाए जाने वाले एकल सेल प्रकार मोनोलेयर या सह-संस्कृतियों को शामिल किया जाता है, जबकि पूर्व वीवो त्वचा सेल व्यवहार का पता लगाने के लिए एक देशी वातावरण प्रदान करती है। हाल ही में, त्वचा के समकक्ष प्रणालियों की एक संख्या उभरी है, जहां त्वचा कृत्रिम मैट्रिक्स और अलग त्वचा कोशिकाओं20, 21से एक प्रयोगशाला सेटिंग में उगायाजाताहै । हालांकि ये मॉडल मानव त्वचा की नकल सबसे इन विट्रो दृष्टिकोण से बेहतर है, वे अभी भी पूरी तरह से देशी ऊतक पर्यावरण अनुकरण नहीं करते हैं और आम तौर पर पुन: उत्पन्न करने के लिए बहुत नाजुक होते हैं। इसके अतिरिक्त, हम (और अन्य लोगों ने) यह प्रदर्शित किया है कि पूर्व वीवो मानव त्वचा ऊतक निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बरकरार रखता है, जिसमें कोई संदेह नहीं है कि22,23की मरम्मत में योगदान मिलेगा। भविष्य के काम में अब देर से चरण चिकित्सा मूल्यांकन24के लिए पूर्व वीवो मॉडल की व्यवहार्यता और इम्यूनोसक्षमता का विस्तार करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए । एक विकल्प आशाजनक अंग-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकियों की और उन्नति है जो ऊतक व्यवहार्यता को लंबा करने और संस्कृति25में दो सप्ताह तक देशी त्वचा वास्तुकला को बनाए रखने में सक्षम हैं। पूर्व वीवो मॉडल ने भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जैसे न्यूट्रोफिल, को मेजबान ऊतक26 में सफलतापूर्वक शामिल करके त्वचा की भड़काऊ प्रतिक्रिया के महत्व पर विचार करना शुरू कर दिया है या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया27को प्रकाश में लाने के लिए एंटीबॉडी के साथ मेजबान ऊतक इंजेक्शन। हम उम्मीद करते हैं कि इन निष्कर्षों से भविष्य में और अधिक परिष्कृत और अनुवादयोग्य तरीकों के विकास का मार्ग प्रशस्त होगा ।

घाव बंद करने को मापने के लिए पूर्व वीवो त्वचा का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ स्वस्थ (जैसे, गैर-मधुमेह) बनाम रोग (जैसे, मधुमेह या वृद्ध) ऊतक में उपचार दरों की तुलना करने की क्षमता है। यहां हमने दिखाया कि फिर से epithelialization और बाधा गठन वास्तव में स्वस्थ पूर्व वीवो घावों बनाम मधुमेह में बिगड़ा हुआ है । दरअसल, यह रोग की मरम्मत के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक मार्ग प्रदान करता है, जहां पुराने घावों के विकास के लिए वृद्धावस्था और मधुमेह प्रमुख जोखिम कारक हैं1। जबकि इन विट्रो पैथोलॉजिकल मॉडल मौजूद हैं, जैसे वृद्ध और मधुमेह ऊतक से अलग कोशिकाएं, या हाइपरग्लाइसेमिया28, 29की नकल करने के लिए उच्च ग्लूकोज में सुसंस्कृत कोशिकाएं, ये कोशिकाएं एक बार वीवो माइक्रोएनवायरमेंट से हटाए जाने के बाद अपने फेनोटाइप को जल्दी से खो सकती हैं। बाह्य रोग चिकित्सा वातावरण का एक महत्वपूर्ण घटक डर्मल मैट्रिक्स है, जो बुढ़ापे और मधुमेह दोनों में बदल जाता है30। दरअसल, यह बेफिक्र मैट्रिक्स निवासी और भोले फाइब्रोब्लास्ट31,32के व्यवहार को प्रभावित करता है। इस प्रकार, उनके मेजबान ऊतक वातावरण में कोशिकाओं का अध्ययन करने के महत्व को कम करके आंका नहीं जा सकता है।

संक्षेप में, हमारा प्रोटोकॉल मानव घाव को फिर से एपिथेलाइजेशन की मात्रा निर्धारित करने, नियामक कारकों का पता लगाने और संभावित चिकित्सीय12, 13की वैधता और प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक महत्वपूर्ण मंच प्रदान करता है। जबकि पूर्व नैदानिक परीक्षण अभी भी वीवो दृष्टिकोण में आवश्यकता होती है, पूर्व वीवो मानव ऊतक का उपयोग करके एक संयुक्त रणनीति और वीवो मुरीन घायल में पूर्व-नैदानिक मार्ग को परिष्कृत करना चाहिए, जबकि क्रॉस-प्रजातियों की अनुवादशीलता में वृद्धि करते हुए पशु उपयोग को कम करना चाहिए।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम रोगी ऊतक प्रदान करने के लिए श्री पाओलो Matteuci और श्री जॉर्ज स्मिथ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी ऊतक संग्रह और प्रयोगशाला सुविधाएं प्रदान करने के लिए डेज़ी अपील के साथ सहायता के लिए मिस एंबर गुलाब Stafford के आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Falcon Tubes Falcon 352070 For skin washing
1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) Starlab S1615-5510 For whole-mount staining
48-Well CytoOne Plate, TC-Treated Starlab CC7682-7548 For whole-mount staining
Acetic Acid Glacial Fisher Chemical A/0400/PB15 Part of fixative
Alkyltrimethylammonium Bromide Sigma-Aldrich M7635 Part of fixative
Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] Abcam ab7817 Stains blood vessels
Anti-Collagen I Antibody Abcam ab34710 Stains collagen
Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] Abcam ab7800 Stains epidermis
CD1A Antibody (CTB6) Santa Cruz Biotechnology sc-5265 Stains Langerhans cells
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific 62247 Counterstain for cell nuclei
Falcon 60mm Petri dishes Falcon 353004 Human ex vivo culture
Fibronectin Antibody (EP5) Santa Cruz Biotechnology sc-8422 Stains fibronectin
Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR Fisher Chemical F/1501/PB17 Part of fixative
Gauze Swabs Medisave CS1650 To clean skin
Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution Thermo Fisher Scientific 15240062 Human ex vivo culture
Gibco DMEM, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific 11960044 Human ex vivo culture
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10500064 Human ex vivo culture
Gibco HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170088 Human ex vivo culture
Gibco L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081 Human ex vivo culture
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich H1009-100ML For immunoperoxidase staining
ImageJ Software National Institutes of Health N/A For image analysis
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001 Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A11012 Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody
Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fisher Scientific L3224 For viability assessment of tissue
Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth World Precision Instruments 15917 To create wounds
Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide World Precision Instruments 501264 To create wounds
Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide World Precision Instruments 501263 To remove adipose tissue
Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified Biolegend 905201 Stains epidermis
Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified Biolegend 905301 Stains epidermis
LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss Discontinued For fluorescent imaging
Merck Millipore Absorbent pads Merck Millipore AP10045S0 Human ex vivo culture
Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters Merck Millipore HNWP04700 Human ex vivo culture
Normal Goat Serum Solution Vector Laboratories S-1000-20 Animal serum used depends on secondary antibody
Phosphate Buffer Solution Sigma-Aldrich P3619 For wash buffer
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 For blocking buffer
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212 Part of fixative
Sterilisation Pouches Medisave SH3710 To sterilise instruments
Stiefel 2mm biopsy punches Medisave BI0500 For partial thickness wound
Stiefel 6mm biopsy punches Medisave BI2000 For outer explant
Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific 101VR20 To prepare skin
Triton X-100 Fisher Chemical T/3751/08 For wash buffer
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) Vector Laboratories PK-6101 For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody
Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) Vector Laboratories SK-4800 For immunoperoxidase staining
Wireless Digital Microscope Jiusion N/A For brightfield imaging

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References

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Wilkinson, H. N., Kidd, A. S., Roberts, E. R., Hardman, M. J. Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair. J. Vis. Exp. (168), e62326, doi:10.3791/62326 (2021).

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