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Biology

एकल जीवाणु में ड्यूटेरियम निगमन के उत्तेजित रमन स्कैटरिंग इमेजिंग द्वारा रैपिड एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

यहप्रोटोकॉल डी 2ओ चयापचय के एकल-कोशिका-उत्तेजित रमन प्रकीर्णन इमेजिंग द्वारा 2.5 घंटे के भीतर तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) परख प्रस्तुत करता है। यह विधि मूत्र या पूरे रक्त वातावरण में बैक्टीरिया पर लागू होती है, जो क्लिनिक में तेजी से एकल-कोशिका फेनोटाइपिक एएसटी के लिए परिवर्तनकारी है।

Abstract

रोगाणुरोधी प्रतिरोधी संक्रमणों के प्रसार को धीमा करने और रोकने के लिए, तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) रोगजनकों पर रोगाणुरोधी प्रभावों को मात्रात्मक रूप से निर्धारित करने की तत्काल आवश्यकता है। आमतौर पर लंबे समय की संस्कृति के आधार पर पारंपरिक तरीकों से एएसटी को पूरा करने में दिन लगते हैं, और वे नैदानिक नमूनों के लिए सीधे काम नहीं करते हैं। यहां, हम ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) चयापचय निगमन के उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) इमेजिंग द्वारा सक्षम एक तेजी से एएसटी विधि की रिपोर्ट करते हैं। बायोमास में डी2ओ का चयापचय समावेश और एकल जीवाणु स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने पर चयापचय गतिविधि अवरोध एसआरएस इमेजिंग द्वारा निगरानी की जाती है। एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने पर बैक्टीरिया की एकल-कोशिका चयापचय निष्क्रियता एकाग्रता (एससी-एमआईसी) नमूना तैयार करने और पता लगाने के कुल 2.5 घंटे के बाद प्राप्त की जा सकती है। इसके अलावा, यह तेजी से एएसटी विधि सीधे जटिल जैविक वातावरण में बैक्टीरिया के नमूनों पर लागू होती है, जैसे कि मूत्र या पूरे रक्त। ड्यूटेरियम निगमन की एसआरएस चयापचय इमेजिंग क्लिनिक में तेजी से एकल-सेल फेनोटाइपिक एएसटी के लिए परिवर्तनकारी है।

Introduction

रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) संक्रामक रोगके प्रभावी उपचार के लिए एक बढ़ता वैश्विक खतरा है। यह अनुमान लगाया गया है कि एएमआर प्रति वर्ष अतिरिक्त 10 मिलियन मौतों और 2050 तक $ 100 ट्रिलियन वैश्विक जीडीपी नुकसान का कारण बनेगा यदि एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया कामुकाबला करने के लिए कोई कार्रवाई नहीं की जाती है। यह एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के उद्भव को धीमा करने और संबंधित मृत्यु दर को कम करने के लिए संक्रामक बैक्टीरिया के एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) के लिए तेजी से और अभिनव नैदानिक तरीकों की तत्काल आवश्यकता पर जोरदेता है। सर्वोत्तम संभव नैदानिक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, 24 घंटे के भीतर प्रभावी चिकित्सा शुरू करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, डिस्क प्रसार या शोरबा कमजोर पड़ने की विधि की तरह वर्तमान स्वर्ण मानक विधि को आमतौर पर नैदानिक नमूनों के लिए प्रीइन्क्यूबेशन प्रक्रिया के लिए कम से कम 24 घंटे और न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) परिणाम प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 16-24 घंटे की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, ये विधियां क्लिनिक में संक्रामक रोग उपचार के लिए तत्काल निर्णय का मार्गदर्शन करने के लिए बहुत समय लेने वाली हैं, जिससे रोगाणुरोधी प्रतिरोध 4 का उद्भव और प्रसार होताहै।

जीनोटाइपिक एएसटी विधियां, जैसे पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित तकनीक5, तेजी से पता लगाने के लिए विकसित की गई हैं। ऐसी तकनीकें तेजी से एएसटी परिणाम प्रदान करने के लिए विशिष्ट प्रतिरोध आनुवंशिक अनुक्रमों को मापती हैं। वे समय लेने वाली सेल संस्कृति पर भरोसा नहीं करते हैं; हालांकि, प्रतिरोध के साथ केवल विशिष्ट ज्ञात आनुवंशिक अनुक्रमों का परीक्षण किया जाता है। इसलिए, इसका आवेदन विभिन्न जीवाणु प्रजातियों या प्रतिरोध के विभिन्न तंत्रों तक सीमित है। इसके अलावा, वे चिकित्सा निर्णय 6,7 के लिए एमआईसी परिणाम प्रदान नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, इन सीमाओं को दूर करने के लिए रैपिड एएसटी के लिए नए फेनोटाइपिक तरीकेविकसित किए जा रहे हैं, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 9,10,11,12,13, ऑप्टिकल डिवाइस 14,15,16, फेनोटाइपिक एएसटी न्यूक्लिक एसिड कॉपी नंबर 17,18 और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपिक विधियों 19 की मात्रा निर्धारित करनाशामिल है। 20,21,22,23,24. ये विधियां एएसटी परिणामों को निर्देशित करने के लिए समय को कम करती हैं, हालांकि, उनमें से अधिकांश केवल बैक्टीरियल आइसोलेट्स पर लागू होती हैं, सीधे नैदानिक नमूनों पर नहीं, और अभी भी लंबे समय तक प्रीइन्क्यूबेशन की आवश्यकता होती है।

इस काम में, हम एसआरएस इमेजिंग द्वारा सेलुलर चयापचय गतिविधि की निगरानी के माध्यम से मूत्र और पूरे रक्त में बैक्टीरिया की संवेदनशीलता के तेजी से निर्धारण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। पानी (एच2ओ) जीवित कोशिकाओं में आवश्यक बायोमोलेक्यूलर संश्लेषण प्रक्रियाओं के विशाल बहुमत में भाग लेता है। पानी के आइसोटोपोलोग के रूप में, एनएडीपीएच में रेडॉक्स-सक्रिय हाइड्रोजन परमाणु और डी 2 ओ में डी परमाणु के बीच एंजाइम-उत्प्रेरित एच / डी विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से, ड्यूटेरियम को सेल25,26 के अंदर बायोमास में शामिल किया जा सकता है। एनएडीपीएच लेबल वाले ड्यूटेरियम द्वारा एक ड्यूटेरेटेड फैटी एसिड संश्लेषण प्रतिक्रिया की मध्यस्थता की जाती है। एमिनो एसिड (एए) की प्रतिक्रियाओं में डी2ओ को शामिल करने से ड्यूरेटेड प्रोटीन उत्पादनहोता है 26 (चित्रा 1)। इस तरह, एकल माइक्रोबियल कोशिकाओं में नए संश्लेषित सी-डी बॉन्ड युक्त बायोमोलेक्यूल्स को एक सामान्य चयापचय गतिविधि मार्कर के रूप में नियोजित किया जा सकता है। नए संश्लेषित सी-डी बॉन्ड को पढ़ने के लिए, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी, बायोमोलेक्यूल्स की विशिष्ट और मात्रात्मक रासायनिक जानकारी प्रदान करने वाला एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक उपकरण, व्यापक रूप से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता निर्धारित करने और परीक्षण के समय को कुछ घंटोंतक कम करने के लिए उपयोग किया जाता है। . हालांकि, रमन प्रकीर्णन प्रक्रिया की अंतर्निहित कम दक्षता के कारण, सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी कम पहचान संवेदनशीलता का है। इसलिए, सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय छवि परिणाम प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग (CARS) और उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (SRS) सहित सुसंगत रमन प्रकीर्णन (CRS), सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी की तुलना में बड़े परिमाण के आदेश उत्पन्न करने के लिए सुसंगत प्रकाश क्षेत्र के कारण उच्च पहचान संवेदनशीलता तक पहुंच गया है, जिससे एकल कोशिका स्तर31,32,33,34,35 पर उच्च गति, विशिष्ट और मात्रात्मक रासायनिक इमेजिंग प्रदान की जाती है। , 36,37,38,39.

यहां, हमारे सबसे हालिया काम40 के आधार पर, हम एकल-कोशिका स्तर पर सामान्य माध्यम, मूत्र और पूरे रक्त वातावरण में बैक्टीरिया के डी2ओ समावेश के फेम्टोसेकंड एसआरएस सी-डी इमेजिंग द्वारा चयापचय गतिविधि और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता के तेजी से निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। फेम्टोसेकंड एसआरएस इमेजिंग 2.5 घंटे के भीतर एकल जीवाणु स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ एकल कोशिका चयापचय निष्क्रियता एकाग्रता (एससी-एमआईसी) की निगरानी की सुविधा प्रदान करता है। एससी-एमआईसी परिणाम शोरबा माइक्रोडायल्यूशन के माध्यम से मानक एमआईसी परीक्षण द्वारा मान्य हैं। हमारी विधि पारंपरिक विधि की तुलना में बहुत कम परख समय के साथ बैक्टीरिया मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) और रक्तप्रवाह संक्रमण (बीएसआई) रोगजनकों की रोगाणुरोधी संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए लागू है, जो एकल-कोशिका स्तर पर क्लिनिक में तेजी से फेनोटाइपिक एएसटी के लिए अवसर खोलता है।

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Protocol

मानव रक्त नमूनों का उपयोग बोस्टन विश्वविद्यालय के आईआरबी और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशानिर्देशों के अनुसार है। विशेष रूप से, नमूने एक बैंक से हैं और पूरी तरह से अज्ञात हैं। बोस्टन विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) कार्यालय द्वारा इन नमूनों को मानव विषय नहीं माना जाता है।

1. बैक्टीरिया और एंटीबायोटिक दवाओं स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. एंटीबायोटिक्स (जेंटामाइसिन सल्फेट या एमोक्सिसिलिन) स्टॉक समाधान 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर तैयार करें जो बाँझ 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) या डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) विलायक में 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में घुल जाता है। बाँझ पीबीएस समाधान में जेंटामाइसिन सल्फेट और बाँझ डीएमएसओ विलायक में एमोक्सिसिलिन घोलें। इसके बाद, एंटीबायोटिक दवाओं के समाधान को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जैसा कि सुझाव दिया गया है।
  2. डी2ओ को केशन-एडजस्टेड म्यूलर-हिंटन ब्रोथ (एमएचबी) मीडिया युक्त बनाने के लिए, 100% डी 2 ओ युक्त माध्यम बनाने के लिए 10 एमएल डी 2 ओ में220मिलीग्राम एमएचबी शोरबा बेस जोड़ें। 200 एनएम छिद्र आकार के फिल्टर के साथ फ़िल्टर करके घोल को निष्फल करें।
    नोट: आगे के चरणों में मध्यम समाधान बनाने और स्टरलाइज़ करने के लिए हमेशा इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
  3. एसआरएस इमेजिंग के लिए जीवाणु के नमूने तैयार करने के लिए, सामान्य एमएचबी मीडिया के 2 एमएल जोड़ें, जिसमें ड्यूटेरियम नहीं होता है, एक बाँझ गोल-तल संस्कृति ट्यूब में, और फिर इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म करें।
  4. ट्राइप्टिक सोया एगर प्लेट पर ताजा संस्कृति से एक जीवाणु (एस्चेरिचिया कोलाई बीडब्ल्यू 25113 या स्यूडोमोनास एरुगिनोसा एटीसीसी 47085) कॉलोनी का चयन करने के लिए एक बाँझ लूप का उपयोग करें। फिर बैक्टीरिया निलंबन तैयार करने के लिए इसे पूर्वप्रवेशित संस्कृति मीडिया और धीरे से भंवर में निलंबित करें।
  5. 200 परिक्रमा प्रति मिनट (आरपीएम) पर एक शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया को इनक्यूबेट करें जब तक कि यह लघुगणकीय चरण तक नहीं पहुंच जाता।

2. एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में डी2ओ निगमन उपचार (चित्रा 2 ए)

  1. 600 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर फोटोमीटर के साथ ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापकर जीवाणु एकाग्रता की जांच करें।
  2. सामान्य एमएचबी माध्यम का उपयोग करके जीवाणु समाधान को पतला करें, जिसमें ड्यूटेरियम नहीं होता है, 8 x 105 सीएफयू / एमएल की अंतिम सेल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए। बैक्टीरिया कोशिकाओं को मिलाने के लिए भंवर धीरे से।
  3. सात 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में बैक्टीरिया के घोल के 300 μL एलिकोट तैयार करें, और एक 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में जीवाणु समाधान के 600 μL एलिकोट तैयार करें।
  4. बैक्टीरियल घोल के 600 μL युक्त माइक्रो ट्यूब में एंटीबायोटिक (जेंटामाइसिन या एमोक्सिसिलिन) स्टॉक समाधान (1 mg / mL) के 4.8 μL जोड़ें, ताकि अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता 8 μg / mL हो सके।
  5. एंटीबायोटिक युक्त बैक्टीरिया समाधान के 8 μg / mL में से 300 μL घोल लें, और बैक्टीरिया के घोल के एक और 300 μL में जोड़ें, ताकि दो गुना पतला एंटीबायोटिक- (4 μg / mL) युक्त बैक्टीरिया समाधान बनाया जा सके।
  6. परीक्षण एंटीबायोटिक दवाओं, जेंटामाइसिन, या एमोक्सिसिलिन के दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने को दोहराएं, जब तक कि सबसे कम सांद्रता (0.25 μg / mL) वाली माइक्रो ट्यूब तक नहीं पहुंच जाती है, और ट्यूब से 300 μL को छोड़ दें। जेंटामाइसिन और एमोक्सिसिलिन दोनों के लिए, सीरियल सांद्रता 0.25 μg / mL - 8 μg / mL से होती है।
    1. खाली नियंत्रण के लिए एक ट्यूब को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ छोड़ दें। यह एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के बिना लेकिन डी 2 ओ उपचार के साथजीवाणुचयापचय गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण होगा।
    2. नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक ट्यूब को एंटीबायोटिक दवाओं और कोई डी2ओ के साथ छोड़ दें।
  7. बैक्टीरियल एलिकोट को कुछ एंटीबायोटिक (जेंटामाइसिन या एमोक्सिसिलिन) के साथ 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें जिसमें एमएचबी माध्यम होता है।
  8. इनक्यूबेशन दौरान, चरण2.6में तैयार एंटीबायोटिक दवाओं की समान एकाग्रता ढाल के साथ 100% डी 2 ओ युक्त माध्यम के साथ एंटीबायोटिक दवाओं का एक सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। जेंटामाइसिन और एमोक्सिसिलिन दोनों के लिए, सीरियल सांद्रता 0.25 μg / mL - 8 μg / mL से होती है।
  9. 1 घंटे के एंटीबायोटिक उपचार के बाद, क्रमशः उसी एंटीबायोटिक एकाग्रता (चरण2.6में तैयार) में एंटीबायोटिक-प्रीट्रीटेड बैक्टीरिया के 300 μL में क्रमिक रूप से पतला एंटीबायोटिक और 100% डी 2 ओ-युक्त एमएचबी माध्यम जोड़ें।
    1. उदाहरण के लिए, 100% डी2ओ युक्त एमएचबी माध्यम (एंटीबायोटिक के 8 μg / mL युक्त) का 700 μL 8 μg / mL एंटीबायोटिक-पूर्वउपचारित बैक्टीरिया के 300 μL में जोड़ें। उसी तरह, अगली एकाग्रता के संबंधित ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके समरूप करें।
    2. एक रिक्त नियंत्रण के रूप में एंटीबायोटिक मुक्त 100% डी2ओ युक्त एमएचबी माध्यम के 700 μL को एंटीबायोटिक मुक्त बैक्टीरिया (चरण 2.6.1 में तैयार) के 300 μL जोड़ें।
    3. अतिरिक्त 30 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर एक इनक्यूबेशन शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस चरण में, परीक्षण के लिए माध्यम में डी2ओ की अंतिम एकाग्रता 70% है।
  10. पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए6200x g पर एंटीबायोटिक और डी 2 ओ-उपचारित जीवाणु नमूने के 1 एमएल सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर शुद्ध पानी से दो बार धोएं। अंत में, 10% फॉर्मेलिन समाधान में नमूने ठीक करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. मूत्र के वातावरण में बैक्टीरिया की तैयारी (चित्रा 2 बी)

  1. लघुगणकीय चरण में ई कोलाई बीडब्ल्यू 25113 तैयार करने के लिए, 1.4 और 1.5 पर चरणों का पालन करें।
  2. 600 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर फोटोमीटर के साथ ओडी को मापकर बैक्टीरिया की एकाग्रता की जांच करें।
  3. नैदानिक यूटीआई नमूने14,18,41 की नकल करने के लिए, ई कोलाई समाधान को 106 सीएफयू / एमएल की अंतिम कोशिका एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 10 एमएल अज्ञात मूत्र में स्पाइक करें।
  4. ई कोलाई स्पाइक्ड मूत्र को 5 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें, और फिर बैक्टीरिया के घोल को 300 μL एलिकोट में सात 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में विभाजित करें, और एक 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में जीवाणु समाधान के 600 μL एलिकोट।
  5. एंटीबायोटिक दवाओं और नमूना संग्रह की उपस्थिति में डी2ओ निगमन उपचार करें जैसा कि 2.4 से 2.10 तक पिछले चरणों में वर्णित है।

4. रक्त के वातावरण में बैक्टीरिया की तैयारी (चित्रा 2 सी)

  1. लघुगणकीय चरण में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा एटीसीसी 47085 तैयार करने के लिए, 1.4 और 1.5 पर चरणों का पालन करें।
  2. नैदानिक रक्तप्रवाह संक्रमणके नमूनों 42,43 की नकल करने के लिए, 107 सीएफयू / एमएल की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 1 एमएल मानव रक्त में पी. एरुगिनोसा स्पाइक करें।
  3. रक्त को पतला करने के लिए 9 एमएल बाँझ शुद्ध पानी जोड़ें।
  4. एरुगिनोसा स्पाइक्ड रक्त को 5 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6200 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बैक्टीरिया को 1 एमएल मात्रा में काटें।  बैक्टीरिया के घोल और धीरे से भंवर में 9 एमएल पूर्व-गर्म सामान्य एमएचबी जोड़ें। बैक्टीरिया की अंतिम सांद्रता 106 CFU / mL है
  5. एरुगिनोसा स्पाइक्ड रक्त समाधान को 300 μL एलिकोट में सात 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में विभाजित करें, और एक 1.5 एमएल माइक्रो ट्यूबों में जीवाणु समाधान के 600 μL एलिकोट।
  6. एंटीबायोटिक दवाओं और नमूना संग्रह की उपस्थिति में डी2ओ निगमन उपचार करें जैसा कि 2.4 से 2.10 तक पिछले चरणों में वर्णित है।

5. एक एकल जीवाणु में डी2ओ चयापचय निगमन की एसआरएस इमेजिंग

  1. शुद्ध पानी के साथ 1 एमएल निश्चित बैक्टीरिया समाधान धोएं और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें। जीवाणु समाधान को लगभग 20 μL तक समृद्ध करें।
  2. पॉली-एल-लाइसिन लेपित कवरग्लास पर जीवाणु समाधान जमा करें। सैंडविच और एसआरएस इमेजिंग के लिए नमूना सील करें।
  3. एसआरएस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 2168 सेमी -1 पर सी-डी कंपन आवृत्ति पर छवि बैक्टीरिया।
    1. कंप्यूटर पर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पंप तरंग दैर्ध्य को 852 एनएम तक इनपुट और ट्यून करें।
    2. पावर मीटर का उपयोग करके लेजर पावर को मापें। लेजर आउटपुट के सामने अर्ध-तरंग प्लेट को समायोजित करके नमूने में पंप लेजर की शक्ति ~ 8 mW और नमूने पर स्टोक्स लेजर की शक्ति ~ 40 mW तक सेट करें।
      नोट: एसआरएस माइक्रोस्कोप में, 80-मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर के साथ एक असमर्थ फेम्टोसेकंड लेजर पंप (680 से 1300 एनएम) और स्टोक्स (1045 एनएम) उत्तेजना लेजर प्रदान करता है।
  4. प्रतिबिंब दर्पण के स्क्रू को समायोजित करके, पंप और स्टोक्स बीम को स्थानिक रूप से संरेखित करें और लेजर स्कैनिंग के लिए 2 डी गैल्वो मिरर सिस्टम से लैस एक सीधे माइक्रोस्कोप में दो बीम को निर्देशित करें।
    1. नमूने पर पंप और स्टोक्स लेजर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 60x पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें।
    2. आगे की दिशा में नमूने से संकेतों को एकत्र करने के लिए एक तेल कंडेनसर का उपयोग करें।
    3. फोटोडायोड में निर्देशित करने से पहले स्टोक्स लेजर को फ़िल्टर करने के लिए बैंडपास फ़िल्टर का उपयोग करें।
    4. लॉक-इन एम्पलीफायर द्वारा उत्तेजित रमन सिग्नल निकालें और फोटोडायोड द्वारा संकेतों का पता लगाएं।
  5. प्रत्येक एसआरएस छवि को 200 x 200 पिक्सेल और सॉफ़्टवेयर के नियंत्रण कक्ष में 30 μ के लिए पिक्सेल निवास समय सेट करें। एक छवि के लिए कुल अधिग्रहण समय ~ 1.2 सेकंड है। चरण आकार को 150 एनएम पर सेट करें, इसलिए छवि का आकार लगभग 30 x 30 μm2 है। प्रत्येक नमूने के लिए दृश्यों के कम से कम तीन क्षेत्रों की छवि.

6. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण (चित्रा 3)

  1. औसत सी-डी सिग्नल तीव्रता प्राप्त करने के लिए, इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ एसआरएस छवियों को खोलें और संसाधित करें।
  2. सबसे पहले, छवि पर क्लिक करके एसआरएस छवियों को उल्टे रंग के साथ 8-बिट प्रकार की छवियों में परिवर्तित | टाइप | 8-बिट, और उसके बाद | संपादित करें ImageJ सॉफ़्टवेयर में इनवर्ट बटन.
  3. फिर, प्रक्रिया पर क्लिक करके गॉसियन ब्लर के साथ छवियों को फ़िल्टर करें | फ़िल्टर | गॉसियन बटन को धुंधला करते हैं और सिग्मा (त्रिज्या) को 1 पर सेट करते हैं।
  4. जीवाणु क्षेत्र का चयन करने के लिए छवि दहलीज समायोजन का उपयोग करें। छवि | क्लिक करें | समायोजित करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि चयनित जीवाणु आकार मूल एसआरएस छवियों में उन लोगों से मेल खाते हैं। कणों को निर्धारित करने के लिए आकार सीमा को समायोजित करके छोटे कणों को हटा दें। लागू करें क्लिक करें.
  5. विश्लेषण | लागू करें बैक्टीरिया के क्षेत्र को लेबल और निर्धारित करने के लिए कण विश्लेषण बटन।
  6. मूल असंसाधित एसआरएस छवि में ROI प्रबंधक में सभी दिखाएं बटन पर क्लिक करके, बैक्टीरिया के समान क्षेत्र को लेबल करें, ROI प्रबंधक में माप बटन पर क्लिक करके प्रत्येक डेटा बिंदु की औसत तीव्रता निर्धारित करें।
  7. मूल एसआरएस छवि में पृष्ठभूमि क्षेत्र को सर्कल करें और पृष्ठभूमि की औसत तीव्रता को मापें। प्रत्येक जीवाणु की औसत सी-डी तीव्रता पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता को घटाकर प्राप्त की जाती है।

7. एससी-एमआईसी के माध्यम से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता की मात्रा

नोट: एससी-एमआईसी निर्धारित करने के लिए 0.60 पर कट-ऑफ मान दवा जोखिम40 की विभिन्न सांद्रता पर बैक्टीरिया के लिए चयापचय-सक्रिय और चयापचय-बाधित स्थितियों के एसआरएस सी-डी तीव्रता के सांख्यिकीय विश्लेषण के अनुसार स्थापित किया गया है। एंटीबायोटिक-अतिसंवेदनशील और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी समूहों के लिए सी-डी तीव्रता को सामान्य वितरण के साथ फिट किया गया था।

  1. रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (आरओसी) वक्र को प्लॉट करें और 0.60 पर कट-ऑफ सीमा का मूल्यांकन करें। इस कट-ऑफ मूल्य के आधार पर, एससी-एमआईसी को एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता के संकेतक के रूप में चयापचय रूप से निष्क्रिय और चयापचय रूप से सक्रिय समूह को निर्धारित करने के लिए परिभाषित किया जा सकता है।
  2. एसआरएस इमेजिंग डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए, क्रमिक रूप से पतला एंटीबायोटिक एकाग्रता के साथ इलाज किए गए प्रत्येक बैक्टीरिया समूह के लिए सी-डी सिग्नल तीव्रता के हिस्टोग्राम को प्लॉट करें। रंगीन डेटा बिंदु विभिन्न व्यक्तिगत जीवाणुओं के लिए खड़े हैं।
  3. एंटीबायोटिक उपचारित समूह की सी-डी तीव्रता को एंटीबायोटिक उपचार के बिना नियंत्रण समूह की औसत तीव्रता तक सामान्य करें। 0.60 पर कट-ऑफ मान का उपयोग करके सी-डी क्षेत्र में एसआरएस सिग्नल तीव्रता बनाम एंटीबायोटिक दवाओं की विभिन्न एकाग्रता को निर्धारित करके विभिन्न बैक्टीरिया और एंटीबायोटिक संयोजनों के एससी-एमआईसी परिणामों का निर्धारण करें।
  4. पारंपरिक शोरबा माइक्रोडायल्यूशन परख का उपयोग करके निर्धारित एमआईसी के साथ एससी-एमआईसी रीडआउट को मान्य और तुलना करें।
  5. क्लिनिकल एंड लेबोरेटरी स्टैंडर्ड इंस्टीट्यूट (सीएलएसआई) के अनुसार, प्रत्येक परीक्षण किए गए जीवाणु तनाव के लिए एसआरएस चयापचय इमेजिंग परिणामों के आधार पर संवेदनशीलता श्रेणी को "अतिसंवेदनशील", "प्रतिरोधी" या "मध्यवर्ती" के रूप में व्याख्या की जाती है।

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Representative Results

ड्यूटेरियम निगमन पर इनक्यूबेशन समय का प्रभाव सी-डी (2070 से 2250 सेमी -1) और सी-एच (2,800 से 3,100 सेमी -1) क्षेत्र में सहज रमन माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है (चित्रा 4 ए)। पी. एरुगिनोसा के टाइम-लैप्स सिंगल-सेल रमन स्पेक्ट्रा को 70% डी2ओ युक्त मध्यम में संवर्धित किया गया है, जो इनक्यूबेशन समय में 0 से 180 मिनट तक सीडी/सीएच तीव्रता में वृद्धि दिखाता है। (चित्र 4बी) एकल माइक्रोबियल कोशिकाओं में बढ़ती सी-डी प्रचुरता से पता चलता है कि डी 2 ओ को सेल के अंदर ड्यूटेरेटेड बायोमोलेक्यूल्स में शामिल कियागयाहै।

50% से ऊपर डी2ओ लेबलिंग 23 घंटे इनक्यूबेशन अवधि27 के दौरान बैक्टीरिया चयापचय को काफी प्रभावित करती है। हमने जीवाणु विकास अवरोध देखा जबडी 2ओ लेबलिंग एकाग्रता 25 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के दौरान 70% से ऊपर है (चित्रा एस 1)। हमने गोल्ड स्टैंडर्ड ब्रोथ कमजोर पड़ने से एमआईसी किया है और दो पी. एरुगिनोसा उपभेदों (पी. एरुगिनोसा एटीसीसी 47085 और पी. एरुगिनोसा 1133) में एससी-एमआईसी परिणाम प्राप्त किए हैं (तालिका एस 1)। हमारे वर्तमान परिणाम बताते हैं कि 70% डी2ओ पी एरुगिनोसा में हमारी विधि के प्रदर्शन को प्रभावित नहीं करता है। पारंपरिक संस्कृति-आधारित विधि के साथ हमारी एससी-एमआईसी विधि का श्रेणी समझौता सभी परीक्षण किए गए पी. एरुगिनोसा और एंटीबायोटिक संयोजनों के लिए 100% है, जैसा कि तालिका एस 1 में दिखाया गया है। हम एससी-एमआईसी निर्धारण में 30 मिनट की अवधि के दौरान पी एरुगिनोसा पर 70% डी2ओ की न्यूनतम विषाक्तता इनक्यूबेशन लिए इस अच्छे समझौते का श्रेय देते हैं।

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, पी. एरुगिनोसा को 1 घंटे के लिए क्रमिक रूप से पतला जेंटामाइसिन और फिर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए 70% डी 2ओ के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एंटीबायोटिक उपचार पर सी-डी तीव्रता को नियंत्रण समूह के औसत मूल्य से विभाजित किया जाता है, जो एंटीबायोटिक उपचार के बिना है। मात्रात्मक सांख्यिकीय विश्लेषण (चित्रा 5 बी) से पता चला है कि पी. एरुगिनोसा के सी-डी सिग्नल जेंटामाइसिन उपचार (0 μg / mL) के बिना की तुलना में 2 μg / mL या उच्च जेंटामाइसिन एकाग्रता पर काफी कम थे। 0.60 पर कट-ऑफ सीमा का उपयोग करते हुए, पी. एरुगिनोसा को चयापचय रूप से 2 μg / mL और जेंटामाइसिन की उच्च सांद्रता पर रोक दिया गया था। डॉटेड लाइन चित्रा 5 बी में 0.60 पर परिभाषित कट-ऑफ मान दिखाती है। इस तरह, सामान्य एमएचबी माध्यम में जेंटामाइसिन के खिलाफ पी. एरुगिनोसा के लिए एससी-एमआईसी 2 μg / mL निर्धारित किया गया था। यह एससी-एमआईसी मान शोरबा माइक्रोडायल्यूशन विधि (चित्रा 5 सी) द्वारा निर्धारित एमआईसी (4 μg / mL) के साथ एक गुना अंतर सीमा के भीतर सत्यापित किया जाता है। एक साथ लिया गया, हमारी तकनीक द्वारा निर्धारित एससी-एमआईसी रोगाणुरोधी संवेदनशीलता की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।

नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए ड्यूटेरियम चयापचय निगमन की एसआरएस इमेजिंग द्वारा तेजी से एएसटी की क्षमता का पता लगाने के लिए, विशेष रूप से सबसे प्रचलित यूटीआई संक्रमण के लिए, हमने ई कोलाई का उपयोग करके बैक्टीरिया-स्पाइक्ड मूत्र नमूने का परीक्षण किया, जो यूटीआई संक्रमण44 का कारण बनने वाला सबसे आम रोगज़नक़ है। एक रीलावेंट बैक्टीरियल एकाग्रता पर नैदानिक यूटीआई नमूनों की नकल करने के लिए, ई कोलाई को 106 सीएफयू / एमएल की अंतिम एकाग्रता में अज्ञात मूत्र में जोड़ा जाता है। नमूना शुद्धिकरण के बाद, मूत्र के नमूनों को एमोक्सिसिलिन और डी2ओ के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एसआरएस छवियों में स्वच्छ पृष्ठभूमि से पता चला कि नमूना तैयारी प्रोटोकॉल तेजी से एएसटी माप (चित्रा 5 डी) के लिए लागू था। एमोक्सिसिलिन के खिलाफ ई कोलाई-स्पाइक्ड मूत्र नमूने के लिए एससी-एमआईसी को 4 μg/mL (चित्रा 5e) निर्धारित किया गया था, जिसमें सामान्य MHB माध्यम (चित्रा 5f) में शुद्ध ई कोलाई के लिए पारंपरिक शोरबा कमजोर पड़ने की विधि द्वारा MIC (8 μg/mL) के समान संवेदनशीलता है। इन परिणामों से सामूहिक रूप से पता चला है कि ड्यूटेरियम चयापचय निगमन के एसआरएस इमेजिंग द्वारा तेजी से एएसटी यूटीआई संक्रामक रोगजनकों के नैदानिक निदान के लिए बहुत क्षमता है।

यूटीआई संक्रमण की तुलना में, बीएसआई रोगजनकों के लिए तेजी से एएसटी बैक्टीरिया चयापचय गतिविधि के सीटू अध्ययन के लिए बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि रक्त में बहुत सारी रक्त कोशिकाएं मौजूद हैं। नैदानिक बीएसआई नमूनों के लिए डी2ओ चयापचय निगमन की एसआरएस इमेजिंग द्वारा रैपिड एएसटी की प्रयोज्यता की जांच करने के लिए, अज्ञात मानव रक्त में पी. एरुगिनोसा स्पाइक का पता लगाया गया था। जैसा कि चित्रा 5 जी में दिखाया गया है, 2168 सेमी -1 पर एसआरएस छवि की सी-डी तीव्रता जीवाणु संकेतों पर हावी थी। चूंकि लाल रक्त कोशिकाओं में आगे जैवसंश्लेषण के लिए डी2ओ को लेने के लिए चयापचय गतिविधि नहीं होती है, इसलिए सी-डी संकेत जीवित बैक्टीरिया के चयापचय ड्यूटेरियम निगमन से उत्पन्न हुए थे। एससी-एमआईसी के मात्रात्मक विश्लेषण को प्रभावित किए बिना, मलबे या लाल रक्त कोशिकाओं की प्रजातियों के क्रॉस-फेज मॉड्यूलेशन या फोटोथर्मल सिग्नल ने कमजोर पृष्ठभूमि संकेतों में योगदान दिया। रक्त में पी. एरुगिनोसा के लिए एससी-एमआईसी परिणाम 2 μg/mL (चित्रा 5h) निर्धारित किया गया था, जो सामान्य विकास माध्यम में P. Aruginosa के लिए पारंपरिक मानक MIC परिणाम के साथ अच्छी तरह से सहमत था (चित्रा 5i)। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चला कि ड्यूटेरियम चयापचय निगमन की एसआरएस चयापचय इमेजिंग बीआईएस संक्रमण में बैक्टीरिया के लिए एससी-एमआईसी निर्धारित करने के लिए एक तेजी से एएसटी विधि हो सकती है।

Figure 1
चित्र 1: डी2ओ को ड्यूरेटेड लिपिड और प्रोटीन25,26 में शामिल करने की योजना। ड्यूटेरियम को एनएडीपीएच में रेडॉक्स-सक्रिय हाइड्रोजन परमाणु और डी2ओ में डी परमाणु के बीच एंजाइम-उत्प्रेरित एच / डी विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से एक सेल के अंदर बायोमास में शामिल किया जा सकता है। एमिनो एसिड की प्रतिक्रियाओं में डी2ओ को शामिल करने से ड्यूटेरेटेड प्रोटीन उत्पादन होता है। इस आंकड़े को ref.40 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ड्यूटेरियम निगमन के एसआरएस चयापचय इमेजिंग द्वारा तेजी से एएसटी का वर्कफ़्लो। (ए) एमएचबी माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में डी2ओ निगमन उपचार, और निम्नलिखित एसआरएस इमेजिंग प्रक्रियाएं। (बी) मूत्र वातावरण में बैक्टीरिया की तैयारी। (ग) रक्त वातावरण में जीवाणुओं की तैयारी। इस आंकड़े को ref.40 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. स्वचालित छवि प्रसंस्करण और डेटा व्याख्या। (ए) कच्ची एसआरएस छवि। (बी) जीवाणु कोशिकाओं के क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए तीव्रता सीमा समायोजन के बाद छवि। (ग) कण विश्लेषण चरण के बाद चयनित डेटा बिंदु। (घ) तदनुरूपी डेटा बिन्दुओं को कच्ची छवि में चुना जाता है। (ई) कच्ची छवि में संबंधित डेटा बिंदुओं के परिणाम। (च) पृष्ठभूमि के घटाव के बाद डेटा बिंदुओं की औसत तीव्रता के सांख्यिकीय परिणाम। स्केल बार: 10 μm. इस आंकड़े को ref.40 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. बैक्टीरिया में ड्यूटेरियम निगमन पर इनक्यूबेशन समय का प्रभाव। (क) सहज रमन माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी (20 स्पेक्ट्रा से औसत) द्वारा सी-डी (2070 से 2250 सेमी-1) और सी-एच (2,800 से 3,100 सेमी-1) क्षेत्र में समय-चूक माप। (ख) सीडी/सीएच तीव्रता अनुपात का हिस्टोग्राम प्लॉट डी2ओ से अधिक है इनक्यूबेशन समय (ए) में बैक्टीरिया के लिए है। प्रत्येक रंगीन बिंदु एक एकल जीवाणु से माप के लिए खड़ा है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. एससी-एमआईसी निर्धारण सामान्य माध्यम, मूत्र और रक्त वातावरण में एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ डी 2 ओ केजीवाणुचयापचय निगमन के एसआरएस इमेजिंग का उपयोग करके। (क) सी-डी कंपन (2168 सेमी-1) पर एसआरएस इमेजिंग और सामान्य एमएचबी माध्यम में क्रमिक रूप से पतला जेंटामाइसिन को मिलाकर डी2ओ की उपस्थिति में पी एरुगिनोसा की तदनुरूपी संचरण छवियां। (क) पी एरुगिनोसा की एसआरएस सी-डी तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण। हिस्टोग्राम में रंगीन डेटा बिंदु विभिन्न व्यक्तिगत जीवाणु के लिए खड़े हैं। डॉटेड लाइन कट-ऑफ मान को 0.60 पर इंगित करती है। (ग) एससी-एमआईसी रीडआउट की तुलना शोरबा माइक्रोडायल्यूशन विधि द्वारा एमआईसी के साथ की जाती है और सीएलएसआई के अनुसार पी एरुगिनोसा के लिए संवेदनशीलता श्रेणी। (घ) सी-डी कंपन (2168 सेमी-1) पर एसआरएस इमेजिंग और क्रमिक रूप से पतला एमोक्सिसिलिन के साथ डी2ओ में इनक्यूबेशन के बाद मूत्र में ई कोलाई की तदनुरूपी संचरण छवियां। (ङ) एसआरएस सी-डी तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण (घ) में। (च) सामान्य एमएचबी और मूत्र में ई कोलाई के लिए एससी-एमआईसी रीडआउट और संवेदनशीलता श्रेणी की तुलना। (छ) सी-डी कंपन (2168 सेमी-1) पर एसआरएस इमेजिंग और क्रमिक रूप से पतला जेंटामाइसिन के साथ डी2ओ में इनक्यूबेशन के बाद रक्त में पी एरुगिनोसा की तदनुरूपी संचरण छवियां। (ज) एसआरएस सी-डी तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण (जी) में। (i) सामान्य एमएचबी और रक्त में पी एरुगिनोसा के लिए एससी-एमआईसी रीडआउट और संवेदनशीलता श्रेणी की तुलना। एस: संवेदनशील। कोशिकाओं की संख्या एन प्रति समूह 10 ≥। त्रुटि पट्टियाँ SEM. स्केल पट्टी का प्रतिनिधित्व करती हैं: 10 μm. इस आंकड़े को ref.40 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समस्या संभावित कारण घोल
दृश्य के इमेजिंग क्षेत्र में बहुत कम या कोई जीवाणु कोशिका संख्या नहीं घोल में जीवाणु घनत्व बहुत कम है बैक्टीरिया को और समृद्ध करने के लिए लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूज
एसआरएस इमेजिंग के दौरान जीवाणु कोशिकाओं का फोटोडैमेज उपयोग की जाने वाली लेजर शक्ति बहुत अधिक है लेजर पावर को उचित मान तक ट्यून करें
कोई एसआरएस सिग्नल पता लगाने योग्य नहीं है पंप और स्टोक्स बीम के स्थानिक और अस्थायी ओवरलैप को अनुकूलित नहीं किया गया है पंप और स्टोक्स बीम को एक मानक नमूना ड्यूटेरेटेड डाइमिथाइल सल्फोक्साइड का उपयोग करके संरेखित करें

तालिका 1: समस्या निवारण तालिका.

चित्रा एस 1: विभिन्न डी2ओ सांद्रता के साथ लौरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम में संवर्धित पी एरुगिनोसा पर डी2ओ विषाक्तता का परीक्षण। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन मानों को इंगित करती हैं (माप की संख्या = 5). कृपया इस चित्र को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका S1. एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार पर पी. एरुगिनोसा के सामान्य एमएचबी में एससी-एमआईसी और एमआईसी की तुलना। एस: संवेदनशील; आर: प्रतिरोधी; I: इंटरमीडिएट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

नमूने से एससी-एमआईसी परिणामों के लिए 2.5 घंटे के भीतर एकल-सेल एसआरएस चयापचय इमेजिंग का उपयोग करके एंटीबायोटिक उपचार के लिए जीवाणु चयापचय गतिविधि की प्रतिक्रिया का आकलन करके रैपिड एएसटी प्राप्त किया जा सकता है। सी-डी बॉन्ड के एसआरएस इमेजिंग का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल संश्लेषण के लिए डी2ओ के चयापचय निगमन की निगरानी करके जीवाणु चयापचय गतिविधि और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता की प्रतिक्रिया का पता लगाया जा सकता है। चूंकि जीवित कोशिकाओं में पानी का सर्वव्यापी रूप से उपयोग किया जाता है, एसआरएस चयापचय इमेजिंग तेजी से एएसटी के लिए एक सार्वभौमिक विधि प्रदान करता है। रैपिड एएसटी विधि जटिल जैविक वातावरण में बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए लागू होती है, जैसे कि मूत्र या पूरे रक्त को एक जीवाणु स्तर पर। एससी-एमआईसी को मूत्र और रक्त में बैक्टीरिया की 1.5 घंटे की संस्कृति के बाद निर्धारित किया जा सकता है, जिसे यूटीआई और बीएसआई निदान के प्रतिमान को समय लेने वाली संस्कृति-निर्भर प्रक्रिया से संस्कृति-स्वतंत्र सीटू दृष्टिकोण में बदलने के लिए परिवर्तनकारी माना जाता है। इसलिए, इसका मतलब पारंपरिक शोरबा माइक्रोडायल्यूशन विधि की तुलना में निदान के समय में जबरदस्त कमी है, जो नैदानिक अनुवाद की दिशा में मार्ग प्रशस्त करता है जो सटीक उपचार के लिए उपयुक्त रोगाणुरोधी एजेंटों की समय पर पहचान की अनुमति देता है।

यहां वर्णित एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के प्रोटोकॉल सीएलएसआई के दिशानिर्देशों का पालन करते हैं, जिसमें सुझाए गए एमएचबी माध्यम का उपयोग आम तौर पर विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों की खेती के लिए किया जा सकता है। एक प्रमुख पैरामीटर यह है कि रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले जीवाणु कोशिका संख्या को सीएलएसआई में अनुशंसित लगभग 5 x 105 सीएफयू / एमएल पर रखा जाता है। सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए यह महत्वपूर्ण महत्व का है। एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार प्रयोगों में, बैक्टीरिया एकाग्रता 8 x 105 सीएफयू / एमएल पर सेट की जाती है। उच्च बैक्टीरिया एकाग्रता से एमआईसी परिणामों में वृद्धि हो सकती है। एक बार जीवाणु निलंबन समायोजित हो जाने के बाद, बैक्टीरिया सेल एकाग्रता में परिवर्तन से बचने के लिए इसका उपयोग 30 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए।

एक एंटीबायोटिक जैसे डैप्टोमाइसिन के संवेदनशीलता परीक्षण के लिए, मीडिया में कैल्शियम के 50 मिलीग्राम / एल को पूरक करने की सिफारिश की जाती है। केशन समायोजित एमएचबी माध्यम में सीए 2 + का 20-25 मिलीग्राम / एल होताहै। इसलिए, सुनिश्चित करें कि माध्यम को 30 मिलीग्राम / एल की एकाग्रता में अतिरिक्त सीए2 + (पानी में घुलनशील और फ़िल्टर स्टरलाइज़) के साथ पूरक किया जाता है।

प्रस्तुत विधि में एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबायोटिक दवाओं के जोखिम और डी2ओ निगमन पर बैक्टीरिया का इनक्यूबेशन समय है। क्योंकि जीवाणु जीवन चक्र का पीढ़ी का समय लगभग 30 से 60 मिनट है, इसलिए एक निश्चित समय के लिए एंटीबायोटिक जोखिम पर जीवाणु चयापचय गतिविधि को प्रभावित करना महत्वपूर्ण है। इस परीक्षण का मूल्यांकन 0.5 एच डी 2 ओ उपचार से पहले 1 घंटे के लिए एंटीबायोटिक एक्सपोजर के लिए विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया-एंटीबायोटिकसंयोजनोंके लिए किया गया है। जीवाणु चयापचय गतिविधि को प्रभावित करने के लिए पहला 1 एच एंटीबायोटिक उपचार कदम आवश्यक है। इसके बाद, बैक्टीरिया को अतिरिक्त 30 मिनट के लिए डी2ओ-युक्त और एंटीबायोटिक युक्त माध्यम के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। अंतिम एंटीबायोटिक सांद्रता को एक ही स्तर पर बनाए रखा जाता है, और डी2ओ की अंतिम एकाग्रता को 70% तक समायोजित किया जाता है। कुल मिलाकर, 1 घंटे एंटीबायोटिक प्रीकल्चर के बाद और डी2ओ और एंटीबायोटिक निगमन के 0.5 घंटे के बाद, एससी-एमआईसी परिणाम तब जीवाणु चयापचय गतिविधि के एसआरएस चयापचय इमेजिंग द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। यह डिजाइन बैक्टीरिया के लिए रोगाणुरोधी गतिविधि के डी2ओ प्रभाव के प्रभाव को कम करता है और पारंपरिक विधि द्वारा एमआईसी के साथ एससी-एमआईसी परिणामों के तुलनीय रीडआउट की ओर जाता है।

एससी-एमआईसी माप में, हम समानांतर 40 नमूने तैयार करते हैं, जिसमें 5 अलग-अलग एंटीबायोटिक्स शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक एक ही समय में 8 सांद्रता के साथ है। हालांकि, क्योंकि बहुत सारी मैनुअल ऑपरेशन प्रक्रियाएं हैं, पांच अलग-अलग बैक्टीरिया-एंटीबायोटिक्स संयोजनों के लिए एएसटी का पता लगाने के लिए कुल परख समय 2.5 घंटे से अधिक है। हमारी विधि में, ~ 20 व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं वाली प्रत्येक एसआरएस छवि को 30 μs पिक्सेल रहने के समय पर एक शॉट में ~ 1.0 सेकंड के भीतर प्राप्त किया गया था। हमारा अनुमान है कि एक जीवाणु तनाव के लिए 10 एंटीबायोटिक दवाओं का अध्ययन करने के लिए कुल एएसटी परख समय नमूने से एससी-एमआईसी रीडआउट तक 2.5 घंटे से कम होगा, जिसमें उच्च थ्रूपुट माप करने की जबरदस्त संभावना है। भविष्य के काम में, थ्रूपुट को और बेहतर बनाने के लिए एक स्वचालित नमूना तैयारी और इमेजिंग डेटा अधिग्रहण विधि को नियोजित किया जाएगा। समस्या निवारण विवरण तालिका 1 में दिए गए हैं।

पारंपरिक संस्कृति-आधारित एएसटी विधियों में, आगे के माप के लिए बैक्टीरियल आइसोलेट्स प्राप्त करने के लिए, घंटों के लिए नैदानिक नमूनों को पूर्व-इनक्यूबेट करना आवश्यक है। नैदानिक यूटीआई नमूने के लिए उन्नत एएसटी विधियां, जैसे रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी29, नैनोलीटर सरणी6, और डिजिटल न्यूक्लिक एसिड परिमाणीकरण18, लंबे समय तक प्रीइन्क्यूबेशन से छुटकारा पाने के लिए विकसित किए गए हैं। यूटीआई संक्रमण की तुलना में, बीएसआई या सेप्सिस बहुत अधिक जीवन-धमकीदेने वाला 18,45 है, जहां क्लिनिक में सटीक निदान के लिए तेजी से एएसटी की तत्काल आवश्यकता होती है। एमआईसी परिणाम प्रदान करने के लिए सकारात्मक रक्त संस्कृतियों से बैक्टीरिया कॉलोनी गठन को मापने के लिए एक सूक्ष्म इमेजिंग विधि की सूचना दी गईहै। हालांकि, एएसटी परख का संचालन करने के लिए बैक्टीरिया बढ़ने में कम से कम 6 घंटे लगते हैं। इसके अलावा, वाणिज्यिक स्वचालित सिस्टम47 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री48,49 रणनीतियां सकारात्मक रक्त संस्कृतियों से एएसटी रीडआउट प्रदान कर सकती हैं। हालांकि, नैदानिक निर्णय के लिए एमआईसी परिणाम प्रदान नहीं किए जा सकते हैं। एएसटी परिणाम और एमआईसी रीडआउट क्लीनिकों में संभावित दुष्प्रभाव पैदा करने के लिए रोगियों को एंटीबायोटिक दवाओं की अतिरिक्त खुराक से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं, ताकि रोगाणुरोधी प्रतिरोधी संक्रमण50,51 के प्रसार को धीमा और रोका जा सके। मौजूदा सहज रमन माइक्रोस्कोपी-आधारित एएसटी विधियों की तुलना में, हमारी तकनीक ऑर्डर-ऑफ-परिमाण सिग्नल वृद्धि के कारण डेटा अधिग्रहण समय (सीए 600 गुना कम) को काफी कम कर देती है। इस काम में, हम मूत्र या पूरे रक्त के वातावरण में नैदानिक रूप से प्रासंगिक जीवाणु एकाग्रता (105 ~ 106 सीएफयू / एमएल) पर एकल बैक्टीरिया में ड्यूटेरियम चयापचय की एसआरएस इमेजिंग द्वारा तेजी से एएसटी का प्रदर्शन करते हैं। जैसा कि पिछले परिणामों में दिखाया गया है, एमआईसी परिणाम 1 घंटे एंटीबायोटिक उपचार और डी2ओ और एंटीबायोटिक दवाओं के 30 मिनट मिश्रण के बाद मूत्र और रक्त में बैक्टीरिया में इनक्यूबेशन के बाद निर्धारित किए जाते हैं। हमारी विधि 2.5 घंटे के भीतर प्रत्येक तनाव-एंटीबायोटिक संयोजन के लिए एमआईसी और संवेदनशीलता वर्गीकरण प्रदान कर सकती है, और इसलिए, नैदानिक अनुवाद के लिए एक नया अवसर खोलती है। संक्षेप में, प्रीकल्चरिंग और बैक्टीरियल डिवीजन की आवश्यकता के बिना, हमारी विधि में संक्रामक रोगों में तेजी से और उच्च थ्रूपुट एएसटी के क्षेत्र में एक विशाल क्षमता है।

एसआरएस मेटाबोलिक इमेजिंग द्वारा हमारी एससी-एमआईसी विधि एमआईसी का पता लगाने और नैदानिक उपयोग के लिए तनाव-एंटीबायोटिक संयोजनों की प्रचुर किस्मों से निपटने पर संक्रामक रोगजनकों के लिए संवेदनशीलता वर्गीकरण प्रदान करने के लिए लागू होती है। एससी-एमआईसी मूत्र और रक्त में बैक्टीरिया में डी2ओ के 30 मिनट के समावेश के बाद निर्धारित किया जाता है, जिसका अर्थ है कि पारंपरिक शोरबा कमजोर पड़ने की विधि की तुलना में निदान के समय में जबरदस्त कमी आई है। नैदानिक निर्णय लेने के लिए रोगज़नक़ पहचान जानकारी प्रदान करने के लिए, एसआरएस चयापचय इमेजिंग तकनीक को तेजी से रोगज़नक़ पहचान में सक्षम नैदानिक प्लेटफार्मों के साथ एकीकृत किया जा सकता है, जैसे कि मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर प्रदूषक आयनीकरण-टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री 49,52,53। सीटू रोगज़नक़ पहचान और तेजी से एएसटी निदान के संयोजन से क्लिनिक में अनुवाद की बड़ी संभावना हो सकती है जो सटीक उपचार के लिए उपयुक्त रोगाणुरोधी एजेंटों की समय पर पहचान करने की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर01एआई141439 से जे-एक्ससी और एमएस और आर35जीएम136223 से जे-एक्ससी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

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References

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जीव विज्ञान अंक 180
एकल जीवाणु में ड्यूटेरियम निगमन के उत्तेजित रमन स्कैटरिंग इमेजिंग द्वारा रैपिड एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

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