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Biochemistry

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62415
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 1
1Astbury Centre Structural Molecular Biology, School Molecular and Cellular Biology, Faulty Biological Sciences, University of Leeds, 2Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

क्रायोईएम का उपयोग करके मैक्रोमोलेक्यूलर परिसरों की संरचना का निर्धारण प्रोटीन और परिसरों के कुछ वर्गों के लिए नियमित हो गया है। यहां, इस पाइपलाइन को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है (नमूना तैयारी, स्क्रीनिंग, डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण) और पाठकों को आगे के विस्तृत संसाधनों और चर की ओर निर्देशित किया जाता है जिन्हें अधिक चुनौतीपूर्ण नमूनों के मामले में बदला जा सकता है।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एकल कण विश्लेषण (एसपीए) के माध्यम से मैक्रोमोलेक्यूलर परिसरों की संरचना निर्धारण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। समग्र प्रक्रिया में शामिल है i) क्रायोईएम ग्रिड पर समर्थित एक पतली फिल्म में नमूने को विट्रीफाइंग करना; ii) कण वितरण और बर्फ की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए नमूने की स्क्रीनिंग; iii) यदि ग्रिड उपयुक्त है, तो विश्लेषण के लिए एक कण डेटासेट एकत्र करना; और iv) एक ईएम घनत्व मानचित्र उपज करने के लिए छवि प्रसंस्करण। इस प्रोटोकॉल में, इन चरणों में से प्रत्येक के लिए एक सिंहावलोकन प्रदान किया जाता है, जिसमें उन चरों पर ध्यान केंद्रित किया जाता है जिन्हें उपयोगकर्ता वर्कफ़्लो और सामान्य समस्याओं के समस्या निवारण के दौरान संशोधित कर सकता है। दूरस्थ माइक्रोस्कोप ऑपरेशन कई सुविधाओं में मानक बनने के साथ, कुशल संचालन में उपयोगकर्ताओं की सहायता करने के लिए इमेजिंग प्रोटोकॉल पर भिन्नताओं और माइक्रोस्कोप तक भौतिक पहुंच सीमित होने पर इमेजिंग का वर्णन किया जाएगा।

Introduction

एकल कण क्रायोईएम
एक आणविक स्तर पर जीवन की जांच करने के लिए हमें संरचना को समझना चाहिए। प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए कई तकनीकें उपलब्ध हैं, जैसे कि एनएमआर, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)। आज तक, प्रोटीन डेटाबैंक (पीडीबी) में जमा अधिकांश संरचनाओं को एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके हल किया गया है। हालांकि, ~ 2012 के बाद से, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए एक मुख्यधारा की तकनीक बन गई और इसका उपयोग नाटकीय रूप से बढ़ गया। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटाबैंक (ईएमडीबी) (दिसंबर 2020 तक) में जमा किए गए ईएम मानचित्रों की कुल संख्या 2012 में 1,566 की तुलना में 13,421 थी (चित्रा 1, www.ebi.co.uk)। 2012 में पीडीबी में जमा क्रायोईएम घनत्व मानचित्रों में मॉडलिंग किए गए परमाणु निर्देशांकों की संख्या केवल 67 थी, लेकिन दिसंबर 2020 तक, 2,309 संरचनाओं को अब तक जमा किया गया है, जो 35 गुना वृद्धि है। क्रायोईएम घनत्व मानचित्रों की गुणवत्ता और मात्रा में यह अंतर्निहित वृद्धि, जिसे कभी-कभी 'रिज़ॉल्यूशन क्रांति' 1 के रूप में जाना जाता है, कई क्षेत्रों में प्रगति के सम्मिलन के कारण हुआ था: इमेजिंग के लिए नए कैमरों का विकास जिसे प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों के रूप में जाना जाता है; नए सॉफ़्टवेयर; और अधिक स्थिर माइक्रोस्कोप2,3,4.

Figure 1
चित्र1: 2012 से दिसंबर 2020 तक EMDB के लिए संचयी सबमिशन। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

एकल कण विश्लेषण (एसपीए) वायरस 7,8, झिल्ली प्रोटीन 9,10, हेलिकल असेंबली11 और अन्य गतिशील और विषम मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स 12,13 सहित पृथक परिसर5,6 की उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को स्पष्ट करके नमूना प्रकारों की एक विस्तृत विविधता में जैविक अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जिसके आकार परिमाण के आदेशों से भिन्न होते हैं (39 केडीए से) 14,15 से दसियों मेगाडाल्टन)। यहां, क्रायोईएम एसपीए के लिए नमूना से संरचना तक एक मानक पाइपलाइन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

इस पाइपलाइन पर शुरू करने से पहले, एक शुद्ध नमूने को जैव रासायनिक विश्लेषण के अधीन किया जाना चाहिए ताकि डाउनस्ट्रीम सफलता की संभावनाओं का आकलन किया जा सके। एक उपयुक्त नमूने की तैयारी यकीनन एसपीए के लिए सबसे बड़ी बाधा है, विशेष रूप से क्षणिक और विषम (दोनों रचनात्मक और संरचनात्मक) परिसरों के लिए। मैक्रोमोलेक्यूलर जटिल तैयारी में जितना संभव हो उतना कम प्रदूषक होना चाहिए, प्रत्येक क्रायोईएम माइक्रोग्राफ में कई कणों को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त एकाग्रता पर, और क्रायोईएम विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बफर संरचना में। सुक्रोज, ग्लिसरॉल और उच्च (~ > नमक के 350 mM सांद्रता सहित कुछ बफर घटक, नमूना आकार, गुणों और अन्य बफर घटकों के आधार पर) vitrification की प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं या छवियों में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम कर सकते हैं, संरचना निर्धारण में बाधा डाल सकते हैं16।

आमतौर पर, एक न्यूनतम, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) और एसडीएस के रूप में- पेज जेल विश्लेषण का उपयोग नमूना शुद्धता 17,18 का आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन परिपत्र डाइक्रोइज़म, कार्यात्मक assays, एसईसी बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन के साथ युग्मित, और थर्मल स्थिरता assays क्रायोईएम विश्लेषण से पहले मैक्रोमोलेक्यूलर जटिल तैयारी के गुणात्मक विश्लेषण के लिए सभी उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, इन जैव रासायनिक विश्लेषणों के परिणाम नमूने की संरचनात्मक विषमता और क्रायोईएम ग्रिड पर इसके व्यवहार में बहुत कम अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं। इस कारण से, नकारात्मक दाग ईएम का उपयोग नियमित रूप से रचनात्मक और संरचनात्मक विषमता का आकलन करने के लिए एक त्वरित, सस्ते और शक्तिशाली उपकरण के रूप में किया जाता है, और इसलिए यह पता लगाने का एक अच्छा तरीका है कि शुद्धिकरण से कौन सा क्षालन अंश सबसे अधिक आशाजनक है, या विभिन्न बफर रचनाओं की स्क्रीनिंग 19,20। एक बार एक होनहार नमूने की पहचान की गई है, हम एसपीए क्रायोईएम पाइपलाइन के लिए आगे बढ़ सकते हैं। नकारात्मक दाग हमेशा क्रायोईएम में देखे गए बाद के परिणामों के साथ संरेखित नहीं होता है; कभी-कभी एक नमूना नकारात्मक दाग से गरीब दिखता है, लेकिन जब क्रायोईएम में विट्रियस बर्फ में देखा जाता है तो सुधार होता है। इसके विपरीत, कभी-कभी नमूने नकारात्मक दाग चरणों के दौरान उत्कृष्ट दिखते हैं, लेकिन क्रायोईएम में प्रगति करते समय महत्वपूर्ण आगे के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हालांकि, अधिकांश मामलों में नकारात्मक दाग एक उपयोगी गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदान करता है।

काचन
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के वैक्यूम सिस्टम के भीतर कठोर वातावरण निर्जलीकरण और विकिरण क्षति दोनों का कारण बनता है अनिर्धारित जैविक नमूनों 21। इसलिए, एक देशी जैसी स्थिति में नमूने की छवि बनाने के लिए, जैविक नमूने को इमेजिंग से पहले संरक्षित किया जाना चाहिए। मैक्रोमोलेक्यूलर परिसरों की शुद्ध तैयारी के लिए, विट्रीफिकेशन परिसर के परमाणु विवरणों को संरक्षित करते हुए क्रायोईएम द्वारा अपने विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए पसंद की विधि है। नमूना तैयार करने की एक विधि के रूप में विट्रीफिकेशन की खोज जैविक नमूनों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में एक मौलिक प्रगति थी, जिसके लिए डुबोचेट को रसायन विज्ञान में 2017 के नोबेल पुरस्कार में मान्यता दी गई थी। नमूना विट्रीफिकेशन में ब्याज के नमूने वाले समाधान की एक पतली परत बनाना शामिल है, आमतौर पर दसियों एनएम मोटी, एक क्रायोईएम ग्रिड समर्थन पर निलंबित। पतली फिल्म तब एक क्रायोजेन में बहुत तेजी से जमे हुए होती है जैसे कि तरल इथेन ~ -175 डिग्री सेल्सियस पर। ठंड की दर ~ 106 डिग्री सेल्सियस / एस है, जो काफी तेजी से है कि अनाकार, या विट्रियस बर्फ रूपों, एक पतली, ठोस फिल्म 22 में नमूने को निलंबित कर देता है।

विचार करने के लिए प्रारंभिक चर cryoEM ग्रिड समर्थन चुना 23 है। एक ईएम ग्रिड में आमतौर पर एक समर्थन संरचना पर छिद्रों (या तो नियमित या अनियमित) के साथ एक अनाकार कार्बन फिल्म होती है। समर्थन संरचना आमतौर पर व्यास में 3.05 मिमी एक परिपत्र धातु ग्रिड है, जो आमतौर पर तांबे से बनाई जाती है, लेकिन अन्य धातुओं जैसे कि सोना, या मोलिब्डेनम (जिसमें थर्मल विस्तार गुण पसंद किए गए हैं24) का उपयोग किया जा सकता है। कभी-कभी, एक अतिरिक्त पतली, निरंतर समर्थन ग्रिड में लागू किया जाता है, जैसे कि ग्राफीन, ग्राफीन ऑक्साइड या एक पतली (~ 1-2 एनएम) अनाकार कार्बन परत। जबकि मानक क्रायोईएम ग्रिड (आमतौर पर 400-200 जाल तांबा एक छिद्रित के साथ (1.2 μm गोल छेद 1.3 μm (r1.2/1.3) से अलग हो जाते हैं), या 2 μm को कार्बन समर्थन के 2 μm (r2/2)) द्वारा अलग किया जाता है) कार्बन समर्थन- हालांकि कई अलग-अलग पैटर्न उपलब्ध हैं) का उपयोग आज तक रिपोर्ट की गई संरचनाओं के विशाल बहुमत में किया गया है, बेहतर चालकता और कम नमूना आंदोलन के साथ उपन्यास ग्रिड प्रौद्योगिकियों की सूचना दी गई है25 . चयनित ग्रिड एक चमक-निर्वहन / प्लाज्मा सफाई उपचार के अधीन हैं ताकि उन्हें हाइड्रोफिलिक और नमूना अनुप्रयोग 26 के लिए उपयुक्त प्रदान किया जा सके।

चमक-निर्वहन के बाद, अगला चरण पतली फिल्म गठन है। यह पतली फिल्म आमतौर पर ग्रिड से अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करके बनाई जाती है। हालांकि इसे मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, कई डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जिनमें विट्रोबॉट एमके IV (थर्मो फिशर साइंटिफिक), ईएम जीपी II (Leica) और CP3 (Gatan) शामिल हैं। इन उपकरणों के साथ, समाधान में नमूने के ~ 3-5 μL को ईएम ग्रिड पर लागू किया जाता है, इसके बाद फ़िल्टर पेपर का उपयोग करके अतिरिक्त समाधान को ब्लोटिंग किया जाता है। ग्रिड, एक पतली फिल्म के साथ इसके पार निलंबित है, फिर तरल नाइट्रोजन (LN2) से ~ -175 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा तरल एथेन में डूब जाता है। एक बार जमे हुए होने के बाद, ग्रिड को इमेजिंग से पहले और इमेजिंग के दौरान डेविट्रिफिकेशन बिंदु (-137 डिग्री सेल्सियस) से नीचे के तापमान पर बनाए रखा जाता है।

नमूना स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह
क्रायोईएम ग्रिड के विट्रिफिकेशन के बाद, अगला चरण ग्रिड को इसकी गुणवत्ता का आकलन करने के लिए स्क्रीन करना है और यह निर्धारित करना है कि ग्रिड उच्च रिज़ॉल्यूशन डेटा संग्रह के लिए आगे बढ़ने के लिए उपयुक्त है या नहीं। एक आदर्श क्रायोईएम ग्रिड में विट्रियस बर्फ (क्रिस्टलीय बर्फ के विपरीत) होती है, जिसमें बर्फ की मोटाई नमूने के सबसे लंबे आयाम को समायोजित करने के लिए पर्याप्त होती है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि आसपास की बर्फ परिणामस्वरूप छवि में जितना संभव हो उतना कम शोर योगदान देती है। बर्फ के भीतर कणों का एक आकार होना चाहिए और (यदि ज्ञात हो) जैव रसायन के अनुरूप आकार होना चाहिए, और आदर्श रूप से कण अभिविन्यास के यादृच्छिक वितरण के साथ मोनोडिस्पर्स होना चाहिए। अंत में, ग्रिड में वांछित डेटा संग्रह लंबाई को संतुष्ट करने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के पर्याप्त क्षेत्र होने चाहिए। नमूने के आधार पर, यह विट्रीफिकेशन और स्क्रीनिंग के कई पुनरावृत्तियों को ले सकता है जब तक कि इष्टतम ग्रिड का उत्पादन नहीं किया जाता है। सौभाग्य से और दुर्भाग्य से दोनों, चर की एक बड़ी श्रृंखला है जिसे क्रायोईएम ग्रिड पर कण वितरण को बदलने के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया जा सकता है (16,27 में समीक्षा की गई)। इस पांडुलिपि में, एक झिल्ली प्रोटीन project10 के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं।

एक बार एक उपयुक्त ग्रिड की पहचान हो जाने के बाद, डेटा संग्रह आगे बढ़ सकता है। जैविक नमूनों के लिए क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कई मॉडलों को स्वचालित फैशन में उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा एकत्र करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। आमतौर पर, डेटा 300 kV या 200 kV सिस्टम पर एकत्र किया जाता है। स्वचालित डेटा संग्रह EPU (थर्मो फिशर साइंटिफिक) 28, Leginon29, JADAS30 और SerialEM31,32 सहित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। आधुनिक डिटेक्टरों के साथ एक स्वचालित डेटा संग्रह आमतौर पर 24 घंटे की अवधि में कच्चे डेटा के टेराबाइट्स (टीबी) में परिणाम देता है (औसत डेटासेट आकार में ~ 4 टीबी होते हैं)।

दुनिया के अधिकांश हिस्सों (दिसंबर 2020 को लिखने का समय) पर लागू कोविड -19 प्रतिबंधों के कारण, कई माइक्रोस्कोपी सुविधाएं दूरस्थ पहुंच की पेशकश करने के लिए चली गई हैं। एक बार जब ग्रिड को माइक्रोस्कोप के ऑटोलोडर में लोड किया जाता है, तो डेटा अधिग्रहण को दूरस्थ रूप से आयोजित किया जा सकता है।

छवि प्रसंस्करण और मॉडल निर्माण
जहां एक डेटा संग्रह सत्र आमतौर पर 0.5-4 दिन हो सकता है, बाद की छवि प्रसंस्करण में कंप्यूटिंग संसाधनों की उपलब्धता के आधार पर कई सप्ताह और महीने लग सकते हैं। यह प्रारंभिक छवि प्रसंस्करण चरणों के लिए मानक है, अर्थात् गति सुधार और कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमान 'फ्लाई पर' 33,34। डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग के लिए, उपलब्ध सॉफ़्टवेयर सुइट्स की अधिकता है। कणों को 'उठाया' जाता है और माइक्रोग्राफ 35,36 से निकाला जाता है। एक बार कणों को निकाले जाने के बाद, एक मानक प्रोटोकॉल कणों के एक सजातीय सबसेट तक पहुंचने के लिए वर्गीकरण के कई दौरों (दोनों दो आयामों (2 डी) और तीन आयामों (3 डी) और / या ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों पर केंद्रित) के माध्यम से कणों को संसाधित करना होगा। कणों के इस सजातीय सबसेट को तब 3 डी पुनर्निर्माण का उत्पादन करने के लिए एक साथ औसत किया जाता है। इस बिंदु पर डेटा को अक्सर उच्चतम गुणवत्ता वाले मानचित्र का उत्पादन करने के लिए आगे सही किया जाता है, उदाहरण के लिए सीटीएफ शोधन, विरूपण सुधार 37 और बायेसियन पॉलिशिंग 38 के माध्यम से। इस छवि प्रसंस्करण का परिणाम ब्याज के जैविक नमूने का एक 3 डी क्रायोईएम मानचित्र है। रिज़ॉल्यूशन रेंज पर्याप्त गुणवत्ता के ग्रिड से एक 'मानक' स्वचालित एकल कण प्रयोग में पहुंच गई, जिसमें 300 केवी माइक्रोस्कोप सिस्टम पर एकत्र किए गए डेटा आमतौर पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के आकार और लचीलेपन के आधार पर 10 Å और 2 Å के बीच होते हैं। एक आदर्श नमूने के साथ, ~ 1.2 Å के संकल्प अब SPA workflows5 का उपयोग कर तक पहुंच गए हैं। जबकि यह प्रोटोकॉल एक ईएम घनत्व मानचित्र प्राप्त करने की दिशा में कदम उठाता है, एक बार जब यह हाथ में होता है तो इसे प्रोटीन मॉडल को फिट करने और परिष्कृत करने के माध्यम से आगे की व्याख्या की जा सकती है (यदि रिज़ॉल्यूशन 3.5 Å < है) या बिल्डिंग डे नोवो 39। संरचना निर्धारण प्रयोगों से जुड़े डेटा को ऑनलाइन सार्वजनिक भंडारों में जमा किया जा सकता है, जिसमें ईएम घनत्व मानचित्र (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा बैंक) 40, जिसके परिणामस्वरूप परमाणु निर्देशांक (प्रोटीन डेटा बैंक) 41 और कच्चे डेटासेट (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पब्लिक इमेज आर्काइव) 42 शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल में, Porphyromonas gingivalis से बाहरी-झिल्ली प्रोटीन जटिल RagAB (~ 340 kDa) का उपयोग एक उदाहरण मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स 10 (EMPIAR-10543) के रूप में किया जाता है। क्रायोईएम के लिए नए लोगों के लिए, नमूने से संरचना तक इस पाइपलाइन के माध्यम से नमूनों के लिए समर्थन उपलब्ध है, पीयर समीक्षा के अधीन, आईनेक्स्ट डिस्कवरी और इंस्ट्रक्ट जैसी वित्त पोषित पहुंच योजनाओं के माध्यम से।

Protocol

1. ग्रिड Vitrification

नोट: चरण 1 और 2 में सभी चरणों के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण साफ, सूखे और कमरे के तापमान पर उन्हें LN2 तापमान पर ठंडा करने से पहले, बर्फ संदूषण को कम करने के लिए ताजा decanted LN2 का उपयोग करके। जहां संभव हो, < 20% सापेक्ष आर्द्रता के साथ आर्द्रता-नियंत्रित वातावरण के भीतर काम करें। सुनिश्चित करें कि काम शुरू करने से पहले उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और एच एंड एस प्रलेखन जगह में है।

  1. सुनिश्चित करें कि ब्याज का नमूना नमूना तैयार करने के लिए तैयार है।
  2. उपयुक्त क्रायोईएम ग्रिड चुनें और सुनिश्चित करें कि इन्हें चमक निर्वहन या प्लाज्मा उपचार का उपयोग करके हाइड्रोफिलिक प्रदान किया गया है। प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न प्रकार की प्रणालियां और विविधताएं उपलब्ध हैं, लेकिन सभी में ग्रिड को एक चमक निर्वहन / प्लाज्मा सफाई प्रणाली में रखना और एक कार्यक्रम चलाना शामिल है जो सिस्टम में एक विशिष्ट गैस मिश्रण / रासायनिक वाष्प या हवा पेश करने से पहले चैंबर को वांछित वैक्यूम स्तर पर पंप करेगा। सिस्टम के माध्यम से एक विद्युत प्रवाह पारित किया जाता है, गैस कणों को आयनित करता है और ग्रिड की सतह को अधिक हाइड्रोफिलिक प्रदान करने के लिए प्रेरित करता है।
  3. पीछे की ओर पावर स्विच का उपयोग करके सिस्टम को चालू करके ग्रिड विट्रिफिकेशन के लिए डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस शुरू करें, और टच स्क्रीन को लोड करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  4. प्रदान किए गए स्टाइलस या उंगलियों का उपयोग करते हुए, कंसोल में, कक्ष के वांछित कार्य तापमान को सेट करें (उपलब्ध सीमा 4-60 डिग्री सेल्सियस है, जो अधिकांश मैक्रोमोलेक्यूल्स 4-6 डिग्री सेल्सियस के लिए अनुशंसित है)।
  5. ह्यूमिडिफायर के नीचे रबर टयूबिंग के माध्यम से एक सिरिंज का उपयोग करके टाइप II लैब पानी के 50 मिलीलीटर के साथ ह्यूमिडिफायर को भरें। भरने से पहले सिरिंज में किसी भी फंसी हुई हवा को हटाना सुनिश्चित करें। सावधान रहें कि ह्यूमिडिफायर को ओवरफिल न करें या पानी कक्ष में बह जाएगा। एक बार humidifier भर जाता है, एक वैक्यूम सील बनाने के लिए 5-10 मिलीलीटर द्वारा सिरिंज प्लंजर वापस ड्रा।
  6. कंसोल में, कक्ष के लिए वांछित सापेक्ष आर्द्रता सेट करें (उपलब्ध सीमा 0-100% है, 95-100% की आर्द्रता आमतौर पर उपयोग की जाती है)। ग्रिड बनाने से ठीक पहले तक आर्द्रता को 'बंद' करने के लिए सेट छोड़ दें ताकि कक्ष बहुत गीला न हो।
  7. डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस चिमटी प्राप्त करें और पैड पर फिट होने के लिए सही आकार में कटौती करने के लिए फ़िल्टर पेपर प्राप्त करें, या तो खरीदा गया या उचित आकार के एपर्चर को काटने के लिए एक टिकट का उपयोग करें।
  8. डुबकी ठंड के लिए क्रायोजेन तैयार करें।
    1. धातु क्रायो-ग्रिड बॉक्स धारक, क्रायोजेन कप और धातु मकड़ी के पैरों को शीतलक कंटेनर में रखें।
    2. LN2 के साथ बाहरी कक्ष को भरकर कंटेनर को ठंडा करें। क्रायो-ग्रिड बॉक्स धारक के शीर्ष को कवर करने के लिए बाहरी कक्ष को सबसे ऊपर रखें। LN2 तापमान के लिए सिस्टम के संतुलन की सहायता करने के लिए क्रायोजेन कप के लिए अतिरिक्त LN2 के ~ 1 सेमी जोड़ें।
      नोट: विरोधी संदूषण अंगूठी क्रायोजेन कप के चारों ओर आर्द्र हवा संघनन को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और क्रायो-शीतलक / एथेन संदूषण के लिए अग्रणी है। यह आमतौर पर आर्द्रता-नियंत्रित वातावरण में आवश्यक नहीं है। यदि एंटी-संदूषण रिंग का उपयोग कर रहे हैं, तो सावधान रहें कि कंटेनर को एलएन 2 के साथ ओवरफिल न करें या जब रिंग को बाद में इस प्रक्रिया में कंटेनर में दबाया जाता है तो यह फैल सकता है।
    3. मकड़ी के पैरों के उबलने का निरीक्षण करने के लिए 3-5 मिनट प्रतीक्षा करें, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए एक और 3 मिनट प्रतीक्षा करें कि क्रायोजेन कप विट्रीफिकेशन माध्यम को संघनित करने के लिए पर्याप्त रूप से ठंडा है।
  9. क्रायोजेन कप में क्रायोजेन (तरल इथेन) को तरल रूप से लेकफाई करें।
    1. पतली टयूबिंग और गैस वितरित करने के लिए एक नोजल के साथ इथेन सिलेंडर पाइप ले लो। एपर्चर के साथ एक P200 पिपेट टिप एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके बहुत टिप को काटकर खोला गया है, यहां आदर्श है। टिप पर इथेन को जमने से रोकने और गैस के प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए एक व्यापक एपर्चर की आवश्यकता होती है।
    2. यह सुनिश्चित करना कि क्रायोजेन कप में कोई शेष एलएन 2 नहीं है, एथेन गैस नोजल लें और इसे क्रायोजेन कप के भीतर रखें। गैस सिलेंडर नियामक का उपयोग करते हुए, एक कम प्रवाह शुरू करें और गैस को संघनित करने के लिए क्रायोजेन कप में क्रायोजेन गैस वितरित करें। उस टिप को रखें जहां से गैस सीधे क्रायोजेन कप की दीवार के खिलाफ दबाया जाता है, लेकिन इसे सतह के खिलाफ एक टैपिंग गति में धीरे से आगे और पीछे ले जाएं। क्रायोजेन कप के भीतर एक नियंत्रित फैशन में संघनित / तरल पदार्थ शुरू करने के लिए एक कम, स्थिर प्रवाह की अनुमति देने के लिए गैस के प्रवाह को विनियमित करें।
    3. चांदी मकड़ी रिम के ठीक नीचे कप भरें और गैस प्रवाह को रोकें, फिर ईथेन के साथ आसपास के एलएन 2 को दूषित करने से बचने के लिए सावधानीपूर्वक गैस लाइन को हटा दें।
    4. एलएन 2 के साथ शीतलक कंटेनर को ऊपर उठाएं, बहुत सावधान रहें कि तरल इथेन में कोई भी न फैलें।
    5. मकड़ियों के पैरों को ~ 3-5 मिनट के लिए स्थिति में छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि तरल इथेन को पर्याप्त रूप से ठंडे तापमान पर संतुलित किया गया है। क्रायोजेन बादल / थोड़ा अपारदर्शी दिखना शुरू हो जाएगा। यह इंगित करता है कि यह अपने हिमांक बिंदु के करीब है। इस स्तर पर, मकड़ी को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें। जब तक एलएन 2 को क्रायोजेन कप के आसपास के कंटेनर के भीतर रखा जाता है, तब तक एथेन अब तरलीकृत रहेगा और 1-2 एच के लिए विट्रीफिकेशन के लिए उपयुक्त होगा। हालांकि, बर्फ संदूषण को कम करने के लिए प्रक्रिया को जितनी जल्दी हो सके पूरा करने का लक्ष्य रखें, विशेष रूप से गैर-आर्द्रता-नियंत्रित कमरों में।
      नोट: यदि मकड़ी 'पर फंस गई' प्रतीत होती है, तो अखरोट जैसी धातु की वस्तु का उपयोग करें और उन्हें थोड़ा गर्म करने के लिए मकड़ी के पैरों के खिलाफ पकड़ें, और फिर पैरों को हटा दें।
  10. नमूना vitrification के लिए डुबकी ठंड डिवाइस और सामान तैयार करें।
  11. धातु क्रायो-ग्रिड बॉक्स धारक के लिए ग्रिड भंडारण बक्से जोड़ें और प्रक्रिया के दौरान यह सुनिश्चित करें कि LN2 को ग्रिड बक्से (आमतौर पर हर ~ 5 मिनट) के स्तर से ऊपर रखा जाता है।
  12. डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस स्क्रीन पर, प्रोसेस पैरामीटर बॉक्स में चुने गए पैरामीटर शामिल हैं: धब्बा समय (समय डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस पैड एक साथ आएंगे), बल (ग्रिड से ब्लोटिंग पैड की दूरी, जो बर्फ के गठन के ढाल को बदल देती है) और कुल (ब्लोटिंग पैड को पूरा करने के लिए आने वाले समय की संख्या)। व्यक्तिगत डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस और मैक्रोमोलेक्यूल के व्यवहार के आधार पर इन मापदंडों का चयन करें। विशिष्ट मान 0 और 5 के बीच एक धब्बा बल हैं, 1-6 s से धब्बा समय और 1 का एक धब्बा कुल। विशिष्ट प्रतीक्षा समय (धब्बा शुरू करने के बीच का समय, और धब्बा शुरुआत) और नाली का समय (डुबकी लगाने से पहले ब्लोटिंग के बाद का समय) 0-2 सेकंड है।
    नोट: उपयोगकर्ता वरीयताओं के आधार पर, विकल्प में अतिरिक्त विकल्प, विविध अनुभाग का चयन किया जा सकता है, जिसमें प्रत्येक प्रेस पर अगले चरण में जाने के लिए फुट पेडल का उपयोग करें , ग्रिड स्थानांतरण छोड़ें (अंतिम चरण को छोड़ देता है जहां चिमटी हाथ थोड़ा उठाया जाता है), प्रक्रिया के दौरान आर्द्रता को बंद कर दें (जबकि नमूना लागू किया जा रहा है, कक्ष के सक्रिय आर्द्रता को रोकता है जो ग्रिड को देखना कठिन बना सकता है) और ऑटोरेज़ एथेनलिफ्ट (चिमटी के चरण को कक्ष में उठाया जा रहा है और शीतलक कंटेनर को बढ़ाता है- एथेन कंटेनर चरण को बढ़ाता है)। यहाँ, इन सभी विकल्पों को चालू किया गया है।
  13. कूलेंट कंटेनर को कक्ष के नीचे चलती प्लेटफ़ॉर्म बांह पर सुरक्षित रूप से रखें
  14. प्रत्येक ब्लॉटर हाथ पर ताजा ब्लोटिंग पेपर डालें जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि प्लास्टिक रिंग क्लिप सुरक्षित हैं। प्रत्येक फिल्टर पेपर 16 धब्बों की अनुमति देगा (हथियार ब्लोटिंग पेपर को घुमाते हैं)। नियंत्रण अनुभाग में धब्बा काग़ज़ रीसेट करें बटन दबाएँ .
  15. यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक चलती भाग अपेक्षित व्यवहार कर रहा है, डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस विट्रीफिकेशन प्रक्रिया का 1 पूर्ण चक्र चलाएं।
    1. नया ग्रिड रखने के लिए (या पैर पैडल का उपयोग करें) दबाएँ, फिर प्रक्रिया प्रारंभ करें, फिर प्रक्रिया फिर जारी रखें. इस स्तर पर, यह सुनिश्चित करने के लिए देखें कि ब्लोटिंग हथियार उम्मीद के अनुसार एक-दूसरे से संपर्क कर रहे हैं।
  16. ह्यूमिडिफायर को 'चालू' करें। जल वाष्प का उत्पादन किया जाएगा (जब तक कि सेट आर्द्रता कक्ष में वर्तमान की तुलना में अधिक है)।
  17. ब्याज का नमूना अब vitrified किया जा सकता है। पैर पेडल या प्लेस न्यू ग्रिड का उपयोग करें और प्लंजिंग रॉड चेंबर से बाहर उतर जाएगी जिससे चिमटी को माउंट में संलग्न किया जा सकता है।
    1. डुबकी ठंड डिवाइस चिमटी का उपयोग करते हुए, वांछित चमक डिस्चार्ज / प्लाज्मा साफ क्रायोईएम ग्रिड उठाएं, यह ध्यान रखने के लिए ध्यान रखें कि ग्रिड निर्माता के अनुसार नमूना आवेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले सही पक्ष कौन से पक्ष हैं। रिम द्वारा ग्रिड उठाओ, चिमटी के साथ अत्यधिक / अनावश्यक संपर्क से बचने के लिए ध्यान रखें क्योंकि यह समर्थन को नुकसान पहुंचाएगा। चिमटी के ridged भाग के लिए नीचे काले क्लिप ले जाने से चिमटी में ग्रिड सुरक्षित. ग्रिड को सुरक्षित रूप से आयोजित करने की आवश्यकता है, लेकिन क्लिप को बहुत दूर नहीं होना चाहिए क्योंकि यह ब्लोटिंग पैड से संपर्क करेगा, जिससे अपरिवर्तनीय ब्लोटिंग हो जाएगी और बाद में, क्लिप जारी करते समय चिमटी को इस बिंदु के नीचे आयोजित करने की आवश्यकता होगी।
    2. अपने प्रमुख हाथ का सामना करने वाले सही पक्ष के साथ वायवीय बांह पर क्रायोईएम ग्रिड को पकड़े हुए डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस चिमटी रखें। डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस चिमटी और कक्ष का डिजाइन ऐसा है कि नमूना या तो कक्ष के दाएं या बाएं हाथ की ओर के माध्यम से लागू किया जा सकता है, उपयोगकर्ता की हस्तरेखा के अनुसार।
      नोट: एक ही ब्लोटिंग पैरामीटर के साथ विभिन्न पक्षों पर नमूना लागू करने से शायद ही कभी तुलनीय परिणाम होते हैं, इसलिए बाएं हाथ के शोधकर्ताओं को अपने दाहिने हाथ के सहयोगियों से स्वतंत्र रूप से अपने ब्लोटिंग पैरामीटर को ट्यून करने की आवश्यकता हो सकती है।
    3. प्रेस प्रारंभ प्रक्रिया और चिमटी में आयोजित ग्रिड कक्ष में ले जाया जाएगा और शीतलक कंटेनर उठाया जाएगा.
    4. प्रेस प्रक्रिया और चिमटी ग्रिड को उस स्थिति में ले जाएगी जहां ग्रिड पर नमूने को लागू करने के लिए एक पिपेट का उपयोग किया जा सकता है। ग्रिड के सही पक्ष का सामना करने वाले साइड पोर्ट को खोलें और पिपेटिंग द्वारा नमूना लागू करें, यह सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप ग्रिड को स्पर्श नहीं करता है क्योंकि यह ग्रिड समर्थन / ग्रिड को झुकने के नुकसान का कारण बन सकता है, लेकिन तरल को पर्याप्त रूप से बंद कर देता है ताकि ड्रॉपलेट ग्रिड पर वितरित हो सके। आमतौर पर, 3-5 μL लागू किया जाता है।
  18. प्रेस जारी रखें और उपयोगकर्ता पूर्वनिर्धारित पैरामीटर ग्रिड को धब्बा और फिर नमूना vitrification के लिए शीतलक कप में घुड़सवार ग्रिड के साथ चिमटी डुबकी होगा. चिमटी शीतलक कंटेनर और शीतलक को पकड़ने वाले हाथ के साथ संयोजन के रूप में उतरेंगे, जिससे ग्रिड क्रायोजेन में डूब जाएगा।
  19. क्रायोजेन कप से ग्रिड को LN2 में जलमग्न ग्रिड संग्रहण बॉक्स में स्थानांतरित करें.
    1. चिमटी हाथ से चिमटी अलग, बहुत ध्यान रखने के लिए क्रायोजेन कप के पक्षों के साथ vitrified ग्रिड से संपर्क नहीं कर रही है. पकड़ को समायोजित करें ताकि चिमटी आराम से आयोजित की जा सके। जितनी जल्दी हो सके और सावधानी से, ग्रिड को क्रायोजेन से एलएन 2 में ले जाएं। एक हाथ से, अपनी उंगलियों का उपयोग करके चिमटी को बंद कर दें और दूसरे हाथ से, काले क्लिप को रास्ते से ऊपर की ओर स्लाइड करें, चिमटी को बंद कर दें। पकड़ को समायोजित करें और ग्रिड भंडारण बॉक्स में ग्रिड में हेरफेर करें।
    2. चरण 1.10-1.19 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी ग्रिड नहीं बनाए जाते हैं (एक विशिष्ट सत्र में 4-12 ग्रिड बनाना शामिल होगा)। अगले चरणों तक LN2 देवर में ग्रिड युक्त सभी ग्रिड संग्रहण बक्से संग्रहीत करें।

2. एक ऑटोलोडर माइक्रोस्कोप में लोड करने के लिए क्लिपिंग ग्रिड

  1. पहले वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार ऑटोग्रिड असेंबली में क्लिप ग्रिड 28.

3. सुरक्षित दूरस्थ लॉग इन करने के लिए माइक्रोस्कोप

नोट: लेखन के समय कोविड -19 नियंत्रण के साथ, लेकिन अंतरराष्ट्रीय यात्रा से जुड़ी पर्यावरणीय चिंताओं के साथ, अधिक माइक्रोस्कोपी सुविधाएं उन सेवाओं की पेशकश कर रही हैं जहां उपयोगकर्ता दूरस्थ रूप से संचालित होता है। इसके लिए कार्यान्वयन की विधि प्रत्येक सुविधा के स्थानीय आईटी कॉन्फ़िगरेशन, और इसके आंतरिक और बाहरी उपयोगकर्ता समुदाय की जरूरतों के अनुसार भिन्न होगी। यहां ईबीआईसी पर क्रायोईएम तक दूरस्थ रूप से पहुंचने और ईपीयू सॉफ्टवेयर के माध्यम से माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है।

  1. क्रायोईएम के लिए दूरस्थ रूप से लॉग इन करें। दूरस्थ लॉगऑन माइक्रोस्कोप समर्थन पीसी का उपयोग करने के लिए NoMachine सॉफ़्टवेयर के माध्यम से मध्यस्थता की है और केवल उपयोगकर्ताओं को जो उपयोगकर्ताओं FedID लॉगऑन क्रेडेंशियल्स के माध्यम से एक यात्रा पर पंजीकृत कर रहे हैं के लिए उपयोग की अनुमति देने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है। पहुँच केवल सत्र की अवधि के लिए सक्रिय रहता है।
  2. NoMachine खोलें और पासवर्ड प्रमाणीकरण के साथ nx-cloud.diamond.ac.uk करने के लिए एक नया NX कनेक्शन प्रारंभ करें।
  3. कनेक्शन खोलें और उपयोगकर्ता नाम fedid@fed.cclrc.ac.uk और FedID पासवर्ड के साथ लॉग इन करें। प्रासंगिक समर्थन PC के लिए कनेक्शन खोलने के लिए उपलब्ध विकल्पों से प्रासंगिक माइक्रोस्कोप के अनुरूप आइकन डबल-क्लिक करें।
  4. Windows लॉगऑन स्क्रीन पर उपयोगकर्ता नाम clrc\FedID और पासवर्ड दर्ज करें.
  5. डेस्कटॉप आइकन से TeamViewer सॉफ़्टवेयर खोलें और प्रदान किए गए पासवर्ड के साथ PartnerID: TEM से कनेक्ट करें। यह समर्थन PC से TEM PC के लिए कनेक्शन स्थापित करता है। TeamViewer रिबन में अगला मॉनिटर बटन माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस और EPU विंडो के बीच टॉगल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. माइक्रोस्कोप कार्यों को तब ईपीयू इंटरफ़ेस के माध्यम से सीधे उपयोगकर्ताओं द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।

4. एक autoloader माइक्रोस्कोप में नमूने लोड हो रहा है और बर्फ और नमूना गुणवत्ता के लिए स्क्रीनिंग

नोट: इस अनुभाग में एक autoloader और EPU सॉफ़्टवेयर के साथ एक माइक्रोस्कोप नमूना स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन यह अन्य सॉफ़्टवेयर और एक साइड एंट्री सिस्टम और अन्य निर्माताओं से क्रायोईएम का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

  1. पहले से वर्णित के रूप में माइक्रोस्कोप autoloader में clipped ग्रिड लोड28.
  2. माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के ऑटोलोडर टैब में, तीर का उपयोग करके विकल्प संवाद को टैब करें और इन्वेंट्री बटन दबाएं । यह अनुक्रमिक रूप से कैसेट में प्रत्येक स्थिति की जांच करेगा ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कारतूस मौजूद है या नहीं। कब्जे वाले स्लॉट को नीले रंग में लेबल किया जाएगा। यदि सभी कब्जे वाले स्लॉट मैप किए गए हैं, तो वर्तमान स्थिति के बाद रोकने के लिए माल बटन को फिर से दबाएं, अन्यथा तब तक चलने दें जब तक कि सभी कब्जे वाले स्लॉट मैप नहीं किए जाते हैं। प्रदान किए गए बक्से में नमूना विवरण के साथ सभी कब्जे वाले स्लॉट लेबल करें।
  3. माइक्रोस्कोप स्तंभ में स्थानांतरित किए जाने वाले ग्रिड को हाइलाइट करें और लोड करें क्लिक करें. एक बार ग्रिड को मंच पर सफलतापूर्वक लोड किए जाने के बाद स्लॉट लेबल नीले से पीले रंग में बदल जाएगा। ग्रिड को स्क्रीन करने के लिए आगे बढ़ें।
    1. EPU सॉफ़्टवेयर खोलें. तैयारी पृष्ठ पर, अधिग्रहण प्रकाशिकी और सेटिंग्स का चयन करें फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से एटलस प्रीसेट का चयन करें। उपयुक्त बीम सेटिंग प्रीसेट चुनें (उदाहरण के लिए, 64x नाममात्र मैग, स्पॉट आकार 5, माइक्रोप्रोब, फाल्कन डिटेक्टर के लिए समानांतर रेंज में एक प्रबुद्ध क्षेत्र के साथ- बीम सेटिंग प्रीसेट see28 चुनने के लिए आगे की जानकारी के लिए)। माइक्रोस्कोप के लिए पैरामीटर को धक्का देने के लिए सेट दबाएँ ।
    2. दबाएँ खोलें स्तंभ वाल्व और FluScreen सम्मिलित करें। जांचें कि एक बीम दिखाई दे रहा है और डिटेक्टर को कवर करने के लिए पर्याप्त रूप से फैला हुआ और केंद्रित है। यदि आवश्यक हो, तो एक्स और वाई में चरण आंदोलनों को नियंत्रित करने के लिए जॉयस्टिक या स्टेज मेनू का उपयोग करके ग्रिड के एक पतले क्षेत्र में नेविगेट करें।
    3. FluScreen लिफ्ट और EPU में पूर्वावलोकन बटन का उपयोग कर एक छवि ले लो. अधिग्रहीत छवि के आधार पर, खुराक को कम संख्या में स्पॉट आकार में जाकर बढ़ाया जा सकता है, और इसके विपरीत।
    4. EPU में, एटलस पृष्ठ पर जाएँ और नया सत्र दबाएँ. MRC छवि स्वरूप का चयन करें और स्क्रीनिंग सत्र को सहेजने के लिए एक उपयुक्त फ़ोल्डर नाम और स्थान दर्ज करें, फिर लागू करें क्लिक करें.
    5. बाईं ओर मेनू से स्क्रीनिंग का चयन करें। एक एटलस असेंबल अधिग्रहित करने के लिए प्रत्येक ग्रिड के बगल में चेकबॉक्स पर टिक करें। EPU में स्क्रीनिंग सत्र प्रारंभ करें । प्रत्येक चेक किए गए ग्रिड के लिए एक एटलस का अधिग्रहण किया जाएगा, जिसमें पूरा होने पर सूचीबद्ध कई उपलब्ध ग्रिड वर्ग होंगे। प्रत्येक एटलस को स्क्रीनिंग पेज पर हाइलाइट करके देखा जा सकता है, जो रंग द्वारा समूहीकृत एक समान अनुमानित बर्फ की मोटाई के साथ ग्रिड वर्गों को दिखाते हुए एक मार्क-अप के साथ पूरा होता है।
  4. पूरा होने पर, एकत्र किए गए एटलस की समीक्षा करें और उच्च आवर्धन पर नमूना गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उपयुक्त ग्रिड की पहचान करें (यानी, ग्रिड वर्गों की एक उचित संख्या वाले जो न तो सूखे हैं और न ही मोटी बर्फ से अस्पष्ट हैं)। EPU स्क्रीनिंग मेनू पर चुने गए ग्रिड को हाइलाइट करें और नमूना लोड करें क्लिक करें.
    1. बीम सेटिंग प्रीसेट का उपयोग करें (प्रत्येक चरण के लिए वांछित बीम सेटिंग प्रीसेट के स्पष्टीकरण के लिए 28 देखें) और अधिक विस्तार से वांछित ग्रिड वर्गों की जांच करने के लिए पूर्वावलोकन फ़ंक्शन।
    2. एटलस स्क्रीनिंग मेनू से, वर्तमान में लोड किए गए ग्रिड का चयन करें और ग्रिड छवि पर वांछित स्थान पर राइट क्लिक करके और ग्रिड स्क्वायर पर जाने का चयन करके भरे हुए छेद वाले ग्रिड वर्ग में चरण को स्थानांतरित करें।
    3. EPU, तैयारी पृष्ठ पर लौटें और GridSquare प्रीसेट का चयन करें।
    4. EPU, ऑटो फ़ंक्शंस पृष्ठ खोलें और नमूने को eucentric ऊंचाई पर ले जाने के लिए GridSquare प्रीसेट के साथ चरण झुकाव द्वारा ऑटो-eucentric चलाएँ।
      नोट: बीम झुकाव द्वारा ऑटो-eucentric भी उपलब्ध है, जो तेज है, लेकिन आमतौर पर मंच झुकाव द्वारा ऑटो-eucentric की तुलना में कम सटीक है।
    5. EPU, तैयारी में, एक नई GridSquare पूर्वावलोकन छवि ले लो। अलग-अलग छेदों में अलग-अलग ग्रे मानों को ध्यान में रखें जो अलग-अलग बर्फ की मोटाई का संकेत देते हैं। सही क्लिक का उपयोग करके एक छेद पर मंच ले जाएँ > यहाँ कदम कदम. होल/Eucentric Height preset और पूर्वावलोकन का चयन करें।
      नोट: ब्याज के कण के आणविक वजन और आकार के आधार पर, इसे होल / यूसेंट्रिक ऊंचाई आवर्धन पर पहचानना संभव हो सकता है।
    6. डेटा अधिग्रहण प्रीसेट का चयन करें और एक आवर्धन सेट करें जो कणों की आसान पहचान की अनुमति देता है (आम तौर पर <2 Å / पिक्सेल के ऑब्जेक्ट सैंपलिंग के अनुरूप)। Defocus ऑफसेट को ~-3 से -5 μm पर सेट करें जिसमें ~ 40-80 e-/ Å2 की एक्सपोजर इलेक्ट्रॉन खुराक है।
  5. ग्रिड भर में कण वितरण, अभिविन्यास और संदूषण के लिए बर्फ मोटाई की एक श्रृंखला का आकलन करने के लिए 4.4 में चरणों के माध्यम से पुनरावृत्ति। कण वितरण छेद के केंद्र बनाम किनारों के करीब भिन्न हो सकता है और इसलिए छेद के साथ विभिन्न स्थानों का सर्वेक्षण करना महत्वपूर्ण है।
  6. स्क्रीन सभी ग्रिड जो पर्याप्त ग्रिड वर्गों होने के रूप में एटलस से वादा दिखाते हैं। या तो इन्हें माइक्रोस्कोप में रखें और ईपीयू का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें, या माइक्रोस्कोप से नमूनों को अनलोड करें और डेटा संग्रह शेड्यूल होने तक एलएन 2 के तहत स्टोर करें।

5. एकल कण क्रायोईएम डेटा संग्रह (दूरस्थ ऑपरेशन पर ध्यान केंद्रित करने के साथ)

नोट:: EPU के साथ डेटा अधिग्रहण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल निर्माताओं मैनुअल और कहीं और 28 में वर्णित है। यहां दूरस्थ संचालन के लिए इस प्रोटोकॉल के संशोधनों (अर्थात् कार्यों का संचालन करने के लिए हाथ पैनलों के उपयोग को कम करना और सॉफ़्टवेयर-आधारित विकल्पों का उपयोग करना) पर प्रकाश डाला गया है।

  1. जब तक कि सत्र के दौरान पहले से ही एकत्र नहीं किया गया है, तब तक ग्रिड के लिए एक एटलस एकत्र करें।
  2. परियोजना की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार बीम सेटिंग प्रीसेट में से प्रत्येक को परिभाषित करें।
  3. छवि शिफ्ट अंशांकन 28 निष्पादित करें।
  4. EPU सत्र सेट करें.
    1. EPU में, EPU पृष्ठ फिर सत्र सेटअप का चयन करें, नया सत्र फिर प्राथमिकताओं से नया का चयन करें।
    2. नया सत्र चुनें एक पॉप अप पिछली सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए एक विकल्प प्रदान करते हुए दिखाई देगा। हाँ स्वचालित रूप से पिछले EPU (यानी, नमूना वाहक, defocus रेंज, autofocus सेटिंग्स, ग्रिड प्रकार) से वर्तमान EPU सत्र में सेटिंग्स लोड होगा. वरीयताओं से नया का चयन करना उपयोगकर्ता को सहेजी गई प्राथमिकताओं (यानी, डीफोकस रेंज, ऑटोफोकस सेटिंग्स, ग्रिड प्रकार) के साथ एक फ़ाइल चुनने में सक्षम बनाता है और इस जानकारी को ईपीयू में प्रीलोड किया जाएगा।
    3. कुछ जानकारीपूर्ण के साथ सत्र का नाम भरें। स्थानीय सुविधा एक नामकरण सम्मेलन का सुझाव दे सकती है।
    4. प्रकार में, मैन्युअल का चयन करें।
    5. अधिग्रहण मोड के लिए, सटीक छेद केंद्रीकरण या तेजी से अधिग्रहण का चयन करें।
    6. छवि स्वरूप में, इच्छित स्वरूप का चयन करें.
    7. एक उपयुक्त संग्रहण फ़ोल्डर का चयन करें और EPU सत्र नाम के साथ एक निर्देशिका बनाएगा।
    8. उपयुक्त नमूना वाहक का चयन करें जिसके अनुसार ग्रिड प्रकार और छेद रिक्ति का उपयोग किया जा रहा है (उदाहरण के लिए, Quantifoil 1.2/1.3) और लागू करें दबाएँ। यह प्रोटोकॉल छेद की एक नियमित सरणी के लिए टेम्पलेट उत्पन्न करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है
  5. एक प्रारंभिक ग्रिड वर्ग का चयन करें और एक अधिग्रहण टेम्पलेट सेट करें।
    1. स्क्वायर चयन पर जाएं, यदि सभी वर्ग हरे हैं, तो ऊपर बाईं ओर सभी का चयन रद्द करें पर क्लिक करें।
    2. टाइल्स खोलें (खुली टाइल > राइट क्लिक करें). किसी वर्ग का चयन करें (जोड़ें > राइट क्लिक करें, > चरण को ग्रिड वर्ग में ले जाएँ) पर राइट क्लिक करें.
    3. होल चयन पर जाएं और ऑटो Eucentric दबाएँ। जब तक यह पूरा नहीं हो जाता है और एक ग्रिड स्क्वायर छवि ली गई है तब तक प्रतीक्षा करें। यदि autofunction विफल रहता है, तो यह हो सकता है क्योंकि ऊंचाई काफी बंद है; यदि ऐसा है तो इसे ग्रिड स्क्वायर आवर्धन पर FluScreen का उपयोग करके मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है।
    4. छेद आकार को मापें। पीले हलकों को स्थानांतरित करें और समायोजित करें ताकि वे सही आकार और रिक्ति के साथ छेद पर हों।
    5. छेद ढूँढें दबाएँ. जाँचें कि छेद सही ढंग से पाए गए हैं। यदि छेद का आकार नहीं बदलें और फिर से छेद खोजें। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि यह छेद को सही ढंग से न ढूंढ ले। यदि यह लगातार विफल रहता है, तो ग्रिड वर्ग आवर्धन पर कम संख्या (उज्ज्वल) स्पॉट आकार में जाने पर विचार करें।
    6. छेद चयन को समायोजित करने के लिए दाईं ओर फ़िल्टर बर्फ गुणवत्ता हिस्टोग्राम का उपयोग करें। यह मोटी बर्फ और पतली बर्फ वाले क्षेत्रों को बाहर करने के लिए उपयोगी हो सकता है। यह इस सत्र के दौरान चयनित भविष्य के ग्रिड वर्गों के लिए याद किया जाएगा।
    7. शीर्ष पर चयन करें मेनू में उपकरणों के साथ छेद चयन को ऑप्टिमाइज़ करें . उदाहरण के लिए, ग्रिड पट्टी के पास छेद निकालें क्लिक करें.
    8. टेम्पलेट परिभाषा पर जाएँ और प्राप्त करें दबाएँ.
    9. ढूँढें और केंद्र छेद क्लिक करें. अब छेद के चारों ओर एक पीले सर्कल के साथ एक छेद की एक छवि होगी।
      नोट:: यदि यह छेद खोजने के लिए संघर्ष करता है, तो उद्देश्य एपर्चर डालें। यदि यह अभी भी छेद नहीं ढूंढ सकता है, तो छेद / eucentric ऊंचाई प्रीसेट के लिए एक्सपोज़र समय बढ़ाने या इस पूर्व निर्धारित या छवि को बिन करने के लिए डिफोकस बढ़ाने का प्रयास करें। एक बड़ा defocus परिवर्तन छवि शिफ्ट संरेखण को बदल सकता है।
    10. चरण शिफ्ट के बाद विलंब और छवि शिफ्ट समय के बाद विलंब को 1-5 सेकंड में परिवर्तित करें.
    11. अधिकतम छवि शिफ्ट मान की जाँच करें (यदि विकल्प उपलब्ध है) वांछित के रूप में है। यदि विपथन मुक्त छवि शिफ्ट संग्रह का उपयोग किया जा रहा है, तो यह मान EPU कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल में परिभाषित किया गया है, अन्यथा 5 μm एक मानक मान है।
    12. अधिग्रहण क्षेत्र जोड़ें क्लिक करें, फिर छवि पर कहीं भी क्लिक करें. अधिग्रहण क्षेत्र को वांछित स्थान पर ले जाएं (यानी, एक छेद के किनारे पर) ताकि अधिग्रहण के क्षेत्रों को बीम के साथ दोगुना उजागर न किया जा सके (हरे सर्कल में वर्ग डिटेक्टर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है, हरा सर्कल बीम व्यास है)।
    13. ऊपर दाईं ओर, defocus श्रेणी जोड़ें। फिर अन्य अधिग्रहण क्षेत्रों को जोड़ें। एक झिल्ली प्रोटीन परियोजना के लिए एक विशिष्ट defocus सूची -0.8 से -3 μm defocus है।
    14. ऑटोफोकस क्षेत्र जोड़ें पर क्लिक करें और छवि पर कहीं भी क्लिक करें। ऑटोफोकस क्षेत्र को एक छेद के आसपास के कार्बन में ले जाएं। मानक अभ्यास AFIS, या हर 5-15 μm का उपयोग करते समय केंद्रीकरण के बाद ऑटोफोकस करना है, जो वर्ग में z-ऊंचाई भिन्नता पर निर्भर करता है।
    15. बहाव माप क्षेत्र जोड़ें क्लिक करें, 0.05 nm/s की एक सेट थ्रेशोल्ड के साथ प्रति ग्रिड वर्ग एक बार किया गया बहाव माप एक मानक सेटिंग है। बहाव माप क्षेत्र कर सकते हैं (और यह करने के लिए एक अच्छा विचार है) सीधे autofocus क्षेत्र के साथ ओवरलैप. सुनिश्चित करें कि न तो बहाव और न ही ऑटोफोकस क्षेत्र अधिग्रहण क्षेत्र के साथ ओवरलैप होता है।
      नोट:: टेम्पलेट निष्पादन फ़ंक्शन का उपयोग कर टेम्पलेट की जाँच की जा सकती है। यह देखने के लिए एक अच्छा विचार है कि क्या अधिग्रहण क्षेत्रों को आगे बढ़ने की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, छवियों में बहुत अधिक / पर्याप्त कार्बन नहीं), लेकिन आवश्यक नहीं है।
    16. स्क्वायर चयन पर वापस जाएं, और ग्रिड पर अधिग्रहण के लिए वर्गों का चयन करें। अधिग्रहण क्षेत्रों की संख्या और अपेक्षित डेटा अधिग्रहण दर (डिटेक्टरों और प्रयोगात्मक सेट अप के आधार पर सुविधा से) का उपयोग करें ताकि यह अनुमान लगाया जा सके कि कितने अधिग्रहण क्षेत्रों की आवश्यकता है।
    17. जब सभी वांछित वर्गों का चयन किया जाता है, तो सभी वर्ग तैयार करें दबाएँ.
    18. एक बार जब प्रत्येक वर्ग एकत्र हो जाता है, तो ग्रिड वर्गों के बीच नेविगेट करें और चयन ब्रश का उपयोग करके छेद को ठीक करें।
  6. नमूने पर एक चरण स्थान पर ले जाएँ और eucentric ऊंचाई सेट करने के लिए ऑटो कार्यों का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप संरेखण के रूप में पहले वर्णित 28 प्रदर्शन, लेकिन कोमा मुक्त संरेखण प्रदर्शन करने और उद्देश्य अस्थिरता के लिए मैन्युअल रूप से सही करने के बजाय, सॉफ़्टवेयर के भीतर संरेखण उपकरणों का उपयोग करें। संक्षेप में, अधिग्रहण बीम की स्थिति सेट करें, यह सुनिश्चित करें कि उद्देश्य एपर्चर (ओए) को हटा दिया गया है और चरण को यूसेंट्रिक ऊंचाई पर नमूने के बीम स्थिर क्षेत्र पर तैनात किया गया है। ओए को फिर से सम्मिलित करने और केंद्रित करने और ईपीयू के साथ उद्देश्य लेंस अस्थिरता को सही करने से पहले ऑटो-फ़ंक्शंस के भीतर कोमा-मुक्त संरेखण करें। सुनिश्चित करें कि दोनों संरेखण उपयुक्त मूल्यों (<150 एनएम कोमा और शून्य अस्थिरता के करीब) पर अभिसरण करते हैं।
    1. स्वचालित अधिग्रहण रन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि ऑटोलोडर टर्बो पंप बंद हो गया है, और उद्देश्य एपर्चर डाला गया है।
  7. स्वचालित अधिग्रहण में, स्वचालित डेटा अधिग्रहण प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ चलाएँ दबाएँ.

6. छवि प्रसंस्करण ईएम घनत्व मानचित्र उपज करने के लिए

नोट: क्रायोईएम सुविधाओं के बहुमत माइक्रोग्राफ फिल्मों के पूर्व प्रसंस्करण की पेशकश 'मक्खी पर'. वहाँ सॉफ्टवेयर पैकेज और RELION पाइपलाइनों 28,33, cryoSPARC43, Scipion34 और WarpEM44 सहित इसके लिए उपलब्ध दृष्टिकोण की एक विस्तृत विविधता हैं. एक RELION आधारित पाइपलाइन यहाँ वर्णित है और यह माना जाता है कि उपयोगकर्ता कंप्यूटिंग संसाधनों तक पहुंच के साथ एक उपयुक्त भंडारण स्थान पर माइक्रोग्राफ फिल्मों को स्थानांतरित कर दिया है। एक झिल्ली प्रोटीन परियोजना के लिए प्रक्रिया और प्रतिनिधि परिणामों का एक सिंहावलोकन प्रदान किया जाता है, एक विस्तृत विवरण और कदम से कदम ट्यूटोरियल RELION मुखपृष्ठ पर पाया जा सकता है: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion।

  1. माइक्रोग्राफ गति सुधार और सीटीएफ अनुमान का 'मक्खी पर' विश्लेषण करें। प्रोजेक्ट निर्देशिका में RELION प्रारंभ करें। शेड्यूल आयात, गति सुधार और CTF आकलन कार्य लूप करने के लिए जैसे कि वे डेटा संग्रह और स्थानांतरण के साथ समवर्ती हैं। एक माइक्रोग्राफ विश्लेषण script28 अस्थिरता और अनुमानित defocus मूल्यों पर वास्तविक समय दृश्य प्रतिक्रिया प्रदान करता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  2. पूर्व-संसाधित माइक्रोग्राफ से कणों को चुनें। वहाँ स्वचालित कण से चुनने के लिए सॉफ्टवेयर संकुल चुनने की एक संख्या कर रहे हैं. संदर्भ मुक्त और टेम्पलेट-आधारित चयन विकल्प RELION37 के ऑटो-पिकिंग टैब के भीतर उपलब्ध हैं। अन्य कार्यक्रमों का उपयोग विभिन्न चरणों के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कण पिकिंग 35 के लिए crYOLO का उपयोग करना।
  3. CTF-सही माइक्रोग्राफ से कणों को निकालें।
    नोट: प्रारंभिक के लिए आवश्यक कम्प्यूटेशनल समय को कम करने के लिए, 'क्लीन-अप', प्रसंस्करण चरणों, निष्कर्षण पर कणों को नीचे-स्केल / बिन। कैसे निकालने नौकरी चलाने पर विवरण RELION 3.1 ट्यूटोरियल में पाया जा सकता है. इस परियोजना के लिए, कणों को शुरू में 2 के एक कारक द्वारा बिन किया गया था।
  4. 2 डी वर्ग औसत प्रदर्शन करें। 100-200 कक्षाओं में वर्गीकृत करना ≥100,000 कणों वाले अधिकांश डेटासेट के लिए अच्छी तरह से काम करता है। 200 से अधिक वर्गों या 50 से कम कक्षाओं का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है, यहां तक कि जहां डेटासेट छोटे होते हैं जब तक कि नमूने में उच्च समरूपता (यानी, इकोसाहेड्रल वायरस) न हो, जिस स्थिति में 50 से कम कक्षाएं अभी भी एक अच्छा परिणाम दे सकती हैं। कण के सबसे लंबे आयाम को समायोजित करने के लिए मास्क व्यास को पर्याप्त रूप से सेट करें, लेकिन किसी भी पड़ोसी कणों को बाहर करने के लिए पर्याप्त तंग (इसके लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है)।
  5. सबसेट चयन कार्य का उपयोग करके अच्छे वर्गों (यानी, संरचनात्मक विवरण वाले) का चयन करें। अच्छे और बुरे 2 डी वर्ग औसत के उदाहरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में पाए जा सकते हैं।
  6. RELION में 3 डी प्रारंभिक मॉडल नौकरी का उपयोग कर डेटा से एक प्रारंभिक मॉडल डे नोवो उत्पन्न करें।
    नोट: कम साफ कण ढेर बहु-संदर्भ ab initio SGD (stochastic ढाल वंश) शोधन से लाभ हो सकता है क्योंकि यह जंक / उप-इष्टतम कणों को छानने का एक अतिरिक्त अवसर प्रदान करता है। एक मुखौटा व्यास का चयन करें जो ब्याज के कण को समायोजित कर सकता है, और 'एसजीडी' टैब में फ़ील्ड के लिए डिफ़ॉल्ट मान छोड़ सकता है क्योंकि ये नियमित रूप से अच्छा प्रदर्शन करते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक मॉडल चिमेरा (या एक अन्य उपयुक्त विज़ुअलाइज़ेशन प्रोग्राम) में उचित दिखता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  7. एक संदर्भ मॉडल के रूप में चरण 6.6 से आउटपुट का उपयोग करके डेटा में विषमता को संबोधित करने के लिए 3D वर्गीकरण निष्पादित करें। Chimera में परिणामी नक्शे का आकलन करें। प्रक्रिया कण स्टैक स्वतंत्र रूप से अद्वितीय संरचनात्मक राज्यों के अनुरूप है। रुचि के वर्ग/वर्गों का चयन करने और संबंधित कण स्टैक के लिए particles.star फ़ाइलें उत्पन्न करने के लिए सबसेट चयन कार्य का उपयोग करें.
  8. 3D ऑटो-शोधन चलाएँ. उनके संबंधित कण ढेर के शोधन के लिए संदर्भ के रूप में पिछले चरण में प्राप्त 3 डी वर्ग औसत का उपयोग करें। यदि शोधन का संकल्प डेटा की Nyquist सीमा के करीब पहुंच रहा है, तो डाउन-स्केलिंग के बिना कणों को फिर से निकालें। पुन: निष्कर्षण के बाद, unbinned कण स्टैक के साथ 3 डी ऑटो-परिष्कृत कार्य को दोहराएं। इस मामले में, 3 डी संदर्भ मॉडल को इस तरह से रीस्केल किया जाना चाहिए कि पिक्सेल और बॉक्स आकार फिर से निकाले गए कण छवियों के अनुरूप हों। इस कार्रवाई को पूरा करने के लिए relion_image_handler आदेश पंक्ति उपकरण का उपयोग करें।
  9. यदि उपयुक्त हो तो परिशोधन में समरूपता का उपयोग करें। यदि एक पुनर्निर्मित मानचित्र में समरूपता है, तो relion_align_symmetry कमांड लाइन टूल का उपयोग करके उपयुक्त समरूपता अक्ष पर मानचित्र को संरेखित करें। परिणामी संरेखित मानचित्र का उपयोग संदर्भ टैब में निर्दिष्ट उपयुक्त समरूपता ऑपरेटर के साथ एक नए 3D ऑटो-परिशोधन कार्य में संदर्भ के रूप में करें.
  10. 3 डी ऑटो-शोधन से नक्शे तेज करें। यह RELION में पोस्ट-प्रोसेसिंग नौकरी का उपयोग करके किया जाता है, लेकिन पहले परिष्कृत मानचित्र से एक उपयुक्त मुखौटा बनाया जाना चाहिए। मुखौटा निर्माण और पोस्ट-प्रोसेसिंग के चरणों को RELION ट्यूटोरियल में विस्तृत किया गया है (प्रतिनिधि परिणाम भी देखें)।
    नोट:: कई reconstructions के संकल्प आगे Bayesian चमकाने और RELION में CTF परिशोधन functionalities का उपयोग कर सुधार किया जा सकता है। उच्च क्रम aberrations (बीम झुकाव, trefoil aberrations और 4 आदेश aberrations) के लिए अनुमान लगाने और सही करने के लिए CTF परिशोधन नौकरी-प्रकार का उपयोग करें और, अलग-अलग नौकरियों के रूप में, अनिसोट्रोपिक आवर्धन और प्रति-कण defocus। इसके बाद, प्रति-कण आधार पर बीम-प्रेरित गति को संबोधित करने के लिए बायेसियन पॉलिशिंग जॉब (प्रशिक्षित या डिफ़ॉल्ट मूल्यों के साथ) का उपयोग करें। जैसा कि RELION 3.1 ट्यूटोरियल में संबोधित किया गया है, इन नौकरियों की संभावना एक पुनरावर्ती दृष्टिकोण (सीटीएफ-शोधन → बायेसियन चमकाने → 3 डी ऑटो-शोधन → पोस्ट-प्रोसेसिंग → से लाभान्वित होगी ... लूप) के बाद से दोनों उच्च संकल्प मॉडल से लाभ.
  11. यदि आवश्यक हो तो ईएम घनत्व मानचित्रों की हस्तरेखा को सही करें। यह निर्धारित करने के लिए मानचित्रों की जांच करें कि क्या हैंडनेस एक मौजूदा परमाणु मॉडल को फिट करने का प्रयास करके, या अल्फा हेलिकल क्षेत्रों की हस्तरेखा का आकलन करके सही है। जहां आवश्यक हो, 'vop zflip' कमांड का उपयोग करके UCSF Chimera45 में z-अक्ष के साथ मानचित्र को फ्लिप करें।

Representative Results

स्क्रीनिंग करते समय, ग्रिड को एटलस चरण में छोड़ दिया जा सकता है, जहां कम आवर्धन पर हल की गई विशेषताएं ग्रिड को डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त नहीं के रूप में चिह्नित करती हैं। उदाहरण के लिए, यदि एक ग्रिड को ग्रिड वर्गों के बहुमत के साथ महत्वपूर्ण यांत्रिक क्षति के अधीन किया गया है (चित्रा 2 ए), या जहां ग्रिड 'सूखा' प्रतीत होता है, जिसमें कोई विट्रियस बर्फ नहीं होती है (चित्रा 2 बी)। इस तरह के ग्रिड आमतौर पर पहचाने जाते हैं क्योंकि ग्रिड वर्गों के किनारे तेज और अलग दिखाई देते हैं। डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग करके बनाए गए अधिकांश ग्रिड में, बर्फ की एक ढाल देखी जाती है (चित्रा 2 सी, डी)। कण वितरण, ब्याज के नमूने के आधार पर, बर्फ की मोटाई के साथ नाटकीय रूप से भिन्न हो सकता है और इसलिए कण वितरण का आकलन करने के लिए ग्रिड वर्गों की एक श्रृंखला की स्क्रीनिंग की सिफारिश की जाती है। एटलस स्क्रीनिंग चरण के दौरान ईपीयू सॉफ़्टवेयर के भीतर उपकरण ों को लागू किया गया है ताकि उपयोगकर्ता को समान या अलग बर्फ मोटाई के ग्रिड वर्गों की पहचान करने में मदद मिल सके, जो विशेष रूप से उन उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकते हैं जो क्रायोईएम ग्रिड (चित्रा 2 ई, एफ) की जांच करने के लिए नए हैं।

Figure 2
चित्रा 2: उदाहरण कम आवर्धन 'एटलस' स्क्रीनिंग सत्र से montages. ए) एक ग्रिड जिसे अधिकांश ग्रिड वर्गों के टूटने के साथ महत्वपूर्ण क्षति हुई है - संग्रह के लिए अनुपयुक्त। बी) कोई vitreous बर्फ के साथ एक सूखी ग्रिड - संग्रह के लिए अनुपयुक्त. सी) एक ग्रिड के साथ एक बर्फ ढाल का प्रदर्शन ~ ग्रिड के 50% उपयोग योग्य. डी) ग्रिड के ~ 33% के साथ एक बर्फ ढाल उपयोग करने योग्य. सी और डी दोनों, डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त हैं यदि उपयोग करने योग्य ग्रिड वर्गों में संग्रह के लिए उपयुक्त बर्फ की मोटाई होती है, और संग्रह की न्यूनतम अवधि को पूरा करने के लिए पर्याप्त अधिग्रहण क्षेत्र होते हैं (उदाहरण के लिए, 24 घंटे) ई) बर्फ की मोटाई की सीमा के साथ एक उदाहरण एटलस। एफ) ई में प्रस्तुत एक ही एटलस लेकिन के साथ, ग्रिड वर्गों को वर्गीकृत और बर्फ की मोटाई के अनुसार ईपीयू सॉफ्टवेयर द्वारा रंगीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कण वितरण की स्क्रीनिंग करते समय, सुनिश्चित करें कि इमेजिंग पैरामीटर, जैसे आवर्धन और कुल इलेक्ट्रॉन खुराक, अपेक्षित परिणामों की सटीक तस्वीर प्रदान करने के लिए डेटा अधिग्रहण के दौरान उपयोग किए जाने की उम्मीद के समान हैं। स्क्रीनिंग के दौरान, एक आदर्श कण वितरण दिखाई देने वाले कण अभिविन्यासों की एक श्रृंखला के साथ एकविभेद्य है (नमूने और कण की आकृति विज्ञान के मौजूदा ज्ञान के आधार पर, यह पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है) (चित्रा 3 ए)। बर्फ को कणों के सबसे बड़े आयाम को समायोजित करते हुए जितना संभव हो उतना पतला होना चाहिए, यदि बर्फ बहुत पतली है तो इलेक्ट्रॉन बीम के साथ प्रकाशित होने पर यह पिघल सकती है। यह माइक्रोग्राफ में अत्यधिक गति का कारण बनता है, और इस विशेषता को प्रदर्शित करने वाले क्षेत्रों से बचा जाना चाहिए (चित्रा 3 बी)। सामूहिक अनुभव से, यह प्रभाव सबसे अधिक देखा जाता है जब बफर में डिटर्जेंट होता है। इसके परिणामस्वरूप छेद के केंद्र में बहुत पतली बर्फ हो सकती है और इसलिए कणों को शारीरिक रूप से बाहर रखा जा सकता है और किनारे की ओर मजबूर किया जा सकता है। यह प्रभाव चित्रा 3 सी में मनाया जाता है, लेकिन इस मामले में यह एक चरम उदाहरण नहीं है और ये छवियां अभी भी डेटासेट में उपयोगी रूप से योगदान देंगी। अंत में, बर्फ को विट्रियस होने की आवश्यकता है; ग्रिड (या ग्रिड) के किसी भी क्षेत्र को बाहर निकालें जहां अधिकांश या ली गई सभी छवियां डेटा अधिग्रहण से क्रिस्टलीय बर्फ (चित्रा 3 डी) दिखाती हैं। अक्सर, ग्रिड वर्गों के किनारे पर गैर-विट्रियस बर्फ देखी जाती है। पाठकों को चर की विस्तृत समीक्षाओं के लिए संदर्भित किया जाता है जिन्हें ग्रिड विट्रीफिकेशन 16 के दौरान बदला जा सकता है और आगे की जानकारी के लिए पतली फिल्म वातावरण 46,47 में कण व्यवहार का विवरण।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ अलग-अलग कण वितरण दिखा रहा है। ए) अभिविन्यास की एक श्रृंखला को अपनाने वाले मोनोडिस्पर्स कणों का एक 'आदर्श' वितरण। बी) छेद के बीच में अत्यधिक पतली बर्फ जो इलेक्ट्रॉन बीम के संपर्क में आने पर विकृत हो जाती है जिससे माइक्रोग्राफ में अत्यधिक गति होती है। यह प्रभाव अक्सर देखा जाता है जब डिटर्जेंट बफर सी में मौजूद होता है) जहां बर्फ छेद के केंद्र में पतली होती है, यह शारीरिक रूप से केंद्र से कणों को बाहर करती है, जिससे छेद के किनारे की ओर कणों की भीड़ होती है। इस मामले में यह इन छवियों को उपयोगी होने से रोकने के लिए पर्याप्त चरम नहीं है, लेकिन यह सुझाव देता है कि यह थोड़ा मोटा क्षेत्रों की स्क्रीनिंग के लायक है। डी) बर्फ vitreous नहीं है, डेटा उन क्षेत्रों पर एकत्र नहीं किया जाना चाहिए जो इस उदाहरण माइक्रोग्राफ की तरह दिखते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऑन-द-फ्लाई इमेज प्रोसेसिंग डेटा अधिग्रहण के साथ त्रुटियों और समस्याओं को लेने में मदद कर सकती है और इसलिए जहां संभव हो हमेशा अनुशंसित होती है। उदाहरण के लिए, माइक्रोग्राफ के भीतर अत्यधिक गति यह संकेत दे सकती है कि ऑटोलोडर टर्बो पंप सक्रिय है, या डेटा को एक फटे हुए ग्रिड वर्ग पर एकत्र किया जा रहा है जहां इलेक्ट्रॉन बीम में बर्फ काफी आगे बढ़ रही है, यह दर्शाता है कि ग्रिड वर्ग को छोड़ दिया जाना चाहिए। फ्लाई सीटीएफ अनुमान पर उन परिस्थितियों को प्रकट कर सकते हैं जहां एक सकारात्मक फोकस बिंदु (डिफोकस के बजाय) लागू किया जाता है (जहां इन बिंदुओं को खोजने के लिए सीटीएफ अनुमान कार्यक्रम और पैरामीटर का उपयोग किया जाता है), और चरण शिफ्ट का निर्धारण करें जहां वोल्टा चरण प्लेट 48 का उपयोग किया जाता है। फ्लाई इमेज प्रोसेसिंग पाइपलाइनों पर अक्सर डेटा का एक ग्राफिकल सारांश (चित्रा 4 ए) शामिल होता है ताकि उपयोगकर्ताओं के लिए माइक्रोग्राफ की गुणवत्ता का जल्दी से आकलन करना आसान हो सके और यह तय किया जा सके कि डेटा संग्रह संशोधनों की आवश्यकता है या नहीं।

माइक्रोग्राफ से कणों का चयन, जबकि संदूषण या ग्रिड समर्थन फिल्म जैसे 'झूठे सकारात्मक' से बचने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, crYOLO जैसे कण पिकर्स अक्सर डेटा (चित्रा 4 बी) के 'पहले पास' के लिए डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग करके पर्याप्त रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं, जिससे 2 डी क्लास औसत के लिए प्रगति सक्षम होती है जहां डेटा की गुणवत्ता और डाउनस्ट्रीम सफलता की संभावना का आकलन करना आसान हो सकता है। अधिकांश परियोजनाओं के लिए, ~ > 10k कणों के 2 डी वर्गीकरण को उन कक्षाओं को प्रकट करना शुरू करना चाहिए जिनमें माध्यमिक संरचना विवरण है। 3 डी पर आगे बढ़ने के लिए, 2 डी वर्गीकरण चरण को आमतौर पर कण अभिविन्यास की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करने वाली कक्षाओं को प्रकट करना चाहिए। यदि एक पसंदीदा अभिविन्यास का पता चला है, तो नमूना तैयारी 16 के अधिक पुनरावृत्तियों या नमूने के साथ आगे के डेटा अधिग्रहण की आवश्यकता हो सकती है49। सभी कक्षाएं जो माध्यमिक संरचना विस्तार दिखाती हैं, उन्हें 3 डी विश्लेषण को आगे बढ़ाने के लिए चुना जाना चाहिए, जबकि 'जंक' कणों को छोड़ दिया जाता है (चित्रा 4 सी)।

Figure 4
चित्रा 4: प्रारंभिक छवि प्रसंस्करण चरण। ए) एक 'मक्खी पर' छवि प्रसंस्करण स्क्रिप्ट से आउटपुट. बी) उदाहरण माइक्रोग्राफ (बाएं) उचित रूप से ऑटो-चुने गए कणों के साथ crYOLO सामान्य मॉडल (दाएं, लाल वर्गों से घिरे कणों के साथ) स्केल बार (सफेद) का उपयोग करके पहचाने गए 50 एनएम हैं। सी) 2 डी वर्गीकरण के परिणाम उन वर्गों को दिखाते हैं जिन्हें लाल वर्ग में छोड़ दिया गया था, और जिन वर्गों से कणों को हरे रंग में आगे के प्रसंस्करण के लिए चुना गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कणों के एक छोटे से सबसेट का उपयोग प्रारंभिक मॉडल (चित्रा 5 ए) उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रारंभिक मॉडल को तब 3 डी वर्गीकरण और शोधन में एक प्रारंभिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। RagAB के मामले में, डेटासेट में तीन अलग-अलग संरूपक शामिल थे जिन्हें 3 D वर्गीकरण (चित्रा 5B) के दौरान अलग किया जा सकता है। इन वर्गों में से प्रत्येक में योगदान करने वाले कणों को तब स्वतंत्र रूप से इलाज किया जा सकता है और एक ईएम घनत्व मानचित्र को परिष्कृत करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जो तब आगे की व्याख्या और मॉडल निर्माण के अधीन हो सकता है।

Figure 5
चित्रा 5: 3 डी ईएम घनत्व मानचित्र उत्पन्न. ए) RELION का उपयोग करके उत्पन्न विशिष्ट प्रारंभिक मॉडल। बी) 5 वर्गों पर 3 डी वर्गीकरण तीन अलग-अलग संरचनात्मक राज्यों में कणों के अलगाव को दर्शाता है: ओपन-ओपन (हरा), ओपन-क्लोज्ड (नीला), बंद-बंद (बैंगनी)। (c) मुखौटा निर्माण की प्रक्रिया। 3 डी शोधन (बाएं) से मानचित्र chimera में कल्पना की जानी चाहिए. वॉल्यूम दर्शक का उपयोग तब सबसे कम दहलीज की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिस पर नक्शा असंबद्ध, शोर घनत्व (मध्य) से मुक्त होता है। यह थ्रेशोल्ड मान RELION मास्क निर्माण कार्य में प्रारंभिक binarization थ्रेशोल्ड के रूप में इनपुट है। एक उदाहरण मुखौटा आउटपुट ग्रे (दाएं) में दिखाया गया है। डी) RagAB (EMD-10245) के खुले बंद राज्य के उच्च संकल्प EM घनत्व मानचित्र, फ़िल्टर और स्थानीय संकल्प (Å) द्वारा रंगीन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में हमने नियमित एसपीए के लिए उपयुक्त नमूनों पर लागू एक बुनियादी पाइपलाइन का वर्णन किया है। जबकि पतली फिल्म गठन और विट्रीफिकेशन की यह फिल्टर पेपर ब्लोटिंग विधि निस्संदेह एसपीए परियोजनाओं के विशाल बहुमत में इसके उपयोग को देखते हुए सफल है, यह कई नुकसानों के साथ आता है। इनमें नमूना अपव्यय, पतली फिल्म बनाने और नमूने को फ्रीज करने के लिए आवश्यक धीमी टाइमस्केल (सेकंड) शामिल हैं, अपरिवर्तनीयता 27 की सूचना दी गई है और अतिरिक्त तरल 50 को दूर करने के लिए फ़िल्टर पेपर का उपयोग करने के नकारात्मक प्रभावों की सूचना दी गई है। हाल ही में, पतली फिल्म निर्माण 51,52 की पुनरुत्पादकता में सुधार करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों को विकसित किया गया है। अन्य प्रौद्योगिकियों को विकसित किया गया है जो नमूना अनुप्रयोग और विट्रीफिकेशन 53,54,55 के बीच के समय को कम करते हैं। जबकि पतली फिल्म गठन के लिए फ़िल्टर पेपर-आधारित तरीके लेखन के समय एसपीए क्रायोईएम नमूना तैयारी की सबसे सर्वव्यापी विधि बनी हुई हैं, ये नई प्रौद्योगिकियां ग्रिड विट्रीफिकेशन की दक्षता और पुनरुत्पादन के संदर्भ में लाभों की एक श्रृंखला ला सकती हैं, साथ ही साथ अतिरिक्त प्रयोगात्मक आयामों को लाने के लिए नए अवसर पैदा कर सकती हैं, जैसे कि समय संकल्प और विट्रिफिकेशन से पहले तेजी से मिश्रण।

अधिकांश उपयोगकर्ताओं के लिए ग्रिड स्क्रीनिंग की प्रक्रिया वर्तमान में एक गुणात्मक प्रक्रिया है जिसमें कण वितरण का आकलन करने के लिए ग्रिड में उच्च-आवर्धन छवियों को लेने के बाद कम आवर्धन एटलस का अधिग्रहण शामिल है। हालांकि यह कुछ प्रकार के नमूने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत दृष्टिकोण है, यह आंखों से आकलन करना मुश्किल हो सकता है कि क्या नमूना वास्तव में वह है जो शोधकर्ता छवि की उम्मीद कर रहा है या एक पसंदीदा अभिविन्यास है, उदाहरण के लिए छोटे (<200 केडीए) नमूनों के साथ या जहां कम-रिज़ॉल्यूशन आकृति विज्ञान आंखों से पहचानना मुश्किल बनाता है यदि कण वितरण की एक श्रृंखला मौजूद है। कुछ परियोजनाओं के लिए, यह निर्धारित करना असंभव है कि क्या नमूना वांछित है, उदाहरण के लिए जहां एक लिगैंड बाध्य है या जहां नमूना यह आकलन करने के लिए जांचा जा रहा है कि क्या एक छोटा (उदाहरण के लिए, 10 केडीए) सबयूनिट अभी भी एक जटिल के सहयोग से मौजूद है। इन परियोजनाओं के लिए, डेटा विश्लेषण के लिए पूरी तरह से स्वचालित पाइपलाइनों को 'शॉर्ट' 0.5 - 1-एच संग्रह के साथ जोड़ा गया है, जो 2 डी वर्गीकरण या यहां तक कि 3 डी वर्गीकरण और शोधन के लिए छवि प्रसंस्करण चरणों के माध्यम से आगे बढ़ सकता है, यह कुशलतापूर्वक निर्धारित करने में मदद करेगा कि क्या एक लंबा संग्रह वारंट किया गया है। ये पाइपलाइनें अभी भी विकास के अधीन हैं और वर्तमान में व्यापक रूप से लागू नहीं की गई हैं, लेकिन उनके पास क्रायोईएम ग्रिड स्क्रीनिंग की दक्षता में सुधार करने की क्षमता है, खासकर चुनौतीपूर्ण नमूनों के लिए।

प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों में सुधार, साथ ही साथ छवि प्रसंस्करण में प्रगति के साथ संयुक्त माइक्रोस्कोपी में संशोधन जैसे कि छवि शिफ्ट डेटा संग्रह, डेटा अधिग्रहण के दौरान उत्पादित छवियों के थ्रूपुट और गुणवत्ता में वृद्धि हुई है। एकत्र किए जा रहे आंकड़ों की दर में यह वृद्धि कई टीबी डेटा के अधिग्रहण से पहले क्रायोईएम ग्रिड की पूरी तरह से जांच की आवश्यकता पर प्रकाश डालती है।

क्रायोईएम एसपीए वास्तव में एक मुख्यधारा की संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक बन गई है, और कई मामलों में नमूनों के कुछ वर्गों के लिए 'जाने' दृष्टिकोण, जैसे विषम और लेबाइल मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स। जबकि यहां प्रोटोकॉल एसपीए पाइपलाइन के एक बुनियादी अवलोकन का वर्णन करता है, यहां कवर किए गए प्रत्येक अनुभाग (ग्रिड विट्रिफिकेशन और स्क्रीनिंग, क्रायोईएम और छवि प्रसंस्करण) अपने आप में एक विषय है और एक एसपीए परियोजना के विकास के दौरान अन्वेषण के योग्य है। जैसा कि नमूना तैयारी और माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियां प्रगति करती हैं, और नई छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम और दृष्टिकोण ऑनलाइन आते हैं, एसपीए एक पाइपलाइन के रूप में विकसित करना जारी रखेगा, जिससे शोधकर्ताओं को जटिल जैविक प्रणालियों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सहायता मिलेगी।

Disclosures

हितों के टकराव की कोई सूचना नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित iNEXT-डिस्कवरी (अनुदान 871037) द्वारा समर्थित किया गया था। J. B. R. White को Wellcome Trust (215064/Z/18/Z) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। एफईआई टाइटन क्रिओस माइक्रोस्कोप को लीड्स विश्वविद्यालय (यूओएल एबीएसएल पुरस्कार) और वेलकम ट्रस्ट (108466 / जेड / 15 / जेड) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम अपने माइक्रोग्राफ विश्लेषण स्क्रिप्ट के उपयोग के लिए एम Iadanza धन्यवाद. हम यूके के राष्ट्रीय इलेक्ट्रॉन बायो-इमेजिंग सेंटर (ईबीआईसी) में क्रायो-ईएम सुविधाओं के उपयोग और समर्थन के लिए डायमंड लाइट सोर्स को स्वीकार करते हैं, जिसे वेलकम ट्रस्ट, एमआरसी और बीबीआरएससी द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt tweezers Agar Scientific AGT5022
Cryo EM round storage box Agar Scientific AGG3736
CryoEM autogrid boxes ThermoFisher Scientific 1084591
CryoEM grids Quantifoil N1-C14nCu30-01
Ethane gas Boc 270595-F
LN2  foam dewar Agar Scientific AG81760-500
LN2  storage dewar Worthington industries HC 34
Pipette Gilson 10082012
Pipette tips Star labs s1111-1706
Syringe BD BD 300869
Type II lab water Suez select fusion
Vitrobot ThermoFisher Scientific 1086439
Vitrobot filter paper Whatman 1001-055
Vitrobot styrophome container assembly ThermoFisher Scientific 1086439
Vitrobot tweesers ThermoFisher Scientific 72882-D
Software
EPU ThermoFisher Scientific 2.8.1.10REL
TEM server ThermoFisher Scientific 6.15.3.22415REL
Tia ThermoFisher Scientific 5.0.0.2896REL
Titan krios microscope ThermoFisher Scientific Titan Krios G2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक
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