Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Introduksjon Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

Den nåværende studien gir detaljerte in vitro ubiquitylation analyseprotokoller for analyse av E3 ubiquitin ligase katalytisk aktivitet. Rekombinante proteiner ble uttrykt ved hjelp av prokaryote systemer som Escherichia coli-kultur.

Abstract

Den kovalente tilknytningen av ubiquitin (Ub) til interne lysinrester av et substratprotein, en prosess som kalles allestedsnærværende, representerer en av de viktigste postoversettelsesendringene i eukaryote organismer. Allestedsnærværende formidler formidles av en sekvensiell kaskade av tre enzymklasser, inkludert allestedsnærværende-aktiverende enzymer (E1 enzymer), allestedsnærværende-konjugaterende enzymer (E2 enzymer) og allestedsnærværende ligaer (E3 enzymer), og noen ganger allestedsnærværende kjedeforlengelsesfaktorer (E4-enzymer). Her gis in vitroprotokoller for allestedsnærværende analyser, som gjør det mulig å vurdere E3 allestedsnærværende ligaer, samarbeidet mellom E2-E3-par og substratvalg. Samarbeidende E2-E3-par kan screenes ved å overvåke genereringen av frie poly-allestedsnærværende kjeder og/eller automatisk allestedsnærværende av E3-ligaene. Substrat allestedsnærværende er definert ved selektiv binding av E3-ligaene og kan påvises ved vestlig blotting av in vitro-reaksjonen. Videre beskrives en E2~Ub utslippsanalyse, som er et nyttig verktøy for direkte vurdering av funksjonelt E2-E3-samarbeid. Her følges den E3-avhengige overføringen av allestedsnærværende fra det tilsvarende E2-enzymet til frie lysinaminosyrer (etterligning av substrat ubiquitylation) eller interne lysiner av selve E3-ligase (auto-allestedsnærværende). Til slutt er det gitt tre forskjellige in vitro-protokoller som er raske og enkle å utføre for å adressere E3-ligase katalytisk funksjonalitet.

Introduction

Allestedsnærværende er prosessen der Ub er kovalent knyttet til et substratprotein1. Ub-modifikasjonen er katalysert av påfølgende enzymatiske reaksjoner som involverer virkningen av tre forskjellige enzymklasser, det vil siUb-aktiverende enzymer (E1s), Ub-konjugaterende enzymer (E2s), Ub ligases (E3s) og muligens Ub-kjedeforlengelsesfaktorer (E4s)2,3,4,5. Etter adenosin triphosfat (ATP)- og magnesium (Mg2+)-avhengig aktivering av Ub ved E1, angriper det aktive stedet cystein av E1 C-terminal glycin av Ub, og danner et thioesterkompleks (Ub ~ E1). Energien trukket fra ATP hydrolyse får Ub til å oppnå en høy energi overgangstilstand, som opprettholdes gjennom følgende enzym kaskade. Deretter overfører E2-enzymet den aktiverte Ub til sin indre katalytiske cystein, og danner dermed en forbigående Ub ~ E2 thioesterbinding. Deretter overføres Ub til substratproteinet.

Dette kan gjøres på to måter. Enten kan E3-ligaen først binde seg til E2, eller E3-ligaene kan binde Ub direkte. Sistnevnte måte resulterer i dannelsen av en E3 ~ Ub mellomliggende. I begge tilfeller er Ub knyttet til substratproteinet ved dannelse av en isopeptidbinding mellom C-terminal karboksylgruppen Ub og lysin- Ɛ-aminogruppen av substratet6. Det menneskelige genomet koder to E1-er, ca. 40 E2-er og mer enn 600 putative allestedsnærværende ligaer7. Basert på Ub-overføringsmekanismen til E3, er Ub-ligaer delt inn i tre kategorier som involverer Homolog til E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type og RING mellom RING (RBR)-type ligases8. I denne studien brukes U-boksen som inneholder ligaer, Carboxyl Terminus fra HSC70-interagerende protein (CHIP), som et representativt E3-enzym. I motsetning til HECT-type E3 enzymer som danner Ub ~ E3 tioesters, binder U-box-domenet til CHIP E2 ~ Ub og fremmer den påfølgende Ub / substratoverføringen direkte fra E2-enzymet8,9. Basert på viktigheten av U-boksen for enzymatisk funksjon, brukes en inaktiv CHIP U-boks mutant, CHIP (H260Q), som en kontroll. CHIP(H260Q) klarer ikke å binde seg til sin cognate E2s, og mister dermed sin E3 ligase aktivitet10.

Protein allestedsnærværende spiller en avgjørende rolle i å regulere en rekke cellulære hendelser i eukaryote celler. Mangfoldet av cellulære utfall som fremmes av reversibel vedlegg av Ub-molekyler til substratproteiner, kan tilskrives Ubs molekylære egenskaper. Ettersom Ub selv inneholder syv lysin (K) rester for videre allestedsnærværende, er det rikt utvalg av Ub kjedetyper med forskjellige størrelser og / eller topologier11. For eksempel kan substrater modifiseres av et enkelt Ub-molekyl ved en (mono-allestedsnærværende) eller flere lysiner (multimono-allestedsnærværende), og til og med av Ub-kjeder (poly-allestedsnærværende)11. Ub-kjeder er enten dannet homo- eller heterotypisk via samme eller forskjellige lysinrester av Ub, noe som til og med kan resultere i forgrenedeUb-kjeder 9. Dermed fører protein allestedsnærværende til ulike arrangementer av Ub-molekyler som gir spesifikk informasjon, for eksempelfor nedbrytning, aktivering eller lokalisering av konjugede proteiner12,13. Disse forskjellige Ub-signalene muliggjør rask omprogrammering av cellulære signalveier, noe som er et viktig krav for cellens evne til å reagere på endrede miljøbehov.

Et sentralt aspekt ved allestedsnærværende er relatert til proteinkvalitetskontroll. Feilfoldede eller irreversibelt skadede proteiner må forringes og erstattes av nylig syntetiserte proteiner for å opprettholde protein homeostase eller proteostase14. Kvalitetskontroll E3 ligase, CHIP, samarbeider med molekylære anstander i Ub-avhengig nedbrytning av skadede proteiner9,15,16,17. Bortsett fra det regulerer CHIP stabiliteten til den myosinstyrte anstanden, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), som er tett koordinert med muskelfunksjon og avvik fra de optimale nivåene fører til menneskelig myopati18,19,20,21. Nedbrytning av UNC-45B av 26S-proteasomet formidles ved vedlegg av en K48-koblet poly-Ub-kjede9. I fravær av substratproteiner utfører CHIP auto-allestedsnærværende10,22,23, som er karakteristisk for RING / U-boks E3 ubiquitin ligases24,25 og anses å regulere ligase aktivitet26. Anvendelsen av in vitro ubiquitylation analyse metoder beskrevet i dette dokumentet bidro til systematisk å identifisere E2 enzymer som slår seg sammen med CHIP for å fremme dannelsen av frie poly-Ub kjeder og / eller auto-ubiquitylation av CHIP (protokoll avsnitt 2). Videre ble CHIP-avhengig allestedsnærværende ubiquitylation av UNC-45B observert, som er et kjent substrat av E3-ligase18,19 (protokoll § 3). Til slutt ble CHIP-avhengig overføring av aktivert Ub fra Ub ~ E2 thioester overvåket (protokoll avsnitt 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser

MERK: Buffere og reagenser som ble utarbeidet manuelt i laboratoriet er listet opp nedenfor. Alle andre buffere og reagenser som brukes i protokollene ble kjøpt fra forskjellige kilder og brukt i henhold til produsentens instruksjoner.

  1. Forbered 10x fosfatbufret saltvann (10x PBS). Til dette formålet, blanding 1,37 M natriumklorid (NaCl), 27 mM kaliumklorid (KCl), 80 mM disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO2 4,2H2O) og 20 mM kalium-dihydrogenfosfat (KH2PO4) i 1 L dobbeltdestillert H2O (ddH2O). Autoklaver 10x PBS, og klargjør en 1x PBS-løsning i ddH2O.
    1. Autoklavering utføres i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa.
      MERK: Autoklavering utføres under disse forholdene for alle buffere og løsninger. Hvis ikke annet er angitt, lagres løsninger ved romtemperatur (RT).
  2. Forbered 1 L PBS-Tween (PBS-T)-løsning ved å tilsette 0,1 % Tween til 1 L 1x PBS.
  3. Forbered 10 ml av en 0,5 M L-lysin lagerløsning ved å oppløse L-lysin i ddH2O. Aliquot L-lysin i 1 ml porsjoner, og oppbevar dem ved -20 °C til videre bruk.
    MERK: L-lysin kan fryses og tines gjentatte ganger.
  4. Forbered en 0,25 M etylendiamin tetra eddiksyre (EDTA) løsning ved å oppløse EDTA i 200 ml ddH2O.
    1. Juster pH til 8,0 med natriumhydroksid (NaOH).
    2. Juster volumet til 250 ml med ddH2O.
    3. Autoklaver løsningen.
  5. Forbered 10 ml av en 20 mg/ml bovint serumalbumin (BSA)-løsning ved å oppløse BSA i ddH2O. Oppbevares ved -20 °C i 200 μL aliquots.
    MERK: BSA kan fryses og tines gjentatte ganger.
  6. Forbered 1 L 2-(N-morpholino)etan sulfonsyre (MES) løpebuffer ved å oppløse 50 mM MES, 50 mM Tris base, 3,47 mM natriumdodecylsulfat (SDS) og 1,03 mM EDTA i 0,9 L ddH2O. Når du har blandet riktig, justerer du volumet til 1 L.
    1. pH for 1x-bufferen er 7,6. PH må ikke justeres med syre eller base.
  7. Forbered 200 ml blokkeringsløsning (5% melk) ved å oppløse 10 g melkepulver i 1x PBS-T. Oppbevar blokkeringsløsningen ved 4 °C i opptil én uke.
  8. Klargjør 1 L overføringsbuffer (se materialtabellen) i henhold til produsentens instruksjon.
  9. Klargjør 2x SDS-prøvebuffer ved å oppløse 125 mM Tris-base, 4% SDS, 4% glyserol, 0,03% bromofenolblå og 50 μL/ml β-mercaptoetanol i 50 ml ddH2O. Aliquot i 1 ml porsjoner, og oppbevar ved -20 °C til bruk.

2. In vitro auto-allestedsnærværende analyse

  1. Analyseforberedelse og utførelse
    1. Beregn volumet av hvert reagens som kreves per reaksjon basert på proteinenes gitte modaliteter og proteinkonsentrasjonene av proteinløsningene. Bruk 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 og 50 μM Ub per auto-allestedsnærværende reaksjon. Juster volumet på reaksjonen til 20 μL med ddH2O.
      MERK: ATP-løsning og allestedsnærværendeyleringsbuffer ble kjøpt som 10x lagerløsninger og brukt ved 1x.
    2. Forbered en pipetteringsordning for alle reaksjoner. Test ni forskjellige E2-enzymer for deres evne til å fungere (I) med CHIP, (II) med et katalytisk inaktivt CHIP(H260Q) mutant, og (III) uten CHIP i individuelle allestedsnærværende reaksjoner.
    3. For å unngå pipetteringsfeil, lag en master mix på is som inneholder volumet som kreves for alle reaksjoner pluss en ekstra reaksjon. Beregn mengden masterblanding som kreves per reaksjon.
      MERK: Master mix-komponenter er reagenser som er like nødvendige for hver reaksjon, det vil siE1, E3, Ub, ATP og allestedsnærværende buffer.
    4. Tilsett ddH2O og master mix til polymerasekjedereaksjonsrørene (PCR). Hold rørene på is.
    5. Før du starter allestedsnærværende reaksjoner ved å legge til E2 enzymer, sett opp en PCR termisk syklist med følgende program: 2 h, 37 °C etterfulgt av 4 °C, uendelig.
    6. Tilsett 1 μM av E2-enzymene i de respektive rørene, og inkuber prøvene i PCR termisk syklist i den angitte tidsperioden.
    7. Etter 2 timer legger du til SDS-prøvebuffer på hver reaksjon, og blander ved å pipettere opp og ned flere ganger.
      MERK: Det nødvendige volumet av prøvebufferen avhenger av lagerkonsentrasjonen av prøvebufferen. Her ble 20 μL 2x SDS-prøvebuffer lagt til hver reaksjon.
    8. Kok prøvene umiddelbart ved 95 °C i 5 minutter, og fortsett med polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). Oppbevar de denaturerte proteinene ved -20 °C.
  2. Gelelektroforese og vestlig flekk
    1. Etter opptining, spinn ned prøvene i ca. 10 s og last inn SDS-PAGE gelen. Bruk en protein stige som størrelsesreferanse.
      MERK: Her ble 4-12% Bis-Tris gradient geler og 3 μL protein stige brukt. Del prøvevolumene og last to geler likt ved hjelp av 20 μL av hver prøve.
    2. Kjør gelen på 160-200 V i ca. 30-45 min slik at prøvefronten når bunnen av gelen.
    3. Overfør hver gel til en plastbeholder fylt med semidry blotting buffer, og inkuber den i 2-5 min på RT. Fjern stablingsgelen.
    4. Forbered to stykker gel-størrelse blotting papir og en gel-størrelse nitrocellulose membran per SDS gel og pre-soak i semidry blotting buffer. Monter det vestlige flekksmørbrødet (WB) i et WB-kammer fra bunn til topp i følgende rekkefølge: blotting papir, nitrocellulosemembran, SDS-PAGE gel, blotting papir.
    5. Fjern luftbobler som kan ha blitt fanget mellom sandwichlagene. Til dette formål, bruk en rulle for å forsiktig rulle over smørbrødet et par ganger.
    6. Lukk kammeret, og la overflødig blotbuffer renne ut.
    7. Plasser kammeret i den respektive blottingsenheten, og bruk følgende program for semidry blotting: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Overfør den flekkete membranen til en plastbeholder fylt med blokkeringsløsning, og inkuber i 30 min ved RT.
    9. Forbered den primære antistoffløsningen ved å tilsette antistoffet til 10 ml PBS-T som inneholder et blokkerende reagens (se materialtabellen).
      MERK: Arbeidskonsentrasjonen av antistoffet er antistoffspesifikk. I dette tilfellet ble et monoklonalt mus anti-allestedsnærværende antistoff brukt ved en fortynning på 1:5,000. For den andre gelen ble et monoklonalt kanin anti-CHIP antistoff brukt ved 1:5,000 i PBS-T / blokkerende reagens.
    10. Bytt ut blokkeringsløsningen med den primære antistoffløsningen, og inkuber over natten ved 4 °C på en rocker.
    11. Vask membranen tre ganger i 10 min med PBS-T.
    12. Forbered den sekundære antistoffløsningen ved å legge til det respektive antistoffet til 10 ml PBS-T.
      MERK: Her brukes geit antimus og mus anti-kanin antistoffer ved en fortynning på 1:10,000.
    13. Inkuber membranen med sekundært antistoff i 1 time ved RT på en rocker.
    14. Vask membranen tre ganger i 5 min med PBS-T.
  3. Dataanalyse
    1. Tilsett vestlige flekkdeteksjonsreagenser for pepperrotperoksidase (HRP)-konjugerte antistoffer i den vaskede membranen i henhold til produsentens instruksjoner, og fang HRP-signalet ved hjelp av røntgenfilmer eller et lade koblet enhetskamera (figur 1).

3. In vitro substrat allestedsnærværende analyse

  1. Analyseforberedelse og utførelse
    1. Beregn volumet av hvert reagens som kreves per reaksjon, basert på proteinenes gitte modaliteter og proteinkonsentrasjonene av proteinløsningene. Bruk 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM E3, 1 μM substrat og 50 μM Ub. Bruk 10x ATP-løsning og 10x allestedsnærværendeylasjonsbuffer ved 1x. Juster volumet av substratets allestedsnærværendeylasjonsreaksjon til 20 μL med ddH2O.
    2. Forbered en pipetteringsordning for alle reaksjoner. Inkluder riktige kontrollreaksjoner som bekrefter at substratet allestedsnærværende er E3-spesifikt. Bruk proteinet UNC-45B som et representativt substrat av CHIP og et katalytisk inaktivt CHIP-mutant (H260Q) som en kontroll. Forbered følgende reaksjoner: E1, E2, Ub mix (inkludert Ub, ATP, allestedsnærværendeyleringsbuffer); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; og E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. For å unngå pipetteringsfeil, lag en master mix på is som inneholder volumet som kreves for alle reaksjoner pluss en ekstra reaksjon. Beregn volumet av hovedblandingen som kreves per reaksjon.
      MERK: Hovedblandingskomponenter for denne analysen inkluderer E1, E2, Ub, ATP og allestedsnærværendeyleringsbuffer.
    4. Tilsett reaksjonskomponenter i følgende rekkefølge: ddH2O, substrat, E3-ligaer.
    5. Før du starter allestedsnærværende reaksjon ved tilsetning av master mix, sett opp en PCR termisk syklist med følgende program: 2 h, 37 °C etterfulgt av 4 °C, uendelig.
    6. Tilsett hovedblandingen i hvert rør, og inkuber prøvene i PCR termisk syklist i den angitte tidsperioden.
    7. Etter 2 timer tilsettes 2x SDS-prøvebuffer til hver reaksjon, og blandes ved å pipettere opp og ned flere ganger.
    8. Etter løpet koker du prøvene umiddelbart ved 95 °C i 5 minutter, og fortsetter med PAGE. Alternativt kan du lagre de denaturerte proteinene ved -20 °C.
  2. Gelelektroforese og vestlig flekk
    1. Utfør gelelektroforese og vestlig flekk som beskrevet i pkt. 2.2. Bruk spesifikke antistoffer for påvisning av henholdsvis substratet og E3-ligaene.
      MERK: Her smeltes UNC-45B sammen til en polypeptidproteinkode avledet fra c-myc-genproduktet, noe som muliggjør bruk av et monoklonalt mus anti-MYC-antistoff. Anti-MYC brukes kl. 13.10.000.
  3. Dataanalyse
    1. Utføre dataanalyse som beskrevet i avsnitt 2.3 (Figur 2).

4. Lysin utslipp analyse

  1. Analyseforberedelse og utførelse
    1. Lading av E2-enzymet med Ub ved E1
      1. Beregn volumet av hvert reagens som kreves per reaksjon basert på proteinenes gitte modaliteter og proteinkonsentrasjonene av proteinløsningene. Bruk 2 μM E1, 4 μM E2 og 4 μM lysinfri ubiquitin (Ub K0) per ladereaksjon. Bruk 10x ATP- og 10x allestedsnærværendeylasjonsbuffer ved 1x. Juster volumet på ladereaksjonen til 20 μL med ddH20.
        MERK: Den lysinfrie Ub K0-mutanten brukes til å håndheve den eksklusive produksjonen av mono-allestedsnærværende E2. Wild-type Ub kan også brukes; Dette kan imidlertid føre til ulike E2~Ub-modifikasjoner (f.eks.poly-allestedsnærværende av E2), som er vanskeligere å analysere. For første gangs bruk eller ved bruk av et nytt E2-enzym, bestem nivået av Ub-lading på E2 som kan oppnås ved E1. For å bestemme utbyttet av lading, visualiser uladet vs. ladet E2 via Coomassie farging. Her ble omtrent halvparten av Ub K0 pålitelig konvertert til UBE2D2 ~ Ub ved bruk av likevektsforhold av UBE2D2 og Ub K0 (Tilleggsfigur S2A).
      2. Forbered en pipetteringsordning for ladereaksjonen. Juster volumet på ladereaksjonen etter de påfølgende utladningsreaksjonene, for eksempelbruk CHIP og CHIP (H260Q) i individuelle utslippsreaksjoner. Forbered dermed dobbelt volumet av en ladereaksjon.
        MERK: For første gangs bruk, test forskjellige konsentrasjoner av den valgte E3-ligaen for å overvåke optimale utslippsforhold, og analyser dem ved vestlig blotting. I en ideell tilstand vil utslippet av Ub fra E2 øke over tid til det respektive E2 ~ Ub proteinbåndet forsvinner.
      3. Inkuber ladereaksjonen i 15 min ved 37 °C.
    2. Oppsigelse av ladereaksjonen
      1. Stopp ladereaksjonen ved å legge til apyrase ved en endelig konsentrasjon på 1,8 U/ml. Utfør inkubasjonen med apyrase i 5 min ved RT, etterfulgt av tilsetning av EDTA ved en endelig konsentrasjon på 30 mM. Juster volumet på ladereaksjonen til 30 μL med ddH2O.
        MERK: Apyrase brukes til å konvertere ATP-molekyler til ADP-molekyler (adenosindifosfat). Siden aktiviteten til E1-enzymet er ATP-avhengig, kan ikke E1 lenger lade E2. EDTA brukes i tillegg til å sikre at E1 hemmes ved å slukke Mg2+ ioner som er nødvendige medfaktorer for E1. Volumet av apyrase som kreves for å stoppe reaksjonen kan variere mellom analyseforhold. Selv om apyrase alene allerede quenches tilgjengelig ATP molekyler, en kombinasjon av apyrase og EDTA var mer effektiv til å stoppe ladereaksjonen for E1-UBE2D2 par. Siden det å stoppe reaksjonen er en kritisk faktor for analysereroduserbarhet, bør effektiv stopp testes for nye E1-E2-par. Til dette formålet kan du sette opp en ladereaksjon, stoppe den og samle prøver på bestemte tidspunkter, for eksempeletter 2, 5, 10 og 15 minutter. Ikke-skiftende nivåer av E2 ~ Ub indikerer at reaksjonen har stoppet, og at thioester var stabil i løpet av den perioden (Supplerende figur S2B).
    3. Utladning av E2~Ub med E3
      1. Forbered fire rør som tilsvarer de forskjellige tidspunktene (t0, t1, t2, t3); tilsett ikke-reduserende prøvebuffer (6,7 μL 4x litiumdylamulfatbuffer (LDS) til hvert rør.
        MERK: Ikke bruk reduksjonsmiddel i prøvebufferen.
      2. Fjern 6 μL fra den stansede ladereaksjonen i t0, og juster volumet til 20 μL med ddH2O.
      3. Inkuber t0-prøven i 10 min ved 70 °C.
        MERK: Ikke kok prøven ved å forlenge inkubasjonstiden, da tioesters er labile ved høyere temperaturer.
      4. Beregn volumet av hvert reagens som kreves per utslippsreaksjon. Bruk de resterende 24 μL av den ladede E2, og tilsett 10 mM L-lysin, 1 mg/ml BSA og 500 nM av E3-ligaene. Bruk allestedsnærværendeyleringsbufferen ved 1x, og juster volumet til 80 μL med ddH2O.
      5. Forbered en pipetteringsordning for alle utslippsreaksjoner, og bruk CHIP(H260Q) som kontroll i tillegg til CHIP(WT).
      6. Sett opp utslippsreaksjoner på is ved å legge til de nødvendige komponentene i følgende rekkefølge: ddH2O, allestedsnærværendeyleringsbuffer, BSA, lysin, E3-ligase og den ladede E2 for å starte reaksjonen.
      7. Inkuber utslippsreaksjonen ved RT.
      8. Ta prøver etter 5, 30 og 60 min ved å overføre 20 μL av utløpsreaksjonen til de respektive prøverørene.
        MERK: Egnede tidspunkter som tillater riktig overvåking av utladningen kan variere mellom E2-E3 par.
      9. Virvel prøven umiddelbart, og inkuber den ved 70 °C i 10 minutter.
      10. Fortsett direkte med PAGE.
        MERK: E2~Ub-tiioester kan være labile selv etter at prøvebufferen er avtatt. Dermed bør gelelektroforese utføres direkte etter analyseutførelse.
  2. Gelelektroforese og vestlig flekk
    1. Utfør gelelektroforesen og den vestlige blottingen som beskrevet i pkt. 2.2. Bruk et Ub-spesifikt antistoff og, hvis tilgjengelig, også bruke et E3-spesifikt antistoff som ble hevet i en annen art, noe som muliggjør samtidig deteksjon av Ub- og E3-ligasesignalet.
  3. Dataanalyse
    1. Utføre dataanalyse som beskrevet i pkt. 2.3 (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å identifisere E2 enzymer som samarbeider med allestedsnærværende ligase CHIP, ble et sett med E2-kandidater testet i individuelle in vitro ubiquitylation reaksjoner. Samarbeidende E2-E3-par ble overvåket av dannelsen av E3-avhengige allestedsnærværende produkter, det vil siautomatisk allestedsnærværende av E3-ligaene og dannelsen av frie Ub-polymerer. Allestedsnærværende legemidler ble analysert av vestlig blotting. Datatolkning er basert på størrelsessammenligningen av de resulterende proteinbåndene med molekylvektmarkører. Protein allestedsnærværende fører til dannelse av spesifikke båndmønstre preget av utseendet på doble bånd eller flere iterative bånd med en respektive størrelsesforskjell på 8,6 kDa (størrelse på et enkelt Ub-molekyl).

Her ble ni E2-ers evne til å fremme dannelsen av allestedsnærværende produkter testet i nærvær av wild-type CHIP (Figur 1A), den inaktive U-boksen mutant CHIP (H260Q) (Figur 1B), eller uten CHIP (Supplemental Figure S1). E3-uavhengige allestedsnærværende produkter ble dannet i nærvær av inaktiv CHIP og i fravær av CHIP (Figur 1B og Supplerende figur S1). Inaktiv CHIP ble ikke automatisk allestedsnærværende (figur 1B). I motsetning til dette ble wild-type CHIP automatisk allestedsnærværende når den ble kombinert med medlemmer av UBE2D-familien (D1-D3) og medlemmer av UBE2E-familien (henholdsvis E1, E3),(figur 1A, bane 3, 4 og 5). Mens gratis poly-Ub-kjeder ble produsert i samarbeid med UBE2D1-3, ble dette ikke oppdaget for henholdsvis UBE2E1 eller UBE2E3 (Figur 1A, bane 6 og 7).

UBE2D-familiens evne til å fremme både dannelsen av frie Ub-polymerer og auto-allestedsnærværende CHIP har blitt tilskrevet tilstedeværelsen av et ikke-kovalent allestedsnærværende bindested på baksiden av E227,28. På samme måte har den eksklusive dannelsen av gratis Ub-kjeder av UBE2N / V1 (figur 1A, bane 9) blitt tilskrevet bindingen av Ub av en bestemt UBE2V1-underenhet (Uev-underenhet), som styrer dannelsen av K63-tilknyttede Ub-kjeder29. Ingen allestedsnærværende produkter ble dannet i nærvær av UBE2C1 og UBE2H (Figur 1A, bane 2 og 8). Til slutt kan CHIP samarbeide med flere E2 enzymer in vitro; Imidlertid er dens auto-allestedsnærværende E2 enzymspesifikk.

Deretter ble UBE2D2-CHIP-paret brukt til å undersøke allestedsnærværende myosin-regissert anstand, UNC-45B, av CHIP ligase aktivitet (Figur 2). Substrat allestedsnærværende ble analysert via vestlig blotting. Ikke-allestedsnærværende UNC-45B har en molekylvekt på 103 kDa (figur 2, bane 4). Den inaktive U-boksmutanten til CHIP utførte verken allestedsnærværende ylelering av UNC-45B eller auto-allestedsnærværende(figur 2, bane 3). Til sammenligning ble allestedsnærværende 45B og automatisk allestedsnærværende CHIP oppdaget ved inkubasjon med wild-type CHIP (figur 2, bane 6). Dermed kan CHIP allestedsnærværende UNC-45B in vitro, noe som tyder på at UNC-45B er et bevart substrat av CHIP18.

Til slutt ble den katalytiske aktiviteten til CHIP analysert i fravær av noe substratprotein. Til dette formål ble det utført en lysinutladningsanalyse der frie lysinaminosyrer kan tjene som Ub-akseptor i fravær av E3-substrater (Figur 3, Supplerende figur S2C). Utladningsanalysen består av et ladetrinn der Ub lastes på E2 ved E1, et stopptrinn for å forhindre videre lasting av Ub på E2, og et utløpstrinn der Ub overføres fra den forbigående Ub~E2-tioesteren til frie lysinaminosyrer og/eller på lysinrester av E3-ligaene. Western blot analyse ble utført for å visualisere både Ub-modifiserte proteiner og E3 ligase CHIP. Det uladede UBE2D2-enzymet har en molekylvekt på 17 kDa (Supplerende figur S2C).

Når ladet med en enkelt Ub molekyl-sikret ved bruk av lysinfri Ub (Ub K0)-molekylvekten av UBE2D2 ~ Ub skifter oppover til ca 26 kDa. Tidspunktet null (t0) representerer den totale avkastningen for ladet E2 (figur 3). I nærvær av inaktiv CHIP (35 kDa), ble det oppdaget en svak E3-ligaseuavhengig utslipp av UBE2D230,31, men ingen automatisk allestedsnærværende CHIP. I nærvær av wild-type CHIP (35 kDa) ble det derimot oppdaget en raskere utslipp av UBE2D2, noe som gir en fullstendig utslipp innen 60 min. Samtidig ble det observert automatisk allestedsnærværende CHIP, noe som indikerer at CHIP fremmet overføringen av Ub til sine egne lysinrester.

Figure 1
Figur 1: Vestlig blotanalyse for E2-E3 enzymsamarbeid in vitro. In vitro auto-ubiquitylation reaksjoner med forskjellige menneskelige E2 enzymer (fra venstre til høyre: tom, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H, og -N / V1) ble utført som indikert ved hjelp av (A) wild-type CHIP eller (B) den inaktive CHIP U-boksen mutant, CHIP (H260Q), som E3 ubiquitin ligaer. Prøvene ble delt likt, kjørt på separate polyakrylamidgeler og immunoblotted med anti-CHIP og anti-Ub antistoffer for å visualisere reaksjonsprodukter. Forkortelser: Ub = ubiquitin; CHIP = karboksyl terminus av HSC70-interagerende protein; ATP = adenosin tripfosfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vestlig blotanalyse som overvåker substratets allestedsnærværende. In vitro substrat allestedsnærværende ubiquitylation reaksjoner ble utført som indikert for å oppdage allestedsnærværende av menneskelig UNC-45B av CHIP wild-type eller inaktiv CHIP U-boks mutant, CHIP (H260Q). Human UBE2D2 ble brukt som E2-enzym. Forkortelser: WT = wild-type; Ub = ubiquitin; CHIP = karboksyl terminus av HSC70-interagerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vestlig blotanalyse som overvåker chipavhengig Ub-overføring fra UBE2D2~Ub thioester. Lading av human UBE2D2 ved lysinfri Ub (Ub K0), stopp av ladereaksjonen, og utladning av UBE2D2 ~ Ub ble utført som beskrevet. For utslippsreaksjonene ble wild-type CHIP eller den inaktive CHIP U-box mutanten CHIP(H260Q) brukt som allestedsnærværende ligaer og 10 mM L-lysin ble levert som potensiell Ub-akseptor. Prøver ble samlet inn etter de angitte tidsperiodene, kjørt på en polyakrylamidgel og immunoblotted med en anti-Ub / anti-CHIP antistoffblanding. Forkortelser: Ub = ubiquitin; CHIP = karboksyl terminus av HSC70-interagerende protein; ATP = adenosin tripfosfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Representativ vestlig flekkovervåking av E2-enzymaktiviteter i fravær av E3. In vitro ubiquitylation reaksjoner med forskjellige menneskelige E2 enzymer (fra venstre til høyre: tom, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H, og -N / V1) ble utført som angitt i fravær av en E3 ligase for å screene E3-uavhengige reaksjonsprodukter. Prøvene ble kjørt på en polyakrylamidgel og immunoblotted med anti-Ub. Forkortelser: Ub = ubiquitin; ATP = adenosin tripfosfat. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Analyse av ladeutbyttet og stabiliteten til UBE2D2~Ub K0 thioester. (A) Utbyttet av UBE2D2-lading oppnådd av E1 ble testet under ulike forhold. Den første ladereaksjonen (I) besto av 5 μM E1, 5 μM E2 og 50 μM Ub K0. Den andre ladereaksjonen (II) besto av 2 μM E1, 4 μM E2 og 4 μM Ub K0. Ladereaksjonene ble utført som beskrevet i 30 min ved 37 °C. Prøver ble samlet inn etter 15 og 30 min. Reaksjonene ble stoppet ved tilsetning av 4x LDS prøvebuffer og inkubert ved 70 °C i 10 minutter før gelelektroforese og Coomassie-farging. UBE2D2 ble brukt som kontroll. Omtrent halvparten av UBE2D2 ble konvertert til UBE2D2~Ub. Ingen ekstra lading ble oppdaget etter 15 minutter. Videre endret verken økningen i E1 eller økningen i fri allestedsnærværende ladeutbyttet til UBE2D2 ~ Ub. Dermed ble lading senere utført i 15 minutter ved 37 °C ved bruk av 2 μM E1, 4 μM E2 og 4 μM Ub K0. (B) Etter lading ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 1,8 U/ml apyrase og 30 mM EDTA og inkubert ved RT. Prøver ble samlet inn etter at 2, 5, 8, 10 og 15 min (baner 2-6), og uladet UBE2D2 ble brukt som kontroll (kjørefelt 1). 4x LDS prøvebuffer ble tilsatt, og prøver ble inkubert ved 70 °C i 10 minutter før gelelektroforese og Coomassie-farging. Stopp var effektivt målt ved konstant båndintensitet av UBE2D2 ~ Ub-proteinet, noe som også indikerer at thioesteren var stabil i løpet av den angitte tidsperioden. (C) Lading av human UBE2D2 ved lysinfri Ub (Ub K0), stopp av ladereaksjonen og utladning av UBE2D2~Ub ble utført som beskrevet. For utslippsreaksjonene ble wild-type CHIP eller den inaktive CHIP U-box mutanten CHIP (H260Q) brukt som allestedsnærværende ligaer, og 10 mM L-lysin ble levert som potensiell Ub-akseptor. Prøver ble samlet inn etter de angitte tidsperiodene, kjør på separate polyakrylamidgeler og Coomassie-farget. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette dokumentet beskriver grunnleggende in vitro allestedsnærværende metoder for analyse av E3-ligasefunksjon. Når du utfører in vitro allestedsnærværende analyser, bør det vurderes at noen E2-enzymer kan utføre auto-allestedsnærværende på grunn av angrepet av deres aktive cystein på sine egne lysinrester som ligger i nærheten av det aktive stedet30. For å omgå dette problemet anbefales bruk av en E2-mutant der de respektive lysinrester byttes mot arginin, noe som resulterer i et katalytisk aktivt E2-enzym som er motstandsdyktig mot auto-allestedsnærværende32. Dette er spesielt viktig når du overvåker Ub-overføringen via lysinutslippsanalyser for å sikre reproduserbarhet av analysen. En annen kritisk faktor er den forbigående karakteren av E2 ~ Ub thioester-bindingen. I tilfelle thioester stabilitet grenser mulige in vitro applikasjoner, den aktive cystein rester av E2 kan byttes mot en serine å generere en mer stabil E2 ~ Ub oxyester33. For første gangs bruk eller ved bruk av et nytt E2-enzym, bestem nivået av Ub-lading på E2 som kan oppnås ved E1. Ladeeffektiviteten kan påvirkes av flere faktorer, inkludert artens opprinnelse på E1, temperaturen på ladereaksjonen og molarforholdet mellom Ub og E2. Visualiser uladet vs. ladet E2 via Coomassie farging.

Til sammen fremhever disse potensielle begrensningene viktigheten av empirisk optimalisering av in vitro-analyseforhold, for eksempel E2-E3-par, E2-lading og utladning av kinetikk, molaritet og aktivitet av rekombinante proteiner, spesielt for lysinutladningsanalysen, for å oppnå reproduserbare resultater. Gitt de forskjellige cellulære funksjonene til den kovalente tilknytningen av Ub til substratproteiner, er analysen av protein allestedsnærværende et populært forskningsfelt. Analysen av allestedsnærværende hendelser kan imidlertid være vanskelig, spesielt in vivo. Denne vanskeligheten oppstår fra flere faktorer, inkludert den forbigående karakteren av E3-substratinteraksjonen34, redundans av mange E3-ligaer, samt promiskuitet av E3-ligaer for flere substrater35. Videre er karakteriseringen av spesifikke allestedsnærværende hendelser in vivo hindret av eksistensen av ytterligere medvirkende faktorer som allestedsnærværende kjedeforlengelsesfaktorer og deubiquitylation enzymer som modulerer allestedsnærværende kjedetopologi36. Disse begrensningene understreker viktigheten av robuste in vitro-teknikker som bidrar til å karakterisere enzymatiske aktiviteter av E3 ubiquitin ligaer i et definert rekombinant system.

Bortsett fra de beskrevne applikasjonene, kan in vitro allestedsnærværende analyser også brukes til å oppdage Ub-linkage-typen ved hjelp av koblingstypespesifikke antistoffer. Som en ekstra mer detaljert tilnærming kan det respektive proteinbåndet til det Ub-modifiserte substratet ekstraheres fra polyakrylamidgelen og analyseres via massespektrometri. Identifiseringen av koblingstypen støtter forståelsen av E3-substratinteraksjonens fysiologiske rolle, noe som er spesielt viktig for karakteriseringen av sykdomsrelaterte substratforringelsesveier37,38. På samme måte kan lysinutslippsanalysen brukes som et effektivt verktøy for å avdekke katalytiske forskjeller mellom E3 ubiquitin ligases eller E3 ligase familier30. Til slutt er in vitro allestedsnærværende metoder beskrevet heri effektive verktøy for å analysere ulike aspekter av E3-ligasefunksjonen. Foruten den relativt enkle utførelsen av de beskrevne metodene, er en stor fordel den generelle anvendbarheten, da proteiner fra alle eukaryote kilder kan rekombinant uttrykkes og studeres in vitro uten behov for spesialutstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker medlemmene av laboratoriet vårt for kritisk diskusjon og nyttige råd om manuskriptet. Vi beklager at vi ikke har sitert verdifulle bidrag på grunn av størrelsesbegrensning. Dette arbeidet støttes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 og Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD til TH. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy - EXC 2030 - 390661388 og - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 til T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 en T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Tags

Biologi utgave 171
<em>Introduksjon</em> Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter