Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig antimikrobiel følsomhedstest ved stimuleret Raman-spredningsbilleddannelse af deuteriuminkorporering i en enkelt bakterie

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Denne protokol præsenterer hurtig antimikrobiel følsomhedstest (AST) assay inden for 2,5 timer ved enkeltcellestimuleret Raman-spredningsbilleddannelse af D2O-metabolisme. Denne metode gælder for bakterier i urin- eller fuldblodsmiljøet, hvilket er transformerende for hurtig enkeltcellet fænotypisk AST i klinikken.

Abstract

For at bremse og forhindre spredning af antimikrobielt resistente infektioner er der et presserende behov for hurtig antimikrobiel følsomhedstest (ASAT) for kvantitativt at bestemme de antimikrobielle virkninger på patogener. Det tager typisk dage at gennemføre AST ved konventionelle metoder baseret på langtidskulturen, og de fungerer ikke direkte for kliniske prøver. Her rapporterer vi en hurtig AST-metode muliggjort af stimuleret Raman-spredning (SRS) billeddannelse af deuteriumoxid (D2O) metabolisk inkorporering. Metabolisk inkorporering afD2O i biomasse og metabolisk aktivitetshæmning ved eksponering for antibiotika på enkeltbakterieniveau overvåges ved SRS-billeddannelse. Enkeltcellemetabolismeinaktiveringskoncentrationen (SC-MIC) af bakterier ved eksponering for antibiotika kan opnås efter i alt 2,5 timers prøveforberedelse og påvisning. Desuden er denne hurtige AST-metode direkte anvendelig på bakterieprøver i komplekse biologiske miljøer, såsom urin eller fuldblod. SRS metabolisk billeddannelse af deuteriuminkorporering er transformativ for hurtig enkeltcellet fænotypisk AST i klinikken.

Introduction

Antimikrobiel resistens (AMR) er en voksende global trussel mod effektiv behandling af infektionssygdomme1. Det forudsiges, at AMR vil forårsage yderligere 10 millioner dødsfald om året og et globalt BNP-tab på 100 billioner dollars inden 2050, hvis der ikke træffes foranstaltninger til bekæmpelse af antibiotikaresistente bakterier 1,2. Dette understreger det presserende behov for hurtige og innovative diagnostiske metoder til test af antibiotikafølsomhed (AST) af infektiøse bakterier for at bremse fremkomsten af antibiotikaresistente bakterier og reducere den relaterede dødelighed3. For at sikre det bedst mulige kliniske resultat er det afgørende at indføre effektiv terapi inden for 24 timer. Imidlertid kræver den nuværende guldstandardmetode, som diskdiffusion eller bouillonfortyndingsmetode, normalt mindst 24 timer til præinkubationsproceduren for kliniske prøver og yderligere 16-24 timer for at opnå resultaterne af den minimale hæmmende koncentration (MIC). Samlet set er disse metoder for tidskrævende til at styre en øjeblikkelig beslutning om behandling af infektionssygdomme i klinikken, hvilket fører til fremkomsten og spredningen af antimikrobiel resistens4.

Genotypiske AST-metoder, såsom polymerasekædereaktion (PCR)-baserede teknikker5, er blevet udviklet til hurtig påvisning. Sådanne teknikker måler de specifikke resistensgenetiske sekvenser for at give hurtige AST-resultater. De er ikke afhængige af tidskrævende cellekultur; Det er dog kun specifikke kendte genetiske sekvenser med resistens, der testes. Derfor er dens anvendelse begrænset til forskellige bakteriearter eller forskellige resistensmekanismer. De kan heller ikke give MIC-resultater for terapibeslutninger 6,7. Desuden er nye fænotypiske metoder til hurtig AST under udvikling for at overvinde disse begrænsninger8, herunder mikrofluidiske enheder 9,10,11,12,13, optiske enheder14,15,16, fænotypiske AST-kvantificering af nukleinsyrerne kopinummer17,18 og Raman-spektroskopiske metoder 19, 20,21,22,23,24. Disse metoder reducerer tiden til at guide AST-resultater, men de fleste af dem gælder kun for bakterieisolater, ikke direkte til kliniske prøver, og kræver stadig langvarig præinkubation.

I dette arbejde præsenterer vi en metode til hurtig bestemmelse af følsomheden af bakterier i urinen og fuldblod via overvågning af den cellulære metaboliske aktivitet ved SRS-billeddannelse. Vand (H2O) deltager i langt de fleste essentielle biomolekylære synteseprocesser i levende celler. Som en isotopologue af vand gennem enzymkatalyseret H/D-udvekslingsreaktion mellem det redoxaktive hydrogenatom i NADPH og D-atomet iD2O kan deuterium inkorporeres i biomasse inde i en celle25,26. En deutereret fedtsyresyntesereaktion medieres af deuterium mærket NADPH. D2O-inkorporeringen i reaktioner af aminosyrer (AA'er) resulterer i den deutererede proteinproduktion26 (figur 1). På denne måde kan de nyligt syntetiserede CD-bindingsholdige biomolekyler i enkelte mikrobielle celler anvendes som en generel metabolisk aktivitetsmarkør, der skal detekteres. For at aflæse de novo syntetiserede CD-bindinger anvendes Raman-spektroskopi, et alsidigt analytisk værktøj, der giver specifik og kvantitativ kemisk information om biomolekyler, i vid udstrækning til at bestemme antimikrobiel modtagelighed og reducere testtiden betydeligt til et par timer27,28,29,30 . På grund af den iboende lave effektivitet af Raman-spredningsprocessen er den spontane Raman-spektroskopi imidlertid af lav detektionsfølsomhed. Derfor er det udfordrende at opnå billedresultater i realtid ved hjælp af spontan Raman-spektroskopi. Sammenhængende Raman-spredning (CRS), herunder sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimuleret Raman-spredning (SRS), har nået høj detektionsfølsomhed på grund af det sammenhængende lysfelt for at generere størrelsesordener større end spontan Raman-spektroskopi, hvorved højhastigheds-, specifik og kvantitativ kemisk billeddannelse på enkeltcelleniveau 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Her, baseret på vores seneste arbejde40, præsenterer vi en protokol til hurtig bestemmelse af den metaboliske aktivitet og antimikrobielle modtagelighed ved femtosekund SRS C-D-billeddannelse af D2O-inkorporering af bakterier i det normale medium, urin og fuldblodsmiljø på enkeltcelleniveau. Femtosekund SRS-billeddannelse letter overvågning af enkeltcellemetabolismeinaktiveringskoncentration (SC-MIC) mod antibiotika på enkeltbakterieniveau inden for 2,5 timer. SC-MIC-resultaterne valideres ved standard MIC-test via bouillonmikrofortynding. Vores metode er anvendelig til bestemmelse af antimikrobiel modtagelighed af bakterier urinvejsinfektion (UTI) og blodbaneinfektion (BSI) patogener med en meget reduceret analysetid sammenlignet med den konventionelle metode, hvilket åbner mulighed for hurtig fænotypisk AST i klinikken på enkeltcelleniveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af humane blodprøver er i overensstemmelse med retningslinjerne fra IRB fra Boston University og National Institutes of Health (NIH). Specifikt er prøverne fra en bank og er fuldstændigt afidentificeret. Disse prøver anses ikke for at være menneskelige emner af institutional review board (IRB) kontor ved Boston University.

1. Fremstilling af bakterier og antibiotika lageropløsning

  1. Antibiotika (gentamicinsulfat eller amoxicillin) stamopløsning fremstilles i en koncentration på 1 mg/ml opløst i sterilt1x phosphatbufferet saltvand (PBS) eller dimethylsulfoxid (DMSO) opløsningsmiddel i 1,5 ml mikrorør. Gentamicinsulfat opløses i steril PBS-opløsning og amoxicillin i sterilt DMSO-opløsningsmiddel. Derefter opbevares antibiotikaopløsningen ved 2-8 °C som foreslået.
  2. For at fremstille D 2 O, der indeholder kationjusterede Mueller-Hinton Broth (MHB) medier, tilsættes 220 mg MHB bouillonbase til 10 ml D 2 O for at gøre 100% D2O indeholdende medium. Steriliser opløsningen ved at filtrere med filtre med 200 nm porestørrelse.
    BEMÆRK: Brug altid denne protokol til fremstilling og sterilisering af mellemopløsninger i yderligere trin.
  3. For at forberede bakterieprøver til SRS-billeddannelse tilsættes 2 ml normalt MHB-medie, som ikke indeholder deuterium, til et sterilt rundbundet kulturrør og forvarmer det derefter ved 37 ° C.
  4. Brug en steril løkke til at vælge en bakteriel (Escherichia coli BW 25113 eller Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) koloni fra den friske kultur på en tryptisk soja agar plade. Suspender det derefter i det forvarmede kulturmedie og forsigtigt hvirvel for at forberede bakteriesuspensionen.
  5. Inkubere bakterier ved 37 °C i en ryster ved 200 omdrejninger i minuttet (omdr./min.), indtil den når den logaritmiske fase.

2. D2O inkorporeringsbehandling ved tilstedeværelse af antibiotika (figur 2a)

  1. Kontroller bakteriekoncentrationen ved at måle den optiske densitet (OD) med et fotometer ved en bølgelængde på 600 nm.
  2. Fortynd bakterieopløsningen ved hjælp af det normale MHB-medium, som ikke indeholder deuterium, for at nå en endelig cellekoncentration på 8 x 105 CFU / ml. Vortex forsigtigt for at blande bakteriecellerne.
  3. Der fremstilles 300 μL alikvoter af bakterieopløsningen i syv 1,5 ml mikrorør og 600 μL aliquoter af bakterieopløsningen i et 1,5 ml mikrorør.
  4. Der tilsættes 4,8 μL antibiotisk (gentamicin eller amoxicillin) stamopløsning (1 mg/ml) i mikrorøret indeholdende 600 μL bakterieopløsningen for at gøre den endelige antibiotikakoncentration til 8 μg/ml.
  5. Tag 300 μL opløsning ud af 8 μg / ml antibiotikaholdig bakterieopløsning, og tilsæt til en anden 300 μL bakterieopløsning for at fremstille to gange fortyndet antibiotika- (4 μg / ml) indeholdende bakterieopløsning.
  6. Gentag den dobbelte serielle fortynding af testantibiotika, gentamicin eller amoxicillin, indtil mikrorøret med den laveste koncentration (0,25 μg/ml) er nået, og kassér 300 μL fra røret. For både gentamicin og amoxicillin varierer de serielle koncentrationer fra 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
    1. Efterlad et rør uden antibiotika til blindkontrol. Dette vil være den positive kontrol for at inspicere den bakterielle metaboliske aktivitet uden antibiotikabehandling, men med D2O-behandling.
    2. Efterlad et rør uden antibiotika og ingen D2O til den negative kontrol.
  7. Inkubere den bakterielle aliquot med det bestemte antibiotikum (gentamicin eller amoxicillin) indeholdende MHB-medium i 1 time.
  8. Under inkubation fremstilles en seriel fortynding af antibiotika med 100%D2O-indeholdendemedium med samme koncentrationsgradient af antibiotika fremstillet i trin 2.6. For både gentamicin og amoxicillin varierer de serielle koncentrationer fra 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
  9. Efter 1 time antibiotikabehandling tilsættes henholdsvis 700 μL serielt fortyndet antibiotikum og 100%D2O-holdigtMHB-medium til 300 μL antibiotikaforbehandlede bakterier i samme antibiotikakoncentration (fremstillet i trin 2.6).
    1. For eksempel tilsættes 700 μL 100% D2O-holdigt MHB-medium (indeholdende 8 μg / ml antibiotika) til 300 μL 8 μg / ml antibiotikaforbehandlede bakterier. På samme måde overføres til de tilsvarende rør i den næste koncentration, og homogeniseres ved at pipettere op og ned flere gange.
    2. Der tilsættes 700 μL antibiotikafrit 100 %D2O-holdigt MHB-medium til 300 μL antibiotikafrie bakterier (fremstillet i trin 2.6.1) som blindprøve.
    3. Inkuberes ved 37 °C i en inkubationsryster ved 200 o / min i yderligere 30 minutter.
      BEMÆRK: I dette trin er den endelige koncentration afD2Oi mediet til testen 70%.
  10. Centrifuger først 1 ml antibiotika og D2O-behandlet bakterieprøve ved 6200 x g i 5 minutter ved 4 °C, og vask derefter to gange med renset vand. Til sidst fikseres prøverne i 10% formalinopløsning, og de opbevares ved 4 °C.

3. Fremstilling af bakterier i urinmiljøet (figur 2b)

  1. Følg trinene ved 1.4 og 1.5 for at forberede E. coli BW 25113 i den logaritmiske fase.
  2. Kontroller bakteriekoncentrationen ved at måle OD med et fotometer ved en bølgelængde på 600 nm.
  3. For at efterligne de kliniske UTI-prøver 14,18,41 skal du spike E. coli-opløsningen i 10 ml afidentificeret urin for at nå en endelig cellekoncentration på 10 6 CFU / ml.
  4. Filtrer E. coli-spidset urin ved hjælp af et 5 μm-filter, og opdel derefter bakterieopløsningen i 300 μL aliquoter i syv 1,5 ml mikrorør og 600 μL aliquoter af bakterieopløsningen i et 1,5 ml mikrorør.
  5. Udfør D 2O inkorporeringsbehandling i nærværelse af antibiotika og prøveindsamling som beskrevet i de foregående trin fra 2.4 til 2.10.

4. Fremstilling af bakterier i blodmiljøet (figur 2c)

  1. Følg trinene ved 1.4 og 1.5 for at forberede Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 i den logaritmiske fase.
  2. For at efterligne de kliniske blodbaneinfektionsprøver42,43, spike P. aeruginosa i 1 ml afidentificeret humant blod for at nå en koncentration på 107 CFU / ml.
  3. Tilsæt 9 ml sterilt renset vand for at lyse blodet.
  4. P. aeruginosa spiked blod filtreres ved hjælp af et 5 μm filter. Høst derefter bakterier til 1 ml volumen ved centrifugering ved 6200 x g i 5 minutter ved 4 °C.  Tilsæt 9 ml forvarmet normal MHB i bakterieopløsningen og forsigtigt hvirvel. Den endelige koncentration af bakterier er 106 CFU/ml
  5. Opdel P. aeruginosa spiked blodopløsning i 300 μL aliquots i syv 1,5 ml mikrorør og 600 μL aliquoter af bakterieopløsningen i et 1,5 ml mikrorør.
  6. Udfør D 2O inkorporeringsbehandling i nærværelse af antibiotika og prøveindsamling som beskrevet i de foregående trin fra 2.4 til 2.10.

5. SRS-billeddannelse af D2O metabolisk inkorporering i en enkelt bakterie

  1. Der vaskes 1 ml fast bakterieopløsning med renset vand og centrifugeres derefter ved 6200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten. Berig bakterieopløsningen til ca. 20 μL.
  2. Deponer bakterieopløsningen på et poly-L-lysinbelagt dækglas. Sandwich og forsegl prøven til SRS-billeddannelse.
  3. Billedbakterier ved C-D vibrationsfrekvensen ved 2168 cm-1 ved hjælp af et SRS-mikroskop.
    1. Indtast og indstil pumpens bølgelængde til 852 nm ved hjælp af styringssoftwaren på en computer.
    2. Mål lasereffekten ved hjælp af en effektmåler. Indstil effekten af pumpelaser ved prøven til ~ 8 mW og effekten af Stokes laser ved prøven til ~ 40 mW ved at justere halvbølgepladen foran laserudgangen.
      BEMÆRK: I SRS-mikroskopet giver en justerbar femtosekundlaser med en 80 MHz gentagelseshastighed pumpen (680 til 1300 nm) og Stokes (1045 nm) excitationslasere.
  4. Ved at justere skruerne på refleksionsspejlene justeres pumpen og Stokes-strålerne rumligt og dirigerer de to stråler ind i et opretstående mikroskop udstyret med 2D galvo spejlsystem til laserscanning.
    1. Brug et 60x vandsænkningsmål til at fokusere pumpen og Stokes lasere på prøven.
    2. Brug en oliekondensator til at indsamle signalerne fra prøven i fremadgående retning.
    3. Brug et båndpasfilter til at filtrere Stokes-laseren ud, før du dirigerer den ind i en fotodiode.
    4. Uddrag det stimulerede Raman-signal med en låseforstærker og registrer signalerne fra fotodioden.
  5. Indstil hvert SRS-billede til at indeholde 200 x 200 pixels, og pixelen dvæler tid i 30 μs i softwarens kontrolpanel. Den samlede anskaffelsestid for et billede er ~ 1.2 s. Indstil trinstørrelsen til 150 nm, så billedstørrelsen er ca. 30 x 30 μm2. Billede mindst tre synsfelter for hver prøve.

6. Billedbehandling og dataanalyse (figur 3)

  1. For at opnå den gennemsnitlige CD-signalintensitet skal du åbne og behandle SRS-billeder med ImageJ-software.
  2. Først skal du konvertere SRS-billeder til 8-bit type billeder med omvendt farve ved at klikke på Billede | Indtast | 8-bit og derefter Rediger | Inverter knapper i ImageJ-softwaren.
  3. Filtrer derefter billederne med gaussisk sløring ved at klikke på Behandl | Filtre | Gaussiske sløringsknapper og indstil Sigma (Radius) til 1.
  4. Brug justering af billedtærskel til at vælge bakterieområdet. Klik på Billede | Juster | Tærskel for at sikre, at de valgte bakteriestørrelser matcher dem i de originale SRS-billeder. Eliminer små partikler ved at justere størrelsestærsklen for at bestemme partiklerne. Klik på Anvend.
  5. Anvend analyser | Partikler Analyse knapper til mærkning og bestemmelse af bakterieområdet.
  6. Ved at klikke på knappen Vis alle i ROI-manageren til det oprindelige ubehandlede SRS-billede skal du mærke det samme bakterieområde, bestemme den gennemsnitlige intensitet af hvert datapunkt ved at klikke på knappen Måling i ROI-manageren.
  7. Cirkel baggrundsområdet i det originale SRS-billede, og mål den gennemsnitlige intensitet af baggrunden. De gennemsnitlige C-D-intensiteter for hver bakterie opnås ved at trække baggrundssignalintensiteten.

7. Kvantificering af antimikrobiel følsomhed via SC-MIC

BEMÆRK: Afskæringsværdien ved 0,60 til bestemmelse af SC-MIC er fastlagt i henhold til den statistiske analyse af SRS C-D-intensiteterne af de metabolismeaktive og metabolismehæmmede betingelser for bakterier ved forskellige koncentrationer af lægemiddeleksponering40. C-D-intensiteterne for de antibiotika-modtagelige og antibiotikaresistente grupper blev udstyret med normalfordeling.

  1. Kurven for modtagerens driftskarakteristik (ROC) afbildes, og afskæringstærsklen evalueres til 0,60. Baseret på denne afskæringsværdi kan SC-MIC som en indikator for effekten af antibiotika defineres for at bestemme den metabolisk inaktive og metabolisk aktive gruppe.
  2. For kvantitativt at analysere SRS-billeddataene skal du plotte histogrammerne af CD-signalintensiteter for hver bakteriegruppe behandlet med den serielt fortyndede antibiotikakoncentration. De farvede datapunkter står for forskellige individuelle bakterier.
  3. Normaliser C-D-intensiteterne i antibiotikabehandlet gruppe til den gennemsnitlige intensitet af kontrolgruppen uden antibiotikabehandling. Bestem SC-MIC-resultaterne af forskellige bakterier og antibiotikakombinationer ved at kvantificere SRS-signalintensiteterne ved C-D-regionen versus forskellige koncentrationer af antibiotika ved hjælp af afskæringsværdien ved 0,60.
  4. Valider og sammenlign SC-MIC-udlæsningen med MIC bestemt ved hjælp af konventionelt bouillonmikrofortyndingsassay.
  5. Ifølge Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) fortolkes følsomhedskategorien baseret på SRS metaboliske billeddannelsesresultater for hver testet bakteriestamme som "modtagelig", "resistent" eller "mellemliggende".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effekten af inkubationstid på deuteriuminkorporering måles ved spontan Raman-mikrospektroskopi ved C-D (2070 til 2250 cm-1) og C-H (2.800 til 3.100 cm-1) regionen (figur 4a). Time-lapse enkeltcellede Raman-spektre af P. aeruginosa dyrket i 70%D2O indeholdende medium viser stigende CD / CH-intensitet over inkubationstid fra 0 til 180 min. (figur 4b) Den stigende C-D-overflod i enkelte mikrobielle celler afslører, at D2O er inkorporeret i deutererede biomolekyler inde i cellen.

D2O-mærkning over 50% påvirker bakteriemetabolismen betydeligt i løbet af en inkubationsperiode på 23 timer27. Vi observerede bakterievæksthæmning, når D2O-mærkningskoncentrationen er over 70% i løbet af en inkubationsperiode på 25 timer (figur S1). Vi har udført MIC ved guldstandard bouillonfortynding og opnået SC-MIC-resultater i to P. aeruginosa-stammer (P. aeruginosa ATCC 47085 og P. aeruginosa 1133) (tabel S1). Vores nuværende resultater viser, at 70% D2O ikke påvirker ydeevnen af vores metode i P. aeruginosa. Kategoriaftalen for vores SC-MIC-metode med den konventionelle dyrkningsbaserede metode er 100% for alle de testede P. aeruginosa- og antibiotikakombinationer, som vist i tabel S1. Vi tilskriver denne gode aftale den minimale toksicitet på 70%D2O på P. aeruginosa i løbet af 30 minutters inkubationsperioden ved SC-MIC-bestemmelse.

Efter protokollen blev P. aeruginosa inkuberet med serielt fortyndet gentamicin i 1 time og derefter 70%D2O i yderligere 30 min. SRS metabolisk billeddannelse ved ~ 2168 cm-1 (figur 5a) blev udført. C-D-intensiteterne ved antibiotikabehandling divideres med middelværdien af kontrolgruppen, som er uden antibiotikabehandling. Den kvantitative statistiske analyse (figur 5b) viste, at C-D-signaler af P. aeruginosa var signifikant lavere ved 2 μg/ml eller højere gentamicinkoncentration end uden gentamicinbehandling (0 μg/ml). Ved hjælp af afskæringstærsklen på 0,60 blev P. aeruginosa metabolisk hæmmet ved 2 μg/ml og højere koncentrationer af gentamicin. Den stiplede linje viser den definerede afskæringsværdi ved 0,60 i figur 5b. På denne måde blev SC-MIC for P. aeruginosa mod gentamicin i normalt MHB-medium bestemt til at være 2 μg/ml. Det verificeres, at denne SC-MIC-værdi ligger inden for det ene dobbelte forskelsområde med MIC (4 μg/ml) bestemt ved bouillonmikrofortyndingsmetoden (figur 5c). Samlet set muliggør SC-MIC bestemt af vores teknologi kvantificering af antimikrobiel modtagelighed.

For at undersøge potentialet for hurtig AST ved SRS-billeddannelse af deuteriummetabolisk inkorporering til kliniske anvendelser, især for den mest udbredte UTI-infektion, testede vi bakterie-spiked urinprøve ved hjælp af E. coli, det mest almindelige patogen til at forårsage UTI-infektion44. For at efterligne de kliniske UTI-prøver ved en relavent bakteriekoncentration tilsættes E. coli til den afidentificerede urin til en endelig koncentration på 106 CFU / ml. Efter prøverensning blev urinprøverne inkuberet med amoxicillin ogD2O. Den rene baggrund i SRS-billederne viste, at prøveforberedelsesprotokollen var anvendelig til hurtig AST-måling (figur 5d). SC-MIC for E. coli-spiked urinprøven mod amoxicillin blev bestemt til at være 4 μg/ml (figur 5e), som har samme følsomhedsaflæsning som MIC (8 μg/ml) ved konventionel bouillonfortyndingsmetode for ren E. coli i normalt MHB-medium (figur 5f). Disse resultater viste samlet, at hurtig AST ved SRS-billeddannelse af deuteriummetabolisk inkorporering er af stort potentiale for klinisk diagnose til UTI-infektiøse patogener.

Sammenlignet med UTI-infektion er hurtig AST for BSI-patogener meget mere udfordrende for in situ-undersøgelse af bakteriel metabolisk aktivitet, da mange blodlegemer præsenterer sig i blod. For at undersøge anvendeligheden af hurtig AST ved SRS-billeddannelse af D2O metabolisk inkorporering til kliniske BSI-prøver blev P. aeruginosa spiked i afidentificeret humant blod detekteret. Som vist i figur 5g var CD-intensiteten af SRS-billedet ved 2168 cm-1 domineret af bakterielle signaler. Da de røde blodlegemer ikke har metabolisk aktivitet til at optageD2O til yderligere biosyntese, stammer C-D-signalerne fra den metaboliske deuteriuminkorporering af levende bakterier. Krydsfasemodulation eller fototermisk signal af affald eller røde blodlegemer bidrog til de svage baggrundssignaler uden at påvirke den kvantitative analyse af SC-MIC. SC-MIC-resultatet for P. aeruginosa i blod blev bestemt til at være 2 μg/ml (figur 5h), hvilket stemte godt overens med det konventionelle standard MIC-resultat for P. aeruginosa i normalt vækstmedium (figur 5i). Samlet set viste disse resultater, at SRS metabolisk billeddannelse af deuterium metabolisk inkorporering kan være en hurtig AST-metode til at bestemme SC-MIC for bakterier i BIS-infektioner.

Figure 1
Figur 1: Skema for D2O inkorporering i deutereret lipid og protein25,26. Deuterium kan inkorporeres i biomasse inde i en celle gennem enzymkatalyseret H / D-udvekslingsreaktion mellem det redoxaktive hydrogenatom i NADPH og D-atomet iD2O. Deutereret fedtsyresyntesereaktion medieres af deuterium mærket NADPH. D2O-inkorporeringen i reaktioner af aminosyrer resulterer i produktionen af deutererede proteiner. Dette tal er ændret fra ref.40. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang af hurtig AST ved SRS metabolisk billeddannelse af deuteriuminkorporering. a) D2O-inkorporeringsbehandling under tilstedeværelse af antibiotika i MHB-medium og følgende SRS-billeddannelsesprocedurer. b) Fremstilling af bakterier i urinmiljøet. c) Fremstilling af bakterier i blodets omgivelser. Dette tal er ændret fra ref.40. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Automatiseret billedbehandling og datafortolkning. (a) Rå SRS-billede. (b) Justering af intensitetstærskel efter intensitet for at bestemme arealet af bakterieceller. c) Datapunkter valgt efter partikelanalysetrinnet. (d) De tilsvarende datapunkter er valgt i det rå billede. e) Resultater af de tilsvarende datapunkter i råbilledet. f) Statistiske resultater af datapunkternes gennemsnitlige intensitet efter subtraktion af baggrundsviden. Skala bar: 10 μm. Dette tal er ændret fra ref.40. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Effekt af inkubationstid på deuteriuminkorporering i bakterier. a) Time-lapse-måling ved C-D (2070 til 2250 cm-1) og C-H (2.800 til 3.100 cm-1) område ved spontan Raman-mikrospektroskopi (gennemsnitligt fra 20 spektre). b) Histogramplot med CD/CH-intensitetsforholdsplot over D2O-inkubationstid for bakterier i litra a). Hvert farvet punkt står for en måling fra en enkelt bakterie. Fejllinjer repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. SC-MIC-bestemmelse ved hjælp af SRS-billeddannelse af bakteriel metabolisk inkorporering afD2O mod antibiotika i normalt medium, urin og blodmiljø. a) SRS-billeddannelse ved C-D-vibrationer (2168 cm-1) og de tilsvarende transmissionsbilleder af P. aeruginosa i nærværelse afD2O, tilsætning af serielt fortyndet gentamicin i normalt MHB-medium. b) Kvantitativ analyse af SRS C-D-intensiteten af P. aeruginosa i litra a). De farvede datapunkter i histogrammet står for de forskellige individuelle bakterier. Den stiplede linje angiver afskæringsværdien ved 0,60. c) Sammenligning af SC-MIC-udlæsningen med MIC efter bouillonmikrofortyndingsmetode og modtagelighedskategori for P. aeruginosa i henhold til CLSI. d) SRS-billeddannelse ved C-D-vibrationer (2168 cm-1) og tilsvarende transmissionsbilleder af E. coli i urinen efter inkubation iD2Omed den serielt fortyndede amoxicillin. e) Kvantitativ analyse af SRS' C-D-intensitet i litra d). f) Sammenligning af SC-MIC-udlæsnings- og modtagelighedskategorien for E. coli i normal MHB og i urin. g) SRS-billeddannelse ved C-D-vibrationer (2168 cm-1) og tilsvarende transmissionsbilleder af P. aeruginosa i blod efter inkubation iD2O med det serielt fortyndede gentamicin. h) Kvantitativ analyse af SRS C-D-intensitet i litra g). i) Sammenligning af SC-MIC-udlæsnings- og modtagelighedskategorien for P. aeruginosa i normal MHB og i blod. S: følsom. Antal celler N ≥ 10 pr. gruppe. Fejllinjer repræsenterer SEM. Skalalinje: 10 μm. Dette tal er ændret fra ref.40. Klik her for at se en større version af denne figur.

Problem Mulig årsag Opløsning
Lille eller intet bakteriecellenummer i billedfeltet Bakteriel tæthed i opløsningen er for lav Centrifuge i længere tid for yderligere at berige bakterier
Fotoskader af bakteriecellerne under SRS-billeddannelse Den anvendte laserkraft er for høj Indstil lasereffekten til en passende værdi
Intet SRS-signal kan detekteres Den rumlige og tidsmæssige overlapning af pumpen og Stokes-strålen er ikke optimeret Juster pumpen og Stokes-bjælkerne ved hjælp af en standardprøve deutereret dimethylsulfoxid

Tabel 1: Fejlfindingstabel.

Figur S1: Testning af D2O-toksicitet på P. aeruginosa dyrket i Lauria-Bertani (LB) medium med forskelligeD2O-koncentrationer. Fejllinjer angiver standardafvigelsesværdier (antal målinger = 5). Klik her for at downloade denne figur.

Tabel S1. Sammenligning af SC-MIC'er og MIC'er i normal MHB af P. aeruginosa ved antibiotikabehandling. S: følsom R: modstandsdygtig; I: Mellemliggende. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hurtig AST kan opnås ved at vurdere responsen af bakteriel metabolisk aktivitet på antibiotikabehandling ved hjælp af enkeltcellet SRS metabolisk billeddannelse inden for 2,5 timer fra prøven til SC-MIC-resultater. Responsen af bakteriel metabolisk aktivitet og antimikrobiel modtagelighed kan detekteres ved at overvåge den metaboliske inkorporeringaf D2O til biomolekylesyntese ved hjælp af SRS-billeddannelse af CD-bindinger. Da vand er allestedsnærværende anvendt i levende celler, giver SRS metabolisk billeddannelse en universel metode til hurtig AST. Den hurtige AST-metode kan anvendes til at detektere bakterier i komplekse biologiske miljøer, såsom urin eller fuldblod på et enkelt bakterieniveau. SC-MIC kan bestemmes efter 1,5 timers kultur af bakterier i urin og blod, hvilket anses for transformativt for at skifte paradigmet for UTI- og BSI-diagnose fra en tidskrævende kulturafhængig procedure til en kulturuafhængig in situ-tilgang . Derfor betyder det en enorm reduktion i diagnosetiden sammenlignet med den konventionelle bouillonmikrofortyndingsmetode, som baner vejen for klinisk oversættelse, der muliggør rettidig identifikation af passende antimikrobielle midler til præcis behandling.

Protokollerne for antibiotikabehandling, der er beskrevet her, følger retningslinjerne i CLSI, hvor det foreslåede MHB-medium generelt kan anvendes til dyrkning af en lang række mikroorganismer. En nøgleparameter er, at bakteriecellenummeret, der anvendes til antimikrobiel følsomhedstest, holdes på ca. 5 x 105 CFU / ml som anbefalet i CLSI. Dette er af afgørende betydning for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater. I antibiotikabehandlingsforsøg er bakteriekoncentrationen sat til 8 x 105 CFU/ml. Højere bakteriekoncentration kan føre til en stigning i MIC-resultaterne. Når bakteriesuspensionen er justeret, skal den bruges inden for 30 minutter for at undgå ændringer i bakteriecellekoncentrationen.

Til følsomhedstest af et antibiotikum såsom daptomycin anbefales det at supplere 50 mg / l calcium i medierne. Det kationjusterede MHB-medium indeholder 20-25 mg/l Ca2+. Sørg derfor for, at mediet suppleres yderligere med yderligere Ca2+ (opløseligt i vand og filtersteriliseret) i en koncentration på 30 mg / l.

Et andet kritisk trin i den præsenterede metode er inkubationstiden for bakterier ved antibiotikaeksponering og D2O-inkorporering. Fordi generationstiden for den bakterielle livscyklus er ca. 30 til 60 minutter, er det vigtigt at påvirke bakteriel metabolisk aktivitet ved antibiotikaeksponering i en vis tid. Denne test er blevet evalueret for en række bakterier-antibiotiske kombinationer til antibiotikaeksponering i 1 time før 0,5 h D2O behandling. Det første 1 timers antibiotikabehandlingstrin er afgørende for at påvirke den bakterielle metaboliske aktivitet. Derefter inkuberes bakterier med D2O-holdigt og antibiotikaholdigt medium i yderligere 30 minutter. De endelige antibiotikakoncentrationer opretholdes på samme niveau, og den endelige koncentration af D2O justeres til 70%. Samlet set bestemmes SC-MIC-resultaterne efter 1 time antibiotikaprækultur og efter 0,5 timer af D2O og antibiotikainkorporering derefter ved SRS metabolisk billeddannelse af den bakterielle metaboliske aktivitet. Dette design minimerer virkningen afD2O-påvirkning af antimikrobiel aktivitet på bakterier og fører også til en sammenlignelig aflæsning af SC-MIC-resultater med MIC'erne ved den konventionelle metode.

I SC-MIC-målingerne udarbejder vi parallelt 40 prøver, herunder 5 forskellige antibiotika, hver med 8 koncentrationer på samme tid. Men fordi der er mange manuelle betjeningsprocedurer, er den samlede analysetid for påvisning af AST for fem forskellige kombinationer af bakterier og antibiotika længere end 2,5 timer. I vores metode blev hvert SRS-billede, der indeholdt ~ 20 individuelle bakterieceller, opnået inden for ~ 1.0 s i et enkelt skud ved 30 μs pixelopholdstid. Vi estimerer, at den samlede AST-analysetid for at studere 10 antibiotika for en bakteriestamme ville være mindre end 2,5 timer fra prøve til SC-MIC-udlæsning, hvilket har en enorm mulighed for at udføre måling med høj gennemstrømning. I det fremtidige arbejde vil en automatiseret metode til prøveforberedelse og indsamling af billeddata blive anvendt for yderligere at forbedre gennemstrømningen. Fejlfindingsoplysningerne findes i tabel 1.

I konventionelle dyrkningsbaserede AST-metoder er det nødvendigt at præinkubere kliniske prøver i timevis for at opnå bakterieisolater til yderligere målinger. Avancerede AST-metoder til klinisk UTI-prøve, såsom Raman-spektroskopi29, nanoliter array6 og digital nukleinsyrekvantificering18, er udviklet for at slippe af med langvarig præinkubation. Sammenlignet med UTI-infektion er BSI eller sepsis meget mere livstruende18,45, hvor hurtig AST er presserende nødvendig for præcis diagnostik i klinikken. En mikroskopisk billeddannelsesmetode til måling af bakteriel kolonidannelse fra positive blodkulturer er blevet rapporteret at give MIC-resultater46. Det tager dog mindst 6 timer at dyrke bakterier for at udføre AST-analysen. Desuden kan kommercielle automatiske systemer47 og massespektrometri48,49 strategier give AST-aflæsning fra positive blodkulturer. MIC-resultaterne for den kliniske beslutning kan dog ikke fremlægges. AST-resultaterne og MIC-udlæsningen er signifikante for at undgå overskydende dosering af antibiotika til patienter for at forårsage potentielle bivirkninger i klinikker, for at bremse og forhindre spredning af de antimikrobielle resistente infektioner50,51. Sammenlignet med de eksisterende spontane Raman-mikroskopibaserede AST-metoder reducerer vores teknologi enormt dataindsamlingstiden (ca. 600 gange mindre) på grund af signalforbedring i størrelsesordener. I dette arbejde demonstrerer vi hurtig AST ved SRS-billeddannelse af deuteriummetabolisme i enkeltbakterier ved en klinisk relevant bakteriekoncentration (105 ~ 106 CFU / ml) i enten urin eller fuldblodsmiljø. Som vist i tidligere resultater bestemmes MIC-resultaterne efter 1 timers antibiotikabehandling og 30 minutters blanding af D2O og antibiotikainkubation i bakterier i urin og blod. Vores metode kan give MIC'er og følsomhedsklassificering for hver kombination af stamme og antibiotika inden for 2,5 timer og åbner derfor en ny vej til klinisk oversættelse. For at opsummere, uden behov for prækulturation og bakterieopdeling, har vores metode et enormt potentiale inden for hurtig og høj gennemstrømning AST i infektionssygdomme.

Vores SC-MIC-metode ved SRS metabolisk billeddannelse kan anvendes til at detektere MIC'er og give følsomhedsklassificering for infektiøse patogener, når de beskæftiger sig med rigelige sorter af stamme-antibiotiske kombinationer til klinisk brug. SC-MIC bestemmes efter 30 minutters D2O-inkorporering i bakterier i urin og blod, hvilket betyder en enorm reduktion i diagnosetiden sammenlignet med den konventionelle bouillonfortyndingsmetode, der koster 16 til 24 timer for præinkubation. For at levere patogenidentifikationsoplysninger til klinisk beslutningstagning kan SRS metabolisk billeddannelsesteknologi integreres yderligere med diagnostiske platforme, der er i stand til hurtig patogenidentifikation, såsom matrixassisteret laserdesorptionsionisering-time-of-flight massespektrometri 49,52,53. Kombination af in situ-patogenidentifikation og hurtig AST-diagnose kan være et stort potentiale for oversættelse til klinik, der giver mulighed for rettidig identifikation af passende antimikrobielle midler til præcis behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH R01AI141439 til J.-X.C og MS og R35GM136223 til J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Biologi udgave 180
Hurtig antimikrobiel følsomhedstest ved stimuleret Raman-spredningsbilleddannelse af deuteriuminkorporering i en enkelt bakterie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter