Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

Dit protocol beschrijft de methodologie voor het niet-invasief volgen van T-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om chimere antigeenreceptoren in vivo tot expressie te brengen met een klinisch beschikbaar platform.

Abstract

T-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om chimere antigeenreceptoren (CAR) tot expressie te brengen, hebben ongekende resultaten laten zien in cruciale klinische onderzoeken voor patiënten met B-cel maligniteiten of multipel myeloom (MM). Talrijke obstakels beperken echter de werkzaamheid en verbieden het wijdverbreide gebruik van CAR T-celtherapieën als gevolg van slechte handel en infiltratie in tumorlocaties en gebrek aan persistentie in vivo. Bovendien zijn levensbedreigende toxiciteiten, zoals cytokine release syndrome of neurotoxiciteit, grote zorgen. Efficiënte en gevoelige beeldvorming en tracking van CAR T-cellen maakt de evaluatie van T-celhandel, uitbreiding en in vivo karakterisering mogelijk en maakt de ontwikkeling van strategieën mogelijk om de huidige beperkingen van CAR T-celtherapie te overwinnen. Dit artikel beschrijft de methodologie voor het opnemen van de natriumjodidesymporter (NIS) in CAR T-cellen en voor CAR T-celbeeldvorming met behulp van [18F]tetrafluoroboraat-positronemissietomografie ([18F]TFB-PET) in preklinische modellen. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden toegepast op andere CAR-constructies en doelgenen naast de methoden die voor deze studie worden gebruikt.

Introduction

Chimere antigeenreceptor T (CAR T) celtherapie is een snel opkomende en potentieel curatieve benadering bij hematologische maligniteiten1,2,3,4,5,6. Buitengewone klinische resultaten werden gerapporteerd na CD19-gerichte CAR T (CART19) of B-celrijpingsantigeen (BCMA) CAR T-celtherapie2. Dit leidde tot de goedkeuring door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) van CART19-cellen voor agressief B-cellymfoom (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 en lisocabtagene maraleucel)7, acute lymfoblastische leukemie (Tisa-Cel)5,8, mantelcellymfoom (brexucabtagene autoleuce)9 en folliculair lymfoom (Axi-Cel)10 . Onlangs keurde de FDA BCMA-gerichte CAR T-celtherapie goed bij patiënten met multipel myeloom (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Bovendien bevindt CAR T-celtherapie voor chronische lymfatische leukemie (CLL) zich in een laat stadium van klinische ontwikkeling en zal naar verwachting binnen de komende drie jaar goedkeuring van de FDA krijgen1.

Ondanks de ongekende resultaten van CAR T-celtherapie, wordt het wijdverbreide gebruik ervan beperkt door 1) onvoldoende in vivo CAR T-celuitbreiding of slechte handel naar tumorlocaties, wat leidt tot lagere percentages van duurzame respons12,13 en 2) de ontwikkeling van levensbedreigende bijwerkingen, waaronder cytokine release syndrome (CRS)14,15 . De kenmerken van CRS omvatten niet alleen immuunactivatie die resulteert in verhoogde niveaus van inflammatoire cytokines / chemokines, maar ook massale T-celproliferatie na CAR T-celinfusie15,16. De ontwikkeling van een gevalideerde strategie van klinische kwaliteit om CAR T-cellen in vivo in beeld te brengen, zou dus 1) CAR T-celtracking in realtime in vivo mogelijk maken om hun handel naar tumorlocaties te volgen en potentiële mechanismen van resistentie te ontdekken, en 2) monitoring van CAR T-celuitbreiding en mogelijk hun toxiciteiten voorspellen, zoals de ontwikkeling van CRS.

Klinische kenmerken van mild CRS zijn hoge koorts, vermoeidheid, hoofdpijn, huiduitslag, diarree, artralgie, myalgie en malaise. Bij ernstiger CRS kunnen patiënten tachycardie/hypotensie, capillair lek, hartdisfunctie, nier-/leverfalen en gedissemineerde intravasculaire stolling ontwikkelen17,18. Over het algemeen is aangetoond dat de mate van verhoging van cytokines, waaronder interferon-gamma, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor, interleukine (IL)-10 en IL-6, correleert met de ernst van klinische symptomen17,19. De uitgebreide toepassing van "real-time" serumcytokinemonitoring om CRS te voorspellen is echter moeilijk vanwege de hoge kosten en beperkte beschikbaarheid. Om de gunstige eigenschappen van CAR T-celtherapie te benutten, kan niet-invasieve beeldvorming van adoptieve T-cellen mogelijk worden gebruikt om de werkzaamheid, toxiciteit en terugval na CAR T-celinfusie te voorspellen.

Verschillende onderzoekers hebben strategieën ontwikkeld om op radionuclide gebaseerde beeldvorming te gebruiken met positronemissietomografie (PET) of single-photon emission computed tomography (SPECT), die een hoge resolutie en hoge gevoeligheid biedt20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 voor de in vivo visualisatie en monitoring van CAR T-celhandel. Onder die op radionucliden gebaseerde beeldvormingsstrategieën is de natriumjodidesymporter (NIS) ontwikkeld als een gevoelige modaliteit voor beeldcellen en virussen met behulp van PET-scans31,32. NIS+CAR T-celbeeldvorming met [18F]TFB-PET is een gevoelige, efficiënte en handige technologie om CAR T-celuitbreiding, -handel en -toxiciteit te beoordelen en te diagnosticeren30. Dit protocol beschrijft 1) de ontwikkeling van NIS+CAR T-cellen door middel van dubbele transductie met hoge werkzaamheid en 2) een methodologie voor het in beeld brengen van NIS+CAR T-cellen met [18F]TFB-PET-scan. BCMA-CAR T-cellen voor MM worden gebruikt als een proof-of-concept model om NIS te beschrijven als een reporter voor CAR T-celbeeldvorming. Deze methoden kunnen echter worden toegepast op elke andere CAR T-celtherapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board van Mayo Clinic, het Institutional Biosafety Committee en het Institutional Animal Care and Use Committee van Mayo Clinic.

1. NIS+ BCMA-CAR T-cel productie

OPMERKING: Dit protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board van de Mayo Clinic (IRB 17-008762) en de Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).

  1. Productie van BCMA-CAR, NIS en luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP)-coderend voor lentivirussen.
    OPMERKING: Een BCMA-CAR-construct van de tweede generatie werd de novo gesynthetiseerd (zie de tabel met materialen) en gekloond tot een lentivirale vector van de derde generatie onder controle van een elongatiefactor-1 alfa (EF-1α) promotor. De BCMA-CAR-constructie (C11D5.3-41BBz) omvatte 4-1BB costimulatie en een single-chain variable fragment (scFv) afgeleid van een anti-humane BCMA antilichaam kloon C11D5.333,34. De NIS staat onder controle van de EF-1α promotor en bindt aan het puromycine resistentie gen via zelfklievende peptiden (P2A). De lentivirale vector die codeert voor luciferase-GFP (zie de tabel met materialen) wordt gebruikt om tumorcellen te transduceren, die vervolgens GFP en luciferase tot expressie brengen.
    1. Bereid lentivirale vectorplasmiden voor: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) en pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      OPMERKING: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro en pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro bevatten het puromycineresistentiegen. Daarom kunnen NIS- of luciferase-GFP-getransduceerde cellen worden geselecteerd met 1 μg /ml of 2 μg / ml puromycinedihydrochloride, zoals eerder beschreven14,35.
    2. Zaad 20 × 106 van 293T-cellen in een T175-kolf en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2. Bevestig dat 293T-cellen gelijkmatig over de kolf zijn verdeeld bij 70-90% confluentie door directe visualisatie onder de microscoop.
    3. Bereid een mastermix voor van 15 μg van de expressievector (bijv. CAR, NIS of luciferase-GFP lineair DNA), 7 μg van de envelopvector (VSV-G) en 18 μg van de verpakkingsvector (gag, pol, rev en tat). Verdun het DNA-mastermengsel in 4,5 ml van het transfectiemedium en voeg vervolgens 111 μL van het pre-complexerende reagens (mengsel A) toe.
    4. Bereid een nieuwe buis en verdun 129 μL van het liposomale transfectiereagens in 4,5 ml van het transfectiemedium (mengsel B).
    5. Combineer mengsels A en B en veeg op de buis om de inhoud te mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    6. Na de incubatie, gewoon aspirateren van de cel supernatant zonder de cellen los te maken en voeg 16 ml van een groeimedium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-glutamine toe. Voeg vervolgens het mengsel van mengsels A en B toe aan 293T-cellen druppelsgewijs. Incubeer ten slotte de getransfecteerde cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
    7. Oogst op dag 1 en 2 na de transfectie het supernatant van 293T, draai gedurende 10 minuten op 900 × g en filter door een nylonfilter van 0,45 μm. Concentreer het filtraat bij 24 en 48 uur ultracentrifugatie bij 112.700 × g gedurende 2 uur en vries in bij -80 °C.
  2. Ex-vivo T-celisolatie (figuur 1)
    OPMERKING: Voer al het celkweekwerk uit in een laminaire stroomkast met behulp van aseptische techniek en persoonlijke beschermingsmiddelen. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden geoogst uit gezond donorbloed dat is verzameld tijdens aferese36. Pathogeenscreening werd uitgevoerd op menselijke cellen die in deze studie werden gebruikt.
    1. Gebruik de standaard dichtheidsgradiënttechniek om PBMC's te isoleren.
      1. Voeg voorzichtig 15 ml dichtheidsgradiëntmedium (dichtheid van 1,077 g/ml) (met alfa-D-glucopyranoside, bèta-D-fructofuranosylhompolymeer en 3-(acetylamino)-5-(acetylmethylamino)-2,4,6-triodobenzoëzuurmonoodiumzout) toe aan een scheidingsbuis van 50 ml dichtheidsgradiënt zonder luchtbellen te creëren (zie de materialentabel).
      2. Om celvangst te voorkomen, verdunt u het bloedmonster met fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS, 0,2 g/l kaliumchloride, 0,2 g/l kaliumfosfaat monobasisch, 8 g/l natriumchloride en 1,15 g/l natriumfosfaat dibasisch) met 2% FBS bij een volumeverhouding van 1:1. Breng het verdunde bloed voorzichtig over op het medium met dichtheidsgradiënt zonder het raakvlak tussen de twee te verbreken. Draai naar beneden bij 1.200 × g gedurende 10 minuten bij RT.
        OPMERKING: Een scheidingsbuis met een dichtheidsgradiënt van 50 ml kan worden gebruikt voor de isolatie van 4-17 ml van een bloedmonster. De 50 ml dichtheid gradiënt scheidingsbuis (zie de tabel met materialen) die in dit protocol wordt gebruikt, vereist niet de "brake off" tijdens het centrifugeren. Wanneer echter standaardbuizen van 50 ml worden gebruikt, moet de rem uit en moet deze 30 minuten worden gecentrifugeerd.
      3. Breng het supernatant over in een nieuwe conische buis van 50 ml, was met PBS + 2% FBS door tot 50 ml te vullen en draai vervolgens gedurende 8 minuten bij RT op 300 × g .
      4. Zuig het supernatant op en resuspend de gepelleteerde cellen in 50 ml PBS + 2% FBS. Tel het aantal cellen en draai vervolgens 8 minuten lang af op 300 × g bij RT. Herhaal de vorige stap voor een totaal van 2 wasbeurten.
    2. Adem het supernatant op en resuspend de gepelleteerde cellen tot een concentratie van 50 × 106 cellen / ml met PBS + 2% FBS.
    3. Voer T-celisolatie uit van PBMC's met behulp van een magnetische kralenkit met negatieve selectie.
      OPMERKING: Een ideale negatieve selectiekit bevat magnetische kralen die zijn bevestigd aan antilichamen tegen antigenen die tot expressie komen op andere cellen dan T-cellen. Een veelgebruikte kit bevat antilichamen geconjugeerd aan magnetische kralen tegen CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 en CD16 (zie Materiaaltabel).
      1. Breng PBMC's over naar een polystyreen buis met ronde bodem van 14 ml. Plaats vervolgens de PBMC's en de negatieve selectie antilichaamcocktail in een volledig geautomatiseerde celscheider en voer T-celisolatie uit volgens het protocol van de fabrikant.
  3. T-celstimulatie en T-celexpansie (figuur 1)
    1. Om de geïsoleerde T-cellen te kweken, bereidt u T-celexpansiemedium (TCM) voor gemaakt met serumvrij hematopoietisch celmedium aangevuld met 10% humaan serumalbumine en 1% penicilline-streptomycine-glutamine14. Tel na T-celisolatie de cellen en kweek in een concentratie van 2 × 106 cellen/ml met TCM.
    2. Was anti-CD3/CD28 kralen drie keer met TCM voordat je kweekt met T-cellen.
      1. Meng de injectieflacon met de kralen door te wervelen. Pipetteer vervolgens het vereiste volume kralen (3:1 kralen:cel) (bijv. bij het stimuleren van 1,0 × 106 cellen van T-cellen, gebruik 3,0 × 106 anti-CD3/CD28-kralen) in een steriele microcentrifugebuis (1,5 ml) en resuspend in 1 ml TCM.
    3. Plaats de microcentrifugebuis met de kralen gedurende 1 minuut op een magneet en zuig het supernatant op. Verwijder de buis van de magneet en smeer de gewassen kralen opnieuw op in 1 ml TCM. Herhaal de vorige twee stappen voor een totaal van 3 wasbeurten.
    4. Resuspend de kralen in 1 ml TCM en breng ze over naar de T-cellen. Verdun vervolgens de T-cellen tot een eindconcentratie van 1,0 × 106 cellen / ml met TCM. Breng de T-cel/kraalsuspensie over op een met weefselkweek behandelde 6-wells plaat en plaats deze in de couveuse (37 °C, 5% CO2).
  4. Titratie van lentivirussen (figuur 2)
    1. Bereid T-cellen voor op titratietest. Zorg ervoor dat er ongeveer 1,0 x 106 cellen beschikbaar zijn om één type virus te titreren.
    2. Stimuleer T-cellen zoals beschreven in rubriek 1.3.2.
    3. Plaat 1.0 × 105 cellen van gestimuleerde T-cellen in een 96-well plaat (titerplaat) en incuberen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur (figuur 2A). Isoleer en stimuleer de T-cellen zoals beschreven in rubriek 1.2.
    4. Bereid een verdunningsplaat (96-well plate) voor door 100 μL TCM toe te voegen aan de putten van de aangewezen kolommen en de niet-getransformeerde controleputten (figuur 2B).
    5. Ontdooi een injectieflacon met lentivirale deeltjes op ijs en pipetteer voorzichtig op en neer om goed te mengen. Breng 50 μL van het virussupernatant over in de putten van kolom 6 van de 96-putplaat (verdunning 3) (figuur 2B). Pipetteer op en neer om goed te mengen.
    6. Seriële verdunningen uitvoeren (2-voudige seriële verdunning): breng 50 μL over van put A6 naar put B6 en vervolgens 50 μL van put B6 naar put C6; herhaal dit tot G6. Voeg vervolgens 50 μL van het verdunde virus toe aan de titerplaat (figuur 2B).
    7. Incubeer de titerplaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 48 uur en bepaal de percentages CAR-, NIS- of GFP-positieve cellen door middel van flowcytometrie (figuur 2C).
      1. Was de putjes door de titerplaat tweemaal bij 650 × g bij 4 °C gedurende 3 minuten naar beneden te draaien.
      2. Kleur de getransduceerde T-cellen zoals beschreven in stap 1.5.3 tot en met 1.5.9.
      3. Bepaal de titers op basis van de percentages CAR-, NIS- of GFP-positieve cellen met behulp van formule (1):
        Titers = Percentage BCMA-CAR+ of NIS+ T-cellen × T-celgetal bij transductie × de specifieke verdunning / volume (1)
  5. Transductie van lentivirussen en NIS+BCMA-CAR T cel expansie
    1. Vierentwintig tot 48 uur na T-celstimulatie, voer lentivirale transductie uit op gestimuleerde T-cellen (T-cellen moeten clusters vormen).
      1. Ontdooi de ingevroren lentivirussen die coderen voor CAR of NIS bij 4 °C.
      2. Meng de gestimuleerde T-cellen goed om de clusters te breken en voeg eenvoudig vers ontdooid virus toe bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 5,0 (gebruik bij het transduceren van 1,0 × 106 T-cellen 5,0 × 106 lentivirons). Incubeer de getransduceerde cellen bij 37 °C, 5% CO2.
      3. Tel op dag 3, 4 en 5 de getransduceerde T-cellen met behulp van een hematocytometer37 of een volledig geautomatiseerde celteller38 en pas de celconcentratie aan op 1,0 × 106 cellen / ml door verse, voorverwarmde TCM toe te voegen. Voor NIS-getransduceerde T-cellen die het puromycineresistentiegen dragen, behandelt u de cellen met 1 μg / ml puromycinedihydrochloride op dag 3, 4 en 5.
    2. Verwijder op dag 6 de anti-CD3/CD28-kralen uit de getransduceerde T-cellen (vanaf stap 1.3.4) door goed te mengen om de T-celclusters te breken en ze gedurende 1 minuut in een magneet te plaatsen. Plaats vervolgens de verzamelde getransduceerde T-cellen terug in cultuur in een concentratie van 1,0 × 106 cellen / ml. Na het verwijderen van de kralen uit de T-cellen, beoordeelt u de expressie van CAR en NIS door middel van flowcytometrie.
      OPMERKING: Omdat het variabele fragment met één keten van de BCMA-CAR is afgeleid van de muis, kan deze worden gekleurd met geiten-anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met Alexa Fluor 647. NIS kan worden gedetecteerd met behulp van anti-humaan ETNL [synthetisch peptide overeenkomend met aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Dit antilichaam herkent de cytosolische C-terminus van NIS. Daarom moeten T-cellen vóór incubatie worden gepermeabiliseerd met een anti-humaan NIS-antilichaam.
    3. Voer oppervlaktekleuring van BCMA-CAR uit met behulp van geiten-anti-muis IgG (H + L).
      1. Neem een aliquot van de cultuur (bijv. 50.000 T-cellen) en was met stroombuffer (PBS, 1% FBS en 1% natriumazide). Resuspend de cellen vervolgens met 50 μL flowbuffer en kleur de cellen met 1 μL geitenantilichaam voor het detecteren van CAR-expressie en 0,3 μL levend-dode aqua voor het uitsluiten van dode cellen.
      2. Incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij RT, was de cellen door 150 μL stroombuffer toe te voegen en centrifugeer de cellen bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    4. Na carkleuring aan het oppervlak fixeert en permeabiliseert u de cellen door toevoeging van 100 μL fixatiemedium (PBS met 4,21% formaldehyde) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C. Was de cellen tweemaal met 100 μL van een buffer die een celpermeabiliserend middel zoals saponine bevat (650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C).
    5. Resuspend de vaste/gepermeabiliseerde cellen in 50 μL van een permeabiliserende buffer. Voeg vervolgens 0,3 ng anti-humaan ETNL NIS-antilichaam toe aan 50 μL stroombuffer en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C.
    6. Voeg 150 μL stroombuffer toe en centrifugeer de cellen bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Incubeer de cellen met 2,5 μL antikonijn secundair antilichaam in 50 μL stroombuffer gedurende 30 minuten bij 4 °C, was de cellen door 150 μL stroombuffer toe te voegen en centrifugeer bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    7. Resuspend ten slotte in 200 μL stroombuffer en voer flowcytometrie uit om de transductie-efficiëntie te bepalen (figuur 3A,B).
    8. Tel en draai op dag 8 de T-cellen bij 300 × g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Resuspend de T-cellen met vriesmedium (90% FBS + 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) in een concentratie van 10 × 106 / ml en breng vervolgens 1 ml elk over naar gelabelde cryovialen.
    9. Plaats de injectieflacons gedurende 48 uur in een vriezer van -80 °C. Breng na 48 uur (en op dag 10) de T-cellen over in vloeibare stikstof.
      OPMERKING: Zie figuur 1 voor het overzicht van de productie van NIS+ CAR T-cellen. Figuur 3D geeft voorbeelden van ex vivo T-celexpansie van drie verschillende donoren.

2. NIS + BCMA-CAR T-cel beeldvorming met [ 18F] TFB-PET scan

OPMERKING: Dit protocol volgt de richtlijnen van mayo clinic's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767-16), IRB en IBC (Bios00000006.04). OPM-2 is een BCMA+ MM cellijn, die vaak wordt gebruikt als doelcellijn voor BCMA-CAR T cellen39,40.

  1. Stel luciferase+ BCMA+ OPM-2 cellen vast.
    1. Zaad 500.000 OPM-2 cellen in een weefselkweek-behandelde 24-well plaat. Ontdooi lentivirus dat codeert voor luciferase-GFP bij 4 °C.
    2. Voeg het vers ontdooide virus bij een MOI van 3,0 toe aan OPM-2 cellen en meng goed door te pipetteren. Plaats de plaat in de couveuse (37 °C, 5% CO2).
    3. Achtenveertig uur na de transductie voegt u 2 μg / ml puromycine toe om de getransduceerde cellen te selecteren. Beoordeel vier dagen na de transductie de GFP-positieve cellen (luciferase-positief) door middel van flowcytometrie (figuur 3E).
  2. Stel BCMA+ OPM-2 xenograft muismodellen vast (figuur 4).
    1. Tel luciferase+ OPM-2 cellen en draai ze twee keer om alle celkweekmedia te verwijderen. Resuspend de OPM-2 cellen in een concentratie van 10 × 106 cellen/ml met PBS.
    2. Injecteer op dag -21 100 μL (1,0 × 106 cellen) luciferase+ OPM-2 cellen in de staarten van 8 tot 12 weken oude immuungecompromitteerde NOD-scid IL2rγnull (NSG) muizen (Figuur 4).
    3. Controleer op dag 20 na de OPM-2 celinjectie (dag -1 van CAR T-celinjectie) de tumorbelasting via bioluminescentiebeeldvorming (BLI) (figuur 4).
      OPMERKING: OPM-2-cellen vormen een langzaam groeiende tumor, die meestal 2-3 weken nodig heeft om te enten.
    4. Dien 10 μL/g D-luciferine toe aan OPM-2 xenograft muizen via intraperitoneale (IP) injectie. Voer na 10 minuten BLI uit op de muizen onder 2% isofluraangas (figuur 5A). Na bevestiging van tumortransplantatie, randomiseer de muizen op basis van de tumorlast.
    5. Ontdooi op dag -1 van de CAR T-celinjectie NIS+BCMA-CAR T-cellen en verwijder het vriesmedium door centrifugering (300 × g, 8 min, 4 °C). Vervolgens worden de resuspendcellen met TCM bij 2,0 × 106 cellen/ml en incuberen ze 's nachts (37 °C, 5% CO2).
    6. Tel en centrifugeer op dag 0 de NIS+BCMA-CAR T-cellen (300 × g, 8 min, 4 °C). Resuspend de NIS+BCMA-CAR T-cellen bij 50 × 106 cellen/ml met PBS.
    7. Dien 100 μL (5,0 × 106 cellen) NIS+BCMA-CAR T-cellen toe via staartaderinjectie aan de OPM-2 xenograftmuizen. Stel op dag 7 en 15 de muizen in beeld met behulp van een PET-scan.
  3. NIS+BCMA-CAR T cel in vivo beeldvorming met behulp van BCMA+OPM-2 xenograft muis model.
    1. Weeg de muizen vóór de beeldvorming en verwijder alle metalen oormerken om metaalgerelateerde artefacten te elimineren.
    2. Bereid [18F]TFB voor zoals eerder beschreven41.
      OPMERKING: [18F]TFB moet worden geproduceerd op de dag van gebruik. De radiochemische zuiverheid moet >99% zijn en de molaire activiteit >5 GBq/mmol.
    3. Injecteer 9,25 MBq [18F]TFB intraveneus via staartaderinjectie. Laat een opnameperiode van ~ 40 minuten voordat de radiotracer in het lichaam wordt verdeeld en het bloed zuivert.
    4. De muis verdoven met isofluraaninhalatie (2%).
      OPMERKING: Isofluraan is het geprefereerde geïnhaleerde verdovingsmiddel omdat het een snel en betrouwbaar begin en herstel heeft.
    5. Voordat u de muis verdooft, reinigt u alle oppervlakken van het anesthesieapparaat met desinfecterende reinigingsmiddelen.
    6. Plaats de muis in de inductiekamer. Draai de verdamperknop naar 2% en wacht tot de muis binnen 1-2 minuten ligbaar en niet-responsief is.
    7. Controleer de muis om onvoldoende anesthesie of overmatige depressie van ademhalingsfuncties te voorkomen. Kortom, knijp teen om de onvoldoende anesthesie te bevestigen.
      OPMERKING: De normale ademhalingsfrequentie is maximaal 180/min en de acceptabele valsnelheid is 50%.
    8. Breng oogheelkundige zalf aan om uitdroging en trauma van het hoornvlies te voorkomen.
    9. Verkrijg PET/CT-beelden 45 minuten na de injectie met de verdoofde muis in een micro-PET/CT-beeldvormingswerkstation (zie de materiaaltabel). Verkrijg vervolgens statische PET-beelden gedurende 15 minuten, gevolgd door CT-beeldacquisitie gedurende 5 minuten met 360 ° rotatie en 180 projecties bij 500 μA, 80 keV en 200 ms belichting.
  4. Analyse van verkregen beeldgegevens
    1. Analyseer de afbeeldingen met behulp van PET-beeldverwerkingssoftware (figuur 5B en aanvullende video S1).
    2. Definieer het volume van interesse (VOI).
    3. Bereken de gestandaardiseerde opnamewaarde (SUV) met behulp van de formule (2).
      SUV in VOI = Concentratie van activiteit in VOI (MBq/ml) × lichaamsgewicht (g) / toegediende dosis (MBq) (2)
  5. Bevestiging van NIS+BCMA-CAR T-celhandel naar de tumorplaatsen met de flowcytometrie
    1. Na [18F]TFB-PET-beeldvorming plaatst u de muis terug in de kooi. Controleer na het stoppen van de anesthesie de dieren totdat ze in staat zijn tot doelgerichte beweging en zorg ervoor dat ze toegang hebben tot voedsel en water.
    2. Controleer de muizen tot het verval van de geïnjecteerde [18F] TFB. Zodra de radio-isotoop niet detecteerbaar is, euthanaseer de muizen met CO2.
    3. Om te euthanaseren, plaatst u de muizen in de kooi (niet meer dan 5 muizen per kooi).
    4. Stel de muizen bloot aan CO2 totdat de ademhaling in ongeveer 5-10 minuten volledig is gestopt.
      LET OP: Deze euthanasiemethode moet in overeenstemming zijn met de AVMA Richtlijnen voor De Euthanasie van Dieren (Editie 2020).
    5. Om de dood van de muizen te garanderen, voert u cervicale dislocatie uit door de achterkant van het hoofd en de basis van de staart van het dier vast te pakken en vervolgens de handen uit elkaar te trekken / van elkaar weg te trekken.
    6. Oogst het beenmerg om te bevestigen dat de NIS + BCMA-CAR T-cellen efficiënt naar de tumorplaats gaan.
    7. Breng de geoogste dijbenen en scheenbeen over op een 6-putplaat met 5 ml celkweekmedium. Verwijder de spieren en pezen van de dijbenen en het scheenbeen en snijd eenvoudig beide uiteinden (boven de gewrichten) van de dijbenen en het scheenbeen door.
    8. Vul een insulinespuit met het celkweekmedium en spoel het beenmerg op de 6-putplaat. Gebruik voor dijbenen 22 G-naalden en spuiten van 5 ml omdat de dijbeendiameter groter is dan die van het scheenbeen.
    9. Gebruik het platte uiteinde van de zuiger om het beenmerg te slijpen. Plaats een celzeef van 70 μm op een steriele conische buis van 50 ml en filter het gemalen beenmerg. Vul vervolgens de buis met de stroombuffer en centrifugeer de buis gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 300 × g .
    10. Zuig het supernatant op en resuspend het beenmerg met 5 ml stroombuffer. Breng 200 μL beenmerg over op een plaat met 96 putten. Centrifugeer de plaat bij 300 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatant en resuspend de cellen met 50 μL stroombuffer.
    11. Kleur het beenmerg met stroomantistoffen tegen 0,25 μg muis-CD45, 0,03 μg humane CD45, 0,06 μg humane CD3, 0,24 μg humane BCMA en 0,3 μL levende/dode aqua. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
    12. Centrifugeer de plaat bij 300 × g gedurende 3 min bij 4 °C. Voeg vervolgens 200 μL stroombuffer toe en voer uit op de flowcytometer (figuur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 geeft de stappen weer voor het genereren van NIS+BCMA-CAR T-cellen. Isoleer pbmc's op dag 0 en isoleer vervolgens T-cellen door negatieve selectie. Stimuleer vervolgens T-cellen met anti-CD3/CD28-kralen. Op dag 1 transduceren T-cellen met zowel NIS- als BCMA-CAR-lentivirussen. Tel op dag 3, 4 en 5 T-cellen en voer met media om de concentratie aan te passen op 1,0 × 106 / ml. Voeg voor NIS-getransduceerde T-cellen 1 μg/ml puromycine toe om NIS+ -cellen te selecteren. Verwijder op dag 6 de kralen door de cellen een minuut in de magneet te plaatsen. Doe vervolgens de ontkraalde cellen uit de buis in een nieuwe kolf. Neem een hoeveelheid cellen (bijv. 50.000 cellen) en kleur met antilichamen om de expressie van NIS en CAR op het oppervlak van T-cellen te controleren met behulp van flowcytometrie. Tel op dag 8 de T-cellen en cryopreserve met vriesmedia in de concentratie van 10 × 106 /ml.

Figuur 2 geeft de contouren weer van het titreren van de lentivirussen. Op dag 0 resuspend T-cellen in de concentratie van 1,0 × 106 /ml in TCM. Stimuleer vervolgens T-cellen met anti-CD3/CD28-kralen in een verhouding van 1:3 cel:kralen. Voeg 100 μL (100.000 cellen) T-cellen toe aan de gekleurde putten zoals aangegeven in figuur 2A. Deze plaat wordt een "titerplaat" genoemd. Incubeer de titerplaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur. Bereid op dag 1 de verdunningsplaat voor. Voeg 100 μL TCM toe aan de gekleurde putjes zoals aangegeven in figuur 2B. Voeg vervolgens 50 μL vers ontdooide lentivirussen toe aan de eerste rij (bijvoorbeeld A6, A7 of A8 zoals afgebeeld in figuur 2B). Voer seriële verdunning uit door 50 μL over te brengen van A6 naar B6 en vervolgens 50 μL van B6 naar C6, herhalend tot G6. Voer ook seriële verdunning uit voor A7 en A8. Breng vervolgens 50 μL van het verdunde virus over naar de titerplaat. Vierentwintig uur na het overbrengen van het virus van de verdunningsplaat naar de titerplaat, voedt u de cellen met 100 μL TCM. Op dag 3 kleuren cellen met antilichamen en analyseren de expressie van NIS en BCMA op de T-cellen via flowcytometrie.

Figuur 3A,B toont de representatieve stroomplots van BCMA-CAR T- of NIS+BCMA-CAR T-cellen. T-cellen zijn gated op FSC/SSC, gevolgd door singlet- en live-celldiscriminatie. Meer dan 90% van de cellen zijn NIS+-cellen (figuur 3B). Figuur 3C toont de representatieve stroomplot voor de samenstelling van NIS+BCMA-CAR T-cellen. Net als bij figuur 3A,B zijn T-cellen gated op FSC/SSC, gevolgd door singlet- en live-celldiscriminatie. Figuur 3D toont de T-celexpansiecurve van dag 0 tot en met 8. Er zijn geen vouwuitbreidingsverschillen tussen UTD-, BCMA-CAR T- of NIS+BCMA-CAR T-cellen. Figuur 3E toont de GFP-expressie op OPM-2-cellen na de transductie van lentivirus die codeert voor GFP en luciferase, gevolgd door puromycineselectie.

Figuur 4 is de omtrek van het in beeld brengen van NIS+BCMA-CAR T-cellen in vivo met [18F]TFB-PET. Ent zes tot acht weken oude muizen met 1,0 × 106 cellen luciferase+ OPM-2 cellen via staartaderinjectie op dag -21. Beoordeel de tumorbelasting met BLI op dag -1. Randomiseer de muizen op dag 0 op basis van de tumorbelasting die moet worden behandeld met NIS + BCMA-CAR T-cellen via staartaderinjectie of gecontroleerd zonder enige behandeling (onbehandeld xenograft). Stel je de muizen met BLI voor op dag 6. Voer [18F]TFB-PET uit op dag 7 om NIS+BCMA-CAR T-cellen in beeld te brengen.

Figuur 5A toont de representatieve BLI 20 dagen na de inenting van luciferase+OPM-2 cellen in de NSG muizen. Figuur 5B toont de representatieve PET-beeldvorming een week na toediening van NIS+BCMA-CAR T-cellen. [18F] TFB-opname wordt waargenomen in het borstbeen, de stekels, het bekken en de dijbenen. Bovendien wordt fysiologische opname van [18F] TFB gezien in de schildklier en maag. Figuur 5C toont de representatieve stroomplots van van femur afgeleid beenmerg geoogst uit de onbehandelde xenograft of NIS+BCMA-CAR T-celbehandelde muizen. Beenmergmonsters zijn gekleurd met muis CD45, menselijke CD45, menselijke CD3 en menselijke BCMA. Cellen zijn gated op FSC /SSC, gevolgd door singlet, live en human-cell discriminatie. Beenmergmonsters afgeleid van onbehandeld xenograft tonen BCMA + -cellen, terwijl NIS + BCMA-CAR T-cel behandelde muis CD3 + -cellen toont, die de [18F] TFB-PET-bevinding ondersteunen.

Figure 1
Figuur 1: PRODUCTIESCHEMA NIS+BCMA-CAR T-cellen. Normale donor CD3 T-cellen (geïsoleerd uit perifere mononucleaire bloedcellen) met behulp van negatieve kraalselectie. T-cellen worden verguld op 1,0 × 106 /ml en uitgebreid in TCM met behulp van anti-CD3 / CD28-kralen toegevoegd op dag 0 van de cultuur en verwijderd op dag 6. T-cellen worden dubbel getransduceerd met lentivirussen die coderen voor NIS of BCMA-CAR op dag 1 (MOI = 5,0). NIS+BCMA-CAR T-cellen worden behandeld met 1 μg/ml puromycine op dag 3, 4 en 5. T-cellen worden gedurende 8 dagen in cultuur uitgebreid. T-cellen worden gecryopreserveerd in FBS met 10% DMSO voor toekomstige experimenten. T-cellen worden ontdooid en 's nachts bij 37 °C uitgerust voordat alle experimenten worden uitgevoerd. Afkortingen: CD = cluster van differentiatie; TCM = T-cel expansiemedium; BCMA = B-cel rijpingsantigeen; CAR = chimere antigeenreceptor; NIS = natriumjodide symporter; GFP = groen fluorescerend eiwit; PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen; MOI = veelheid van infectie; FBS = foetaal runderserum; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Lentivirustitratie. (A) Stimuleer T-cellen op dag 0 met anti-CD3/CD28-kralen in een verhouding van 3:1 kralen:cel. Voeg 100 μL van 1,0 × 106/ml gestimuleerde T-cellen toe aan de gekleurde putjes zoals aangegeven in de cartoon. Incubeer vervolgens de titerplaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur. (B) Bereid een verdunningsplaat voor door 100 μL TCM toe te voegen aan de gekleurde putten zoals aangegeven in de cartoon. Voeg 50 μL vers ontdooid virus toe aan A6, A7 of A8 (bijv. BCMA-CAR aan A6, NIS aan A7 en luciferase-GFP aan A8). Verdun vervolgens het virus serieel door 50 μL over te brengen van A6 naar B6 en vervolgens 50 μL van B6 naar C6, herhalend tot G6. Voer ook seriële verdunning uit voor A7 en A8. Breng 50 μL van het verdunde virus over op de titerplaat. (C) Kleur op dag 3 de cellen met overeenkomstige antilichamen en analyseer de titerplaat door middel van flowcytometrie. Afkortingen: CD = cluster van differentiatie; TCM = T-cel expansiemedium; BCMA = B-cel rijpingsantigeen; CAR = chimere antigeenreceptor; NIS = natriumjodide symporter; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Het genereren van NIS+BCMA-CAR T cellen en luciferase-GFP positieve OPM-2 cellen. (A en B) Cellen zijn gated op FSC/SSC, gevolgd door singlet en live-cell discriminatie. Representatieve stroomdiagrammen van (A) niet-getransformeerde T- en BCMA-CAR T-cellen en (B) UTD en NIS+BCMA-CAR T worden weergegeven. NIS+BCMA-CAR T-cellen worden gegenereerd door co-transductie van twee virussen op dag 1 van T-celuitbreiding, zoals beschreven in figuur 2. Op dag 6 worden cellen gekleurd voor CARs en NIS. (C) De fenotypische analyse van NIS+BCMA-CAR T. De representatieve stroomplot van NIS+BCMA-CAR T-cellen wordt weergegeven. (D) Samenvatting van de celgroeikinetiek van de UTD, BCMA-CAR T of NIS+BCMA-CAR T. Integratie van BCMA-CAR en/of NIS heeft geen invloed op T-celexpansie (tweerichtings-ANOVA, n=3 biologische replicaties, gemiddelde ± SD). (E) Flowcytometrische analyse van luciferase-GFP-getransduceerde OPM-2. OPM-2-cellen worden getransduceerd met lentivirus dat codeert voor luciferase-GFP met puromycineresistentie. Achtenveertig uur na transductie worden OPM-2-cellen behandeld met 2 μg / ml puromycine. Cellen worden nog twee dagen uitgebreid en de expressie van GFP wordt geanalyseerd via flowcytometrie. Afkortingen: CD = cluster van differentiatie; BCMA = B-cel rijpingsantigeen; CAR = chimere antigeenreceptor; NIS = natriumjodide symporter; GFP = groen fluorescerend eiwit; UTD = niet-vertaald; FSC/SSC = voorwaartse verstrooiing/zijverstrooiing; ANOVA = variantieanalyse; n.s.= niet significant; SD = standaarddeviatie; FL-1-A = oppervlakte van fluorofoor 1; FITC-A = oppervlakte van fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Schema voor in vivo trafficking assay in een systemisch OPM2 xenograft model. Injecteer zes tot acht weken oude NSG-muizen met 1,0 × 106 luciferase-positieve OPM-2-cellen via de staartader op dag -21. Voer op dag -1 bioluminescente beeldvorming uit op de muizen om de engraftment van OPM-2-cellen te bevestigen. Injecteer muizen op dag 0 met 5,0 × 106 NIS+BCMA-CAR T-cellen. Beeld muizen met [18F]TFB-PET/CT op dag 7 om de handel in NIS+BCMA-CAR T cellen te beoordelen. Afkortingen: BCMA = B cell maturation antigen; CAR = chimere antigeenreceptor; NIS = natriumjodide symporter; BLI = bioluminescente beeldvorming; NSG = immuungecompromitteerde NOD-scid IL2rγnull; luc = luciferase; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborate positron emissie tomografie/computertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: In vivo trafficking assay in een systemisch OPM2 xenograft model. (A en B) BCMA+luciferase+OPM2 cellen worden intraveneus geïnjecteerd in NSG muizen. Muizen ontvangen NIS + BCMA CAR T-cellen drie weken na de inenting van OPM-2-cellen. (A) BLI bevestigt de engraftment van OPM-2 cellen. (B) [18F]TFB-PET onthult NIS+BCMA-CAR T-celhandel naar het beenmerg. (C) Om te bevestigen dat OPM-2-cellen enten in het beenmerg en NIS + BCMA-CAR T-cellen naar de tumorplaats gaan, worden muizen na de beeldvorming geëuthanaseerd en wordt het beenmerg geoogst. Flowcytometrische analyse toonde aan dat OPM-2-cellen worden geënt in het beenmerg (links) en NIS + BCMA-CAR T-cellen zijn aanwezig in het beenmerg (rechts). Afkortingen: BCMA = B cell maturation antigen; CAR = chimere antigeenreceptor; NIS = natriumjodide symporter; BLI = bioluminescente beeldvorming; NSG = immuungecompromitteerde NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie; IVIS = in vivo beeldvormingssysteem; CD = cluster van differentiatie; SUV = gestandaardiseerde opnamewaarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video S1: Driedimensionale (3D) weergave van PET/CT-gegevens die de in vivo verdeling van [18F]TFB in de schildklier, maag en beenmerg laten zien. Afkortingen: BCMA = B cell maturation antigen; CAR = chimere antigeenreceptor; NIS = natriumjodide symporter; PET/CT = positronemissietomografie/computertomografie. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het opnemen van NIS in CAR T-cellen en beeldvorming geïnfundeerde CAR T-cellen in vivo via [18F] TFB-PET. Als proof of concept werden NIS+BCMA-CAR T-cellen gegenereerd via dubbele transductie. We hebben onlangs gemeld dat het opnemen van NIS in CAR T-cellen de functies en werkzaamheid van DE CAR T-cel in vivo niet schaadt en CAR T-celhandel en -expansie mogelijk maakt30. Naarmate CAR T-celtherapieën zich blijven uitbreiden van de huidige B-celmaligniteiten naar toepassingen in CLL, zal er een grotere behoefte zijn aan hulpmiddelen die niet-invasieve in vivo beeldvorming en monitoring van geïnfundeerde adoptieve T-cellen mogelijk maken. Dynamische beeldvorming van T-cellen zal de validatie van adoptieve T-celhandel mogelijk maken en mogelijk een eerdere detectie van werkzaamheid en toxiciteit mogelijk maken.

NIS is onderzocht en gevalideerd als een gevoelige modaliteit voor beeldcellen en virussen in klinische onderzoeken32,42. Fysiologische accumulatie van tracers voor NIS wordt voornamelijk gezien in de schildklier / speekselklieren, maag en blaas, die geen veel voorkomende organen zijn die worden aangetast door vloeibare tumoren44. Vooral bij MM worden kwaadaardige plasmacellen vaak verdeeld in het beenmerg of de botten, en een extramedullair plasmacytoom in laesies, waar de fysiologische accumulatie van tracers voor NIS optreedt, is een zeldzaam fenomeen44,45. Bovendien is NIS niet-immunogeen en daarom geschikt voor longitudinale beeldvormingsstudies46. NIS is een intrinsiek membraaneiwit dat jodide in het cytosol transporteert en 13 vermeende transmembraansegmenten bevat met een extracellulaire amino-terminusplaats en cytosolische carboxy-terminus47.

NIS kan worden gevisualiseerd met gamma- of positron-emitterende radio-isotopen zoals technetium-99m (99mTc) pertechnetaat, jodide-123 (123I), 131I, 124I en [18F]TFB43. Onlangs is [18F] TFB naar voren gekomen als een veelbelovend jodide-analoog voor NIS-gebaseerde PET-beeldvorming, omdat het vergelijkbare biochemische eigenschappen heeft en radiogesynthetiseerd is48. Een voordeel van TFB is dat het geen organificatie ondergaat in schildkliercellen en daarom een relatief milde opname heeft in normaal schildklierweefsel48. Een ander voordeel van TFB is de korte halfwaardetijd van 109,8 minuten, terwijl de halfwaardetijden van andere tracers variëren van 12 uur tot 8 dagen, wat veiligheidsproblemen kan opleveren voor klinische toepassingen49. De belangrijkste beperking van NIS-gebaseerde CAR T-celbeeldvorming is dat tracers, waaronder TFB, de bloed-hersenbarrière (BBB) niet binnendringen, waardoor het moeilijk is om neurotoxiciteit te beoordelen na CAR T-celbehandeling50,51,52,53.

Neurotoxiciteit wordt geassocieerd met de infiltratie van T-cellen en de activering van myeloïde cellen in het centrale zenuwstelsel. In de meeste gevallen van neurotoxiciteit na CAR T-celtherapie is de integriteit van de BBB echter verstoord50,54. Daarom is het onduidelijk of de tracer niet in staat is om de BBB te passeren in deze gecompromitteerde instelling. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om te valideren of neurotoxiciteit na CAR T-celtherapie in beeld kan worden gebracht met [18F]TFB-PET. Hoewel de korte halfwaardetijd van [18F]TFB veilig is voor patiënten en personeel, maakt het de aanschaf ervan moeilijk voor het ziekenhuis. Daarom moeten instituten worden uitgerust met cyclotrons of toegang hebben tot een regionale faciliteit. De methodologie die hier in het protocol wordt beschreven, kan mogelijk worden toegepast op een verscheidenheid aan andere CAR T-cellen via dubbele transductie om CAR T-cellen in vivo te visualiseren en te beoordelen met behulp van [18F] TFB-PET-scan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SSK is een uitvinder van patenten in CAR-immunotherapie in licentie gegeven aan Novartis (via een overeenkomst tussen Mayo Clinic, University of Pennsylvania en Novartis) en Mettaforge (via Mayo Clinic). RS, MJC en SSK zijn uitvinders van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Humanigen. SSK ontvangt onderzoeksfinanciering van Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs en Lentigen. Figuren werden gemaakt met BioRender.com.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Mayo Clinic K2R-pijplijn (SSK), het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) en de Predolin Foundation (RS). Figuren 1, 2 en 4 zijn gemaakt met BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Tags

Cancer Research CAR T cell NIS reporter [18F]TFB-PET non-invasive imaging
Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [<sup>18F</sup>]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter