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Cancer Research

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Abstract

Le cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico (CAR) hanno mostrato risultati senza precedenti in studi clinici registrativi per pazienti con tumori maligni delle cellule B o mieloma multiplo (MM). Tuttavia, numerosi ostacoli limitano l'efficacia e vietano l'uso diffuso di terapie con cellule T CAR a causa dello scarso traffico e infiltrazione nei siti tumorali e della mancanza di persistenza in vivo. Inoltre, le tossicità potenzialmente letali, come la sindrome da rilascio di citochine o la neurotossicità, sono le principali preoccupazioni. L'imaging e il tracciamento efficienti e sensibili delle cellule T CAR consentono la valutazione del traffico, dell'espansione e della caratterizzazione in vivo delle cellule T e consentono lo sviluppo di strategie per superare gli attuali limiti della terapia con cellule T CAR. Questo documento descrive la metodologia per incorporare il symporter di ioduro di sodio (NIS) nelle cellule T CAR e per l'imaging delle cellule T CAR utilizzando la tomografia ad emissione di tetrafluoroborato-positrone [18F] tetrafluoroborato ([18F] TFB-PET) in modelli preclinici. I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio.

Introduction

La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR T) è un approccio rapidamente emergente e potenzialmente curativo nelle neoplasie ematologiche1,2,3,4,5,6. Risultati clinici straordinari sono stati riportati dopo la terapia con cellule T CAR T (CART19) o CON l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) CAR T2. Ciò ha portato all'approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti delle cellule CART19 per il linfoma aggressivo a cellule B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblastica acuta (Tisa-Cel)5,8, linfoma a cellule del mantello (brexucabtagene autoleuce)9 e linfoma follicolare (Axi-Cel)10 . Più recentemente, la FDA ha approvato la terapia con cellule T CAR diretta da BCMA in pazienti con mieloma multiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Inoltre, la terapia con cellule T CAR per la leucemia linfocitica cronica (LLC) è in fase avanzata di sviluppo clinico e dovrebbe ricevere l'approvazione della FDA entro i prossimi tre anni1.

Nonostante i risultati senza precedenti della terapia con cellule T CAR, il suo uso diffuso è limitato da 1) insufficiente espansione in vivo delle cellule T CAR o scarso traffico verso i siti tumorali, che porta a tassi più bassi di risposta duratura12,13 e 2) lo sviluppo di eventi avversi potenzialmente letali, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS)14,15 . I segni distintivi della CRS includono non solo l'attivazione immunitaria con conseguente livelli elevati di citochine/chemochine infiammatorie, ma anche la massiccia proliferazione delle cellule T dopo infusione di cellule T CAR15,16. Pertanto, lo sviluppo di una strategia convalidata di livello clinico per l'immagine delle cellule T CAR in vivo consentirebbe 1) il tracciamento delle cellule T CAR in tempo reale in vivo per monitorare il loro traffico verso i siti tumorali e scoprire potenziali meccanismi di resistenza e 2) il monitoraggio dell'espansione delle cellule T CAR e potenzialmente prevedere le loro tossicità come lo sviluppo di CRS.

Le caratteristiche cliniche della CRS lieve sono febbre alta, affaticamento, mal di testa, eruzione cutanea, diarrea, artralgia, mialgia e malessere. Nella CRS più grave, i pazienti possono sviluppare tachicardia/ipotensione, perdita capillare, disfunzione cardiaca, insufficienza renale/epatica e coagulazione intravascolare disseminata17,18. In generale, il grado di elevazione delle citochine, tra cui interferone-gamma, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, interleuchina (IL)-10 e IL-6, ha dimostrato di essere correlato alla gravità dei sintomi clinici17,19. Tuttavia, l'ampia applicazione del monitoraggio delle citochine sieriche "in tempo reale" per prevedere la CRS è difficile a causa dell'elevato costo e della disponibilità limitata. Per sfruttare le caratteristiche benefiche della terapia con cellule T CAR, l'imaging non invasivo delle cellule T adottive può essere potenzialmente utilizzato per prevedere l'efficacia, la tossicità e la ricaduta dopo l'infusione di cellule T CAR.

Diversi ricercatori hanno sviluppato strategie per utilizzare l'imaging a base di radionuclidi con tomografia ad emissione di positroni (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT), che fornisce alta risoluzione e alta sensibilità20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 per il visualizzazione e monitoraggio in vivo del traffico di cellule T CAR. Tra queste strategie di imaging basate su radionuclidi, il symporter di ioduro di sodio (NIS) è stato sviluppato come modalità sensibile per l'immagine di cellule e virus utilizzando scansioni PET31,32. L'imaging delle cellule T NIS+CAR con [18F]TFB-PET è una tecnologia sensibile, efficiente e conveniente per valutare e diagnosticare l'espansione, il traffico e la tossicità delle cellule T CAR30. Questo protocollo descrive 1) lo sviluppo di cellule T NIS+CAR attraverso la doppia trasduzione ad alta efficacia e 2) una metodologia per l'imaging di cellule T NIS+CAR con scansione [18F]TFB-PET. Le cellule T BCMA-CAR per MM sono utilizzate come modello proof-of-concept per descrivere NIS come reporter per l'imaging delle cellule T CAR. Tuttavia, queste metodologie possono essere applicate a qualsiasi altra terapia con cellule T CAR.

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Protocol

Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic, del Comitato istituzionale per la biosicurezza e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.

1. Produzione di cellule T NIS+ BCMA-CAR

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 17-008762) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).

  1. Produzione di BCMA-CAR, NIS e lentivirus codificanti per la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP).
    NOTA: Un costrutto BCMA-CAR di seconda generazione è stato sintetizzato de novo (vedi la Tabella dei materiali) e clonato in un vettore lentivirale di terza generazione sotto il controllo di un promotore alfa (EF-1α) del fattore di allungamento-1. Il costrutto BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) includeva la costimulazione 4-1BB e un frammento variabile a catena singola (scFv) derivato da un clone di anticorpi BCMA anti-umani C11D5.333,34. Il NIS è sotto il controllo del promotore EF-1α e si lega al gene di resistenza alla puromicina tramite peptidi auto-scissioni (P2A). Il vettore lentivirale che codifica per la luciferasi-GFP (vedi la Tabella dei materiali) viene utilizzato per trasdurre le cellule tumorali, che poi esprimono GFP e luciferasi.
    1. Preparare plasmidi vettori lentivirali: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOTA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contengono il gene della resistenza alla puromicina. Pertanto, le cellule trasdotte da NIS o luciferasi-GFP possono essere selezionate con 1 μg/mL o 2 μg/mL di puromicina dicloridrato, come descritto in precedenza14,35.
    2. Seminare 20 × 106 di cellule 293T in un matraccio T175 e incubare per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2. Confermare che le cellule 293T sono distribuite uniformemente sul pallone al 70-90% di confluenza mediante visualizzazione diretta al microscopio.
    3. Preparare un mix principale di 15 μg del vettore di espressione (ad esempio, CAR, NIS o DNA lineare luciferasi-GFP), 7 μg del vettore di inviluppo (VSV-G) e 18 μg del vettore di imballaggio (gag, pol, rev e tat). Diluire la miscela master di DNA in 4,5 mL del mezzo di trasfezione, quindi aggiungere 111 μL del reagente pre-complessante (Miscela A).
    4. Preparare un nuovo tubo e diluire 129 μL del reagente di trasfezione liposomiale in 4,5 mL del mezzo di trasfezione (Miscela B).
    5. Unire le miscele A e B e scorrere il tubo per mescolare il contenuto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
    6. Dopo l'incubazione, è sufficiente aspirare il surnatante cellulare senza staccare le cellule e aggiungere 16 ml di un mezzo di crescita contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina-glutammina. Quindi, aggiungere la miscela di miscele A e B su celle 293T a goccia. Infine, incubare le cellule trasfettate a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
    7. Nei giorni 1 e 2 post-trasfezione, raccogliere il surnatante di 293T, girare a 900 × g per 10 minuti e filtrare attraverso un filtro in nylon da 0,45 μm. Concentrare il filtrato a 24 e 48 ore per ultracentrifugazione a 112.700 × g per 2 ore e congelare a -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolamento delle cellule T (Figura 1)
    NOTA: Eseguire tutti i lavori di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare utilizzando la tecnica asettica e i dispositivi di protezione individuale. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono raccolte dal sangue di un donatore volontario sano raccolto durante l'aferesi36. Lo screening dei patogeni è stato eseguito su cellule umane utilizzate in questo studio.
    1. Utilizzare la tecnica del gradiente di densità standard per isolare i PBMC.
      1. Aggiungere delicatamente 15 mL di gradiente di densità medio (densità di 1,077 g/mL) (contenente alfa-D-glucopiranoside, beta-D-fruttofuranosil omopolimero e 3-(acetilammino)-5-(acetilmetilammino)-sale monosodico dell'acido alfa-D-4,6-triodobenzoico) a un tubo di separazione a gradiente di densità di 50 ml senza creare bolle d'aria (vedere la tabella dei materiali).
      2. Per evitare l'intrappolamento cellulare, diluire il campione di sangue con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 0,2 g/L di cloruro di potassio, 0,2 g/L di fosfato di potassio monobasico, 8 g/L di cloruro di sodio e 1,15 g/L di fosfato di sodio bibasico) contenente il 2% di FBS con un rapporto di volume 1:1. Trasferire delicatamente il sangue diluito sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità senza rompere l'interfaccia tra i due. Spin down a 1.200 × g per 10 minuti a RT.
        NOTA: un tubo di separazione del gradiente di densità di 50 mL può essere utilizzato per l'isolamento di 4-17 mL di un campione di sangue. Il tubo di separazione del gradiente di densità di 50 ml (vedi tabella dei materiali) utilizzato in questo protocollo non richiede il "brake off" durante la centrifugazione. Tuttavia, quando si utilizzano tubi standard da 50 ml, il freno deve essere spento e richiede una centrifugazione di 30 minuti.
      3. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico da 50 mL, lavare con PBS + 2% FBS riempiendo fino a 50 mL, quindi girare verso il basso a 300 × g per 8 minuti a RT.
      4. Aspirare il surnatante e risospendere le celle pellettate in 50 ml di PBS + 2% FBS. Contare il numero di celle e quindi girare verso il basso a 300 × g per 8 minuti a RT. Ripetere il passaggio precedente per un totale di 2 lavaggi.
    2. Aspirare il surnatante e risospesciare le cellule pellettate ad una concentrazione di 50 × 106 cellule/ml con PBS + 2% FBS.
    3. Eseguire l'isolamento delle cellule T dai PBMC utilizzando un kit di perline magnetiche a selezione negativa.
      NOTA: Un kit di selezione negativo ideale include perline magnetiche attaccate agli anticorpi contro gli antigeni espressi su cellule diverse dalle cellule T. Un kit comunemente usato contiene anticorpi coniugati a perline magnetiche contro CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 e CD16 (vedi Tabella dei materiali).
      1. Trasferire i PBMC in un tubo a fondo tondo in polistirene da 14 mL. Quindi, posizionare i PBMC e il cocktail di anticorpi di selezione negativa in un separatore cellulare completamente automatizzato ed eseguire l'isolamento delle cellule T secondo il protocollo del produttore.
  3. Stimolazione delle cellule T ed espansione delle cellule T (Figura 1)
    1. Per coltivare le cellule T isolate, preparare il mezzo di espansione delle cellule T (MTC) realizzato con mezzo cellulare ematopoietico privo di siero integrato con il 10% di albumina sierica umana e l'1% di penicillina-streptomicina-glutammina14. Dopo l'isolamento delle cellule T, contare le cellule e la coltura ad una concentrazione di 2 × 106 cellule / mL con MTC.
    2. Lavare le perline anti-CD3/CD28 tre volte con TCM prima di coltivarle con cellule T.
      1. Mescolare il flaconcino contenente le perline ruotando. Quindi, pipettare il volume richiesto di perline (3:1 perline:cellule) (ad esempio, quando si stimolano 1,0 × 106 cellule di cellule T, utilizzare 3,0 × 106 di perline anti-CD3/CD28) in un tubo microcentrifuga sterile (1,5 ml) e risospesso in 1 mL di MTC.
    3. Posizionare il tubo microcentrifuga con le perline su un magnete per 1 minuto e aspirare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospesciare le perline lavate in 1 mL di MTC. Ripetere i due passaggi precedenti per un totale di 3 lavaggi.
    4. Risospendare le perline in 1 mL di MTC e trasferirle alle cellule T. Quindi, diluire le cellule T ad una concentrazione finale di 1,0 × 106 cellule / mL con MTC. Trasferire la sospensione di cellule T/perline in una piastra a 6 pozzetti trattata con colture tissutali e posizionarla nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
  4. Titolazione dei lentivirus (Figura 2)
    1. Preparare le cellule T per il test di titolazione. Assicurarsi che siano disponibili circa 1,0 x 106 cellule per titolare un tipo di virus.
    2. Stimolare le cellule T come descritto al paragrafo 1.3.2.
    3. La piastra 1.0 × 105 cellule di cellule T stimolate in una piastra a 96 pozzetti (piastra del titolo) e incubare a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore (Figura 2A). Isolare e stimolare le cellule T come descritto al paragrafo 1.2.
    4. Preparare una piastra di diluizione (piastra a 96 pozzetti) aggiungendo 100 μL di MTC nei pozzetti delle colonne designate e dei pozzetti di controllo non trasdotti (Figura 2B).
    5. Scongelare una fiala di particelle lentivirali sul ghiaccio e pipettare delicatamente su e giù per mescolare bene. Trasferire 50 μL del surnatante virale nei pozzetti della colonna 6 della piastra a 96 pozzetti (diluizione 3) (Figura 2B). Pipetta su e giù per mescolare bene.
    6. Eseguire diluizioni seriali (diluizione seriale 2 volte): trasferire 50 μL dal pozzo A6 al pozzo B6 e poi 50 μL dal pozzo B6 al pozzo C6; ripetere fino a G6. Quindi, aggiungere 50 μL del virus diluito alla piastra del titolo (Figura 2B).
    7. Incubare la piastra del titolo a 37 °C, 5% CO2 per 48 ore e determinare le percentuali di cellule CAR-, NIS-, o GFP-positive mediante citometria a flusso (Figura 2C).
      1. Lavare i pozzetti ruotando la piastra del titolo due volte a 650 × g a 4 °C per 3 minuti.
      2. Macchiare le cellule T trasdotte come descritto nei passaggi da 1.5.3 a 1.5.9.
      3. Determinare i titoli in base alle percentuali di cellule CAR-, NIS- o GFP-positive usando la formula (1):
        Titoli = Percentuale di cellule T BCMA-CAR+ o NIS+ × conta delle cellule T alla trasduzione × diluizione / volume specifico (1)
  5. Trasduzione di lentivirus e NIS+Espansione delle cellule T BCMA-CAR
    1. Da ventiquattro a 48 ore dopo la stimolazione delle cellule T, eseguire la trasduzione lentivirale sulle cellule T stimolate (le cellule T dovrebbero formare cluster).
      1. Scongelare i lentivirus congelati che codificano CAR o NIS a 4 °C.
      2. Mescolare bene le cellule T stimolate per rompere i cluster e aggiungere semplicemente il virus appena scongelato a una molteplicità di infezione (MOI) di 5,0 (quando si trasducono 1,0 × 106 cellule T, utilizzare 5,0 × 106 di lentiviri). Incubare le cellule trasdotte a 37 °C, 5% CO2.
      3. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T trasdotte utilizzando un ematocitometro37 o un contatore cellulare completamente automatizzato38 e regolare la concentrazione cellulare a 1,0 × 106 cellule / mL aggiungendo MTC fresca e preriscaldata. Per le cellule T trasdotte da NIS che trasportano il gene di resistenza alla puromicina, trattare le cellule con 1 μg / mL di puromicina dicloridrato nei giorni 3, 4 e 5.
    2. Il giorno 6, rimuovere le perle anti-CD3/CD28 dalle cellule T trasdotte (dal passo 1.3.4) mescolando bene per rompere i cluster di cellule T e mettendole in un magnete per 1 minuto. Quindi, è sufficiente riposizionare le cellule T trasdotte raccolte in coltura ad una concentrazione di 1,0 × 106 cellule / ml. Dopo aver rimosso le perline dalle cellule T, valutare l'espressione di CAR e NIS mediante citometria a flusso.
      NOTA: Poiché il frammento variabile a catena singola del BCMA-CAR è derivato dal topo, può essere colorato con IgG anti-topo di capra (H + L) coniugato con Alexa Fluor 647. I NIS possono essere rilevati utilizzando ETNL anti-umano [peptide sintetico corrispondente ad aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Questo anticorpo riconosce il C-terminus citosolico di NIS. Pertanto, le cellule T devono essere permeabilizzate prima dell'incubazione con un anticorpo anti-umano NIS.
    3. Eseguire la colorazione superficiale di BCMA-CAR utilizzando IgG anti-topo di capra (H + L).
      1. Prelevare un'aliquota della coltura (ad esempio, 50.000 cellule T) e lavare con tampone di flusso (PBS, 1% FBS e 1% azide di sodio). Successivamente, risospese le cellule con 50 μL di tampone di flusso e colorare le cellule con 1 μL di anticorpo anti-topo di capra per rilevare l'espressione di CAR e 0,3 μL di acqua morta viva per escludere le cellule morte.
      2. Incubare per 15 minuti al buio a RT, lavare le cellule aggiungendo 150 μL di tampone di flusso e centrifugare le celle a 650 × g per 3 minuti a 4 °C.
    4. Dopo la colorazione CAR superficiale, fissare e permeabilizzare le cellule aggiungendo 100 μL di mezzo di fissazione (PBS con formaldeide al 4,21%) e incubare per 20 minuti a 4 °C. Lavare le cellule due volte con 100 μL di un tampone che contiene un agente permeabilizzante cellulare come la saponina (650 × g per 3 minuti a 4 °C).
    5. Risospendare le cellule fisse/permeabilizzate in 50 μL di tampone permeabilizzante. Quindi, aggiungere 0,3 ng di anticorpo anti-umano ETNL NIS in 50 μL di tampone di flusso e incubare per 1 ora a 4 °C.
    6. Aggiungere 150 μL di flow buffer e centrifugare le celle a 650 × g per 3 min a 4 °C. Incubare le cellule con 2,5 μL di anticorpo secondario anti-coniglio in 50 μL di flow buffer per 30 min a 4 °C, lavare le cellule aggiungendo 150 μL di flow buffer e centrifugare a 650 × g per 3 min a 4 °C.
    7. Infine, sospendere 200 μL di tampone di flusso ed eseguire la citometria a flusso per determinare l'efficienza di trasduzione (Figura 3A,B).
    8. Il giorno 8, contare e far girare le cellule T a 300 × g per 8 minuti a 4 °C. Risospendare le cellule T con mezzo di congelamento (90% FBS + 10% dimetilsolfossido [DMSO]) ad una concentrazione di 10 × 106/mL, quindi trasferire 1 mL ciascuna a crioviali marcate.
    9. Mettere i flaconcini in un congelatore a -80 °C per 48 ore. Dopo 48 ore (ed entro il giorno 10), trasferire le cellule T in azoto liquido.
      NOTA: vedere la Figura 1 per una panoramica della produzione di cellule T NIS+ CAR. La Figura 3D rappresenta esempi di espansione ex vivo delle cellule T da tre diversi donatori.

2. Imaging delle cellule T NIS+ BCMA-CAR con scansione [ 18F]TFB-PET

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB e IBC (Bios00000006.04). OPM-2 è una linea cellulare BCMA+ MM, che viene spesso utilizzata come linea cellulare target per le cellule T BCMA-CAR39,40.

  1. Stabilire cellule di luciferasi + BCMA + OPM-2.
    1. Semina 500.000 cellule OPM-2 in una piastra a 24 pozzetti trattata con colture tissutali. Scongelare il lentivirus che codifica per la luciferasi-GFP a 4 °C.
    2. Aggiungere il virus appena scongelato a un MOI di 3.0 alle cellule OPM-2 e mescolare bene mediante pipettaggio. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
    3. Quarantotto ore dopo la trasduzione, aggiungere 2 μg/mL di puromicina per selezionare le cellule trasdotte. Quattro giorni dopo la trasduzione, valutare le cellule GFP-positive (luciferasi-positiva) mediante citometria a flusso (Figura 3E).
  2. Stabilire modelli murini di xenotrapianto BCMA+ OPM-2 (Figura 4).
    1. Contare le cellule di luciferasi + OPM-2 e ruotarle due volte per rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare. Risospese le cellule OPM-2 ad una concentrazione di 10 × 106 cellule/mL con PBS.
    2. Il giorno -21, iniettare 100 μL (1,0 × 106 cellule) di cellule di luciferasi + OPM-2 nelle code di topi IMMUNOCOMPROMESSI NOD-SCID IL2rγnull (NSG) di 8-12 settimane (Figura 4).
    3. Il giorno 20 dopo l'iniezione di cellule OPM-2 (giorno -1 dell'iniezione di cellule T CAR), controllare il carico tumorale tramite imaging a bioluminescenza (BLI) (Figura 4).
      NOTA: le cellule OPM-2 formano un tumore a crescita lenta, che di solito richiede 2-3 settimane per attecchirsi.
    4. Somministrare 10 μL/g di D-luciferina a topi xenotrapianto OPM-2 tramite iniezione intraperitoneale (IP). Dopo 10 minuti, eseguire BLI sui topi sotto il 2% di gas isoflurano (Figura 5A). Dopo aver confermato l'attecchimento del tumore, randomizzare i topi in base al carico tumorale.
    5. Il giorno -1 dell'iniezione delle cellule T CAR, scongelare le cellule T NIS+BCMA-CAR e rimuovere il mezzo di congelamento mediante centrifugazione (300 × g, 8 min, 4 °C). Quindi, le cellule risospese con MTC a 2,0 × 106 cellule / mL e incubano durante la notte (37 ° C, 5% CO2).
    6. Il giorno 0, contare e centrifugare le cellule T NIS+BCMA-CAR (300 × g, 8 min, 4 °C). Sospendere le cellule T NIS+BCMA-CAR a 50 × 106 cellule/mL con PBS.
    7. Somministrare 100 μL (5,0 × 106 cellule) di cellule T NIS+BCMA-CAR tramite iniezione della vena della coda ai topi xenotrapianto OPM-2. Nei giorni 7 e 15, immagina i topi usando una scansione PET.
  3. Imaging in vivo delle cellule T NIS+BCMA-CAR utilizzando il modello murino con xenotrapianto BCMA+OPM-2.
    1. Pesare i mouse prima dell'imaging e rimuovere eventuali marchi auricolari metallici per eliminare gli artefatti relativi al metallo.
    2. Preparare [18F]TFB come descritto in precedenza41.
      NOTA: [18F]TFB deve essere prodotto il giorno del suo utilizzo. La purezza radiochimica deve essere >99% e l'attività molare >5 GBq/mmol.
    3. Iniettare 9,25 MBq [18F]TFB per via endovenosa tramite iniezione della vena della coda. Consentire un periodo di assorbimento di ~ 40 minuti per la distribuzione del radiotracciante nel corpo e liberare il sangue.
    4. Anestetizzare il topo usando l'inalazione di isoflurano (2%).
      NOTA: L'isoflurano è l'anestetico inalato preferito in quanto ha un esordio e un recupero rapidi e affidabili.
    5. Prima di anestetizzare il mouse, pulire tutte le superfici della macchina per anestesia con detergenti disinfettanti.
    6. Posizionare il mouse all'interno della camera di induzione. Ruotare il quadrante del vaporizzatore al 2% e attendere che il mouse diventi reclinato e non reattivo entro 1-2 minuti.
    7. Monitorare il mouse per evitare un'anestesia insufficiente o un'eccessiva depressione delle funzioni respiratorie. In breve, pizzicare la punta per confermare l'anestesia insufficiente.
      NOTA: la frequenza respiratoria normale è fino a 180 / min e il tasso di caduta accettabile è del 50%.
    8. Applicare unguento oftalmico per evitare l'essiccazione corneale e traumi.
    9. Acquisire immagini PET/CT 45 minuti dopo l'iniezione con il mouse anestetizzato in una workstation di imaging micro PET/CT (vedere la Tabella dei materiali). Successivamente, acquisire immagini PET statiche per 15 minuti seguite dall'acquisizione di immagini CT per 5 minuti con rotazione a 360 ° e 180 proiezioni a 500 μA, 80 keV e 200 ms di esposizione.
  4. Analisi dei dati di imaging acquisiti
    1. Analizzare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini PET (Figura 5B e Video supplementare S1).
    2. Definire il volume di interesse (VOI).
    3. Calcola il valore di assorbimento standardizzato (SUV) utilizzando la formula (2).
      SUV in VOI = Concentrazione di attività in VOI (MBq/mL) × peso corporeo (g) / dose somministrata (MBq) (2)
  5. Conferma del traffico di cellule T NIS+BCMA-CAR verso i siti tumorali con la citometria a flusso
    1. Dopo l'imaging [18F]TFB-PET, riposizionare il mouse nella gabbia. Dopo la cessazione dell'anestesia, monitorare gli animali fino a quando non sono in grado di muoversi in modo mirato e assicurarsi che abbiano accesso al cibo e all'acqua.
    2. Monitorare i topi fino al decadimento del [18F]TFB iniettato. Una volta che il radioisotopo non è rilevabile, eutanasizzare i topi con CO2.
    3. Per l'eutanasia, metti i topi nella gabbia (non più di 5 topi per gabbia).
    4. Esporre i topi alla CO2 fino alla completa cessazione della respirazione in circa 5-10 minuti.
      NOTA: Questo metodo di eutanasia deve essere coerente con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali (edizione 2020).
    5. Per garantire la morte dei topi, eseguire la lussazione cervicale afferrando la parte posteriore della testa e la base della coda dell'animale, quindi allontanando le mani l'una dall'altra.
    6. Raccogliere il midollo osseo per confermare che le cellule T NIS+BCMA-CAR trafficano in modo efficiente verso il sito tumorale.
    7. Trasferire i femori e le tibie raccolti in una piastra a 6 pozzetti contenente 5 ml di terreno di coltura cellulare. Rimuovere i muscoli e i tendini dai femori e dalla tibia e tagliare semplicemente entrambe le estremità (sopra le articolazioni) dei femori e della tibia.
    8. Riempire una siringa da insulina con il terreno di coltura cellulare e lavare il midollo osseo sulla piastra a 6 pozzetti. Per i femori, utilizzare aghi da 22 G e siringhe da 5 ml perché il diametro del femore è maggiore di quello della tibia.
    9. Utilizzare l'estremità piatta dello stantuffo per macinare il midollo osseo. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo conico sterile da 50 ml e filtrare il midollo osseo macinato. Quindi, riempire il tubo con il tampone di flusso e centrifugare il tubo a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
    10. Aspirare il surnatante e risospesciare il midollo osseo con 5 ml di tampone di flusso. Trasferire 200 μL di midollo osseo in una piastra a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 300 × g per 3 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospescere le cellule con 50 μL di tampone di flusso.
    11. Macchiare il midollo osseo con anticorpi di flusso contro 0,25 μg di CD45 di topo, 0,03 μg di CD45 umano, 0,06 μg di CD3 umano, 0,24 μg di BCMA umano e 0,3 μL di acqua viva / morta. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
    12. Centrifugare la piastra a 300 × g per 3 min a 4 °C. Quindi, aggiungere 200 μL di buffer di flusso ed eseguire sul citometro a flusso (Figura 5C).

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Representative Results

La Figura 1 illustra le fasi di generazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Il giorno 0, isolare i PBMC e quindi isolare le cellule T mediante selezione negativa. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28. Il giorno 1, trasdurre le cellule T con lentivirus NIS e BCMA-CAR. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T e nutrirsi con i mezzi per regolare la concentrazione in modo che sia 1,0 × 106 / ml. Per le cellule T trasdotte da NIS, aggiungere 1 μg/mL di puromicina per selezionare le cellule NIS+. Il giorno 6, rimuovere le perline posizionando le cellule nel magnete per un minuto. Quindi, mettere le cellule disadate dal tubo in un nuovo pallone. Prendere un'aliquota di cellule (ad esempio, 50.000 cellule) e colorare con anticorpi per controllare l'espressione di NIS e CAR sulla superficie delle cellule T usando la citometria a flusso. Il giorno 8, contare le cellule T e crioconservare con mezzi di congelamento alla concentrazione di 10 × 106 / mL.

La Figura 2 rappresenta lo schema della titolazione dei lentivirus. Il giorno 0, risospese le cellule T alla concentrazione di 1,0 × 106/mL nella MTC. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28 con un rapporto cellula/ perline 1: 3. Aggiungere 100 μL (100.000 cellule) di cellule T ai pozzetti colorati come indicato nella Figura 2A. Questo piatto è chiamato "piatto del titolo". Incubare la piastra del titolo a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore. Il giorno 1, preparare la piastra di diluizione. Aggiungere 100 μL di MTC ai pozzetti colorati come indicato nella Figura 2B. Quindi, aggiungere 50 μL di lentivirus appena scongelati nella prima riga (ad esempio, A6, A7 o A8 come illustrato nella Figura 2B). Eseguire la diluizione seriale trasferendo 50 μL da A6 a B6 e quindi 50 μL da B6 a C6, ripetendo fino a G6. Eseguire la diluizione seriale anche per A7 e A8. Quindi trasferire 50 μL del virus diluito alla piastra del titolo. Ventiquattro ore dopo aver trasferito il virus dalla piastra di diluizione alla piastra del titolo, nutrire le cellule con 100 μL di MTC. Il giorno 3, colorare le cellule con anticorpi e analizzare l'espressione di NIS e BCMA sulle cellule T tramite citometria a flusso.

La Figura 3A,B mostra i diagrammi di flusso rappresentativi delle cellule T BCMA-CAR T o NIS+BCMA-CAR. Le cellule T sono chiuse su FSC / SSC, seguite da singoletto e discriminazione delle cellule vive. Oltre il 90% delle cellule sono cellule NIS+ (Figura 3B). La Figura 3C mostra il diagramma di flusso rappresentativo per la composizione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Simile alla Figura 3A, B, le cellule T sono gated su FSC / SSC, seguite da singoletto e discriminazione di cellule vive. La Figura 3D mostra la curva di espansione delle celle T dai giorni 0 a 8. Non ci sono differenze di espansione tra le cellule T UTD, BCMA-CAR T o NIS + BCMA-CAR. La Figura 3E illustra l'espressione della GFP sulle cellule OPM-2 dopo la trasduzione del lentivirus che codifica per la GFP e la luciferasi seguita dalla selezione della puromicina.

La Figura 4 è lo schema di imaging delle cellule T NIS+BCMA-CAR in vivo con [18F]TFB-PET. Inoculare topi di età compresa tra sei e otto settimane con 1,0 × 106 cellule di cellule di luciferasi + OPM-2 tramite iniezione della vena della coda il giorno -21. Valutare il carico tumorale da BLI il giorno -1. Il giorno 0, randomizzare i topi in base al carico tumorale da trattare con cellule T NIS+BCMA-CAR attraverso l'iniezione della vena della coda o monitorati senza alcun trattamento (xenotrapianto non trattato). Immagina i topi con BLI il giorno 6. Eseguire [18F]TFB-PET il giorno 7 per visualizzare le cellule T NIS+BCMA-CAR.

La Figura 5A mostra il BLI rappresentativo 20 giorni dopo l'inoculazione delle cellule luciferasi +OPM-2 nei topi NSG. La Figura 5B mostra l'imaging PET rappresentativo una settimana dopo la somministrazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. [18F] L'assorbimento di TFB è osservato nello sterno, nelle spine, nel bacino e nei femori. Inoltre, l'assorbimento fisiologico di [18F]TFB è visto nella tiroide e nello stomaco. La Figura 5C mostra i diagrammi di flusso rappresentativi del midollo osseo derivato dal femore raccolto dallo xenotrapianto non trattato o dai topi trattati con cellule T NIS+BCMA-CAR. I campioni di midollo osseo sono colorati con CD45 di topo, CD45 umano, CD3 umano e BCMA umano. Le cellule sono chiuse su FSC / SSC, seguite da singoletto, vivo e discriminazione delle cellule umane. I campioni di midollo osseo derivati da xenotrapianti non trattati mostrano cellule BCMA+ mentre il topo trattato con cellule T NIS+BCMA-CAR mostra cellule CD3+ , che supportano la scoperta [18F]TFB-PET.

Figure 1
Figura 1: Schema di produzione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Cellule T CD3 di donatori normali (isolate da cellule mononucleate del sangue periferico) utilizzando la selezione negativa delle perline. Le cellule T sono placcate a 1,0 × 106 /mL ed espanse nella MTC utilizzando perline anti-CD3 / CD28 aggiunte il giorno 0 della coltura e rimosse il giorno 6. Le cellule T sono trasdotte dualmente con lentivirus che codificano per NIS o BCMA-CAR il giorno 1 (MOI = 5.0). Le cellule T NIS+BCMA-CAR sono trattate con 1 μg/mL di puromicina nei giorni 3, 4 e 5. Le cellule T vengono espanse in coltura per 8 giorni. Le cellule T sono crioconservate in FBS con il 10% di DMSO per esperimenti futuri. Le cellule T vengono scongelate e riposate durante la notte a 37 °C prima di tutti gli esperimenti. Abbreviazioni: CD = cluster di differenziazione; TCM = mezzo di espansione delle cellule T; BCMA = antigene di maturazione delle cellule B; CAR = recettore dell'antigene chimerico; NIS = symporter di ioduro di sodio; GFP = proteina fluorescente verde; PBMC = cellule mononucleate del sangue periferico; MOI = molteplicità di infezione; FBS = siero bovino fetale; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Titolazione del lentivirus. (A) Il giorno 0, stimolare le cellule T con perline anti-CD3/CD28 con un rapporto 3:1 perline/cellule. Aggiungere 100 μL di 1,0 × 106/mL di cellule T stimolate ai pozzetti colorati come indicato nel cartone animato. Quindi, incubare la piastra del titolo a 37 °C, 5% CO2 per 24 h. (B) Preparare una piastra di diluizione aggiungendo 100 μL di MTC ai pozzetti colorati come indicato nel cartone animato. Aggiungere 50 μL di virus appena scongelato ad A6, A7 o A8 (ad esempio, BCMA-CAR ad A6, NIS ad A7 e luciferasi-GFP ad A8). Quindi, diluire in serie il virus trasferendo 50 μL da A6 a B6 e quindi 50 μL da B6 a C6, ripetendo fino a G6. Eseguire la diluizione seriale anche per A7 e A8. Trasferire 50 μL del virus diluito alla piastra del titolo. (C) Il giorno 3, colorare le cellule con anticorpi corrispondenti e analizzare la piastra del titolo mediante citometria a flusso. Abbreviazioni: CD = cluster di differenziazione; TCM = mezzo di espansione delle cellule T; BCMA = antigene di maturazione delle cellule B; CAR = recettore dell'antigene chimerico; NIS = symporter di ioduro di sodio; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La generazione di cellule T NIS+BCMA-CAR e cellule OPM-2 positive alla luciferasi-GFP. (A e B) Le cellule sono chiuse su FSC / SSC, seguite da singoletto e discriminazione di cellule vive. Vengono mostrati grafici di flusso rappresentativi di (A) cellule T e BCMA-CAR T non trasdotte e (B) UTD e NIS+BCMA-CAR T. Le cellule T NIS+BCMA-CAR sono generate dalla co-trasduzione di due virus al giorno 1 dell'espansione delle cellule T, come descritto nella Figura 2. Il giorno 6, le cellule sono macchiate per CAR e NIS. (C) L'analisi fenotipica di NIS+BCMA-CAR T. Viene mostrato il diagramma di flusso rappresentativo delle cellule T NIS+BCMA-CAR. (D) Sintesi della cinetica di crescita delle cellule T UTD, BCMA-CAR T o NIS+BCMA-CAR. L'incorporazione di BCMA-CAR e/o NIS non influisce sull'espansione delle cellule T (ANOVA bidirezionale, n=3 repliche biologiche, media ± SD). (E) Analisi citometrica a flusso di OPM-2 trasdotto da luciferasi-GFP. Le cellule OPM-2 sono trasdotte con lentivirus che codifica per la luciferasi-GFP con resistenza alla puromicina. Quarantotto ore dopo la trasduzione, le cellule OPM-2 vengono trattate con 2 μg/mL di puromicina. Le cellule vengono espanse per altri due giorni e l'espressione della GFP viene analizzata tramite citometria a flusso. Abbreviazioni: CD = cluster di differenziazione; BCMA = antigene di maturazione delle cellule B; CAR = recettore dell'antigene chimerico; NIS = symporter di ioduro di sodio; GFP = proteina fluorescente verde; UTD = non trasdotto; FSC/SSC = forward scattering/side scattering; ANOVA = analisi della varianza; n.s.= non significativo; SD = deviazione standard; FL-1-A = area di fluoroforo 1; FITC-A = area dell'isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Schema per il saggio di traffico in vivo in un modello sistemico di xenotrapianti OPM2. Iniettare topi NSG da sei a otto settimane con 1,0 × 106 di cellule OPM-2 sieropositive alla luciferasi attraverso la vena della coda il giorno -21. Il giorno -1, eseguire l'imaging bioluminescente sui topi per confermare l'attecchimento delle cellule OPM-2. Il giorno 0, iniettare topi con 5,0 × 106 di cellule T NIS + BCMA-CAR. Immagine di topi con [18F]TFB-PET/CT il giorno 7 per valutare il traffico di cellule T NIS+BCMA-CAR. Abbreviazioni: BCMA = antigene di maturazione delle cellule B; CAR = recettore dell'antigene chimerico; NIS = symporter di ioduro di sodio; BLI = imaging bioluminescente; NSG = NOD-scid IL2rγnull immunocompromesso; luc = luciferasi; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Saggio del traffico in vivo in un modello sistemico di xenotrapianto OPM2. (A e B) Le cellule BCMA+luciferasi+OPM2 vengono iniettate per via endovenosa nei topi NSG. I topi ricevono le cellule T CAR NIS+BCMA tre settimane dopo l'inoculazione delle cellule OPM-2. (A) BLI conferma l'attecchimento delle cellule OPM-2. (B) [18F]TFB-PET rivela il traffico di cellule T NIS+BCMA-CAR al midollo osseo. (C) Per confermare che le cellule OPM-2 si attecchiano nel midollo osseo e il traffico di cellule T NIS +BCMA-CAR verso il sito tumorale, i topi vengono eutanasizzati dopo l'imaging e il midollo osseo viene raccolto. L'analisi citometrica a flusso ha rivelato che le cellule OPM-2 sono innestate nel midollo osseo (a sinistra) e le cellule T NIS + BCMA-CAR sono presenti nel midollo osseo (a destra). Abbreviazioni: BCMA = antigene di maturazione delle cellule B; CAR = recettore dell'antigene chimerico; NIS = symporter di ioduro di sodio; BLI = imaging bioluminescente; NSG = NOD-scid IL2rγnull immunocompromesso; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata; IVIS = sistema di imaging in vivo ; CD = cluster di differenziazione; SUV = valore di assorbimento standardizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare S1: Rendering tridimensionale (3D) di dati PET/ CT che mostrano la distribuzione in vivo di [18F]TFB nella tiroide, nello stomaco e nel midollo osseo. Abbreviazioni: BCMA = antigene di maturazione delle cellule B; CAR = recettore dell'antigene chimerico; NIS = symporter di ioduro di sodio; PET/CT = tomografia ad emissione di positroni/tomografia computerizzata. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Questo documento descrive una metodologia per incorporare NIS nelle cellule T CAR e l'imaging infuso di cellule T CAR in vivo attraverso [18F] TFB-PET. Come prova di concetto, le cellule T NIS + BCMA-CAR sono state generate tramite doppia trasduzione. Abbiamo recentemente riferito che l'incorporazione di NIS nelle cellule T CAR non compromette le funzioni e l'efficacia delle cellule T CAR in vivo e consente il traffico e l'espansione delle cellule T CAR30. Poiché le terapie con cellule T CAR continuano ad espandersi oltre le attuali neoplasie delle cellule B alle applicazioni nella LLC, ci sarà una maggiore necessità di strumenti che consentano l'imaging in vivo non invasivo e il monitoraggio delle cellule T adottive infuse. L'imaging dinamico delle cellule T consentirà la convalida del traffico adottivo di cellule T e potenzialmente consentirà una diagnosi precoce di efficacia e tossicità.

La NIS è stata studiata e convalidata come modalità sensibile alle cellule e ai virus in studi clinici32,42. L'accumulo fisiologico di traccianti per NIS si osserva principalmente nella tiroide / ghiandole salivari, nello stomaco e nella vescica, che non sono organi comuni affetti da tumori liquidi44. Soprattutto nel MM, le plasmacellule maligne sono spesso distribuite nel midollo osseo o nelle ossa, e un plasmacitoma extramidollare nelle lesioni, dove si verifica l'accumulo fisiologico di traccianti per NIS, è un fenomeno raro44,45. Inoltre, la NIS non è immunogenica e quindi adatta per studi di imaging longitudinale46. NIS è una proteina di membrana intrinseca che trasporta lo ioduro nel citosol e contiene 13 presunti segmenti transmembrana con un sito ammino-terminale extracellulare e un terminale carbossi citosolico47.

I NIS possono essere visualizzati con radioisotopi che emettono gamma o positroni come il tecnezio-99m (99mTc) pertecnetato, lo ioduro-123 (123I), 131I, 124I e [18F]TFB43. Recentemente, [18F]TFB è emerso come un promettente analogo dello ioduro per l'imaging PET basato su NIS, in quanto ha proprietà biochimiche simili ed è radiosintetizzato48. Un vantaggio del TFB è che non subisce l'organificazione nelle cellule tiroidee e quindi ha un assorbimento relativamente lieve nel tessuto tiroideo normale48. Un altro vantaggio del TFB è la sua breve emivita di 109,8 minuti, mentre l'emivita di altri traccianti varia da 12 ore a 8 giorni, il che potrebbe presentare problemi di sicurezza per le applicazioni cliniche49. Il limite principale dell'imaging delle cellule T CAR basato su NIS è che i traccianti, incluso il TFB, non penetrano nella barriera emato-encefalica (BBB), rendendo difficile valutare la neurotossicità dopo il trattamento con cellule T CAR50,51,52,53.

La neurotossicità è associata all'infiltrazione delle cellule T e all'attivazione delle cellule mieloidi nel sistema nervoso centrale. Tuttavia, nella maggior parte dei casi di neurotossicità dopo terapia con cellule T CAR, l'integrità della BBB viene interrotta50,54. Pertanto, non è chiaro se il tracciante non sia in grado di attraversare il BBB in questo ambiente compromesso. Ulteriori studi devono essere condotti per convalidare se la neurotossicità dopo la terapia con cellule T CAR può essere ripresa con [18F]TFB-PET. Sebbene la breve emivita di [18F]TFB sia sicura per i pazienti e il personale, rende difficile il suo approvvigionamento per l'ospedale. Pertanto, gli istituti devono essere dotati di ciclotroni o avere accesso a una struttura regionale. La metodologia qui descritta nel protocollo può potenzialmente essere applicata a una varietà di altre cellule T CAR tramite doppia trasduzione per visualizzare e valutare le cellule T CAR in vivo utilizzando la scansione [18F]TFB-PET.

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Disclosures

SSK è un inventore di brevetti nell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis) e Mettaforge (attraverso Mayo Clinic). RS, MJC e SSK sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen. SSK riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen. Le figure sono state create con BioRender.com.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso la pipeline Mayo Clinic K2R (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e la Predolin Foundation (RS). Le figure 1, 2 e 4 sono state create con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Cancer Research CAR T cell NIS reporter [18F]TFB-PET imaging non invasivo
Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [<sup>18F</sup>] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata
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Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

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