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Biology

न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी लिपिड झिल्ली गतिशीलता और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए एक अद्वितीय जांच के रूप में

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/62396
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Physics, Virginia Tech, 2Center for Soft Matter and Biological Physics, Virginia Tech

ERRATUM NOTICE

Summary

यह पेपर लिपिड झिल्ली के न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई) अध्ययनों में नमूना तैयारी, डेटा में कमी और डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। लिपिड के विवेकपूर्ण ड्यूटेरियम लेबलिंग मेसोस्कोपिक लंबाई और समय तराजू पर विभिन्न झिल्ली गतिशीलता तक पहुंच को सक्षम बनाता है, जिस पर महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं होती हैं।

Abstract

लिपिड बिलेयर कोशिका झिल्ली का मुख्य मैट्रिक्स बनाते हैं और अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के बीच पोषक तत्वों के आदान-प्रदान, प्रोटीन-झिल्ली बातचीत और वायरल नवोदित के लिए प्राथमिक मंच हैं। कुशल जैविक गतिविधि के लिए, कोशिका झिल्ली को कोशिका की अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त कठोर होना चाहिए और इसके डिब्बों को अभी तक पर्याप्त तरल पदार्थ होना चाहिए ताकि झिल्ली घटकों, जैसे प्रोटीन और कार्यात्मक डोमेन को फैलाना और बातचीत करने की अनुमति दी जा सके। लोचदार और द्रव झिल्ली गुणों का यह नाजुक संतुलन, और जैविक कार्य पर उनके प्रभाव, मेसोस्कोपिक लंबाई और प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं के समय तराजू पर सामूहिक झिल्ली गतिशीलता की बेहतर समझ की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, झिल्ली विरूपण और प्रोटीन बाध्यकारी घटनाएं। इस गतिशील रेंज की प्रभावी जांच करने वाली तकनीकों में न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई) स्पेक्ट्रोस्कोपी है। ड्यूटेरियम लेबलिंग के साथ संयुक्त, एनएसई का उपयोग सीधे झुकने और मोटाई में उतार-चढ़ाव के साथ-साथ चुनिंदा झिल्ली सुविधाओं की मेसोस्कोपिक गतिशीलता तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है। यह पत्र एनएसई तकनीक का संक्षिप्त विवरण प्रदान करता है और डेटा संग्रह और कमी के निर्देशों के साथ-साथ नमूना तैयारी और ड्यूटेरेशन योजनाओं के विवरण सहित लिपोसोमल झिल्ली पर एनएसई प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। कागज में प्रमुख झिल्ली मापदंडों को निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा विश्लेषण विधियों का भी परिचय दिया गया है, जैसे कि झुकने वाली कठोरता मोडुलस, क्षेत्र संपीड़न मोडुलस, और इन-प्लेन चिपचिपाहट। एनएसई अध्ययनों के जैविक महत्व को समझाने के लिए, एनएसई द्वारा जांच की गई झिल्ली घटनाओं के चुनिंदा उदाहरणों पर चर्चा की जाती है, अर्थात् झिल्ली झुकने वाली कठोरता पर एडिटिव्स का प्रभाव, झिल्ली के उतार-चढ़ाव पर डोमेन गठन का प्रभाव, और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन के गतिशील हस्ताक्षर।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में कोशिका झिल्ली और उनके कार्य की समझ उल्लेखनीय रूप से विकसित हुई है। कोशिका झिल्ली के पूर्व दृष्टिकोण को निष्क्रिय लिपिड बिलायर के रूप में जो कोशिका सीमाओं और घर की झिल्ली प्रोटीन को परिभाषित करताहै, धीरे-धीरे एक गतिशील मॉडल में बदल गया है जिसमें लिपिड बिलायर सेलुलर सिग्नलिंग, आणविक विनिमय और प्रोटीन फ़ंक्शन सहित महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं - कुछ2,3,4,5, 6नाम के लिए। यह बोध है कि कोशिका झिल्ली अत्यधिक गतिशील हैं, लगातार रिमॉडलिंग और आणविक पुनर्वितरण के दौर सेगुजर रहे हैं, झिल्ली7,8,9की संतुलन संरचनाओं से परे वैज्ञानिक अन्वेषणों का आग्रह किया है । तदनुसार, जैविक और बायोइंपरेड लिपिड झिल्ली में विभिन्न गतिशील मोड का अध्ययन करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। आज तक, इनमें से अधिकांश अध्ययनों ने मुख्य रूप से डिफ्यूरिव आणविक गति10, 11,12,13और स्थूल आकार के उतार-चढ़ाव14,15,16पर ध्यान केंद्रित किया है, जिससे मध्यवर्ती झिल्ली गतिशीलता को समझने में एक महत्वपूर्ण अंतर है, यानी लिपिड विधानसभाओं के सामूहिक उतार-चढ़ाव जिनमें लिपिड अणुओं के कुछ 10-100 शामिल हैं । ये गतिशीलता कुछ दसियों से कुछ 100 Å के लंबाई तराजू पर होती है और उप-एनएस के समय के तराजू से कुछ सौ एनएस (चित्रा 1देखें), जिसे यहां मेसोस्कोपिक तराजू के रूप में संदर्भित किया जाता है। वास्तव में इन पैमानों पर ही प्रमुख जैविक गतिविधि झिल्ली स्तर17पर होती है . इसमें वायरल नवोदित18, चैनल गेटिंग19और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन20शामिल हैं । यहां यह बताना भी महत्वपूर्ण है कि झिल्ली प्रोटीन21, 22 के ऊर्जा परिदृश्य से पता चलता है कि प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन -उनकी नियामक भूमिका के लिए आवश्यक - एनएस समय तराजू पर होता है सामूहिक झिल्ली उतार-चढ़ाव के23, आगे कोशिका झिल्ली के जैविक कार्य में मेसोस्कोपिक गतिशीलता के महत्व पर जोर देते हैं और उनके बायोइंस्पाइरेड एनालॉग20। यह पेपर लिपिड झिल्ली में दो प्राथमिक मेसोस्कोपिक गतिशील मोड पर केंद्रित है, अर्थात्, उतार-चढ़ाव और मोटाई में उतार-चढ़ाव को झुकाना।

इन उतार-चढ़ाव मोड की सीधे जांच करने में मुख्य चुनौती मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करके उनके स्थानिक और लौकिक तराजू तक पहुंचने में कठिनाई है। दूसरी चुनौती यह है कि प्रत्यक्ष संपर्क तकनीक16को मापने के लिए किए गए उतार - चढ़ाव को प्रभावित कर सकती है . यह जैविक झिल्ली24, 25की रचनात्मक और संरचनात्मक जटिलता से और अधिक बढ़ा है, जिसके परिणामस्वरूप लिपिड डोमेनगठन 26, 27, 28,29, 30और झिल्ली विषमता31,32,33- विभिन्न झिल्ली सुविधाओं की गतिशीलता को समझने के लिए चयनात्मक जांच की मांग शामिल है। सौभाग्य से, इन चुनौतियों को गैर-इनवेसिव न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों के साथ दूर किया जा सकता है, जैसे न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई), जो स्वाभाविक रूप से आवश्यक लंबाई और समय तराजू तक पहुंचते हैं, और अपने भौतिक रसायन वातावरण34को बदले बिना चयनात्मक झिल्ली सुविधाओं के अध्ययन को सक्षम करते हैं। दरअसल, पिछले कुछ वर्षों में एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी सामूहिक झिल्ली गतिशीलता35की एक अनूठी और शक्तिशाली जांच के रूप में विकसित हुई है। लिपिड झिल्ली पर एनएसई अध्ययनों के परिणामों ने यांत्रिक36,37 और चिपचिपा38,लिपिड झिल्ली के39 गुणों में नई अंतर्दृष्टि उत्पन्न की है और जैविक कार्य40,41में अपनी संभावित भूमिका पर नई रोशनी दी है ।

एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक एक इंटरफेरोमेट्रिक इंस्ट्रूमेंट डिजाइन पर आधारित है, जो पहले मेज़ी42द्वारा प्रस्तावित है, जो न्यूट्रॉन स्पिन के प्रीसेसियन को नियंत्रित करने के लिए स्पिन-फ्लिपर्स और चुंबकीय कुंडल की एक श्रृंखला का उपयोग करके उपकरण को पार करता है। डिजाइन नमूना स्थिति(चित्रा 1A)के संबंध में चुंबकीय क्षेत्र तत्वों के चुंबकीय मिररिंग पर टिकी हुई है। इसका मतलब यह है कि न्यूट्रॉन और नमूने के बीच ऊर्जा विनिमय के अभाव में, न्यूट्रॉन उपकरण के पहले और दूसरे छमाही में विपरीत दिशाओं में स्पिन प्रीसेशन की एक ही संख्या करता है (दो precession कुंडल के बीच π-फ्लिपर पर ध्यान दें)। नतीजतन, न्यूट्रॉन की अंतिम स्पिन स्थिति प्रारंभिक स्थिति के सापेक्ष अपरिवर्तित बनी हुई है - स्पिन-इको के रूप में संदर्भित एक घटना (चित्रा 1 एमें पारदर्शी न्यूट्रॉन देखें)। हालांकि, जब न्यूट्रॉन ऊर्जावान रूप से नमूने के साथ बातचीत करता है, तो ऊर्जा विनिमय उपकरण की दूसरी छमाही में स्पिन प्रीसेशंस की संख्या को संशोधित करता है, जिससे एक अलग अंतिम स्पिन राज्य होता है (चित्रा 1 एदेखें)। यह प्रयोगात्मक रूप से ध्रुवीकरण में नुकसान के रूप में पाया जाता है, जैसा कि बाद में इस पेपर में दिखाया जाएगा । एनएसई तकनीक के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठक को समर्पित तकनीकी पत्र42, 43,44, 45के लिए संदर्भित कियाजाताहै।

यहां, एनएसई के साथ सुलभ लंबाई और समय तराजू का मोटा अनुमान प्रदान करने के लिए एक सरलीकृत विवरण प्रस्तुत किया जाता है। लंबाई तराजू प्राप्त तरंग क्षेत्रों की सीमा से निर्धारित होते हैं, क्यू = 4 पाप θ/λ,जहां 2θ बिखरने का कोण है और λ न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य है। कोई भी देख सकता है कि क्यू तरंगदैर्ध्य सीमा और स्पेक्ट्रोमीटर की दूसरी भुजा के रोटेशन की सीमा (चित्रा 1Aदेखें) द्वारा निर्धारित किया गया है। एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर पर एक विशिष्ट क्यू-रेंज~ 0.02-2 Å-146,47है,और हाल ही में उन्नयन48,49केसाथ 0.01-4Å-1 तक, ~ 1-600 Å के स्थानिक तराजू के अनुरूप है। दूसरी ओर, सुलभ समय पैमाने की गणना चुंबकीय पूर्वाज कुंडल कुंडल के भीतर न्यूट्रॉन द्वारा अधिग्रहीत कुल प्रीसेशन कोण (या चरण) से की जाती है, औरयह 50पाया जाता है: Equation 12 । इस अभिव्यक्ति में, टी फोरियर समय के रूप में परिभाषित किया गया Equation 13 है, जहां Equation 50 न्यूट्रॉन जायरोमैग्नेटिक अनुपात Equation 51 है, कुंडली की लंबाई है, और Equation 52 कुंडली के चुंबकीय क्षेत्र की ताकत है। यह इंगित करने लायक है कि फोरियर समय एक मात्रा है जो उपकरण ज्यामिति, चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य पर सख्ती से निर्भर है। उदाहरण के लिए, तरंगदैर्ध्य के न्यूट्रॉन का उपयोग करना Equation 70 = 8 Å और साधन सेटिंग्स Equation 51   = 1.2 मीटर और Equation 52 = 0.4 टी, फोरियर समय की गणना टी ~ 50 एनएस होने के लिए की जाती है। प्रायोगिक रूप से, फोरियर समय को प्रेग्नेंसी कॉइल (यानी चुंबकीय क्षेत्र की ताकत) में वर्तमान को बदलकर या विभिन्न न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके ट्यून किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ~ 1 पीएस से 100 एनएस के विशिष्ट एनएसई समय तराजू होते हैं। हालांकि, एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर में हाल के उन्नयन ने लंबे समय तक फोरियर समय तक पहुंच को सक्षम किया है, हेंज मायर-लीबंटिट्ज ज़ेंड्रम51 और एसएनएस-एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर पर जे-एनएसई-फीनिक्स स्पेक्ट्रोमीटर पर ~ 400 एनएस तक, ओक रिज नेशनल लैब 48 में, और इंस्टिट्यूट लॉ-लैंगविन (ILL)49में IN15 एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर में ~1,000 एनएसतक। 

झिल्ली की गतिशीलता की लंबाई और समय पैमाने तक सीधी पहुंच के अलावा, एनएसई में न्यूट्रॉन आइसोटोप संवेदनशीलता52की अंतर्निहित क्षमताएं हैं। विशेष रूप से, हाइड्रोजन के आइसोटोप के साथ अलग-अलग बातचीत करने के लिए न्यूट्रॉन की क्षमता, जैविक प्रणालियों में सबसे प्रचुर तत्व, एक अलग न्यूट्रॉन बिखरने वाली लंबाई घनत्व,34 या एनएसएलडी (अपवर्तन50के ऑप्टिकल इंडेक्स के बराबर) में परिणाम देता है, जब प्रोटियम को ड्यूटेरियम द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। यह एक दृष्टिकोण को विपरीत भिन्नता के रूप में जाना जाता है, जिसका उपयोग आमतौर पर विशिष्ट झिल्ली सुविधाओं को उजागर करने या दूसरों को छुपाने के लिए किया जाता है - उत्तरार्द्ध परिदृश्य को विपरीत मिलान के रूप में संदर्भित किया जाता है। इसके विपरीत भिन्नता/मिलान का एक लगातार आवेदन पानी का प्रतिस्थापन है (NSLD =-0.56 ×10-6 Å-2)भारी पानी या डी2ओ (NSLD = 6. 4 × 10-6 Å-2)प्रोटेटेड लिपिड झिल्ली (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2)से न्यूट्रॉन सिग्नल बढ़ाना। झिल्ली संरचना के अध्ययन में यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रभावी है क्योंकि झिल्ली के हेडग्रुप क्षेत्र में डी2ओ का प्रवेश झिल्ली की मोटाई (चित्रा 2 ए, बाएंपैनल देखें) और विभिन्न लिपिड उपसमूहों के स्थान के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है जब अधिक परिष्कृत मॉडल लागू किए जाते हैं53,54। यह पेपर बायोमिमेटिक झिल्ली और चुनिंदा झिल्ली सुविधाओं में सामूहिक गतिशीलता के अध्ययन के लिए विपरीत भिन्नता के उपयोग पर कुछ उदाहरणों पर प्रकाश डालता है।

यहां, एनएसई की गतिशील और कार्यात्मक झिल्ली गुणों में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करने में एनएसई की प्रभावशीलता को लिपोसोमल निलंबन के रूप में मुक्त-खड़े झिल्ली में मेसोस्केल गतिशीलता पर जोर देने के साथ मॉडल और जैविक रूप से प्रासंगिक लिपिड झिल्ली प्रणालियों पर एनएसई अध्ययनों के ठोस उदाहरणों के माध्यम से सचित्र है। इन-प्लेन झिल्ली गतिशीलता के एनएसई मापों के लिए, पाठक को चराई-घटना न्यूट्रॉन स्पिन-इको स्पेक्ट्रोस्कोपी (जीन्स)55, 56 और गठबंधन मल्टीलैमलर झिल्ली के अन्य अध्ययनों पर समर्पित प्रकाशनों के लिए संदर्भित किया जाता है57,58,59,60।

सादगी के लिए, यह पेपर झिल्ली के तीन अलग-अलग योजनाओं पर प्रकाश डालता है, जो अच्छी तरह से अध्ययन किए गए डोमेन-फॉर्मिंग पर सचित्र है, या चरण अलग, लिपिड बाइलेयर सिस्टम 1,2-डाइमारिस्टोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीएमपीसी) और 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोचोलिन (डीएसपीसी) मिश्रण61,62। दो लिपिड उनके हाइड्रोकार्बन चेन लंबाई में एक बेमेल की विशेषता है (14 कार्बन/डीएमपीसी बनाम 18 कार्बन/डीएसपीसी में पूंछ) और उनके जेल-द्रव संक्रमण तापमान (टीएम, डीएमपीसी = 23 डिग्री सेल्सियस बनाम टीएम, DSPC = ५५ डिग्री सेल्सियस) । इसके परिणामस्वरूप डीएमपीसी में पार्श्व चरण-पृथक्करण: मिश्रण के ऊपरी और निचले संक्रमण तापमान के बीच तापमान पर डीएसपीसी झिल्ली63। यहां विचार की गई ड्यूटेरेशन योजनाओं को लिपोसोमल झिल्ली पर एनएसई मापों में सुलभ विभिन्न गतिशील मोड प्रदर्शित करने के लिए चुना जाता है, अर्थात्, मोड़ उतार-चढ़ाव, मोटाई में उतार-चढ़ाव, और पार्श्व डोमेन के चयनात्मक झुकने/मोटाई में उतार-चढ़ाव । सभी लिपिड रचनाओं डीएमपीसी के लिए सूचित कर रहे हैं: डीएसपीसी bilayers 70:30 के एक तिल अंश पर तैयार, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटेटेड और DMPC और DSPC के छिद्रित वेरिएंट का उपयोग कर । सभी नमूना तैयारी कदम लिपोसोमल निलंबन के 4 एमएल पर आधारित हैं, डी2ओ में, 50 मिलीग्राम/एमएल की लिपिड एकाग्रता के साथ, एममुन्ना = 200 मिलीग्राम प्रति नमूना के कुल लिपिड द्रव्यमान के लिए।

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Protocol

1. प्रयोग के लिए ड्यूटेरेशन योजना आवश्यक

  1. उतार-चढ़ाव मापन को झुकाने के लिए, डी2ओ (डी 99.9%) या डी 2 ओ-बफर (जैसे, एच2ओ के बजाय डी2ओ के साथ तैयार फॉस्फेट बफर) में पूरीतरहसे प्रोटेटेड लिपोसोम बनाएं। 133.4मिलीग्राम के साथ पूरी तरह से प्रोटेटेड डीएमपीसी (सी 36 एच72नंबर8पी) और डीएसपीसी (सी44एच88NO8पी) का उपयोग Equation 1 करें, जहां एक्सडीएमपीसी और एक्सडीएसपीसी डीएमपीसी और डीएसपीसी के तिल अंश हैं, यहां क्रमशः 0.7 और 0.3 तक सेट किया गया है, और एमडब्ल्यूडीएमपीसी और एमडब्ल्यूडीएसपीसी क्रमशः 677.9 ग्राम/मोल और 790.1 ग्राम/मोल द्वारा दिए गए मोलर वजन हैं। इसी तरह, एमDSPC = 66.6 मिलीग्राम। यह ड्यूटेरेशन योजना झिल्ली (एनएसएलडी ~ 0 × 10-6 Å-2)और ड्यूटेरेटेड बफर (एनएसएलडी ~ 6.4 × 10-6 Å-2)के बीच बिखरने के विपरीत को बढ़ाती है और झिल्ली लहरों से संकेत को बढ़ाती है (चित्रा 2ए बाएं पैनल देखें)।
  2. चुनिंदा पार्श्व झिल्ली सुविधाओं की झुकने वाली गतिशीलता को मापने के लिए, उदाहरण के लिए, चरण-डीएमपीसी को अलग करने में मैट्रिक्स गतिशीलता: डीएसपीसी झिल्ली, प्रोटेटेड डीएमपीसी (सी36एच72नंबर8पी) और ड्यूटेरेटेड, डीएसपीसी-डी83 (सी44एच5नंबर 8 पीडी83,एमडब्ल्यू 873.7 ग्राम/मोल) का उपयोग करें, जैसे कि एमडीएमपीसी = 128.8 मिलीग्राम और एमडीएसपीसी-डी83 = 71.2 मिलीग्राम। यह ड्यूटेरेशन योजना अवांछित डीएसपीसी-समृद्ध डोमेन से बिखरने को कम करती है, जिससे डीएमपीसी-समृद्ध मैट्रिक्स (चित्रा 2B मध्य देखें) से उतार-चढ़ाव को झुकाने के चयनात्मक माप को सक्षम करता है।
    नोट: एक विशिष्ट विपरीत मिलान योजना के लिए आवश्यक इष्टतम लिपिड ड्यूटेरेशन खोजने के लिए, उपलब्ध वेब-आधारित स्कैटरिंग लेंथ घनत्व (एसएलडी) कैलकुलेटर का उपयोग करें, जैसे कि एनिस्ट सेंटर फॉर न्यूट्रॉन रिसर्च64द्वारा विकसित एक। ये वेब-आधारित इंटरफेस लिपिड के एसएलडी की आसान गणना के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरणों के साथ-साथ लिपिड मिश्रण के साथ-साथ लिपिड मिश्रण से लैस हैं।
  3. औसत झिल्ली मोटाई में उतार-चढ़ाव (कोई पार्श्व विपरीत के साथ) के एनएसई माप के लिए, घटक लिपिड के पूंछ-deuterated वेरिएंट का उपयोग करें, यानी, डीएमपीसी-d54 (सी36एच18नहीं8पीडी54,732.3 जी/मोल) और डीएसपीसी-डी 70 (सी44एच18नहीं8पीडी70, 860.1 ग्राम/मोल)35,38,ऐसे कि एमडीएमपीसी-डी 54 = 133.0 मिलीग्राम और एमडीएसपीसी-डी70 = 67.0 मिलीग्राम। यह कंट्रास्ट स्कीम(चित्रा 2 ए,राइट पैनल) लिपिड हेडग्रुप (एनएसएलडी ~ 4.5 × 10-6Å-2) से बिखरने वाले संकेत को इसके विपरीत-मिलान करके पूंछ-समूह (एनएसएंड ~ 6.4 × 10-6 Å-2)को डियूटरेटेड बफर को बढ़ाती है जिससे झिल्ली में उतार-चढ़ाव का पता लगाने में सक्षम बनाया जा सकता है।
  4. मोटाई उतार-चढ़ाव के लिए चुनिंदा झिल्ली डिब्बों के अध्ययन, उदाहरण के लिए, डीएमपीसी से भरपूर मैट्रिक्स, अपनी पूंछ-ड्यूटेरेटेड एनालॉग यानी डीएमपीसी-डी54 के साथ प्रोटेटेड डीएमपीसी लिपिड को प्रतिस्थापित करके चरण 1.2 में वर्णित एक ही रणनीति का उपयोग करें, जैसे कि डीएसपीसी-समृद्ध डोमेन ड्यूटेरेटेड बफर से विपरीत हैं और प्राथमिक बिखरने का संकेत पूंछ-ड्यूटर डीएमपीसी-रिच मैट्रिक्स के हेडग्रुप क्षेत्र से है।

2. बाहर निकालने के लिए लिपिड निलंबन की तैयारी

  1. नमूना संरचना के आधार पर, नमूने में प्रत्येक घटक के द्रव्यमान की गणना करें। अंगूठे के नियम के रूप में, कई आणविक घटकों वाले नमूनों के लिए, एक घटक का द्रव्यमान इसके मोलर द्रव्यमान द्वारा दिया जाता है, एमडब्ल्यूi,इसके तिल अंश, एक्सआई द्वारा भारित होता है, और सभी घटकों पर सामान्यीकृतहोताहै जैसे कि: Equation 2 जहां एममुन्ना कुल द्रव्यमान है, यहां 200 मिलीग्राम तक सेट किया गया है। विभिन्न ड्यूटेरेशन योजनाओं के साथ डीएमपीसी-डीएसपीसी लिपिड बिलेयर के लिए ऊपर उदाहरण देखें।
  2. एक डिजिटल अर्ध-माइक्रोसैलेंस का उपयोग करके, लिपिड (और अन्य नमूना घटकों, जैसे प्रोटीन, नैनोकणों, आदि) की गणना की गई जनता का वजन करें और उन्हें एक शीशी या गोल-नीचे फ्लास्क में जोड़ें - पहले से ही शीशी या फ्लास्क का वजन करना याद रखें। एक हुड के अंदर मैन्युअल रूप से मिश्रण करके तौला घटकों को भंग करने के लिए विलायक के 1 मिलीएल जोड़ें। शुद्ध लिपिड नमूनों के लिए, क्लोरोफॉर्म या इथेनॉल का उपयोग करें। अतिरिक्त, गैर-लिपिड घटकों (जैसे, नैनोकणों) वाले नमूनों के लिए, एक आम सॉल्वेंट चुनें जो सभी घटकों को फैलाता है।
    1. छोटे लिपिड मात्रा (<10 मिलीग्राम) के लिए, एक स्टॉक समाधान तैयार करें और मिश्रण में आवश्यक मात्रा को पिपेट करें।
      नोट: सॉल्वेंट की अत्यधिक मात्रा न जोड़ें क्योंकि यह नीचे वर्णित सॉल्वेंट सुखाने के कदम को काफी धीमा कर देगा।
  3. लिपिड समाधान को सुखाएं, एक हुड के अंदर, धीरे-धीरे एक कोण पर शीशी घुमाते हुए शीशी में एक निष्क्रिय गैस (जैसे, नाइट्रोजन, आर्गन) स्ट्रीमिंग करके। शीशी की दीवारों पर सूखे लिपिड की एक पतली फिल्म बनाने के लिए शीशियों को झुका हुआ स्थिति में रखें, जो सूखने के लिए भी अनुमति देगा। वाष्पीकरण-मध्यस्थता शीतलन को दरकिनार करने के लिए रुक-रुककर शीशी को 35 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें, जो सॉल्वेंट वाष्पीकरण को धीमा कर देगा।
  4. अवशिष्ट सॉल्वेंट को पूरी तरह से हटाने के लिए ~ 35 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम ओवन में रात भर शीशियों को रखें। असंतृप्त लिपिड के लिए, ऑक्सीकरण को कम करने के लिए एक निष्क्रिय गैस के साथ वैक्यूम को शुद्ध करें।
  5. पूर्ण विलायक हटाने सुनिश्चित करने के लिए, लिपिड सुखाने के बाद शीशी का वजन और पुष्टि करते हैं कि सामग्री की मापा मात्रा से परे कोई अतिरिक्त द्रव्यमान नहीं है। सूखने के बाद मापा द्रव्यमान से शीशी के द्रव्यमान को घटाकर ऐसा करें। यदि अतिरिक्त द्रव्यमान है, तो एक और 6 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत नमूना सुखाएं। इस प्रक्रिया को आवश्यकतानुसार दोहराएं।
  6. 50 मिलीग्राम/एमएल की लिपिड एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डी2ओ या डी2ओ-बफर के 4 एमएल के साथ लिपिड फिल्म को हाइड्रेट करें। उच्च संक्रमण तापमान वाले लिपिड के लिए, जैसे डीएमपीसी-डीएसपीसी मिश्रण, बफर को संक्रमण तापमान (60 डिग्री सेल्सियस) से ऊपर गर्म करें ताकि मिश्रण भी सुनिश्चित किया जा सके।
    नोट: चूंकि एनएसई प्रयोगों के लिए अपेक्षाकृत बड़े नमूना वॉल्यूम (~ 4 एमएल) की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रति नमूने की संख्या को कम करने के लिए आवश्यक बफर यानी 2 एमएल के आधे हिस्से का उपयोग करके नमूना को हाइड्रेटिंग करने पर विचार करें (धारा 3 देखें)। इस मामले में, बफर पोस्ट एक्सट्रूज़न के शेष आधे जोड़ें। ध्यान दें कि एक्सट्रूशन में इस्तेमाल होने वाली सीरिंज की क्षमता 1 मिलील तक सीमित है। इस प्रकार, बफर के 4 एमएल के साथ हाइड्रेटिंग को एक्सट्रूज़न के चार सेट की आवश्यकता होगी।
  7. भंवर- हाइड्रेटेड लिपिड सॉल्यूशन को तब तक मिक्स करें जब तक लिपिड फिल्म पूरी तरह घुल न जाए और अब शीशी की दीवारों पर नजर नहीं आती। इस स्तर पर, हाइड्रेटेड लिपिड मल्टीलैमलर वेसिकल्स और माइक्रोन आकार के मल्टीलैमलर स्टैक बनाते हैं और निलंबन दूधिया सफेद दिखाई देता है।
  8. लिपिड के ढेर को तोड़ने की सुविधा और मल्टीलैमेलिटी को कम करने के लिए, पूरी तरह से जमे हुए जब तक एक प्रयोगशाला ग्रेड फ्रीजर (अधिमानतः-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर) में हाइड्रेटेड लिपिड समाधान की शीशी रखकर पांच फ्रीज/गल चक्र प्रदर्शन करें और फिर लिपिड समाधान पूरी तरह से गल न जाए तब तक शीशी को 35 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में स्थानांतरित करें। भंवर समरूप होने तक गल समाधान। चार बार और दोहराएं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एसीटोन और सूखी बर्फ के संयोजन से तेजी से ठंड के लिए एक सूखी बर्फ स्नान तैयार किया जा सकता है।

3. हाइड्रेटेड लिपिड समाधान का निष्कासन

  1. दो झिल्ली के बीच पॉलीकार्बोनेट झिल्ली का उपयोग करके एक्सट्रूडर सेटअप को इकट्ठा करें और अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिए प्रत्येक तरफ दो पेपर फिल्टर जोड़ें। एक पोर आकार के साथ पॉली कार्बोनेट झिल्ली का उपयोग करें जो लक्ष्य लिपोसोमल आकार से मेल खाता है (एनएसई प्रयोगों के लिए सामान्य ताकना आकार 50 एनएम और 100 एनएम हैं - आमतौर पर, 100 एनएम-व्यास लिपोसोम कम विवश झिल्ली के उतार-चढ़ाव के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन छोटे 50 एनएम लिपोसोम का उपयोग वक्रता अध्ययन के लिए किया जा सकता है)। सुनिश्चित करें कि पॉली कार्बोनेट झिल्ली पूरी तरह से विधानसभा को पूरा करने और बाहरी एक्सट्रूडर केसिंग को कसने से पहले फैला हुआ है।
  2. एयरटाइट ग्लास सीरिंज का उपयोग करके झिल्ली असेंबली के माध्यम से कई बार डी 2 ओ या डी2ओ-बफर के ~0.3एमएल को पारित करके पॉली कार्बोनेट झिल्ली को हाइड्रेट करें। नमूना तैयार करने में उपयोग किए जाने वाले एक ही बफर का उपयोग करें। इसे कम से कम 10 मिनट के लिए छोड़ दें, फिर नमूना पेश करने से पहले बफर को पूरी तरह से चूस लें।
  3. तैयार लिपिड समाधान के साथ एक 1 एमएल गैस-तंग सिरिंज भरें और एक्सट्रूडर उपकरण के एक छोर में डालें। फिर, विपरीत छोर में एक खाली सिरिंज डालें। एक बार सीरिंज एक्सट्रूडर असेंबली से कनेक्ट हो जाने के बाद, इसे एक्सट्रूडर ब्लॉक में रखें।
  4. यदि एक्सट्रूज़न के लिए ऊंचा तापमान आवश्यक है, जैसा कि उच्च संक्रमण तापमान (जैसे, डीएसपीसी, टीएम = 55 डिग्री सेल्सियस) के साथ संतृप्त लिपिड के मामले में, लिपिड संक्रमण तापमान (जैसे, 60 डिग्री सेल्सियस) के ऊपर एक्सट्रूडर हीटिंग ब्लॉक को पहले से गरम करके, एक गर्म प्लेट पर हीटिंग ब्लॉक रखकर या चित्रा 3 एमें दिखाए गए परिसंचरण स्नान का उपयोग करके।
    नोट: यह कदम लिपिड के सजातीय मिश्रण को सुनिश्चित करने और एक्सट्रूसेशन के दौरान अत्यधिक दबाव डालने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो पॉली कार्बोनेट झिल्ली को टूट सकता है। कम संक्रमण तापमान (<25 डिग्री सेल्सियस) के साथ लिपिड नमूनों के लिए, कमरे के तापमान पर निष्कासन करते हैं।
  5. लिपिड समाधान को बाहर निकालने के लिए, एक एल्यूमीनियम/स्टील फ्रेम के साथ एक प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप के लिए एक्सट्रूडर सेट संलग्न करें जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है। तापमान नियंत्रित एक्सट्रूज़न के लिए, एक तरल पदार्थ चैनल के साथ एक कस्टम-निर्मित एक्सट्रूडर बेस जोड़ें और एक परिसंचारी पानी स्नान से जुड़ते हैं।
  6. निर्माता के मैनुअल के बाद 15-20 एक्सट्रूशन चक्र करने के लिए सिरिंज पंप को प्रोग्राम करें। जब बाहर निकाला जाता है, तो लिपिड समाधान का रंग दूधिया सफेद से पारदर्शी ओपल ब्लू(चित्रा 3B,सी) में बदलताहै,जो एक अंतिम लिपोसोमल आकार का संकेत देता है जो अपेक्षा के अनुसार दिखाई देने वाली रोशनी की तरंगदैर्ध्य से छोटा है। चित्रा 3Aमें दिखाए गए सिरिंज पंप के प्रकार के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. पंप सेटिंग्स को समायोजित करके शुरू करें। रेट बटन को दबाए रखें और एक्सट्रूशन रेट (50.99 एमएल/एच) दर्ज करें, फिर व्यास बटन दबाएं और सिरिंज व्यास (4.606 मिमी) दर्ज करें। उस अंक मूल्य को बदलने के लिए स्क्रीन पर प्रत्येक अंक के नीचे ऊपर तीर का उपयोग करें।
    2. एक्सट्रूडर सेट को दाईं ओर नमूना सिरिंज के साथ रखें (चित्रा 3Aदेखें)। जब तक वापस लेने की रोशनी चालू नहीं हो जाती तब तक वापस लेने का बटन दबाएं। प्रेस शुरू करें और नमूने को बाईं (खाली) सिरिंज में बांटने की प्रतीक्षा करें।
    3. नमूना (दाएं) सिरिंज पूरी तरह से खाली होने से ठीक पहले स्टॉप बटन मारो। तिरस्कृत मात्रा रिकॉर्ड करें और एक्सट्रूशन चक्र को प्रोग्राम करने के लिए इसका उपयोग करें। स्क्रीन पर चरण 1 (पीएच:01) दिखाई देने तक दर बटन को दबाए रखें। पहले दर्ज की गई डिस्पेंस्ड वॉल्यूम को एंटर करने के लिए वॉल्यूम बटन दबाएं। इस चरण में, सुनिश्चित करें कि वापस लेने की रोशनी बंद है - यह सही दिशा में नमूना वितरित करता है।
    4. दर बटन को फिर से दबाएं और चरण 2 (पीएच:02) तक पहुंचने के लिए सबसे सही ऊपर तीर का उपयोग करें। पहले दर्ज की गई तिरस्कृत मात्रा के समान मूल्य में प्रवेश करने के लिए वॉल्यूम दबाएं। इस चरण में, वापस लेने के बटन को तब तक दबाएं जब तक कि वापस न ले लिया जाए - यह नमूने को बाईं ओर वितरित करता है।
    5. इस चक्र को दोहराने के लिए, दर बटन को फिर से दबाएं और चरण 3 (पीएच:03) तक पहुंचने के लिए सबसे सही तीर का उपयोग करें। एलपी तक वॉल्यूम बटन दबाएं: एसई स्क्रीन पर दिखाई देता है और इसे 20 तक सेट करता है। यह छोरों की संख्या है या दोहराता है कि पंप प्रदर्शन करेगा। अंत में, रेट बटन दबाएं, चरण 4 (पीएच:04) तक पहुंचें, और स्टॉप फ़ंक्शन तक पहुंचने के लिए वॉल्यूम बटन को हिट करें। पंप अब स्वचालित निष्कासन के लिए स्थापित किया गया है।
    6. प्रेस एक्सट्रूशन चक्र शुरू करने के लिए शुरू करते हैं।
  7. एक साफ शीशी में निकाले गए लिपिड निलंबन युक्त सिरिंज को खाली करें और भंडारण या माप के लिए तैयार करें। उच्च पिघलने के तापमान के साथ लिपिड नमूनों के लिए, मापा जब तक तरल पदार्थ चरण संक्रमण के ऊपर नमूना स्टोर । अन्यथा, कमरे के तापमान पर नमूने रखें।
  8. ठंड के रूप में निकाले गए नमूनों को फ्रीज न करें क्योंकि वेसिकल्स फट जाएंगे (निलंबन दूधिया सफेद फिर से बदल जाएगा)।

4. नमूने के लिए एनएसई माप (ओं) और एकत्र किए गए डेटा में कमी

  1. एनएसई प्रयोग से पहले, पर्याप्त नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए उपलब्ध तरीकों का उपयोग करके चरण 3.7 से निकाले गए लिपोसोमल नमूने की विशेषता है। संभावित चारकैटराइजेशन विधियों की एक सूची जिसका उपयोग एनएसई प्रयोगों के लिए लिपोसोमल निलंबन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, आकार वितरण, मल्टीलैमेलिटी, पार्श्व झिल्ली संरचना, चर्चा अनुभाग में शामिल है।
  2. प्रयोग के लिए आवश्यक क्यू-रेंज और संबंधित इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स का निर्धारण करें। लिपिड बिलायरों की कठोरता माप झुकने के लिए, ~ (0.04 - 0.2) Å-1 की क्यू-रेंजका उपयोग करें। झिल्ली मोटाई में उतार-चढ़ाव के अध्ययन के लिए, झिल्ली की मोटाई35,66,67के अनुरूप ~ (0.04 - 0.2) Å-1 की क्यू-रेंज काउपयोग करें।
    नोट: प्रयोग की शुरुआत से पहले साधन वैज्ञानिक के साथ प्रयोगात्मक सेटअप पर चर्चा करें। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नमूने का बिना लक्षण वर्णन आवश्यक है, खासकर यदि बिखरने वाले संकेत की पूर्व जानकारी उपलब्ध नहीं है, जैसा कि चुनिंदा रूप से ड्यूटेरेटेड झिल्ली में है। वैकल्पिक रूप से, एनएसई उपकरण पर सीमित क्यू-रेंज पर स्थिर (विवर्तन के रूप में भी जाना जाता है) माप चलाएं, चेतावनी के साथ कि इस तरह के माप को बिना की तुलना में अधिक समय लगता है।
  3. एक सिरिंज या स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, एनएसई बीमलाइंस पर उपलब्ध नामित नमूना कोशिकाओं में निकाले गए लिपोसोमल सस्पेंशन (एस) को लोड करें। ध्यान दें कि मानक एनएसई नमूना कोशिकाएं 1, 2, 3 और 4 मिमी की मोटाई में आती हैं। एक उचित तीव्रता के लिए बेतुका पृष्ठभूमि संकेत रखते हुए बिखरने संकेत का अनुकूलन करने के लिए इस तरह से सेल मोटाई चुनें।
    नोट: अंगूठे के नियम के रूप में, ड्यूटेरेटेड बफर में प्रोटेटेड लिपोसोम्स के लिए 1 या 2 मिमी पथलेंगथ के साथ नमूना कोशिकाओं का उपयोग करें - मोटी कोशिकाओं के परिणामस्वरूप कई बिखरने वाले प्रभाव हो सकते हैं जिन्हें सही करना मुश्किल है। ड्यूटेरेशन के उच्च स्तर वाले लिपोसोम्स के लिए (उदाहरण के लिए, पूंछ के विपरीत-मिलान वाले लिपोसोम या एकल प्रोटेटेड पत्रक के साथ एमेमेट्रिक लिपोसोम), एक मोटा नमूना कोशिका (जैसे, 3 या 4 मिमी पथलेंथ) का उपयोग करने पर विचार करें ताकि नमूना बड़ी मात्रा में उपलब्ध होने पर गिनती के आंकड़ों को बढ़ाया जा सके - कभी-कभी यह निषेधात्मक हो सकता है।
  4. बफर के लिए एक समान नमूना सेल तैयार करें। लिपोसोमल सस्पेंशन में उसी बफर का इस्तेमाल करें। तीव्रता सामान्यीकरण और पृष्ठभूमि (बीकेजी) सुधार के लिए बफर पर माप आवश्यक हैं।
  5. एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर के नमूना धारक में नमूना सेल (एस) रखें, माप रन प्रोग्राम करें, और इको डेटा एकत्र करें। यदि पहली बार एनएसई उपयोगकर्ता माप प्रोग्रामिंग के बारे में साधन वैज्ञानिक से परामर्श करें।
  6. डेटा में कमी के लिए आवश्यक माप के दो अतिरिक्त सेट करें: संकल्प(आर)और ट्रांसमिशन(टी)माप।
    1. एक लोचदार बिखरने संदर्भ (जैसे, कार्बन) पर संकल्प(आर) माप- एक ही सेटिंग्स के तहत चलाया जाना; यानी नमूना और बफर माप के रूप में एक ही तरंग और फोरियर बार।
    2. संचारित न्यूट्रॉन बीम की तीव्रता की गणना करने के लिए नमूने और बफर पर ट्रांसमिशन(टी)माप करें (नीचे चरण 4.9 देखें)। संचरण की गणना एक खुली बीम (यानी, एक खाली नमूना स्थिति के साथ) के लिए न्यूट्रॉन गिनती द्वारा विभाजित नमूने या बफर से न्यूट्रॉन के अनुपात के रूप में की जाती है।
  7. एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर के लिए समर्पित डेटा रिडक्शन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें जिस पर एकत्र किए गए डेटा को कम करने के लिए माप किए जाते हैं।
    नोट: विभिन्न स्पेक्ट्रोमीटर विभिन्न सॉफ्टवेयर या उपयोगकर्ता इंटरफेस का उपयोग कर सकते हैं। नीचे डेटा विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन पर्यावरण (डेव) का उपयोग करके एनएसई डेटा में कमी का एक उदाहरण दिया गया है68 सॉफ्टवेयर विशेष रूप से न्यूट्रॉन अनुसंधान के लिए NIST केंद्र में एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर के लिए लिखा है ।
    1. डेव सॉफ्टवेयर खोलें और डेटा रिडक्शन मेनू से एनएसई डेटा को कम करें। कई पॉप-अप खिड़कियां दिखाई देंगी।
    2. फ़ाइल मेनू से ओपन .इको फाइलों का उपयोग करके विभिन्न क्यू-मानों पर डेटा फ़ाइलों को अपलोड करें। ये फाइलें स्पिन इको सिग्नल के साथ कच्चे डेटा फ़ाइलों के अनुरूप हैं और फ़ाइल नाम में एक्सटेंशन .echo है। एक बार फाइल अपलोड पूरा हो जाने के बाद, फाइलें उपलब्ध डेटा सेट के तहत दिखाई देंगी।
    3. चयनित फ़ाइल पर सही क्लिक करें और इसे माप के अनुसार लेबल करें जो इससे मेल खाता है; यानी, नमूना, सेल (खाली सेल या बफर के लिए), या संकल्प।
    4. डेटा सेट टैब का उपयोग करके सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के लिए 2 x 2 में डिटेक्टर पिक्सल समूह। सभी फाइलों पर एक ही बिनिंग लागू करें; यानी, संकल्प, सेल, और नमूना।
    5. सभी पिक्सेल समूहों पर डेटा का निरीक्षण करें और कीबोर्ड पर एम कुंजी दबाकर खराब संकेतों (चित्रा 4Bदेखें) वाले लोगों को मास्क करें। सभी फोरियर बार या बाद में फोरियर बार पर एक ही मास्क लागू करने के लिए पॉप अप विंडो तक पहुंचने के लिए प्रेस एंटर करें। यह डेटा में कमी के दौरान किसी भी बिंदु पर व्यक्तिगत पिक्सेल पर भी लागू किया जा सकता है। नकाबपोश पिक्सल हरे रंग की हो जाएगी।
    6. सुनिश्चित करें कि एकत्रित डेटा इको सिग्नल के रूप में है, यानी, प्रत्येक डिटेक्टर पिक्सेल (चित्रा 4Aदेखें) पर चरण वर्तमान के संदर्भ में कोसाइन फ़ंक्शन।
      नोट: चरण वर्तमान न्यूट्रॉन स्पिन के प्रीसेशन कोण के आनुपातिक है; इसलिए, यह एक चरण कोण के रूप में चरण वर्तमान का प्रतिनिधित्व करने के रूप में चित्रा 4Aमें दिखाया गया है आम है . स्पंदित स्रोतों पर माप के लिए, एक न्यूट्रॉन पल्स के भीतर घटना न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य के एक समारोह के रूप में इको सिग्नल प्राप्त करने के लिए डेटा पर उड़ान गणना का अतिरिक्त समय लागू किया जाता है।
    7. रिजॉल्यूशन फाइल को फिट करके शुरू करें। अपलोड की गई फाइल लिस्ट से रिज़ॉल्यूशन फाइल चुनें और फाइल पर राइट-क्लिक करें। फिट ऑपरेशंस का चयन करें: पॉप-अप मेनू से फिट इकोज़ (रिज़ॉल्यूशन)।
    8. सुनिश्चित करें कि इको सिग्नल के फिट होने से चरण 4.8 में आवश्यक पैरामीटर, एसहित कई फिटिंग पैरामीटर मिलते हैं। निम्नलिखित अभिव्यक्ति का उपयोग करके फिट स्वचालित रूप से प्रदर्शन किया जाता है।
      Equation 8
      यहां, ζ इको सिग्नल (यानी, चित्रा 4 एमें कोसीन फ़ंक्शन) की अवधि है, σ घटना न्यूट्रॉन बीम के मतलब तरंगदैर्ध्य और तरंगदैर्ध्य प्रसार द्वारा निर्धारित गॉसियन लिफाफे की चौड़ाई है, Φसी चरण वर्तमान है, और Φ0 इको पॉइंट है जो न्यूट्रॉन द्वारा अनुभव किए गए क्षेत्र पथ पर निर्भर करता है50। नमूने के बारे में भौतिक जानकारी समीकरण (1) में कोसाइन फ़ंक्शन के आयाम, एमें एन्कोड की जाती है।
      नोट: गॉसियन लिफाफे की चौड़ाई साधन वैज्ञानिक द्वारा पूर्व निर्धारित मूल्यों पर आधारित है और इसे बदला नहीं जाना चाहिए। अन्य पैराटर वेरिएबल हैं जो प्रत्येक पिक्सेल पर विशिष्ट इको सिग्नल में लगे होते हैं।
    9. परिणामस्वरूप फिटिंग मापदंडों, फिट की गुणवत्ता, और फिट के मतलब वर्ग विचलन दिखाने के लिए प्रत्येक पिक्सेल पर क्लिक करके फिट परिणामों का निरीक्षण करें। पूरे डिटेक्टर पर प्रत्येक फिटिंग पैरामीटर से जुड़ी त्रुटि का निरीक्षण करने के लिए, छवि विकल्पों का चयन करें और फिर ब्याज के फिटिंग पैरामीटर का चयन करें। यह प्रत्येक पिक्सेल पर फिटिंग पैराटर के मूल्य के साथ एक नक्शा उत्पन्न करेगा। डिटेक्टर छवि पर सही क्लिक करें। एक पॉप अप विंडो चयनित फिटिंग पैरामीटर का त्रुटि बार मानचित्र दिखाती दिखाई देगी।
    10. यदि किसी विशिष्ट पिक्सेल पर फिट असंतोषजनक है (उदाहरण के लिए, बड़ी त्रुटि सलाखों के साथ पैरामेटर फिट करें), तो उस विशिष्ट पिक्सेल पर सिग्नल को फिर से फिट करें। उस पिक्सेलका चयन करें, फिटिंग टैब दबाए, और फिर फिट पिक्सेल दबाए। अधिक संतोषजनक फिट प्राप्त करने के लिए फिटिंग टैब में चरण(Φ0)और अवधि (ζ) के लिए नए शुरुआती मापदंडों का इनपुट करें।
      नोट: यह फोरियर टाइम के एक समारोह के रूप में फिट चरण को प्लॉट करने के लिए उपयोगी है। ऐसा करने के लिए, मुख्य भूखंड खिड़की पर जाएं और फिट चरण v. Fourier समयका चयन करें । यह प्लॉट सुचारु और सतत होना चाहिए। इस भूखंड में विच्छेदन का निरीक्षण करें और उन पिक्सेल को फिर से फिट करें जो वे मेल खाते हैं।
  8. अपलोड और लेबल की गई फाइल सूची से संबंधित फ़ाइल का चयन करके नमूना या सेल फ़ाइल को कम करें।
    1. सभी पिक्सल का निरीक्षण करें और खराब आंकड़ों वाले लोगों को मास्क करें जैसा कि चरण 4.7.5 में वर्णित है।
    2. फ़ाइल पर राइट-क्लिक करें और फिट ऑपरेशंस का चयन करें: आयात चरण (नमूना, सेल)। यह संकल्प फ़ाइल से चरणों और लागू मुखौटा आयात करता है।
    3. संकल्प फ़ाइल (चरण 4.7.8-4.7.10) के लिए पहले वर्णित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके इको सिग्नल फिट करें। नमूना और सेल फ़ाइलों को फिट करने में, संकल्प से आयातित अवधि और इको चरण बिंदु के मूल्यों को न बदलें। ये पैरामीटर वाद्य सेटिंग्स पर निर्भर करते हैं और नमूनों के साथ भिन्न नहीं होना चाहिए।
    4. डेटा में कमी के लिए आगे बढ़ने से पहले, सभी डेटा फ़ाइलों के लिए बीम केंद्र इनपुट। डेटा फ़ाइल का चयन करें, सामान्य टैब पर जाएं और एक्स और वाई बीम सेंटर मानों दर्ज करें। प्रयोग के दौरान इन मानों को दर्ज किया जाता है.
    5. एक बार जब नमूना, सेल और रिज़ॉल्यूशन फ़ाइलों के फिट होने का पूरा हो जाता है, तो डेटा विश्लेषण और व्याख्या में बाद में उपयोग किए जाने वाले सामान्यीकृत मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्य की गणना करें। ऐसा करने के लिए, फिट फ़ाइलों की सूची से कम होने के लिए नमूना फ़ाइल पर सही क्लिक करें, और पॉप अप मेनू से गणना I (Q) का चयन करें। एक विंडो रिज़ॉल्यूशन और सेल (यानी बफर) फ़ाइलों के लिए प्रवेश विकल्पों और क्यू-आर्क्स की संख्या (चरण 4.9 देखें) के साथ दिखाई देगी। सभी आवश्यक सूचनाएं दर्ज करने के बाद, ओके बटन दबाएं। परिणाम एक नई खिड़की में दिखाई देंगे।
      नोट: डेटा में कमी सामान्यीकृत मध्यवर्ती बिखरने समारोह69प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित समीकरण के अनुसार किया जाता है।
      Equation 4
      जहां टी फोरियर समय है, एनअप और एनडाउन गैर-स्पिन-फ्लिप और स्पिन-फ्लिप कॉन्फ़िगरेशन में न्यूट्रॉन मायने रखता है (π/2-फ्लिपर्स ऑफ और π-फ्लिपर ऑफ और ऑन, क्रमशः) के साथ मापा जाता है, और सुपरस्क्रिप्ट, बीकेजी और आर,क्रमशः पृष्ठभूमि और संकल्प मापन के अनुरूप है, जैसा कि चरणों में परिभाषित 4.4 और 4.6 है। ध्यान दें कि बीम Equation 3 ध्रुवीकरण, इस प्रकार न्यूट्रॉन और नमूने के बीच ऊर्जा विनिमय के कारण स्पिन राज्य में परिवर्तन ध्रुवीकरण (एकता से) में एक बूंद के रूप में पता चला है।
  9. अंत में, डिटेक्टर पिक्सल को क्यू-आर्क्समें समूहित करें जैसा कि चित्रा 4B में दिखाया गया है ताकि सामान्यीकृत मध्यवर्ती बिखरने वाले समारोह, एस(क्यू,टी) /S(क्यू,0) की क्यू-निर्भरताप्राप्त की जा सके। इसे तकनीकी रूप से डेटा बिनिंग के रूप में जाना जाता है और इसे विवेकपूर्ण ढंग से किया जाना चाहिए, यानी, नमूने से गिनती के आंकड़ों और समूहीकृत पिक्सेल पर डेटा के अपेक्षित मानक विचलन को ध्यान में रखते हुए।
  10. नमूनों को दृढ़ता से बिखरने के लिए, परिणामी मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्य, एस(क्यू,टी) परउचित त्रुटि सलाखों को बनाए रखते हुए डिटेक्टर को अधिकक्यू-आर्क्समें विभाजितकरें। यह अधिक क्यू डेटा अंक पैदा करता है और नीचे वर्णित डेटा विश्लेषण प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। ध्यान रखें कि कमजोर रूप से बिखरने वाले नमूनों के लिए, अत्यधिक बिनिंग के परिणामस्वरूप खराब क्षय संकेतों में परिणाम होता है,यानी एस(क्यू,टी)पर बड़ी त्रुटि सलाखों(Q, Q,0), जिसके परिणामस्वरूप बड़ी अनिश्चितताएं हो सकती हैं ।

5. डेटा विश्लेषण और व्याख्या

  1. सामान्यीकृत मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्यों, एस(क्यू,टी) /
    Equation 9
    नोट: इन फिट बैठता है का एक उदाहरण चित्रा 5Bमें प्रदान की जाती है । एस के फिट बैठता है(Q,t)/S(Q,0) समीकरण के लिए (3) क्यू पर निर्भर छूट दरों Γ(क्यू)उपज ।
  2. Γ की साजिश(क्यू)क्यू के एक समारोह के रूप में और प्रासंगिक झिल्ली मापदंडों को निकालने के लिए एक उपयुक्त मॉडल के लिए फिट ।

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Representative Results

एनएसई अध्ययन झुकने वाले उतार-चढ़ाव तक पहुंचने के लिए आम तौर पर ~ (0.04 - 0.2) Å-1 की क्यू-रेंजपर किया जाता है। यह क्यू-रेंज झिल्ली की मोटाई और लिपोसोमल त्रिज्या के बीच मध्यवर्ती लंबाई तराजू से मेल खाती है, जहां झुकने वाली गतिशीलता हावी होती है। एक विस्तारित क्यू-रेंज पर माप अतिरिक्त गतिशील मोड तक पहुंच दे सकता है, जिसमें लिपोसोमल प्रसार और इंट्रामेम्ब्रान गतिशीलता शामिल हैं। एनएसई द्वारा एक्सेस की गई झिल्ली गतिशीलता में क्रॉस-ओवर के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इन प्रासंगिक प्रकाशनों की जांचकरें 25,71। इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि एनएसई संकेत आनुपातिक हैं: Equation 5 जहां मैंcoh और Iinc क्रमशः, नमूने से सुसंगत और असंगत बिखरने की तीव्रता हैं। इसलिए, एनएसई लिपोसोमल नमूनों को ड्यूटेरेटेड बफ़र्स (यानी,एच2 ओ के बजाय डी2ओ के साथ तैयार बफर) में तैयार करने की सलाह दी जाती है ताकि असंबद्ध बिखरने वाले संकेत को कम किया जा सके, मुख्य रूप से नमूने की हाइड्रोजन सामग्री द्वारा योगदान दिया जाता है। हालांकि, कुछ मामलों में मध्यवर्ती deuteration योजनाओं(यानी,डी 2 ओ और एच2ओ के मिश्रण का उपयोग कर) इष्टतम विपरीत शर्तों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है । आमतौर पर, झिल्ली झुकने वाले उतार-चढ़ाव के एनएसई माप ों को ड्यूटेटेड बफर में पूरी तरह से प्रोटेटेड लिपोसोम पर किया जाता है, जिसे चित्र 5में पूरी तरह से विपरीत लिपोसोम के रूप में जाना जाता है। इस deuteration योजना झिल्ली कोर (~ 0 ×10-6 Å-2)और इसके deuterated तरल वातावरण (~ 6.4 ×10-6 Å-2)के बीच एक बड़ा NSLD अंतर में परिणाम है, जो काफी लिपसोसोमल झिल्ली से बिखरने संकेत को बढ़ाता है और झुकने गतिशीलता के माप आंकड़ों में सुधार करता है। इस कंट्रास्ट स्कीम(चित्रा 2ए लेफ्ट पैनल) का उपयोग अक्सर लिपिड झिल्ली की कठोरता को झुकने के अध्ययन में किया जाता हैजिसमेंएकल38,72 और कई39,66 लिपिड घटक और जैविक समावेशन द्वारा झिल्ली नरम/कठोर के अध्ययन में (उदाहरण के लिए, कोलेस्ट्रॉल, दवा अणु, पेप्टाइड्स/प्रोटीन)36,37,73,74,75,और सिंथेटिक एडिटिव्स (जैसे, नैनोकण)76,77।

झुकने वाले उतार-चढ़ाव के मापन के परिणामस्वरूप छूट दरों में परिणाम होता है जो क्यू3 निर्भरता का पालन करते हैं, जैसा कि ज़िलमैन और ग्रैनेक द्वारा थर्मल रूप से लहरदार लोचदार पतली चादरें70के लिए भविष्यवाणी की गई है। इस क्यू-निर्भरताका एक परिष्कृत रूप वाटसन और ब्राउन78द्वारा सैद्धांतिक सुधारों से प्राप्त किया जाता है , जो सीफर्ट और लैंगर79द्वारा प्रस्तावित इंटरमोनोलेयर घर्षण के प्रभावों को ध्यान में रखता है। इसके अतिरिक्त तटस्थ विमान को हाइड्रोफिलिक हेडग्रुप और झिल्ली की हाइड्रोफोबिक पूंछ के बीच इंटरफेस पर परिभाषित करके, झुकने वाली छूट दरों को निम्नलिखित अभिव्यक्ति38में फिट किया जा सकता है।

Equation 6

जहां ηशौकीन बफर चिपचिपाहट है, केबीटी थर्मल ऊर्जा है, और मापा झिल्ली की झुकने कठोरता है (या चुनिंदा deuterated सिस्टम में झिल्ली के विपरीत हिस्से की) । इस प्रकार का माप झुकने वाली कठोरता मोडुलस के रूप में झिल्ली लोचदार गुणों की प्रत्यक्ष गणना को सक्षम बनाता है। ध्यान दें कि Γ बनाम क्यू 3 के रैखिक फिट की ढलान से निकालागयाहै, जैसा कि चित्र 5सीमें दिखाया गया है।

दूसरी ओर, झिल्ली मोटाई में उतार-चढ़ाव के एनएसई माप क्यू3-क्यू मूल्यों के आसपास Γमेंनिर्भरता से विचलन दिखाते हैं जो झिल्ली की मोटाई के अनुरूप होते हैं (रेफरी 66 में चित्रा 2 देखें)। मोटाई के उतार-चढ़ाव के संकेत को अलग करने के लिए, कोई भी Γ(क्यू) को Q3से विभाजित कर सकता है, जैसा कि चित्र 5 डीमें दिखाया गया है। परिणामस्वरूप डेटा से पता चलता है कि मोटाई में उतार-चढ़ाव के कारण अतिरिक्त गतिशीलता क्यूमें एक लोरेंटज़ियन समारोह का पालन करती है, जैसा कि हाल ही में मोटे-दाने वाले आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन67में पुष्टि की गई है। मनाया अतिरिक्त गतिशीलता फिट करने के लिए, नागाओ एट अल38 ने बिंघम एट अल द्वारा झिल्ली के उतार-चढ़ाव के सैद्धांतिक ढांचे के आधार पर एक अभिव्यक्ति विकसित की।80 इस प्रकार है।

Equation 7

इस अभिव्यक्ति में, क्यू0 झिल्लीमोटाई (जिसे स्वतंत्र रूप से संस माप से प्राप्त किया जा सकता है) के अनुरूप पीक क्यू-वैल्यूहै, μ इन-प्लेन झिल्ली चिपचिपाहट है, एएल लिपिड प्रति क्षेत्र है (संस/एसएक्सएस के साथ मापा जाता है), और कश्मीरए क्षेत्र संपीड़ितता मोडुलस है। यह मानते हुए कि केए की गणना पॉलीमर ब्रश मॉडल का उपयोग करके की जा सकती है, यह अभिव्यक्ति एक फिट पैरामीटर को कम कर देती है, अर्थात् झिल्ली चिपचिपाहट μ,फ्लोरेसेंस लेबलिंग या कण टेदरिंग/ट्रैकिंग13की आवश्यकता के बिना झिल्ली चिपचिपाहट को मापने के लिए एक नया दृष्टिकोण पेश करती है। आधार यह है कि लोचदार पतली चादरें81के विरूपण मॉडल के अनुसार, 81 और केए इस तरह के अन्य निर्भर हैं: जहां Equation 10 टीएम यांत्रिक (या विकृत) झिल्ली मोटाई है और β एक स्थिर है जो इंटरलीफ्लेट युग्मन का वर्णन करता है। धारणा यह है कि   β = 12 पूरी तरह से युग्मित पत्रक के लिए, β = 48 पूरी तरह से uncoupled पत्रक के लिए, और β = 24 मध्यवर्ती युग्मित पत्रक के लिए। उत्तरार्द्ध को पॉलीमर ब्रश मॉडल81 के रूप में जाना जाता है और इसे एकल घटक और बाइनरी द्रव लिपिड झिल्ली39में लागू करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इस सावधानी के साथ संपर्क करने की जरूरत है । उदाहरण के लिए, Doktorova एट अल द्वारा हाल ही में सिमुलेशन। 82 ने दिखाया कि बहुलक ब्रश मॉडल के लिए कोलेस्ट्रॉल युक्त असंतृप्त लिपिड झिल्ली में पकड़ के लिए, यांत्रिक झिल्ली मोटाई की एक संशोधित अभिव्यक्ति का उपयोग किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, यदि केए का एक स्वतंत्र माप संभव है, उदाहरण के लिए, माइक्रोपिपेट आकांक्षा83का उपयोग करके, फिर एनएसई झुकने वाले कठोरता माप के साथ कश्मीरए परिणामों के संयोजन से मॉडल और जैविक झिल्ली में इंटरलीफ्लेट कपलिंग की जांच करने का एक अनूठा अवसर पेश होगा - झिल्ली बायोफिजिक्स और संरचनात्मक जीवविज्ञान में एक लंबे समय से सवाल। एक बार जब कश्मीरए के मूल्यों को मान्य किया जाता है, तो उनका उपयोग मेसोस्कोपिक झिल्ली चिपचिपाहट प्राप्त करने के लिए समीकरण 5 में किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1:एनएसई उपकरण डिजाइन और सहक्रियात्मक ओवरलैप मेसोस्कोपिक झिल्ली गतिशीलता की लंबाई/टाइंस तराजू के साथ । (A)एक एनएसई उपकरण के विभिन्न चुंबकीय तत्वों की योजनाबद्ध, बाएं से दाएं उपकरण को पार करने वाले न्यूट्रॉन की स्पिन में हेरफेर करने के लिए उपयोग किया जाता है । हाइलाइट किए गए न्यूट्रॉन न्यूट्रॉन और नमूने के बीच ऊर्जा विनिमय के कारण स्पिन अभिविन्यास (या ध्रुवीकरण हानि) में परिवर्तन को इंगित करता है, जबकि पारदर्शी न्यूट्रॉन स्पिन-इको का प्रतिनिधित्व करता है, यानी शून्य ऊर्जा विनिमय के कारण न्यूट्रॉन स्पिन में कोई परिवर्तन नहीं होता है। ग्रे तीर बड़े बिखरने कोणों तक पहुंचने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर की दूसरी भुजा को घुमाने की संभावना को इंगित करता है। (ख)लिपिड झिल्ली में पदानुक्रमित गतिशीलता का सचित्र प्रतिनिधित्व, विभिन्न गतिशील मोड दिखाता है जो कई लंबाई और समय तराजू तक फैलाते हैं। छायांकित क्षेत्र एनएसई द्वारा एक्सेस की गई लंबाई और समय तराजू का प्रतिनिधित्व करता है, जो सामूहिक झिल्ली के उतार-चढ़ाव के मेसोस्केल के साथ ओवरलैप होता है, अर्थात् झुकने और मोटाई में उतार-चढ़ाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:लिपिड झिल्ली पर एनएसई प्रयोगों में संभावित ड्यूटेरेशन योजनाओं के उदाहरण।(ए)बाएं: पूरी तरह से विपरीत झिल्ली, उदाहरण के लिए, ड्यूटेरेटेड बफर में प्रोटेटेड झिल्ली, झिल्ली सतह के लिए सामान्य के साथ एनएसएलडी प्रोफ़ाइल दिखाता है। पूंछ क्षेत्र (~ 0 × 10-2 Å-2)और हेडग्रुप क्षेत्र (~ 4.5 × 10-6 Å-2)झिल्ली के बीच एनएसएलडी में अंतर ड्यूटेरेटेड बफर के साथ हेडग्रुप हाइड्रेशन के कारण होता है। सही: पूंछ के विपरीत मिलान झिल्ली ऐसी है कि झिल्ली के हाइड्रोकार्बन पूंछ क्षेत्र बफर के रूप में एक ही NSLD है, के रूप में झिल्ली सामान्य के साथ इसी NSLD प्रोफ़ाइल में दिखाया गया है । (ख)डोमेन बनाने झिल्ली दो न्यूट्रॉन कंट्रास्ट योजनाओं के साथ जहां डोमेन (केंद्र) या मैट्रिक्स (बाएं) बफर से विपरीत मिलान कर रहे हैं, मैट्रिक्स या डोमेन गतिशीलता के चयनात्मक अध्ययन को सक्षम करने, क्रमशः । इस आंकड़े को निकल्स एट अल, जेएसीएस 201541से संशोधित किया गया है। (ग)प्रोटेटेड और ड्यूटेरेटेड लिपिड वेसिकल्स के बीच साइक्लोडेक्स्ट्रिन एक्सचेंज द्वारा तैयार असममित झिल्ली, जिसके परिणामस्वरूप दूसरे पत्रक को प्रोटेटेड रखते हुए एक झिल्ली पत्रक का विरूपण होता है । यह प्रोटेटेड पत्रक की झुकने वाली गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है और असममित झिल्ली में विरोधी पत्रकों के बीच यांत्रिक युग्मन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस आंकड़े को रिकेर्ड एट अल, नैनोस्केल 202040से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-लिपोसोम्स के स्वचालित निष्कासन के लिए सेटअप का चित्रण। (ए)सिरिंज पंप, एक मिनी एक्सट्रूडर सेट, और एक एल्यूमीनियम/स्टील फ्रेम का उपयोग करके एक एल्यूमीनियम/स्टील फ्रेम का उपयोग करके चक्रीय एक्सट्रूज़न को सक्षम करता है। (ख)और(ग)लिपिड निलंबन के दृश्य उपस्थिति में अंतर से पहले (दूधिया सफेद) और बाद (पारदर्शी ओपल ब्लू) निष्कासन दिखाते हैं । यह माइक्रोन आकार के लिपिड स्टैक या विशाल वेसिकल्स के प्रारंभिक गठन के कारण होता है जो दृश्यमान प्रकाश की तरंगदैर्ध्य के क्रम या उससे बड़े होते हैं। निष्कासन के बाद, निलंबन में नैनोस्कोपिक वेसिकल्स (~ 100 एनएम) शामिल होंगे, जो दृश्यमान प्रकाश की तरंगदैर्ध्य से छोटे हैं, जो पारदर्शी निलंबन का परिणाम देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:लिपोसोमल सस्पेंशन पर एनएसई प्रयोगों से प्रतिनिधि डेटा। (ए)एक ही डिटेक्टर पिक्सेल (पैनल बी में चिह्नित पिक्सेल) पर इको-सिग्नल का उदाहरण, समीकरण (1) का उपयोग करके इको सिग्नल के फिट होने को दिखाता है, जिसमें इको फिट में आवश्यक विभिन्न मापदंडों का चित्रण होता है । ध्यान दें कि इको सिग्नल को चरण वर्तमान के बजाय चरण कोण के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया जाता है जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 4.7 में चर्चा की गई है। (ख)एनएसई डिटेक्टर इमेज प्रति पिक्सेल न्यूट्रॉन काउंट में भिन्नता दिखा रही है । छवि भी खराब इको संकेतों के कारण सफाया डिटेक्टर पिक्सल (ग्रीन) से पता चलता है । क्यू-आर्क्स (जिसे डेबी-शेरर रिंग्स के रूप में भी जाना जाता है) में डिटेक्टर पिक्सल की बिनिंग एनएसई डेटा का विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए आवश्यक मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्य की क्यू-निर्भरता की पैदावार करती है। इस आंकड़े को अशकर, जे Appl. Phys से संशोधित किया गया था । २०२०५०। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:विभिन्न ड्यूटेरेशन योजनाओं के साथ लिपोसोमल निलंबन पर एनएसई प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम। (ए)एक न्यूट्रॉन की बिखरने वाली ज्यामिति एक लिपोसोम के साथ बातचीत कर रही है, जिसमें बिखरने का कोण, 2θऔर वेववेक्टर ट्रांसफर दिखाया गया Equation 11 है। (ख)मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्य, एस(क्यू,टी) /एस(क्यू,0), फोरियर समय के एक समारोह के रूप में क्षय प्रदर्शित करते हैं । मापी गई क्षय को एक फैला हुआ घातीय कार्य करने के लिए फिट करें समीकरण द्वारा दिए गए 3 में छूट दर, Γ(क्यू)की पैदावार होती है। (ग)ड्यूटेरेटेड बफर में पूरी तरह से प्रोटेटेड लिपोसोम्स केलिए, Γ(क्यू) एक क्यू3 निर्भरता का पालन करता है, जो गतिशीलता को झुकाने की विशिष्ट है। एक ज़िलमैन-ग्रैनेक मॉडल के लिए प्राप्त डेटा का रैखिक फिट झिल्ली के झुकने वाली कठोरता मॉड्यूलस की पैदावार करता है। (घ)पूंछ ड्यूटेटेड लिपोसोम्स के लिए, उतार-चढ़ाव को मोड़ने के अलावा अतिरिक्त गतिशीलता देखी जाती है और क्यू-मानों सबसे अधिक स्पष्ट होती है जो झिल्ली की मोटाई के अनुरूप होती है। एक Lorentzian समारोह (समीकरण 5) के लिए अतिरिक्त गतिशीलता फिटिंग झिल्ली चिपचिपाहट के निष्कर्षण की अनुमति देता है । एनआईएसटी में एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर पर डाटा सेट एकत्र किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एनएसई विभिन्न परिस्थितियों में लिपिड झिल्ली की मेसोस्कोपिक गतिशीलता को मापने में एक शक्तिशाली और अनूठी तकनीक है। एनएसई का प्रभावी उपयोग नमूना गुणवत्ता, न्यूट्रॉन कंट्रास्ट और सुलभ गतिशीलता की सीमा पर निर्भर करता है जिसे किसी दिए गए नमूने के लिए जांचा जा सकता है। इस प्रकार, सफल एनएसई प्रयोगों को करने और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा एकत्र करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदमों की आवश्यकता है। एनएसई प्रयोग के दौरान न्यूट्रॉन बीम समय का प्रभावी उपयोग सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कदम एनएसई प्रयोग से पहले प्रयोगशाला आधारित तरीकों के साथ लिपोसोमल निलंबन की विशेषता है। एक्साम्पल के लिए, निकाले गए लिपोसोम्स के आकार वितरण (या प्रसार स्थिर) को गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जो व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में या साझा सुविधाओं में आसानी से उपलब्धहै 84। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी हाल ही में लिपोसोमल नमूनों पर मान्य एक और चारकैटराइजेशन विधि है, जहां लिपोसोमल सस्पेंशन के क्रायोमिक्रोमेटेड वर्गों पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी छवियों का प्रभावी रूप से उपयोग लिपोसोमल यूनिलैमलिटी65,डोमेन फॉर्मेशन85,86,या नैनोकण76 और प्रोटीन87जैसे एडिटिव्स के समावेश की जांच करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, झिल्ली संरचना88की विशेषता के लिए छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (एसएक्सएस) का उपयोग किया जा सकता है, लिपोसोमल मल्टीलैरिटिटी65का आकलन करें, या झिल्ली संरचनात्मक गुणों पर योजक के प्रभावों का मूल्यांकनकरें 89। इन प्रयोगशाला-आधारित तकनीकों के अलावा, यह अत्यधिक उचित है कि लिपोसोमल नमूनों पर एनएसई माप को छोटे कोण न्यूट्रॉन बिखरने (SANS)54,90का उपयोग करके संरचनात्मक अध्ययनों के साथ जोड़ा जाता है। संस एनएसई के लिए एक उत्कृष्ट पूरक है, न केवल संरचनात्मक झिल्ली जानकारी प्राप्त करने के लिए बल्कि नमूने से न्यूट्रॉन बिखरने के संकेत की तीव्रता की जांच करने के लिए, विपरीत योजना की पुष्टि, और क्यू-रेंज के बारे में एक सूचित विकल्प बनाने के लिए जिस पर एनएसई माप किया जाना चाहिए। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि एनएसई उपयोगकर्ता एनएसई प्रयोगों के लिए आवेदन करते समय बिना बीमटाइम का अनुरोध करें।

हालांकि, एनएसई जैविक झिल्ली के अध्ययन में नमूना सीमाओं से ग्रस्त है। इस तरह के प्रयोगों के प्रमुख सीमित कारकों में से एक एनएसई माप (2-4 एमएल) के लिए आवश्यक नमूने की मानक राशि और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए 100-200 मिलीग्राम झिल्ली सामग्री (लिपिड और प्रोटीन) की राशि वाले उच्च नमूना सांद्रता है। कई मामलों में, जैविक सामग्री की इतनी मात्रा का उत्पादन व्यवहार्य नहीं है या लागत निषेधात्मक है । ऐसे परिदृश्यों में, एकाग्रता को 20-25 मिलीग्राम/एमएल तक कम करना संभव है, लेकिन इसके लिए ५० मिलीग्राम/एमएल सांद्रता वाले नमूनों के लिए तुलनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण समय में कम से 4 गुना वृद्धि की आवश्यकता होगी । नमूना मात्रा और एकाग्रता पर इन कठोर आवश्यकताओं को उच्च प्रवाह न्यूट्रॉन स्रोतों पर एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर की अगली पीढ़ी के साथ समाप्त किया जा सकता है, जैसे ओक रिज नेशनल लैब में दूसरा लक्ष्य स्टेशन और यूरोपीय स्पैलेशन स्रोत। चयनात्मक deuteration योजनाओं की आवश्यकता लिपिड झिल्ली पर एनएसई प्रयोगों के प्रदर्शन में एक और महत्वपूर्ण सीमा लिपिड अणुओं या उनके अत्यधिक कीमतों के कुछ deuterated वेरिएंट की वाणिज्यिक लाभ की कमी है, यदि उपलब्ध है । कुछ मामलों में, इन सीमाओं को उपयोगकर्ता ड्यूयूटेरेशन सुविधाओं के माध्यम से ड्यूटेरेटेड लिपिड (या कोलेस्ट्रॉल, प्रोटीन) के संश्लेषण का अनुरोध करके दरकिनार किया जा सकता है, जैसे ओक रिज नेशनल लैब में बायो-ड्यूयूटेरेशन लैब, ANSTO में राष्ट्रीय deuteration सुविधा, या आईएसआईएस न्यूट्रॉन और म्यून स्रोत पर ड्यूटरेशन सुविधा। इन सुविधाओं तक पहुंच और उनकी संश्लेषण क्षमताएं प्रस्तुत किए गए उपयोगकर्ता प्रस्तावों के माध्यम से उपलब्ध हैं जो प्रस्तावित सामग्री संश्लेषण की वैज्ञानिक योग्यता और आइसोटोप-संवेदनशील अध्ययनों में इसके इच्छित उपयोग के आधार पर सहकर्मी-समीक्षा किए जाते हैं ।

इन सीमाओं के बावजूद, झिल्ली यांत्रिकी के अध्ययन में एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन ने जटिलता की विभिन्न डिग्री के साथ झिल्ली की झुकने वाली कठोरता मोडुली का निर्धारण किया है, एकल घटक लिपिड झिल्ली35,38 से बहुकंपोनेंट बायोमिमेटिक झिल्ली41,66,91,जिनमें से सभी लिपिड झिल्ली की गतिशील प्रकृति की हमारी उन्नत समझ है। उदाहरण के लिए, एनएसई ने विभिन्न आणविक इकाइयों के साथ लिपिड झिल्ली की कठोरता माप को झुकाया, उदाहरण के लिए, विभिन्न एसील चेन लंबाई और श्रृंखला संतृप्ति38,72,92के लिपिड ने झिल्ली यांत्रिकी में आणविक रसायन विज्ञान की भूमिका के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान की है। जब झिल्ली की मोटाई या आणविकपैकिंग 93जैसी संरचनात्मक जानकारी के साथ जोड़ा जाता है, तो ये माप झिल्ली संरचना और गतिशीलता के बीच परस्पर निर्भरता पर नए दृष्टिकोण प्रदान करना शुरू करते हैं और वे झिल्ली कार्य को कैसे प्रभावित करते हैं। एनएसई के मेसोस्कोपिक तराजू संरचना-संपत्ति संबंधों की ऐसी मौलिक जांच के लिए विशिष्ट रूप से इसे स्थिति में लेते हैं, जो आणविक विधानसभाओं के लंबाई पैमाने पर सबसे अधिक प्रासंगिक होते हैं। इस विषय को हाल ही में कोलेस्ट्रॉल से भरपूर लिपिड झिल्ली36 और बाइनरी लिपिड झिल्ली में दो लिपिड घटकों39के बीच हाइड्रोफोबिक बेमेल के साथ दो एनएसई अध्ययनों में खोजा गया था। दोनों अध्ययनों से मजबूत सबूत मिले कि लिपिड प्रति क्षेत्र के साथ झिल्ली यांत्रिकी पैमाने पर, Doktorova एट अलद्वाराहाल ही में सभी परमाणु एमडी सिमुलेशन से निष्कर्ष पुष्ट । ये निष्कर्ष लिपिड झिल्ली की आत्म-इकट्ठा प्रकृति पर जोर देते हैं और झिल्ली गतिशील और कार्यात्मक गुणों को परिभाषित करने में एक प्रमुख पैरामीटर के रूप में आणविक पैकिंग की एक एकीकृत तस्वीर प्रदान करते हैं।

एनएसई के अन्य अनुप्रयोगों में छोटे एडिटिव्स के लिए झिल्ली की यांत्रिक प्रतिक्रिया का अध्ययन शामिल है, जिसमें कोलेस्ट्रॉल36,37,ट्रेहलोज92,और मेलिटिन73,94,या नशीली दवाओं के वितरण अनुप्रयोगों के लिए नैनोपार्टिकल्स जैसे अकार्बनिक एडिटिव्स शामिल हैं। एनएसई का उपयोग यह समझने के लिए भी किया जाता है कि झिल्ली यांत्रिकी अपने वातावरण में परिवर्तन का जवाब कैसे देती है, जिसमें तापमान92, पीएच74और भीड़ मैक्रोमॉलिक्यूल्स96की उपस्थिति शामिल है। इस तरह के अध्ययन उन कारकों की बेहतर समझ में योगदान दे रहे हैं जो स्वास्थ्य और रोग से संबंधित जैविक परिस्थितियों में, और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रित सेटिंग्स में लिपिड झिल्ली के नरम या कठोर को प्रभावित करते हैं। विशेष रूप से, झिल्ली गतिशीलता73,94,95पर एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स के प्रभाव की जांच करने के लिए एनएसई मापों का भी उपयोग किया गया है । बायोमेम्ब्रेन पर एनएसई अनुप्रयोगों के अलावा उदाहरणों में चपटी झिल्ली संरचनाओं की गतिशीलता का अध्ययन शामिल है, जिसे थायलाकोइड कहा जाता है, जो साइनोबैक्टीरियल कोशिकाओं97, 98में फोटोसिंथेटिक मशीनरी को घर देते हैं।

जैविक कार्य के लिए प्रासंगिक विशिष्ट झिल्ली सुविधाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए एनएसई अध्ययनों में चयनात्मक लिपिड ड्यूटेरेशन का भी उपयोग कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, निकल्स एट अल ने झिल्ली के भीतर पार्श्व विपरीत उत्पन्न करने के लिए डोमेन-बनाने वाले लिपिड झिल्ली में चयनात्मक लिपिड ड्यूटेरेशन का उपयोग किया, जैसा कि पहले हेबर्ले एट अलद्वारादर्शाया गया था। इस ड्यूटेरेशन योजना ने लिपिड डोमेन और मेजबान लिपिड मैट्रिक्स41 (चित्रा 2Bदेखें) की झुकने वाली कठोरता के स्वतंत्र माप को सक्षम किया। निष्कर्षों ने पुष्टि की कि दो झिल्ली डिब्बों में अलग झुकने वाली कठोरता मोडुली है, जो सेलुलर झिल्ली में डोमेन गठन के लिए एक ड्राइविंग तंत्र हो सकता है। हाल ही में एक और अध्ययन में, रिकेर्ड एट अल ने आइसोटोपिकल लेबल वाले पत्रक40 (चित्रा 2सी)के साथ असममित लिपोसोम प्राप्त करने के लिए प्रोटेटेड और ड्यूटेरेटेड लिपोसोम्स के बीच साइक्लोडेक्स्ट्रिन एक्सचेंज का उपयोग किया। उनके अंत लिपोसोम्स में एक प्रोटेटेड पत्रक और एक ड्यूटेरेटेड पत्रक था जो बफर से मेल खाता है, व्यक्तिगत पत्रक गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम करता है और झिल्ली मोड़ उतार-चढ़ाव पर विषमता और पत्रक युग्मन के प्रभाव का पहला प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक खाता प्रदान करता है।

झिल्ली की मोटाई में उतार-चढ़ाव के एनएसई अध्ययनों में चयनात्मक झिल्ली ड्यूटेरेशन का भी उपयोग किया गया है, लिपिड झिल्ली99 में एक लंबी भविष्यवाणी की गई गतिशील मोड जो हाल ही में एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी35,100के आगमन के साथ देखा गया था। ये माप झिल्ली हेडग्रुप क्षेत्रों से संकेत को बढ़ाने और मोटाई के उतार-चढ़ाव संकेत को हल करने के लिए पूंछ-ड्यूटेरेटेड झिल्ली का उपयोग करते हैं। एनएसई प्रयोगों के इस प्रकार अपेक्षाकृत हाल ही में है, लेकिन यह प्रभावी ढंग से झिल्ली लोचदार और चिपचिपा गुण38की निर्भरता को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है, मिश्रित लिपिड झिल्ली39में आणविक पैकिंग के साथ कठोरता और चिपचिपाहट झुकने के स्केलिंग का पता लगाने के लिए, और झिल्ली चिपचिपाहट36पर कोलेस्ट्रॉल के स्थानीय प्रभावों की जांच करने के लिए। जैविक महत्व का एक अन्य क्षेत्र जिसमें इस गतिशील मोड के दूरगामी प्रभाव हो सकते हैं, वह है मेसोस्कोपिक झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन95। यह ज्ञात है कि झिल्ली प्रोटीन का कार्य प्रोटीन और मेजबान झिल्ली के बीच हाइड्रोफोबिक मिलान से कसकर जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, झिल्ली मोटाई में भिन्नता, मोटाई में उतार-चढ़ाव के कारण, झिल्ली प्रोटीन के कार्य के लिए एक नियामक तंत्र के रूप में कार्य कर सकती है। एनएसई इस तरह के अध्ययनों के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह सीधे प्रोटीन बाध्यकारी और झिल्ली मोटाई में उतार-चढ़ाव पर सम्मिलन के प्रभावों की जांच कर सकता है। हमारे समूह (अप्रकाशित) से हाल ही में एनएसई मापों का सुझाव है कि ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन प्रविष्टि झिल्ली मोटाई में उतार-चढ़ाव को काफी दबा सकती है और सिग्नलिंग घटनाओं को विनियमित करने के लिए एक संभावित तंत्र पेश कर सकती है। यह एक दबाव, अभी तक अविकसित, अनुसंधान का क्षेत्र है जहां एनएसई को कोशिका झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत द्वारा प्रदान किए गए प्रमुख जैविक कार्यों की लंबाई और समय तराजू पर प्रोटीन बाध्यकारी और प्रविष्टि के लिए झिल्ली की गतिशील प्रतिक्रियाओं को समझने में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है ।

संक्षेप में, एनएसई पिछले कुछ वर्षों में महत्वपूर्ण जैविक कार्यों के स्थानिक और लौकिक तराजू पर झिल्ली गतिशीलता से पूछताछ के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित हुआ है। तकनीक तेजी से व्यापक रुचि प्राप्त कर रही है और झिल्ली समारोह में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में इसकी क्षमता अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त होती जा रही है। एनएसई के भीतर विपरीत भिन्नता क्षमताओं ने इसे मेसोस्कोपिक झिल्ली गुणों को मापने के लिए एक अद्वितीय दृष्टिकोण के रूप में तैनात किया है जो अन्यथा प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण होगा। झिल्ली गतिशीलता के अध्ययन में पारंपरिक स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों पर एनएसई का एक और महत्वपूर्ण लाभ एमडी सिमुलेशन के साथ सुलभ लंबाई और समय तराजू के साथ इसका ओवरलैप है, जो झिल्ली बनाने वाले विभिन्न आणविक घटकों की आणविक स्तर की समझ हासिल करने के लिए सहक्रियात्मक प्रयोगात्मक/गणना अध्ययनों की अनुमति देता है । अपने वादे के बावजूद, जैविक झिल्ली अध्ययन में एनएसई के उपयोग में अभी भी कुछ सीमाएं हैं, जिनमें बड़े नमूना खंडों के लिए आवश्यकता, जैविक प्रणालियों में चयनात्मक deuteration में कठिनाई, और एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर पर अपेक्षाकृत कम न्यूट्रॉन फ्लक्स शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक मापन समय और सीमित बीमटाइम उपलब्धता होती है। हालांकि, इन कमियों को निकट भविष्य में न्यूट्रॉन स्रोतों और इंस्ट्रूमेंटेशन में निरंतर विकास के साथ-साथ ड्यूयूटेरेशन सुविधाओं में प्रगति के साथ दूर किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा और कुछ भी नहीं खुलासा किया है ।

Acknowledgments

आर अशकर धन्यवाद एम नागाओ, एल-आर कई उपयोगी चर्चाओं के लिए स्टिंगसियू, और पी. जोल्नियरज़ुक और उनके संबंधित बीमलाइंस पर एनएसई प्रयोगों के साथ उनकी लगातार सहायता के लिए। लेखक NIST और ORNL में न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग को स्वीकार करते हैं । NIST में एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर उच्च संकल्प न्यूट्रॉन बिखरने, राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान और समझौते के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के बीच एक साझेदारी के लिए केंद्र द्वारा समर्थित है । डीएमआर-1508249। ओआरएनएल के स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत पर एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर को वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधाएं प्रभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान कार्यालय, अमेरिकी ऊर्जा विभाग द्वारा समर्थित किया जाता है । ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला यूटी द्वारा प्रबंधित किया जाता है-Batelle, अमेरिका डो अनुबंध नहीं के तहत LLC । DE-AC05-00OR22725।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform (biotech grade) Sigma Aldrich 496189 Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath Julabo SE-12 Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide Cambridge Isotopes Laboratories DLM-4 Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance Mettler Toledo MS105 Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade) Sigma Aldrich E7023 200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets VWR 36360-536 Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials Thermo Scientific B7990-1 Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer Fisher Scientific IU2886D Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated) Avanti Polar Lipids varies by lipid Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier Millipore Sigma ZRQSVP3US Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set Avanti Polar Lipids 610020 Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings Grainger 2YDA1 and 2YDA7 Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump SyringePump.com New Era-1000 Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath Fisher Scientific CPX2800 Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven Thermo Scientific 3608 0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-414 Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 08/06/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

In the Introduction, the fith pargraph was updated from:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

to:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

In the Protocol, step 1.1 was updated from:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

to:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

to:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी लिपिड झिल्ली गतिशीलता और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए एक अद्वितीय जांच के रूप में
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Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. … More

Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (171), e62396, doi:10.3791/62396 (2021).

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