Summary
توفر هذه البروتوكولات المنهجية المستخدمة لتقييم النشاط الأنزيمي لأفراد عائلة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMT) في الخلايا. يتم وصف إرشادات مفصلة حول تقييم نشاط PRMT باستخدام المؤشرات الحيوية الذاتية والخارجية ، والتعرف على الميثيل أرجينين الأجسام المضادة ، ومركبات أداة المانع.
Abstract
البروتين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) تحفيز نقل مجموعة الميثيل إلى بقايا أرجينين من البروتينات الركيزة. تتكون عائلة PRMT من تسعة أعضاء يمكنهم إعادة الترطيب الأحادي أو بقايا أرجينين ثنائي ميثيلات متناظرة /غير متماثلة. تتوفر عدة أجسام مضادة تعترف بأنواع مختلفة من ميثيل الأرجينين من البروتينات المختلفة؛ وبالتالي ، وتوفير أدوات لتطوير PRMT نشاط المؤشرات الحيوية المقايسات. إن المقايسات المستندة إلى الأجسام المضادة PRMT تشكل تحديا بسبب تداخل الركائز وخصائص الأجسام المضادة القائمة على الزخارف. وتناقش هذه القضايا والإعداد التجريبي للتحقيق في ميثيل الأرجينين التي ساهمت بها PRMTs الفردية. ومن خلال الاختيار الدقيق للركائز التمثيلية التي تمثل علامات بيولوجية لثمانية من أصل تسعة أفرقة استراتيجية الحد من الفقر، تم تصميم فريق من عمليات فحص نشاط فريق إدارة الموارد الطبيعية. هنا، يتم الإبلاغ عن بروتوكولات لإجراء فحوصات خلوية قياس كميا النشاط الأنزيمي لأفراد الأسرة PRMT الفردية في الخلايا. ميزة الأساليب الموصوفة هي أدائها المباشر في أي مختبر مع ثقافة الخلية وقدرات البقع الغربية الفلورية. تم التحقق من صحة خصوصية الركيزة وموثوقية الأجسام المضادة المختارة بالكامل مع نهج الضربة القاضية والإفراط في التعبير. وبالإضافة إلى المبادئ التوجيهية التفصيلية للمؤشرات الحيوية والأجسام المضادة للفرز، تقدم أيضا معلومات عن استخدام مجموعة مركبة أداة مثبطة لمضادات المركبات المضادة للمركبات.
Introduction
ميثيل أرجينين هو تعديل مهم بعد التحويل ينظم التفاعلات بين البروتين والبروتين والحمض النووي الريبي ، وبالتالي يلعب دورا مهما في العمليات الخلوية المختلفة مثل الربط قبل مرنا ، وتلف الحمض النووي ، واستجابة النسخ ، ونقل عامل النمو بوساطة1،2. أرجينين هو ميثيليد بواسطة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراس (PRMTs) مما أدى إلى أرجينين أحادي ميثيل (Rme1), ثنائي ميثيل لارجينيني غير متناظرة (Rme2a), أو ثنائي ميثيل متماثل (Rme2s)3. واستنادا إلى نوع الميثيل، تصنف أفرقة الحد من الفقر إلى ثلاث مجموعات: النوع الأول (PRMT1، 2، 3، 4، 6، و8)، الذي يحفز ثنائي ميثيل أحادي وغير متماثل؛ النوع الأول (PRMT1، 2، 4، 6، 8)، الذي يحفز ثنائي ميثيل ثنائي الميثيل الأحادي وغير المتماثل؛ النوع 1، 2، 4، 6، 8، الذي يحفز ثنائي ميثيل أحادي وغير متماثل؛ النوع الأول من ثنائي الميثيل( 1، 2، 4، 6، 8)، والذي يحفز ثنائي الميثيل الأحادي وغير المتماثل؛ النوع الأول من ثنائي الميثيل( 1، 2، 4، 6، 8)، والذي يحفز ثنائي ثنائي الميثيل الأحادي وغير المتماثل؛ النوع النوع الثاني (PRMT5 و PRMT9) ، الذي يحفز ثنائي ميثيل أحادي ومتناظر ؛ والنوع الثالث (PRMT7)، والتي يمكن أن monomethylate أرجينينفقط 3.
نظرا لعدد متزايد من الأجسام المضادة الخاصة بمثيلة الأرجينين المتاحة تجاريا ، يمكن قياس نشاط PRMT باستخدام النشاف الغربي. الفلورسنت القائم على لطخة الغربية هي التقنية المفضلة على الكشف chemiluminescent بسبب مجموعة ديناميكية أكبر والخطية، وحساسية أعلى، والسماح لتعدد4. لتحديد مستويات ميثيل البروتين، يلزم تطبيع إشارة الميثيل إلى مستويات البروتين الإجمالية. عن طريق اختيار الأجسام المضادة للبروتين الكلي والميثيلية التي أثيرت في الأنواع المضيفة المختلفة (مثل الماوس والأرنب)، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المسماة بفلوروفوريس مختلفة ويمكن تحديد إشارة لكلا الجسمين المضادين في نفس نطاق العينة. تم تطوير الأجسام المضادة الميثيل أرجينين لتحديد وتوصيف أحادي ميثيلات، غير متماثل، أو بروتينات ثنائية الثيلات بشكل متناظر حيث يوجد الميثيل أرجينين في سياق محدد. منذ الغالبية العظمى من PRMTs الميثيلات glycine- وأرجينين الغنية الزخارف داخلركائزها 5, أثيرت عدة أجسام مضادة للببتيدات التي تحتوي على مونوميل أو غير متماثل, متماثل ثنائي ميثيل أرجينين الجليسين يكرر مثل D5A12, ASYM24, أو ASYM25, وSYM11, على التوالي. تم إنشاء أجسام مضادة أخرى الميثيل أرجينين ضد مكتبة الببتيد التي تحتوي على غير المتماثلة، المتماثل ثنائي ميثيل وأرجينين أحادي ميثيل في سياق تكرار تسهيل الكشف عن الميثيل أرجينين في هذه السياقات خاصة6. وهناك أيضا عدد متزايد من الأجسام المضادة التي تعترف علامة أرجينين محددة على بروتين واحد والتي تمكن من الكشف الانتقائي عن الميثيل مثل الهستون H4R3me2a أو BAF155-R1064me2a.
هناك العديد من مثبطات PRMT المتاحة تجاريا ، والتي يمكن استخدامها كأدوات للمقاايسات الخلوية PRMT. ومع ذلك، لا تتميز جميعها بدقة بالانتقائية والآثار خارج الهدف، وينبغي استخدام بعضها بحذر. وقد طور اتحاد الجينوم الهيكلي، بالتعاون مع المختبرات الأكاديمية وشركاء الأدوية، مثبطات PRMT قوية وانتقائية وقابلة نفاذية للخلايا (مسابير كيميائية) يمكن استخدامها دون أي قيود من قبل المجتمع العلمي. ويمكن الاطلاع على معلومات عن هذه المثبطات على https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics https://www.chemicalprobes.org/. المسابير الكيميائية هي مثبطات جزيء صغير مع في المختبر IC50 أو Kd < 100 nM، أكثر من 30 أضعاف الانتقائية على البروتينات في نفس الأسرة، والنشاط الخلوي كبيرة في 1 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك، كل مسبار كيميائي لديه التناظرية الكيميائية القريبة التي هي غير نشطة ضد الهدف المقصود7،8،9،10،11،12.
الهدف من هذا البروتوكول هو قياس النشاط الخلوي لأفراد عائلة PRMT الفردية باستخدام طريقة الفلورسنت الغربية. هنا يتم توفير معلومات مفصلة عن المؤشرات الحيوية المقايسة التحقق من صحة، والأجسام المضادة، ومثبطات قوية نشطة الخلية، فضلا عن استراتيجيات قيمة لتنفيذ الفحص الناجح.
Protocol
1. خلية زراعة والطلاء
ملاحظة: خلايا الثقافة مع وسائل الإعلام الموصى بها واختبار روتيني للتلوث الميكوبلازما. تم اختيار خلايا HEK293T وMCF7 وC2C12 كأمثلة حيث تم استخدام خطوط الخلايا هذه بنجاح في عمليات فحص PRMT.
- الثقافة HEK293T، MCF7، و C2C12 في DMEM تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، البنسلين (100 U مل−1)،والستريبتوميسين (100 ميكروغرام مل−1)في 10 سم الأنسجة الثقافة المعالجة (TC) أطباق.
- بالنسبة إلى المقايسة PRMT8، قم بزراعة خلايا الضربات القاضية القابلة للاختزال PRMT1 HEK293T في الوسائط التي تحتوي على دوكسيسيكلين (2 ميكروغرام/مل) لمدة 3 أيام قبل بدء الفحص.
- للوحة الخلايا، قم بإزالة الوسائط والتخلص منها من اللوحة.
- إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني (دون Ca+2 و Mg+2 الأيونات) لغسل الخلايا وتجاهل الحل.
- أضف 1 مل من تريبسين-EDTA (0.25٪)، واحتضن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم تجاهل الحل. احتضان حتى تصبح الخلايا جولة وفصل من لوحة. اضغط على اللوحة للمساعدة في فصل الخلايا، إذا لزم الأمر. بالنسبة للخلايا التي يصعب تجريبها، مثل C2C12، قم باحتضان اللوحة لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب التعرض للخلايا إلى حل التريبسين لفترات أطول (>10 دقيقة) لأنه سيقلل من صلاحية الخلية. - إضافة 1 مل من وسائل الإعلام prewarmed إلى لوحة، وخلايا ماصة بلطف صعودا وهبوطا لتفريق كتل الخلية. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، وإضافة 3-5 مل من وسائل الإعلام.
- لقياس عدد الخلايا، اخلط 10 ميكرولتر من الخلايا مع 10 ميكرولتر من أزرق تريبان ونقل 10 ميكرولتر إلى مقياس الدم أو استخدم أي طريقة أخرى لحساب الخلايا.
- تمييع الخلايا إلى كثافة الخلية الموصى بها ووضع 500 ميكرولتر / جيدا في لوحات TC 24 جيدا (الجدول 1). لإجراء عمليات الفحص الذاتية (PRMT1 وPRMT4 وPRMT5 وPRMT7 وPRMT9)، انتقل إلى الخطوة 3.1.
2. إصابة الخلية
- بالنسبة للمقاايسات الخارجية (PRMT3، PRMT6، PRMT8) خلايا HEK293T المتحولة مع الكمية الموصى بها من الحمض النووي (الجدول 2). خلايا HEK293T سهلة التحويل بحيث يمكن استخدام أي كاشف إصابة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. العلاج المركب
ملاحظة: لا تتجاوز تركيز ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) النهائي بنسبة 0.1٪ في وسائط الثقافة. الحفاظ على نفس تركيز DMSO في كل بئر. يمكن العثور على مثبطات PRMT الانتقائية (المسابير الكيميائية) ونظائرها غير النشطة ذات الصلة الوثيقة في الجدول 3.
- بالنسبة للمقاايسات الذاتية (PRMT1 وPRMT4 وPRMT5 وPRMT7 وPRMT9)، قم بإزالة الوسائط من الخلايا واستبدالها ب 500 ميكرولتر من الوسائط مع مركب أو DMSO وحده (التحكم).
ملاحظة: يستغرق عادة 2 أيام لمراقبة أكثر من 80٪ انخفاض في مستويات ميثيل R. - بالنسبة للمقاايسات الخارجية (PRMT3 و PRMT6 و PRMT8) ، قم بإزالة الوسائط بعد 4 ساعة من الإصابة ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسائط مع المركب أو DMSO وحده (التحكم) ، واحتضانها لمدة 20-24 ساعة.
4. إعداد خلية lysate
- إزالة جميع الوسائط من الآبار، وغسل مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة الوسائط المتبقية، وإضافة 60 ميكرولتر من العازلة تحلل (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8، 150 مليون م م كلوريد NaCl، 1 mM حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA)، 10 mM MgCl2، 0.5٪ تريتون X-100، 12.5 U mL−1 بنزوناز، كوكتيل مثبط بروتيز خال من EDTA) لكل بئر.
- احتضان لمدة تقل عن 1 دقيقة في RT، هزاز لوحة لتوزيع العازلة تحلل على الخلايا. ثم أضف 3 ميكرولتر من 20٪ ث / v كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، إلى تركيز 1 ٪ النهائي، ومزيج عن طريق اهتزاز بلطف. نقل اليسات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق وإبقائه على الجليد.
ملاحظة: إضافة البنزوناز والبروتين كوكتيل مثبطات الطازجة قبل الاستخدام. إضافة البنزوناز بسرعة هيدروليس الأحماض النووية مما يقلل من لزوجة ليسات الخلية.
- احتضان لمدة تقل عن 1 دقيقة في RT، هزاز لوحة لتوزيع العازلة تحلل على الخلايا. ثم أضف 3 ميكرولتر من 20٪ ث / v كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، إلى تركيز 1 ٪ النهائي، ومزيج عن طريق اهتزاز بلطف. نقل اليسات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق وإبقائه على الجليد.
- تحديد تركيز البروتين من العينات باستخدام BCA البروتين المقايسة كيت أو استخدام أي طريقة أخرى التي تتسامح مع 1٪ SDS في الحل.
- أضف 2 ميكرولتر من معايير التحلل والبروتين (0 و1 و2 و4 و8 ميكروغرام/مل من BSA في حاجز التحلل) إلى آبار اللوحة الواضحة 96 جيدا.
- امزج الكاشف A مع الكاشف B بنسبة 50:1 وأضف 200 ميكرولتر لكل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية وقراءة امتصاص.
- ضبط تركيز البروتين مع تحلل العازلة لتكون متساوية عبر العينات.
- أضف 20 ميكرولتر من 4x تحميل المخزن المؤقت إلى 60 ميكرولتر من lysate الخلية والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد التشبع الحراري ، يمكن تخزين الليزيات عند -20 درجة مئوية.
5. تحليل لطخة الغربية
- تحميل 5-20 ميكروغرام من مجموع lysate الخلية لتحليل البروتينات الهستون و 20-100 ميكروغرام للبروتينات الأخرى في هلام البروتين بيس تريس 4-12٪.
- تشغيل هلام في MOPS SDS تشغيل العازلة (50 م MOPS، 50 mM تريس قاعدة، 0.1٪ SDS ث / v، 1 mM EDTA، pH 7.7) لحوالي 2 ساعة في 100 V أو حتى الجبهة صبغ يصل إلى الجزء السفلي من هلام.
- إذا كان تنفيذ نقل الرطب، وتجميع شطيرة نقل في الجليد الباردة تريس-الجلايسين نقل العازلة (25 mM تريس، 192 mM الجليسين، 20٪ v/v الميثانول، و 0.05٪ ث / ضد SDS).
- ضع الإسفنج وورق التصفية وغشاء PVDF والجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تنشيط غشاء PVDF عن طريق نقع في الميثانول وهلام متساوية في نقل العازلة لمدة 30 ق قبل التجميع.
ملاحظة: استخدام الغشاء PVDF الغربية النشاف الموصى بها نظرا لأنه يحتوي على انخفاض autofluorescence وملاءمة للبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي، مثل الهستونات(جدول المواد).
- ضع الإسفنج وورق التصفية وغشاء PVDF والجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تنشيط غشاء PVDF عن طريق نقع في الميثانول وهلام متساوية في نقل العازلة لمدة 30 ق قبل التجميع.
- نقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF في مخزن نقل تريس-غليسين عند 70 فولت لمدة 1.5 ساعة على الجليد.
- كتلة غشاء لمدة 30 دقيقة في العازلة حجب (5٪ ث / v الحليب في المالحة العازلة الفوسفات، برنامج تلفزيوني). شطف مع عازلة غسل (PBST: 0.1٪ v/v توين-20 في برنامج تلفزيوني)، واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية في الالبومين مصل البقري (BSA) حل (5٪ BSA في PBST) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (الجدول 3).
ملاحظة: للتخزين لفترة أطول، فلتر تعقيم محلول BSA، إضافة 0.02٪ ث / v الصوديوم azide، والاحتفاظ في 4 درجة مئوية. - غسل الغشاء 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. ثم احتضان مع الماعز المضادة للأرنب (IR800) والحمار المضادة للفأرة (IR680) الأجسام المضادة في العازلة حظر الموصى بها (جدول المواد، الجدول 3) لمدة 30 دقيقة في RT وغسل 3 × 5 دقيقة مع PBST.
- قراءة إشارة على صور لطخة الغربية الفلورسنت في 800 و 700 نانومتر. ويفضل استخدام الأداة التي تسمح التصوير قوية وعصابات خافتة بوضوح في صورة واحدة مع حساسية عالية والمدى الديناميكي، وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتحذير عندما يتم التوصل إلى تشبع الصورة، فضلا عن تعدد لونين الفلورسنت في نفس النطاق عينة.
- تحديد كثافة النطاق لتحليل البقع الغربية باستخدام البرامج المناسبة للتصوير الغربي الفلوري.
Representative Results
وترد أدناه أمثلة على نتائج لطخة الغربية لل المقايسات الخلوية PRMTs الفردية. كما يتم تلخيص تفاصيل المقايسات في الجدول 4.
PRMT1 المقايسة
PRMT1 هو المساهم الرئيسي في الهستون 4 أرجينين 3 ثنائي ميثيل غير متماثل (H4R3me2a) في الخلايا13. عند فقدان نشاط PRMT1 ، تزيد مستويات Rme1 و Rme2s العالمية بشكل كبير13. كما هو مبين في الشكل 1A و 1B، يمكن استخدام العديد من الأجسام المضادة لرصد التغيرات العالمية في Rme1 ، Rme2a ، Rme2s ، وكذلك H4R3me2a. ويمكن ملاحظة انخفاض كبير في مستويات Rme2a وH4R3me2a العالمية والزيادات في Rme1 و Rme2s بعد 3 أيام من الضربة القاضية PRMT1 (الشكل 1A، B). خطوط الخلية تختلف في إشارة H4R3me2a القاعدية، لذلك، لتسهيل رصد فقدان النشاط PRMT1، خطوط الخلية مثل MCF7 مع مستويات الميثيل القاعدية العالية يمكن استخدامها (الشكل 1C). الوقت الأمثل لمراقبة تأثير تثبيط PRMT1، على سبيل المثال عند العلاج مع نوع I PRMT المانع MS0238،هو 2 أيام (الشكل 1D،1E). ينتج عن العلاج الأطول انخفاض قدرة الخلايا على البقاء والنمو.
PRMT3 المقايسة
بالنسبة للمقايسة الخلوية PRMT3 ، لا يمكن اكتشاف أي بروتينات انتقائية للعلامات الحيوية التي تتغير الميثيل في البقعة الغربية عند ضربة قاضية PRMT3 أو الإفراط في التعبير. وقد تبين PRMT3 إلى ثنائي ميثيلات غير متماثل H4R3 في المختبر14، ومع ذلك ، يتم إيداع العلامة في الغالب من قبل PRMT1 ، وبالتالي تم تصميم مقايسة خارجية مع PRMT3 مفرط التعبير. بما يتفق مع النتائج في المختبر، أدى الإفراط في التعبير عن PRMT3 البرية من النوع ولكن ليس متحولة الحفازة (E338Q) إلى زيادة في مستويات H4R3me2a(الشكل 2A). تم استخدام خلايا HEK293T نظرا لأن لديها ميثيل القاعدي منخفضة من هذه العلامة(الشكل 1C). تم التحقق من صحة الفحص مع PRMT3 المانع الانتقائي SGC7077، والتي منعت PRMT3 تعتمد H4R3 مثيلة غير متماثلة (الشكل 2B).
PRMT4 المقايسة
PRMT4 ثنائي ميثيلات غير متماثل BAF155 في أرجينين 106415. منذ الأجسام المضادة الكشف عن BAF165-R1064me2a متاح تجاريا، يمكن رصد نشاط PRMT4 في الخلايا عن طريق وصمة عار الغربية عن طريق الكشف عن التغيرات في مستويات علامة R1064me2a. فقدان البروتين PRMT4 أو تثبيط النشاط الحفاز مع مثبط PRMT4 انتقائية, TP-06410, يؤدي إلى انخفاض في مستويات BAF165-R1064me2a (الشكل 3). عادة ما يكون العلاج لمدة يومين كافيا لإزالة معظم إشارة الميثيل.
PRMT5 المقايسة
PRMT5 هي المسؤولة عن غالبية البروتين أرجينين متماثل ثنائي ميثيل. وقد أفيد سابقا أن البروتينات المركبة SMN المختلفة، بما في ذلك SmBB'، هي PRMT5 ركائز16. يمكن رصد نشاط PRMT5 من خلال النظر في التغيرات في المستويات العالمية من ثنائي ميثيل الأرجينين المتماثل أو ثنائي ميثيل ثنائي الفينيل المتماثل لبروتينات SmBB. ضربة قاضية من PRMT5، ولكن ليس PRMT1 ، 3 ، 4 ، 6 ، و 7 النتائج في انخفاض في مستويات Rme2s العالمية(الشكل 4A). في معظم خطوط الخلية، والعلاج من الخلايا مع PRMT5 مثبطات انتقائية LLY-28311 وGSK591 لمدة 2-3 أيام قمعت معظم إشارة SmBB'Rme2s (الشكل 4B). معظم الخلايا حساسة لتثبيط PRMT5 ، مما يؤدي إلى انخفاض في انتشار الخلايا وموت الخلايا مع التعرض للمثبطات لفترات طويلة.
PRMT6 المقايسة
وقد أفيد أن PRMT6 هو المساهم الرئيسي لهستون H3 أرجينين 2 ثنائي ميثيل غير المتماثلة (H3R2me2a) في الخلايا17. في خلايا HEK293T، لم تكن الضربة القاضية PRMT6 لمدة 3 أيام كافية لمراقبة انخفاض كبير في مستويات H3R2me2a. ومع ذلك، فإن التعبير المفرط عن نوع البرية PRMT6 ولكن ليس متحولة الحفاز (V86K/D88A) يزيد من مستويات H3R2me2a، فضلا عن H3R8me2a وH4R3me2a(الشكل 5A). هناك العديد من مثبطات التي تمنع نشاط PRMT6 مع قوة مختلفة والانتقائية: انتقائي, allosteric PRMT6 مثبطات SGC687018, PRMT نوع I مثبط MS0238, وPRMT4/6 مثبط MS0499. كل هذه تثبيط PRMT6 تعتمد H3R2 (الشكل 5B)، وكذلك H4R3 وH3R8 ثنائي ميثيل غير متماثل (البيانات غير مبين).
PRMT7 المقايسة
PRMT7 أحادي ميثيلات أرجينين 469 في كل من الأشكال التأسيسية وغير القابلة للانزهاك من HSP70 (HSPA8 و HSPA1/6، على التوالي)12. على الرغم من عدم وجود أجسام مضادة متاحة تجاريا ، والتي تكشف عن مستويات HSP70-R469me1 ، يمكن اكتشاف العلامة بأجسام مضادة أحادية ميثيل عموم. فقدان البروتين PRMT7 أو تثبيط النشاط الحفاز مع مثبط PRMT7 الانتقائية، SGC302712،يؤدي إلى انخفاض مستويات HSP70-R469me1 (الشكل 6A، B). SGC3027 هو برودرودروغ نفاذية الخلية، والتي في الخلايا يتم تحويلها عن طريق الاختزال إلى مثبط PRMT7 الانتقائي SGC8158، وبالتالي قد تختلف قوة الخلوية بين خطوط الخلية. تعبر عدة خطوط للخلايا السرطانية عن أشكال متساوية HSP70 غير قابلة للانزداع عند مستويات عالية، ويمكن أن يكون من الصعب اكتشاف الميثيل بسبب تداخل نطاق غير محدد من أصل نووي(الشكل 6C). لذلك ، بالنسبة للمقايسة الخلوية PRMT7 ، يوصى بخطوط الخلايا التي تعبر في الغالب عن HSPA8 مثل C2C12 ، أو بما أن HSP70 يترجمة بشكل رئيسي في السيتوبلازم ، حدد مستويات HSP70-R469me1 في الكسر السيتوبلازمي لخطوط الخلية المفضلة.
PRMT8 المقايسة
PRMT8 هو PRMT الوحيد مع نمط التعبير المقيد بالأنسجة - يتم التعبير عنه إلى حد كبير في الدماغ19. انها تشترك في 80 ٪ تشابه تسلسل ولها تفضيل الركيزة مماثلة كما PRMT119. وهو يختلف عن PRMT1 أساسا في ن-terminus، حيث نتائج myristoylation في ارتباط PRMT8 مع غشاء البلازما20. وقد أفيد أن PRMT8 جنبا إلى جنب مع PRMT1 ميثيلات الحمض النووي الريبي ملزمة بروتين EWS21. منذ PRMT8 النشاط منخفض في خطوط الخلايا غير العصبية ويمكن أيضا أن يكون ميثيل EWS من قبل PRMT1، تم تطوير المقايسة التي PMRT8 هو التعبير المشترك جنبا إلى جنب مع EWS في خلايا الضربة القاضية PRMT1. منذ PRMT1 هو جين أساسي وفقدانه على المدى الطويل النتائج في موت الخلية، وهو نظام لا يمكن الاخلاص فيه PRMT1 هو هدمت لمدة 3 أيام قبل استخدامها في PRMT8 تم استخدام المقايسة(الشكل 7A). التعبير المشترك عن PRMT8 البرية من النوع ، ولكن ليس متحولة غير نشطة بشكل حفاز (E185Q) ، جنبا إلى جنب مع EWS أدى إلى زيادة مستويات ثنائي ميثيل EWS غير المتماثل(الشكل 7B). تم اختبار العديد من الأجسام المضادة ثنائي ميثيلاجين غير المتماثلة وتم الكشف عن الميثيل فقط مع الأجسام المضادة Asym25. تم التحقق من صحة الفحص مع اختبار كيميائي انتقائي من نوع PRMT I ، MS0238، مما أدى إلى انخفاض ثنائي ميثيل ثنائي ميثيل غير متماثل معتمد على PRMT8 من EWS الخارجية(الشكل 7B). على الرغم من MS023 قوية جدا في تثبيط PRMT8 في المقايسات في المختبر, في الخلايا مطلوب تركيزات عالية من MS023 لرؤية تثبيط الميثيل21.
PRMT9 المقايسة
PRMT9 تبين أن dimethylate SAP145 متناظرة في أرجينين 50822. لسوء الحظ، لا يمكن للأجسام المضادة المتاحة تجاريا التعرف على العلامة. بالنسبة للمقاايسة PRMT9 ، تم استخدام الأجسام المضادة التي تكرمت بالهدية من قبل الدكتور يانتشونغ يانغ (معهد بيكمان للأبحاث في مدينة الأمل). عندما يتم التعبير عن أكثر من ذلك، نوع البرية ولكن ليس R508K متحولة SAP145 ميثيل من قبل PRMT9(الشكل 8A). تم تصميم المقايسة لمراقبة مستويات SAP145-R508me2s الذاتية وتم التحقق من صحتها باستخدام المركب X ، وهو نموذج أولي مثبط PRMT9 (العمل قيد التنفيذ ، لم ينشر بعد) ، والذي يمنع بقوة PRMT9 في المختبر مع قوة النانو. انخفاض مستويات SAP145-R508me2s المركب X بطريقة تعتمد على الجرعة(الشكل 8B).
الشكل 1. PRMT1 الفحص الخلوي. (أ) نتائج PRMT1 ضربة قاضية في انخفاض ثنائي ميثيل أرجينين غير المتماثلة العالمية (Rme2a) وزيادة مستويات متماثل أرجينين ثنائي ميثيل (Rme2s) وأحادية البرومثيل (Rme1). يتم تقديم كفاءة الضربة القاضية PRMT1 في لوحة B. (B) PRMT1 الضربة القاضية يقلل من ثنائي ميثيل غير المتماثلة من H4R3 الهستون (H4R3me2a). (ج) تختلف مستويات H4R3me2a القاعدية عبر خطوط الخلايا المختلفة. (D) نوع I PRMT المانع MS023 يقلل من مستويات H4R3me2a بطريقة تعتمد على الجرعة. عولجت خلايا MCF7 مع MS023 لمدة يومين. (ه)يمثل الرسم البياني التناسب غير الخطي لكثافة إشارة H4R3me2a التي تم تطبيعها إلى إجمالي الهستون H4. MS023 IC50 = 8.3 نانومتر (n =1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. PRMT3 الفحص الخلوي. (أ)يزيد التعبير المفرط عن النوع البري (WT) ولكن ليس متحولة محفزة E338Q من PRMT3 مستويات H4R3me2a في خلايا HEK293T. تم تحويل الخلايا مع PRMT3 العلم الموسومة لمدة 24 ساعة (ب) PRMT3 المانع الانتقائي، SGC707، يقلل PRMT3 ectopic تعتمد H4R3 إزالة الإيثيل غير المتماثلة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. PRMT4 الفحص الخلوي. (أ) نتائج PRMT4 ضربة قاضية في انخفاض BAF155-R1064 ثنائي ميثيل أرجينين غير المتماثل (خلايا HEK293T). (ب) PRMT4 مثبطات انتقائية, TP-064, يقلل BAF155-R1064Rme2a المستويات. عولجت خلايا HEK293T بالمجمع لمدة يومين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. PRMT5 الفحص الخلوي. (أ) PRMT5 يؤدي إلى انخفاض مستويات ثنائي ميثيل أرجينين متماثلة (خلايا MCF7). (ب) PRMT5 مثبطات انتقائية GSK591 و LLY-283, تقليل SmBB 'متماثل أرجينين ثنائي ميثيل (الأخضر), في حين أن المستويات الإجمالية SmBB 'لا تزال دون تغيير (أحمر). عولجت خلايا MCF7 بالمركبات لمدة يومين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. PRMT6 الفحص الخلوي. (أ)يزيد التعبير المفرط عن النوع البري (WT) ولكن ليس V86K/D88A من PRMT6 المتحول الحفاز من مستويات H4R3me2a و H3R2me2a وH3R8me2a في خلايا HEK293T. تم تحويل الخلايا المصابة مع PRMT6 الموسومة بالعلم لمدة 24 ساعة (B) مثبط PRMT6 الانتقائي (SGC6870) ، مثبط PRMT النوع الأول (MS023) ، ومثبطات PRMT4 /6 (MS049) انخفاض مستويات H3R2me2a التابعة PRMT6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. PRMT7 الفحص الخلوي. (أ) PRMT7 نتائج خروج المغلوب في انخفاض HSP70-R469 أحادية الوميثيل (HCT116 الخلايا). (ب) مثبطات PRMT7 الانتقائية، SGC3027، يقلل من أحادية HSP70-R469 في خلايا C2C12. عولجت الخلايا بالمجمع لمدة يومين. (ج)يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن ميثيل HSP70-R469 من HSP70 غير القابلة للاختزال (HSPA1/6) مع الأجسام المضادة أحادية الميثيل أرجينين (Rme1) بسبب تداخل نطاق غير محدد من أصل نووي. من المستحسن قياس مستويات ميثيل HSP70 في الكسر السيتوبلازمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. PRMT8 الفحص الخلوي. (أ)يمكن الكشف عن ميثيل PRMT8 من EWS عندما يتم منع نشاط PRMT1 بالضربة القاضية. تم نقل خلايا HEK293T مع ناقل الضربة القاضية PRMT1 غير قابل للانتزال. بعد 3 أيام من علاج دوكسيسيكلين، تم تخفيض مستويات PRMT1 بشكل كبير. (ب)عندما يتم إسقاط PRMT1، يتم ثنائي الثيلين EWS الخارجية غير متماثل من قبل نوع البرية OVEREXPRESSED PRMT8 ولكن ليس متحولة الحفازة (E185Q) من PRMT8. يتم تقليل الميثيل بتركيز عال من مثبط PRMT من النوع الأول (MS023). تم مشاركة خلايا HEK293T PRMT1KD مع نوع PRMT8 البري الموسوم بالعلم أو متحولة محفزة وEWS الموسومة ب GFP وتعامل مع MS023 لمدة 20 ساعة.
الشكل 8. PRMT9 الفحص الخلوي. (أ)نوع البرية ولكن ليس R508K متحولة SAP145 هو ميثيل من قبل PRMT9. تم تحويل خلايا HEK293T مع SAP145 الموسومة ب GFP لمدة يوم واحد. (ب) يقلل النموذج الأولي لمثبطات PRMT9 (المركب X) من ثنائي ميثيل R508 المتماثل ل SAP145 التابع ل PRMT9 بطريقة تعتمد على الجرعة. تم علاج خلايا HEK293T بالمجمع لمدة يومين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| PRMT | خلايا | الكثافة لكل مل |
| PRMT1 | MCF7 | 1 × 105 |
| PRMT3 | HEK293T | 2 × 105 |
| PRMT4 | HEK293T | 1 × 105 |
| PRMT5 | MCF7 | 1 × 105 |
| PRMT6 | HEK293T | 2 × 105 |
| PRMT7 | C2C12 | 1 × 105 |
| PRMT8 | HEK293T (PRMT1 دينار كويتي)* | 2 × 105 |
| PRMT9 | HEK293T | 2 × 105 |
| * علاج الخلايا مع دوكسيسيكلين (2 ميكروغرام / مل) 3 أيام قبل الطلاء لPRMT8 المقايسة | ||
الجدول 1 - الجداول أنواع الخلايا وكثافات الموصى بها ل PRMT المقايسات.
| PRMT | μg الحمض النووي/24-جيدا | أدجين # | ملاحظات إضافية |
| PRMT3 | 0.5 العلم -PRMT3 | 164695 | |
| أو 0.5 العلم -PRMT3 (E338Q) | 164696 | ||
| PRMT6 | 0.5 العلم -PRMT6 | 164697 | |
| أو 0.5 FLAG-PRMT6 (V86K/D88A) | 164698 | ||
| PRMT8 | 0.05 EWS-GFP | 164701 | |
| 0.45 PRMT8-العلم | 164699 | ||
| أو 0.45 PRMT8 (E185Q) - العلم | 164700 | ||
| PRMT9 | 0.05 SAP145-GFP | NA | هدية من الدكتور يان تشونغ يانغ، معهد بيكمان للبحوث في مدينة الأمل |
| أو 0.05 SAP145-R508K-GFP | |||
| 0.45 متجه فارغ |
الجدول 2 - الأرباح تركيز الحمض النووي الموصى به لتجربة العدوى.
| PRMT | جسم | مسبار كيميائي (نشاط الخلية IC50) | التحكم السلبي |
| PRMT1 | H4R3me2a (1:2000) | MS023 -PRMT النوع الأول | MS094 |
| Rme1 (1:1000) | (PRMT1، PRMT6، PRMT3، PRMT4 IC50 = 9، 56، 1000، 5000 nM، على التوالي) | ||
| Rme2s (1:2000) | |||
| Rme2a (1:2000) | |||
| Rme2a (ASYM24، 1:3000) | |||
| Rme2a (ASYM25، 1:2000) | |||
| H4 (1:2000) | |||
| ب-أكتين (1:500 ) | |||
| PRMT3 | H4 (1:2000) | SGC707 (IC50 = 91 نانومتر) | XY-1 |
| H4R3me2a (1:2000) | |||
| العلم (1:5000) | |||
| PRMT4 | BAF155 (1:200) | TP-064 (IC50 = 43 nM) | TP064N |
| BAF155-R1064me2a (1:3000) | SKI-73 (IC50 = 540 nM)* | سكي-73N* | |
| PRMT5 | مكافحة SMBB '(1:100) | LLY-283 (IC50 = 30 nM) | LLY-284 |
| Rme2s (#13222، 1:2000) | GSK591 (IC50 = 56 nM) | SGC2096 | |
| PRMT6 | H4R3me2a (1:2000) | SGC6870 (IC50 = 0.9 ميكرومتر) | SGC6870N |
| H4 (1:2000) | MS023 -PRMT النوع الأول | MS094 | |
| H3R2me2a ( 1:2000) | (PRMT1، PRMT6، PRMT3، PRMT4 IC50 = 9، 56، 1000، 5000 nM، على التوالي) | ||
| H3R8me2a (1:2000) | MS049 (PRMT 4، 6 IC50 = 970، 1400 nM، على التوالي) | MS049N | |
| H3 ( 1:5000) | |||
| العلم ( 1:5000) | |||
| PRMT7 | Rme1 (1:1000) | SGC3027 (IC50 = 1300 nM) * | SGC3027N* |
| Hsp/Hsc70 (1:2000)* | |||
| PRMT8 | GFP (1:3000) | MS023 (50 ميكرومتر) | MS094 |
| Rme2a (ASYM25,1:2000) | |||
| العلم (1:5000) | |||
| PRMT9 | SAP145 (1:1000) | ||
| SAP145-R508me2s -نوع هدية من الدكتور يانتشونغ يانغ، معهد بيكمان للبحوث من مدينة الأمل (1:1000) (PIMID: 25737013) | |||
| الأجسام المضادة الثانوية | الماعز المضادة للأرانب IgG-IR800 (1:5000) | ||
| حمار المضادة للفأرة IgG-IR680 (1:5000) | |||
| *- يتعرف الجسم المضاد على HSPA8 و HSPA1 و HSPA6 (تم اختباره باستخدام بروتينات معلمة ب GFP مفرطة التعبير) ، * prodrug - قد يختلف IC50 بين خطوط الخلايا المختلفة | |||
الجدول 3 - الأرباح الأجسام المضادة الموصى بها و PRMT المسبار الكيميائي / مركبات أداة التحكم السلبية.
| PRMT | علامة بيولوجية | قراءات المقايسة | التحقق من صحة الفحص | خط الخلية الموصى به | الرقم المرجعي. | ||||||||
| PRMT1 | H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a | مستويات H4R3me2a تطبيع إلى مجموع H4 العالمية Rme1, Rme2a أو Rme2s مستويات تطبيع إلى B-actin. | انخفاض الضربة القاضية PRMT1 القاعدية H4R3me2a ومستويات Rme2a العالمية وزيادة مستويات Rme1 و Rme2s العالمية في الخلايا (Fig.1A, B). PRMT النوع الأول مسبار كيميائي MS023 خفض مستويات H4R3me2a بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1D). | تختلف الخلايا في مستويات H4R3me2a القاعدية (الشكل 1C). تحتوي خلايا MCF7 على مستويات عالية من H4R3me2a القاعدية مما يجعلها الأفضل للمقاايسات التي تراقب الانخفاض في نشاط PRMT1. | 8 | ||||||||
| PRMT3 | H4R3me2a | H4R3me2a مستويات الميثيل الناجمة عن علم خارجي الموسومة PRMT3 WT أو محفز E338Q متحولة (خلفية) تطبيع لإجمالي الهستون H4 | الإفراط في التعبير عن نوع البرية PRMT3 ولكن ليس متحولة الحفاز (E338Q) زيادة H4R3me2a (الشكل 2A). PRMT3 المانع الانتقائي SGC707 انخفض PRMT3 زيادة تعتمد في مستويات H4R3me2a (الشكل 2B) | تحتوي خلايا HEK293T على مستويات منخفضة من H4R3me2a القاعدية (الشكل 1C)، وهو أمر مفضل لرصد نشاط PRMT3 الخارجي | 7 | ||||||||
| PRMT4 | BAF155-R1064me2a | BAF155-R1064me2a مستويات تطبيع إلى إجمالي BAF155 | PRMT4 ضربة قاضية انخفض ثنائي ميثيل غير المتماثلة من BAF155 (الشكل 3A). 2 العلاج اليوم مع PRMT4 التحقيق الكيميائي الانتقائي (TP-064) انخفض ثنائي ميثيل غير المتماثلة من BAF155 (الشكل 3B). | أي خط خلية | 10 | ||||||||
| PRMT5 | SmBB'-Rme2s | تم الكشف عن مستويات SmBB'Rme2s مع الأجسام المضادة ل Pan Rme2s (CST) التي تم تطبيعها إلى إجمالي SmBB' | وأدى إسقاط PRMT5 إلى انخفاض مستويات ثنائي ثنائي الفينيل المتماثلة في SmBB (الشكل 4A). 2 العلاج اليوم مع PRMT5 مسابير كيميائية انتقائية، GSK591 و LLY285، وانخفاض مستويات SmBB'Rme2s (الشكل 4B). | أي خط خلية | 11 | ||||||||
| PRMT6 | H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a |
H4R3me2a، H3R2me2a أو H3R8me2a مستويات الميثيل يتم زيادة بواسطة EXOGENOUS FLAG الموسوم PRMT6 WT ولكن ليس محفز V86K، D88A متحولة (الخلفية) تطبيع لإجمالي الهستون H4 أو H3، على التوالي | الإفراط في التعبير عن نوع البرية PRMT6 ولكن ليس لها متحولة الحفاز (V86K, D88A) زيادة H3R2me2a, H3R8me2a وH4R3me2a مستويات (الشكل 5A). Allosteric PRMT6 المانع (SGC6870), PRMT نوع I مثبطات MS023 , PRMT4/6 المانع MS049 انخفض PRMT6 زيادة تابعة في مستويات H3R2me2a (الشكل 5B). | تحتوي خلايا HEK293T على مستويات منخفضة من H4R3me2a و H3R2me2a و H3R8me2a ، وهو أمر مفضل لمراقبة نشاط PRMT6 الخارجي | 8,9 | ||||||||
| PRMT7 | HSP70-R469me1 | تطبيع مستويات ميثيل HSP70-Rme1 إلى إجمالي HSP70 | PRMT7 بالضربة القاضية أو الضربة القاضية خفضت HSP70 أحادية الثيل (الشكل 6A). 2 العلاج اليوم مع PRMT7 التحقيق الكيميائي الانتقائي SGC3027 انخفض PRMT7 تعتمد HSP70 أحادية في جرعة تعتمد على طريقة (الشكل 6B). | C2C12, HT180 تعبر عدة خطوط للخلايا السرطانية عن شكل غير قابل للاختزال من HSP70 تتداخل إشارة الميثيل الخاصة به مع بروتين غير محدد المنشأ (الشكل 6C). في هذه الحالة، نوصي بتحليل مستويات ميثيل HSP70 في الكسر السيتوبلازمي. |
12 | ||||||||
| PRMT8 | EWS-Rme2a | مستويات ميثيل EWS الموسومة ب GFP الخارجية الناجمة عن PRMT8 WT أو E185Q المحفزة (الخلفية) الخارجية ، التي تم تطبيعها إلى إجمالي إشارة GFP في خلايا PRMT1 KO. | الإفراط في التعبير عن نوع البرية PRMT8 ولكن ليس محفز E185Q متحولة ميثيل EWS ectopic فقط في خلايا PRMT1 KD (الشكل 7A). PRMT نوع I مسبار كيميائي MS023 منعت ثنائي ميثيل غير متماثل من EWS الخارجية بواسطة PRMT8 (الشكل 8B). | HEK293T PRMT1 دينار كويتي (غير قابل للانتزاف). PRMT1 يؤدي إلى موت الخلية لذلك نوصي باستخدام نظام غير قابل للاختزال. |
8 | ||||||||
| PRMT9 | SAP145-R508me2s | PRMT9 تعتمد SAP145 ثنائي الفينيل المتماثل في R508 تطبيع إلى SAP145 | خسارة PRMT9 ولكن ليس PRMT5 يؤدي إلى انخفاض ثنائي ميثيل متماثل من SAP145. تم ميثيل SAP145 WT الموسومة ب GFP ولكن ليس SAP145mut (R508K) من قبل PRMT9 (الشكل 8A). العلاج لمدة يومين مع Copound X، النموذج الأولي مثبط PRMT9، انخفض مستويات SAP145-R508me2s بطريقة تعتمد على الجرعة الشكل 8B). | أي خط خلية | 21 | ||||||||
الجدول 4 - الأرباح ملخص اختبارات PRMT.
Discussion
هنا ، يتم وصف بروتوكولات الفحص الخلوي التفصيلية لأفراد عائلة PRMT التي تستخدم أساليب النشاف الغربية الفلورية. تم اختيار الركائز الفريدة التي يمكن اكتشاف التغيرات في ميثيل الأرجينين بسهولة عند فقدان PRMT الفردي أو التثبيط الحفاز ولا يمكن تعويضها من قبل أفراد الأسرة الآخرين. يتم ميثيل بعض البروتينات من قبل PRMTs متعددة21،23، مما يشير إلى تداخل في خصوصية الركيزة حيث تساهم بعض PRMTs سوى كمية صغيرة من العلامة الخلوية في ركيزة بروتين معين24،25،26،27، على سبيل المثال ، يساهم كل من PRMT8 و PRMT1 في ميثيل EWS. لذلك، كل المقايسة تتطلب التحقق من صحة شاملة من الركائز والأجسام المضادة مع التجارب الضربة القاضية و / أو الإفراط في التعبير والمزيد من التحقق من صحة مع مثبطات انتقائية تتميز بشكل جيد. تم تحديد ركائز محددة PRMT التي يمكن الكشف عن تغييرات علامة الميثيل في غضون 2-3 أيام بعد فقدان PRMT / تثبيط لتجنب الآثار المركبة لانخفاض صلاحية الخلية والانتشار التي قد تؤثر بشكل غير مباشر على مستويات علامة الميثيل أرجينين. على الرغم من أنه كان من الممكن العثور على ركائز فريدة من نوعها لPRMT1 و 4 و 5 و 7 و 9 ؛ بالنسبة ل PRMT3 و 6 و 8 ، كان لا بد من استخدام نهج اكتساب الوظيفة. تم اختبار العديد من الأجسام المضادة الخاصة بمثيل الأرجينين لمختلف الأهداف الخلوية ، ولكن لم يتمكن أي منها من اكتشاف تغييرات كبيرة في غضون 3 أيام من الضربة القاضية PRMT3 و PRMT6 ؛ لذلك ، تم تطوير مقايسات العلامات الحيوية باستخدام الإنزيمات المعبر عنها خارج الرحم جنبا إلى جنب مع المسوخ غير النشطة الحفازة ، والتي كانت بمثابة عنصر تحكم لمثيلة الركيزة الأساسية. PRMT8 هو تجانس PRMT1 قريب ويشارك تفضيلات ركيزة مماثلة. كما لم يتم تحديد علامة بيولوجية انتقائية PRMT8، تم تطوير مقايسة في خلايا الضربة القاضية PRMT1، حيث تم التعبير عن PRMT8 بالاشتراك مع EWS. PRMT1 هو أيضا إنزيم رئيسي مسؤول عن الميثيل غير المتماثل H4R3 ، لذلك ، لاستخدام H4R3me2a كمرسم حيوي ل PRMT3 وPRMT6 المقايسات الخلوية ، تم اختيار الخلايا ذات مستويات H4R3me2a القاعدية المنخفضة وكذلك المسوخ غير النشطة بشكل تحفيزي كتحكم في الخلفية. على الرغم من أن يتم تفضيل المقايسات الذاتية، المقايسات الخارجية تثبت لا تقدر بثمن لاختبار قوة الخلوية من عدة مثبطات PRMTانتقائية 7،8،9. مع المعرفة المتزايدة لبيولوجيا PRMT ، نتوقع تحسين المقايسات من خلال العثور على بروتينات أكثر تحديدا للعلامات الحيوية PRMT3 و PRMT6 و PRMT8.
استخدام الأجسام المضادة التحقق من صحة والضوابط المناسبة حاسمة لأداء PRMT المقايسة. جميع الأجسام المضادة الموصى بها هنا قد تم التحقق من صحتها بدقة عن طريق تجارب الضربة القاضية والإفراط في التعبير ، ومع ذلك ، فإن الاختلافات دفعة إلى دفعة ، خاصة في حالة الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، قد لا تزال تؤثر على أدائها. لذلك، من المهم استخدام الطرق الجينية والتحقيقات الكيميائية جنبا إلى جنب مع الضوابط السلبية ذات الصلة الوثيقة لتأكيد موثوقية المقايسة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لمقاايسات PRMT التي تتطلب التعبير المفرط عن البروتين ، من الأهمية بمكان استخدام المسوخ غير النشطة بشكل تحفيزي جنبا إلى جنب مع البروتين البري لتحديد مستويات الميثيل القاعدية.
ويمكن أن تكون هذه المجموعة من المقايسات الكمية لتوصيف نشاط تكنولوجيات PRMTs في الخلايا مفيدة على نطاق واسع للمجتمع العلمي حيث يمكن تنفيذها بسرعة وسهولة بأقل قدر من المعدات والخبرة التقنية المحدودة، والتي تنطوي فقط على زراعة الخلايا الأساسية وتقنيات النشاف الغربية الفلورية. ويمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة الموصى بها والتحقيقات الكيميائية ل PRMTs لإجراء عمليات تقييم تنميط البروتين القائمة على النشاط (ABPP) لتحديد مدى ملاءمة مسبار ABPP معين ، ورصد المشاركة المستهدفة ، وتقييم الآثار خارج الهدف باستخدام تنسيق ABPP التنافسي. يمكن أيضا استقراء نهج تطوير المقايسة التي تمت مناقشتها هنا لعائلات الإنزيم الأخرى مثل lysine-methyltransferases البروتينية والأسيتيل ترانسفيراسي.
Disclosures
ولا يملك صاحبا البلاغ أي مصالح مالية متنافسة أو مصالح متضاربة أخرى للإعلان عنها.
Acknowledgments
اتحاد الجينوم الهيكلي هو مؤسسة خيرية مسجلة (رقم: 1097737) تتلقى الأموال من AbbVie ، باير AG، بوهرنجر إنغلهايم، Genentech، الجينوم كندا من خلال معهد أونتاريو الجينوم [OGI-196]، والاتحاد الأوروبي وEFPIA من خلال مبادرة الأدوية المبتكرة 2 التعهد المشترك [EUbOPEN منحة 875510]، يانسن، ميرك KGaA (الملقب EMD في كندا والولايات المتحدة)، فايزر، تاكيدا وصندوق ويلكوم [106169/ZZ14/Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
| 24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
| Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
| anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
| anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
| anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
| anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
| anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
| anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
| anti-GFP | Clontech | 632381 | |
| anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
| anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
| anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
| anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
| anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
| anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
| anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
| anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
| anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
| anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
| anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
| anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
| anti-Rme1 | CST | 8015 | |
| anti-Rme2a | CST | 13522 | |
| anti-Rme2s | CST | 13222 | |
| anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
| anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
| anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
| anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
| benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
| BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
| C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
| donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
| doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
| EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| FBS | Wisent | 80150 | |
| glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
| goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
| HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
| Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
| Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
| MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
| Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
| PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
| PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
| penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
| SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
| skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
| Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
| Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
| Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
| trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |
References
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311 (2013).
- Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
- Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
- Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
- Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
- Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
- Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396 (2020).
- Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
- Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
- Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307 (2014).
- Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
- Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
- Yudao Shen,, L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
- Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
- Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
- Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428 (2015).
- Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
- Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571 (2017).
- Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).
