Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dissekera mekanoenzymatiska egenskaper hos processiva myosiner med ultrasnabb kraftklämspektroskopi

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Här presenteras ett omfattande protokoll för att utföra ultrasnabba kraftklämma experiment på processiva myosin-5-motorer, som lätt kan utvidgas till studier av andra klasser av processiva motorer. Protokollet beskriver alla nödvändiga steg, från installationen av experimentapparaten till provberedning, datainsamling och analys.

Abstract

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) är en enmolekylär teknik baserad på laserpincett som möjliggör undersökning av kemomekaniken hos både konventionella och okonventionella myosiner under belastning med oöverträffad tidsupplösning. I synnerhet har möjligheten att sondra myosinmotorer under konstant kraft direkt efter aktin-myosinbindningsbildningen, tillsammans med den höga hastigheten för kraftåterkopplingen (200 kHz), visat UFFCS vara ett värdefullt verktyg för att studera belastningsberoendet av snabb dynamik såsom myosinets arbetsslag. Dessutom möjliggör UFFCS studier av hur processiva och icke-processiva myosin-aktininteraktioner påverkas av intensiteten och riktningen hos den applicerade kraften.

Genom att följa detta protokoll kommer det att vara möjligt att utföra ultrasnabba kraftklämma experiment på processiva myosin-5-motorer och på en mängd olika okonventionella myosiner. Genom vissa justeringar kan protokollet också lätt utvidgas till studier av andra klasser av processiva motorer såsom kinesiner och dyneiner. Protokollet innehåller alla nödvändiga steg, från installationen av experimentapparaten till provberedning, kalibreringsförfaranden, datainsamling och analys.

Introduction

Under de senaste decennierna har optiska pincetter varit ett värdefullt verktyg för att belysa mekanokemin för proteininteraktioner på enmolekylnivå, på grund av den slående möjligheten till samtidig manipulation och mätning av konformationsförändringar och enzymatisk kinetik 1,2. I synnerhet förmågan att applicera och mäta krafter inom området för de som utövas av molekylära motorer i cellen, tillsammans med förmågan att mäta subnanometerkonformationsförändringar, gjorde optiska pincett till ett unikt enmolekylverktyg för att avslöja de kemomekaniska egenskaperna hos motorproteiner och deras mekaniska reglering.

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) är en enmolekylär kraftspektroskopiteknik baserad på optisk pincett, utvecklad för att studera den snabba kinetiken hos molekylära motorer under belastning i en tre-pärlgeometri (figur 1a)3,4. UFFCS minskar tidsfördröjningen för kraftapplicering på motorproteinet till den fysiska gränsen för optisk pincett, dvs systemets mekaniska avkopplingstid, vilket möjliggör applicering av kraften snabbt efter början av en myosinkörning (några tiotals mikrosekunder)3. Denna förmåga har utnyttjats för att undersöka de tidiga mekaniska händelserna i snabb skelett 3 och hjärt5 muskelmyosin för att avslöja belastningsberoendet av kraftslag, de svaga och starka bindande tillstånden, liksom ordningen på biokemiska (Pi) och mekaniska (powerstroke) händelser.

Trepärlgeometrin används vanligtvis för att studera icke-processiva motorer, en enda pärlgeometri med en kraftklämma har vanligtvis använts för att undersöka processiva icke-konventionella myosiner såsom myosin Va6. Det finns dock flera skäl att föredra en UFFCS-analys med tre pärlor även för processiva myosiner. För det första möjliggör den snabba appliceringen av belastning direkt efter aktin-myosinbindning mätning av de tidiga händelserna i kraftutveckling som i icke-processiva motorer. När det gäller processiva motorer möjliggör den dessutom en noggrann mätning av motorns körlängder och körtider under konstant kraft under hela deras progression (figur 1b). På grund av den höga hastigheten på kraftåterkopplingen kan systemet dessutom hålla kraften konstant under snabba positionsförändringar, såsom myosinets arbetsslag, vilket garanterar en konstant belastning under motorstegning. Systemets högtidsupplösning möjliggör detektering av sub-ms-interaktioner, vilket öppnar möjligheten att undersöka svag bindning av myosin till aktin. Slutligen garanterar analysgeometrin att kraften appliceras längs aktinfilamentet, med försumbara tvärgående och vertikala komponenter av kraften. Denna punkt är särskilt relevant eftersom den vertikala kraftkomponenten har visat sig väsentligt påverka belastningsberoendet hos motorns kinetik 7,8. Genom att använda denna teknik kunde vi tillämpa en rad hjälpande och resistiva belastningar på processiv myosin-5B och direkt mäta belastningsberoendet av dess processivitet för ett brett spektrum av krafter4.

Som visas i figur 1a är i detta system ett enda aktinfilament upphängt mellan två polystyrenpärlor som fångas i fokus för dubbla optiska pincetter ("hanteln"). En obalanserad nettokraft F = F1-F 2 påförs glödtråden genom ett snabbt återkopplingssystem, vilket gör att glödtråden rör sig med konstant hastighet i en riktning tills den når en användardefinierad inversionspunkt där nettokraften vänds i motsatt riktning. När motorproteinet inte interagerar med filamentet kan hanteln röra sig fram och tillbaka i en triangulär vågform (figur 1b, bottenpanelen) som spänner över piedestalsträngen på vilken ett enda motorprotein är fäst. När interaktionen är etablerad överförs kraften som bärs av hanteln mycket snabbt till motorproteinet och motorn börjar förskjuta filamentet genom att kliva under kraftintensiteten och riktningen som applicerades av återkopplingssystemet vid tidpunkten för interaktionen tills myosin lossnar från aktin. Eftersom förskjutningen som produceras av motorns stegning är beroende av polariteten hos det fångade aktinfilamentet, beroende på riktningen för den applicerade kraften, kan belastningen antingen vara assisterande, dvs trycka i samma riktning av motorförskjutningen (tryck i figur 1b övre panelen) eller resistiv, dvs dra i motsatt riktning med avseende på motorförskjutningen (dra i figur 1b övre panelen) vilket gör det möjligt att studera den kemomekaniska regleringen av motorprocessiviteten med både intensiteten och riktningen hos den applicerade belastningen.

I nästa avsnitt beskrivs alla steg för att mäta aktin-myosin-5B-interaktioner under olika belastningar med en ultrasnabb kraft-klämspektroskopiinställning fullständigt, inklusive 1) installationen av den optiska installationen, optiska fällor justering och kalibreringsprocedurer, 2) förberedelserna av alla komponenter och deras montering i provkammaren, 3) mätproceduren, 4) representativa data och dataanalys för att extrahera viktiga fysikaliska parametrar, såsom körlängd, stegstorlek och motorproteinets hastighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optisk inställning

OBS: Den experimentella installationen består av dubbla optiska pincett med nanometerpekstabilitet och < 1% laserintensitetsfluktuationer. Under dessa förhållanden garanteras hantelns stabilitet på nanometernivå under typisk fällstyvhet (0,1 pN / nm) och spänning (1 pN - några tiotals pN). Figur 2 visar ett detaljerat schema för den optiska inställningen.

  1. Optisk pincett design och konstruktion 9,10,11.
    1. Placera alla komponenter i installationen på ett optiskt bord enligt schemat i figur 2. Observera att det optiska bordet innehåller aktiva isolatorer för att minimera mekaniska vibrationer. Dessutom är mikroskopstrukturen monterad på elastomera isolatorer för att absorbera akustiskt brus och mekaniska resonanser.
    2. Sätt i en optisk isolator nära laserkällan ("OI" i figur 2) för att undvika slumpmässiga amplitudfluktuationer på grund av optisk återkoppling.
    3. Försegla hela banan i en sluten låda för att minska luftström och turbulenser som kan påverka laserpekstabiliteten.
    4. Skapa den dubbla optiska pincetten genom att dela huvudlaserkällan (Nd: YAG-laser, 1,064 nm våglängd i figur 2) i två grenar med ortogonala polarisationer med hjälp av polariserande stråldelare (PBS). Tidsdelade fällor bör undvikas eftersom de inducerar hantelns svängning under spänning12.
    5. Använd två akustooptiska deflektorer (AOD i figur 2) som drivs av Direct Digital Synthesizers (DDS) för att möjliggöra fina och snabba rörelser av de två fällorna och exakt reglering av aktinspänningen genom att direkt driva DDS: erna genom de digitala utgångarna från FPGA-kortet för fältprogrammerbar grindmatris (se figur 2).
      OBS: Den totala återkopplingsresponstiden måste vara <10 μs för att snabbt korrigera och bibehålla konstant kraft på båda fällorna under mätningar, inklusive obundet tillstånd, myosininteraktion och rörelse. För detta ändamål måste positionsdetektorer ha en bandbredd på > = 100 kHz och data måste samlas in med > = 200 kHz samplingsfrekvens. För varje förvärvad datapunkt (5 μs förvärvstid) beräknas proportionella korrigeringar för de två fällorna av FPGA och skickas till de två DDS som driver AOD: erna. AOD-svarstiden måste vara under 5 μs för att uppfylla den erforderliga återkopplingssvarstiden.
    6. För nm-detektering av de fångade pärlornas position, sätt två kvadrantfotodioddetektorer (QPD i figur 2) i kondensorns bakre fokalplan. Noggrann inriktning av QPD: erna i ett plan konjugerat till kondensorns bakre fokalplan, liksom AOD: erna i ett plan konjugerat till målets bakre fokalplan, kommer att säkerställa att QPD: s signaler kommer att vara oberoende av AOD: s frekvens.
    7. Montera AOD på en linjär översättare med mikrometerdrivning och förskjut den tills kristallkanten kommer nära laserstrålen. Ersätt sedan objektivet med en iris, centrerad på det gängade objektivhuset, och reglera dess bländare så att den passar objektivets bakre bländarstorlek.
    8. Flytta översättaren mot laserstrålen tills den del av strålen som blockeras av piezokristallen är synlig efter iris, vrid översättaren något bakåt för att få strålen att helt fylla irisbländaren igen.
    9. Upprepa steg 1.1.7-1.1.8 för den andra AOD. Kontrollera responstiden för återkopplingsslingan genom att mäta tidsfördröjningen från QPD: erna medan du snabbt flyttar en stråle på en pärla som sitter fast på ytan av täckglaset13.
      OBS: Ovanstående tre steg (1.1.7-1-1-9) leder till noggrann inriktning av AOD-kristaller. Dessa steg är viktiga för att optimera tidsresponsen för både strålböjningen och återkopplingen13.
  2. Med hjälp av en fotodiod mäts intensitetsfluktuationerna hos fångstlasern vid mikroskopets ingång, som måste vara under 1%. Observera att fotodiodens bandbredd måste vara större än bildhastigheten.
  3. Kontrollera pekstabiliteten för båda fällorna.
    1. Förbered kiseldioxidpärlor i fosfatbuffert (PB) genom att späda 20 μL kiseldioxidpärlor (1,2 μm, 10% fasta ämnen) i 1 ml aceton, sonikat i 30 s, virvel kort och centrifugera i 2 minuter vid 19 000 x g.
    2. Ta bort supernatanten, suspendera igen i 1 ml aceton och upprepa tvätten. Resuspendera i 1 ml 50 mM PB, tvätta 2 gånger. Slutligen resuspenderas i 100 μl 50 mM PB.
    3. Utför kalibrering av optiska pincetter med kiseldioxidpärlor genom att fästa ett täckglas på ett mikroskopglas med en dubbelhäftande tejp (ca 60 μm tjock) för att bygga en flödeskammare. Fyll kammaren med en BSA (bovint serumalbuminprotein) på 1 mg/ml och vänta i 3 minuter.
    4. Flöda en 1:1000 utspädning av kiseldioxidpärlor i PB in i kammaren. Använd en spruta fylld med kiselfett för att försiktigt försegla kammaren. Fånga en enda pärla i varje fälla och använd effektspektrummetoden14 för att kalibrera dem.
    5. Förbered kiseldioxidpärlor i pentylacetat (vid rumstemperatur) genom att lösa 20 μL kiseldioxidpärlor (1,2 μm diameter, 10% fast) i 1-1,5 ml aceton, virvel och sonikat i 30 s.
    6. Centrifugera vid 18 500 x g i 2 min. Kassera supernatanten och återsuspendera i 1 ml aceton och upprepa sedan tvätten. Resuspendera i 1 ml pentylacetat och upprepa tvätt (centrifugering och resuspension) i pentylacetat 2 gånger. Återsuspendera pelleten i 100 μL nitrocellulosa 1% och 900 μL pentylacetat. Förvaras vid 4 °C i 2 månader.
    7. Ta ett 24 x 24 mm glastäckglas och rengör det försiktigt med papper blötlagt med ren etanol. Skölj den sedan en andra gång genom att tvätta direkt med ren etanol medan du håller den med ren pincett. Låt det torka under ett mjukt kväveflöde. Om det behövs, upprepa denna operation för att ta bort alla synliga rester på glasytan.
    8. Ta kiseldioxidpärlorna, virvla det och sonikera det kort för ~ 30 s.
    9. Efter rengöring av ett andra täckglas (24 x 60 mm), använd det för att smeta 2 μL kiseldioxidpärllösning på en yta av täckglaset och vänta tills det torkar.
    10. Rengör noggrant ett mikroskopglas (26 x 76 mm) som kommer att användas för att skapa flödeskammaren.
    11. Klipp ut två linjer med dubbel tejp (~3 mm stor, 60–100 μm tjock) och fäst dem på ena sidan av mikroskopglaset, såsom visas i figur 3.
    12. Stäng kammaren med hjälp av en ren pincett (ca 20 μl slutlig volym) genom att sätta det belagda täckglaset (1.3.9) i kontakt med de klibbiga tejplinjerna, med nitrocellulosa + pärlskiktet mot kammarens insida, såsom visas i figur 3a. Fyll flödeskammaren med 50 mM fosfatbuffert och försegla den med kiselfett.
    13. Avbilda en enda kiseldioxidpärla i ljusfältmikroskopi med >200x förstoring med en laddningskopplad enhet (CCD) eller komplementär metalloxidhalvledarkamera (CMOS) med >1,4 megapixlar. Använd en återkopplingsprogramvara för att flytta piezosteget (med nanometernoggrannhet eller bättre) för att kompensera för termisk drift10.
    14. Överlappa mitten av den vänstra svällningen med mitten av pärlan (x-y-signalnivåerna från QPD ska matcha dem från kalibreringen). Mät sedan positionsbruset och standardavvikelsen för positionssignalerna för denna fälla.
    15. Upprepa föregående steg för rätt fälla15.
  4. Kalibrering av svällningsposition: MHz till nm
    1. Förbered en flödeskammare med kiseldioxidpärlor fästa på täckglasets yta (1.3.5–1.3.12) och flytande polystyrenpärlor (använd α-aktininkonjugerade pärlor beredda enligt följande avsnitt 2.1).
    2. Fokusera en kiseldioxidsträng på täckglasytan något dekanterad (~ 5 μm) från mitten av synfältet (FOV) och få en bild av FOV. Flytta strängen med 10 μm mot synfältets centrum med piezosteget och få en andra bild. Beräkna mitten av pärlan i de två bilderna med hjälp av en centroidalgoritm eller liknande och beräkna avståndet i pixel mellan de två pärlorna för att erhålla nm / pixelkalibrering av brightfield-kameran.
    3. Fäll en enda flytande partikel i en fälla. Flytta sedan fällan med AOD i små steg (0,2 MHz) och få en bild av partikeln och motsvarande frekvens för AOD för varje steg. Beräkna partikelns position i synfältet med hjälp av centroidalgoritmen som tidigare och konvertera den i nm med hjälp av nm/pixelkalibreringen som erhölls i föregående steg.
    4. Utför en linjär anpassning till frekvenspositionsdata och beräkna kalibreringskonstanten i nm / MHz.
    5. Upprepa kalibreringen för den andra svällningen
  5. Svällningseffekt och styvhetskalibrering (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Förbered en flödeskammare med kiseldioxidpärlor fästa på täckglasets yta (1.3.5–1.3.12) och flytande polystyrenpärlor (använd α-aktininkonjugerade pärlor beredda enligt följande avsnitt 2.1) och fånga en enda partikel i en fälla. Flytta sedan båda fällorna genom AOD i små steg (0,2 MHz) och registrera en brunsk rörelse av partikeln i båda fällorna med QPD och motsvarande frekvens för AOD: erna.
    2. Beräkna en genomsnittlig effekt på detektorerna vid varje position och få fällstyvhet och QPD-kalibreringskonstant beta genom att anpassa en Lorentzisk funktion till ett effektspektrum av den inspelade Brownska rörelsen13.

2. Beredning av prov

  1. Förbered α-aktinin konjugerade fluorescerande pärlor
    1. Utför konjugering16: Ta aminofunktionaliserade polystyrenpärlor (1 μm diameter, 2,5% fasta ämnen), tvätta dem två gånger i 500 μL destillerat vatten och återsuspendera i 500 μL PBS (pH 7,0). Tillsätt 1 mM HaloTag-succinimidylesterO2-ligand och inkubera i rumstemperatur i 1 timme. Tvätta tre gånger med 500 μL PBS och återsuspendera med 100-200 μM HaloTag α-aktinin. Inkubera i 1 timme vid 37 °C och tvätta tre gånger i 500 μl PBS (använd pärlor inom 1,5 veckor eller snabbfrysta i flytande kväve och förvara vid −80 °C).
    2. Märkning: Inkubera 200 μL pärllösning med rhodamin-BSA vid 5 μg/ml slutlig koncentration i 10 min. Tvätta med 50 mM PB tre gånger och suspendera på nytt i 500 μl PB 50 mM. Detta kan förvaras i alikvoter vid - 80 °C i månader).
  2. Uttrycka och rena biotinylerad Myosin-5B enligt beskrivningen tidigare 4,17.
  3. Polymerisera och märk F-aktin13:
    1. F-aktinpolymerisation: Blanda 69 μL ultrarent vatten, 10 μL aktinpolymerisationsbuffert 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidinkarbonat pH 7,5), 20 μL G-aktin 10 mg / ml och 1 μL DL-ditiotreitol (DTT) 1 M. Låt den ligga på is i mer än 1 timme.
    2. F-aktinmärkning med rhodamin (Ex/Em: 546/575 nm): Ta 25 μL polymeriserat F-aktin och tillsätt 19,5 μL ultrarent vatten, 2,5 μL aktinpolymerisationsbuffert 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidinkarbonat pH 7,5), 1 μL 1 M DTT och2 μL 250 μM rhodaminfalloidin. Lämna den på is över natten. För fångstexperiment kan rhodamin F-aktin lagras på is och användas inom en vecka.
  4. Provmontering
    1. Ta flödeskammaren (1.3.5-1.3.12) och inkubera 1 mg/ml biotinylerad BSA i 5 minuter. Efter tvättning med AB-buffert (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7,2) inkubera 1 mg/ml streptavidin i 5 min och tvätta igen med AB-buffert. Inkubera biotinylerad myosin-5B tung meromyosin vid 3 nM koncentration i M5B-buffert (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3) med 2 μM kalmodulin (CaM) i 5 min. Tvätta med tre volymer 1 mg/ml biotinylerad BSA kompletterad med 2 μM CaM i AB och inkubera i 3 min.
    2. Under inkubation bereda reaktionsblandningen (RM): 0,005% α-aktinin funktionaliserade pärlor (avsnitt 2.1), 1 nM rhodamin F-Actin (avsnitt 2.3) i bildbuffert (IB: AB-buffert med 1,2 μM glukosoxidas, 0,2 μM katalas, 17 mM glukos, 20 mM DTT, 2 μM CaM och ATP vid den koncentration som behövs för experimentet).
    3. Tvätta med RM och försegla kammaren med silikonfett. Provet är nu klart att ses under mikroskopet.

3. Mätning

  1. Montera hanteln.
    1. Leta efter de flytande α-aktininpärlorna genom att flytta provet med hjälp av långväga översättare, slå på en fälla och fånga en pärla.
    2. När den första fällan är upptagen flyttar du översättaren för att placera den fångade strängen nära täckglasytan för att undvika att flera pärlor fångas och fångar en annan pärla i den andra fällan.
    3. Justera de två fällorna till lika styvheter genom att justera effekten på AOD: s akustiska vågor. Styvheterna ställs vanligtvis in mellan 0,03 och 0,14 pN/nm. Ju mindre styvhet desto mindre kraftljud, särskilt vid låga krafter.
    4. Vänd sedan den motoriserade spegeln M (figur 2) för att byta till fluorescensmikroskopi och leta efter ett aktinfilament som flyter i lösning genom att förskjuta provet genom långväga översättare13. Föredra långa filament (>5 μm) eftersom den processiva myosinen kommer att förskjuta den och flytta den i några mikron innan den lossnar.
    5. Flytta provet så att en av de fångade pärlorna närmar sig ena änden av filamentet tills de fäster vid varandra. Justera sedan pärlavståndet till den ungefärliga filamentlängden och skapa ett flöde i riktning mot den obundna andra strängen genom att flytta scenen i dess riktning. Filamentet kommer att sträckas av flödet och det kommer så småningom att binda till det13. Pärl-aktin-pärlkomplexet kallas "hantel".
  2. Upprätta aktin-myosinkontakt.
    1. Separera försiktigt de två fällorna långt ifrån varandra för att förspänna filamentet upp till cirka 3 pN och sondra hantelns styvhet genom att få en fälla att svänga i en triangulär våg genom att ändra frekvensen för en av de två AOD: erna och verifiera den därav följande överföringen av rörelsen till den efterföljande pärlan genom dess positionssignal.
    2. Flytta scenen för att placera hanteln i närheten av en piedestal kiseldioxidpärla och låt kontakten mellan filamentet och proteinet fäst på pärlytan genom att justera höjden på de fångade pärlcentra något under kiseldioxidpärldiametern. Placera sedan mitten av kiseldioxidpärlan mellan de fångade pärlorna.
  3. Kraftklämma och nm stabiliseringsåterkoppling:
    1. Slå på den ultrasnabba kraftklämman med 2-3 pN kraft och 200 nm svängning och skanna piedestalsträngen i diskreta steg på ca 20-30 nm i riktningen vinkelrätt mot aktinfilamentet. Vänta tills interaktioner inträffar vid varje position (några sekunder) och gå sedan framåt om ingen interaktion observeras. När protein-filamentinteraktionen är etablerad, leta efter den position där interaktioner är vanligare.
    2. Se till att när den processiva myosinen rör sig mot ena änden av aktinfilamentet (vanligtvis + -änden), rör sig den fångade pärlan som är fäst vid + -änden mot kiseldioxidpärlan. Flytta scenen mot glödtrådens ände så att kiseldioxidsträngen ligger så nära den fångade strängen som är fäst vid filamentets ände när myosin inte är bunden och starta nanometerstabiliseringsåterkopplingen. På så sätt minimeras sannolikheten för att den fångade strängen som är fäst vid + änden av filamentet kraschar in i kiseldioxidsträngen.
  4. Spela in data.

4. Analys av data4

OBS: Analysmetoden som beskrivs möjliggör detektering och mätning av processiva körningar och snabba steghändelser baserat på förändringar i hantelhastigheten, som orsakas av myosinstegning. Analys av processiva körningar utförs baserat på en dataanalysmetod för icke-processiva motorer som beskrivs i referenserna 3,4,13.

  1. Ange ett tröskelvärde för hastighetsändringar för att möjliggöra stegvis händelseidentifiering. Eftersom i detta fall både framåt och bakåt förväntas, accepteras korsningen av tröskeln i båda riktningarna.
  2. Tilldela varje steg till motsvarande körning: om tidsintervallet mellan två efterföljande steg är kortare än 3 ms och stegens amplitud är < 90 nm, tilldelas steg till samma körning, annars tilldelas steg till olika körningar4.
  3. Rätt körlängd för hjälpkrafter4.
    1. Korrigera körlängder under hjälpkrafter genom att beräkna värdet för verklig körlängd RL från det uppmätta genomsnittliga värdet för körlängd <RLm> från följande ekvation, där D är svängningsområdet:
      Equation 1
      OBS: Detaljer om härledningen av denna ekvation finns i referens4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa data består av positionsposter över tid som visas i figur 4. I positionsposten är två typer av förskjutningar synliga. För det första, när myosinmotorn inte interagerar med aktinfilamentet, rör sig de fångade pärlorna med konstant hastighet mot lösningens viskösa dragkraft som visar en linjär förskjutning som oscillerar inom det svängningsområde som ställts in av operatören i en triangulär våg3 (inte synlig i figur 4 på grund av den långa tidsskalan). För det andra, när myosinmotorn interagerar med filamentet överförs kraften som bärs av det rörliga filamentet mycket snabbt till proteinet, systemhastigheten sjunker till noll (röda linjer i figur 4) och steghändelser inträffar under konstant kraft till slutet av körningen. Som visas i figur 5 växlas kraften från den positiva till den negativa riktningen (och vice versa) av återkopplingssystemet, som växlar kraftriktningen när strängen når kanten av det svängningsområde som ställts in av användaren. I vissa fall kan det hända att när myosinet binder och förskjuter filamentet mot den positiva riktningen, skjuter den pärlan mot (övre) kanten av svängningsområdet. Om detta sker under hjälpkraft (dvs. riktad mot positiv förskjutning, tryck, i figur 5), kommer myosinets körning att avbrytas av kraftriktningsinversionen vid svängningskanten (pilar i figur 5), vilket begränsar körningens längd till hantelsvängningens amplitud D. Detta kräver en korrigering av körlängden vid hjälpkraft (4.3.1).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av UFFCS applicerad på en processiv myosin-5B-motor. (a) En enda myosin-5B-molekyl är fäst vid en glaspärlpiedestal genom en streptavidin-biotinlänk. Ett enda aktinfilament fångas upp genom att det hängs upp mellan α-aktininbelagda pärlor (den så kallade "tre-pärla"-geometrin). Svarta pilar representerar kraften fastklämd till höger (F1) och vänster pärla (F2), röd pil representerar nettokraften (F) på hanteln. F alterneras fram och tillbaka för att hålla hanteln inom ett begränsat svängningsområde när myosin inte är bunden att agera. (b) Exempel på spår som visar förskjutning och kraft under motsvarande faser av hantelsvängning, myosin-5B-fästning och processiva körningar under assisterande (tryck) och resistiva (drag) belastningar. Denna siffra har ändrats från4. Rådata som förvärvats med 200 kHz samplingsfrekvens plottas. Std. Dev. av kraft är ca 0,27 pN. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Optiskt schema för experimentuppställningen. Det optiska mikroskopet består av: halogenlampa (H), kondensor (C), prov (S), piezoöversättare (x-y och z), objektiv (O), en lågförstoringskamera (CCD 200X) och en högförstoringskamera (CCD 2000X) som används för nm-stabiliseringsåterkopplingen. Dubbla optiska pincetter sätts in och extraheras från mikroskopets optiska axel genom dikroiska speglar (D2 och D3) och omfattar: Nd: YAG-laser (1064 nm), optisk isolator (OI), λ / 2-vågplattor, polariserande stråldelare kuber (PBS), akustooptiska deflektorer (AOD), 1064 nm interferentiella filter (F1 och F2), kvadrantdetektorfotodioder (QDP). Signaler från QDP utarbetades med en FPGA, skickad till två specialbyggda direkta digitala synthesizers (DDS) som driver AOD: erna (force feedback). Fluorescensexcitation tillhandahölls av en duplicerad Nd: YAG-laser (532 nm) och bilden projicerades på en elektronmultiplicerad kamera (EMCCD). M är en rörlig spegel, F3 ett emissionsfilter. Denna siffra har ändrats från 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Flödeskammarsammansättning . a) Förberedelse av kammaren. Ett glastäckglas, smurt med kiseldioxidpärlor, fästs på ett mikroskopglas genom dubbla klibbiga tejpränder för att bilda en flödescell med en volym på cirka 20 μl. b) Ovanifrån av flödescellen. Lösningar flygs från ena sidan av kammaren med en pipett och sugs från den andra sidan genom ett filterpapper för att skapa ett flöde längs pilriktningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Registrering av representativ position. Positionsinspelning som visar myosin-5B-processiva körningar och steg- och kördetekteringsalgoritmen. Detekterad början och slutet av varje körning indikeras med gröna respektive cyan vertikala linjer. Röda horisontella linjer indikerar de upptäckta stegen. Denna siffra har ändrats från4. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Kraftinversion under myosinkörningar. När myosin binder och flyttar filamentet i positiv riktning under hjälpkraft (tryck) kan det hända att det når kanten av svängningsområdet där kraften är omvänd (indikerad av pilarna), så att myosinet körs under hjälpkraft avbryts. Tvärtom, under resistiv kraft (drag), förhindrar myosin processiv stegning hanteln från att nå kraftinversionspunkten. Därför begränsas inte körlängderna i det senare fallet av svängningsområdet för resistiva krafter. Denna siffra har ändrats från4. Rådata som förvärvats med 200 kHz samplingsfrekvens plottas. Std. Dev. av kraft är ca 0,27 pN. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om enmolekylära tekniker, såsom tre-pärlanalysen, är tekniskt utmanande och låg genomströmning, förbättrar UFFCS detekteringen av molekylära interaktioner tack vare det höga signal-brusförhållandet mellan data. UFFCS möjliggör studier av belastningsberoende av motorproteiner, med de främsta fördelarna med att applicera kraften mycket snabbt vid bindning av motorn till filamentet för att undersöka tidiga och mycket snabba händelser i kraftproduktion och svaga bindningstillstånd under kontrollerad kraft; bibehålla kraften konstant under hela körningen och sondera motorberoendet med full kontroll över kraftriktningen. När det gäller den sista punkten är trestränggeometrin som vi använder här mycket effektiv när det gäller att applicera och mäta krafter längs filamentriktningen, vilket minimerar bidrag från tvärgående eller vertikala komponenter. Men när motorproteinet förväntas aktivt producera tvärgående eller vertikala krafter, eller till och med vridmoment, är andra konfigurationer såsom enkelstränggeometrin mer lämpliga 2,7,18. Dessutom, tack vare sin rumsliga och tidsmässiga upplösning, representerar UFFCS ett unikt verktyg för att förstå grunderna för molekylära interaktioner som annars skulle hindras med konventionella enmolekylära tekniker. Faktum är att UFFCS gjorde det möjligt att undersöka hur assisterande och resistiva krafter reglerar det mekaniska svaret hos myosin-5B, vilket ger ny inblick i dess kollektiva beteende inom aktinnätet i cell4.

Framgången för dessa experiment är dock beroende av uppfyllandet av några viktiga krav som måste hanteras mycket noggrant genom att följa alla instruktioner som finns i detta protokoll: den exakta inriktningen och isoleringen av den optiska installationen är grundläggande för att nå en optimal rumslig upplösning; noggrann kalibrering av det optiska systemet är nödvändigt för att bestämma värdena på de applicerade krafterna med hög precision; inställningen av ett snabbt återkopplingssystem är nödvändigt för att nå den höga tidsupplösningen; Slutligen måste alla komponenter som monteras i provkammaren beredas i en kontrollerad miljö och hålla dem så sterila som möjligt, eftersom varje förorening i provkammaren kan äventyra experimentet, och alla indikationer om deras optimala lagring och hantering bör strikt respekteras för experimentprotokollets framgång. Det är viktigt att dataanalys noggrant anpassas till de olika typerna av motor-filamentinteraktioner för att korrekt tolka resultaten och undvika artefakter.

I detta protokoll ingår alla steg för att utföra ultrasnabba kraftklämexperiment på processiva myosin-5-motorer, från installation av experimentell apparat till provberedning, mätning och dataanalys, som bekvämt kan anpassas för att studera en mängd olika okonventionella myosiner och andra klasser av processiva motorer såsom kinesiner och dyneiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 871124 Laserlab-Europe, av det italienska ministeriet för universitet och forskning (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) och av Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk stöddes av Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

Biologi nummer 173 ultrasnabb kraftklämspektroskopi optisk pincett tre-pärlanalys molekylära motorer myosin

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissekera mekanoenzymatiska egenskaper hos processiva myosiner med ultrasnabb kraftklämspektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter