Summary
我们描述了对小鼠气道中 阿斯珀吉卢斯·福米加图斯 孔尼迪亚（3微米大小）分布进行定量分析的方法。该方法还可用于分析各种病理条件模型中气道中的微粒和纳米粒子聚集分布。
Abstract
阿斯珀吉卢斯·福米加图斯 ·科尼迪亚是空气中的病原体，可以穿透人类的气道。免疫能力不过敏的人表现出抵抗力和免疫耐受性，而在免疫功能低下的患者中，针叶可以殖民气道并导致严重的侵入性呼吸系统疾病。不同气道舱内的各种细胞参与防止真菌入侵的免疫反应：然而，病原体消除的时空方面尚未完全了解。光学清除的全安装器官，特别是实验鼠的肺部的三维（3D）成像，允许在感染后不同时间点在气道中检测荧光标记的病原体。在本研究中，我们描述了一个实验设置，对气道中的 A.富米加图斯 针叶分布进行定量分析。利用荧光聚焦激光扫描显微镜（CLSM），我们追踪了在向小鼠应用咽喉后6小时，支气管支部和肺泡室中荧光标记的针叶的位置。此处描述的方法以前用于检测准确的病原体位置和识别免疫反应不同阶段的病原体相互作用细胞。实验设置可用于估计不同病理条件下病原体消除的动能。
Introduction
每天，人们吸入空气中的病原体，包括机会性真菌阿斯珀吉卢斯烟熏（A.富米加图斯针叶）孢子，可以穿透呼吸道1。哺乳动物的呼吸道是不同代的气道系统，其特征是气道壁2、3、4的不同结构。气管支气管壁由多种细胞类型组成，其中细胞是提供粘膜间隙5的细胞。在藻类中，没有细胞，渗透性藻类空间病原体不能通过粘血清除6来消除。此外，每个气道生成是多个免疫细胞群的利基，这些群体的子集对于某些气道隔间来说是独一无二的。因此，藻类巨噬细胞位于气管室中，而气管和导管都与腹内树突状细胞7，8衬里。
A.富米加图斯针叶的大致大小为2-3.5μm9。由于人类甚至小鼠小气道的直径超过3.5μm，因此建议conidia可以穿透2、10、11的藻类空间。事实上，组织学检查显示，患有腹血病12的患者在骨泡中真菌生长。科尼迪亚也被发现在受感染小鼠的肺泡使用厚肺片13的活成像。同时，在14号小鼠支气管上皮的亮侧检测到锥形。
光学清除的全安装鼠肺的三维（3D）成像允许对气道15进行形态分析。特别是使用光学清除小鼠肺标本15对内脏胸神经分布进行定量分析。最近，Amich等人利用光学清除小鼠肺标本的光片荧光显微镜，对针 叶在免疫功能低下的小鼠体内应用后的真菌生长进行了调查。感染后不同时间点在气道中休息的conidia的精确位置对于识别细胞群非常重要，这些细胞群可以在炎症的某些阶段提供足够的抗真菌防御。然而，由于体积相对较小，气道中 A.fumigatus 针叶分布的时空分布特征较差。
在这里，我们提出了一个实验设置，用于定量分析受感染小鼠气道中的A.fumigatus针叶分布。我们使用荧光聚焦激光扫描显微镜（CLSM），对接受荧光标记为A.fumigatusconidia的鼻咽应用的小鼠的肺部进行光学清除，我们获得3D图像并执行图像处理。使用全安装肺叶的3D成像，我们之前已经显示了A.fumigatusconidia在小鼠的导流气道分布72小时后，针叶应用8。
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Protocol
这里描述的所有实验室动物方法都已得到俄罗斯科学院舍米亚金和奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所机构动物护理和使用委员会（协议编号226/2017）的批准。
1. A. 富米加图斯·科尼迪亚申请
- 要获得荧光标记 的A.富米加图斯 针叶，修复5×108 针叶，通过添加1mL的3%的甲醛针叶颗粒。在室温下在 50 mL 试管中孵育 2 小时。
- 用 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗针叶：离心机在 1，000 x g 下 15 分钟，轻轻取出超高纳特，并在 20 mL 的体积中加入新鲜的 PBS。重复。
- 溶解针叶在900微升0.1 M NaHCO3。
- 将 594 nm 荧光染料的苏奇尼米尔酯溶解在 100 微升二甲基硫化物中，并加入针叶。
- 在室温下，在 150 rpm 的摇床上用染料将针叶孵化 1 小时。
- 在离心机中用 20 mL 的 PBS 在离心机中用 1，000 x g 清洗针叶两次，15 分钟。
- 将针叶稀释至 PBS 中浓度为 1 ×10 8 针叶/mL，并储存在 4 °C 下。
- 用0.5-3%的异黄酮蒸汽麻醉小鼠。把鼠标放在支架上，用光滑的钳子固定舌头，并握住内舌。采取单通道移液器，并应用50μL的针叶悬浮到鼠标咽。等待，直到暂停被吸入。
2. 标本制备
- 准备 50 mL 试管，并充满 15 mL 的新鲜 2% 的副甲醛。将医疗器械（15 厘米齿形解剖钳、8 厘米细尖钳子和 10 厘米剪刀与钝端）放入 70% 乙醇溶液中。
- 根据 IACUC 协议对鼠标实施安乐死。然后将鼠标放在做多处位置，用针头固定鼠标爪子。
注：如果使用颈椎错位进行安乐死，请确保气管的完整性。- 使用喷雾器用 70% 乙醇治疗小鼠。
- 使腹腔皮肤的中位纵向切口从后爪到前爪和下巴。
- 使用齿钳和闭紧的剪刀将皮肤与皮下组织分离。用针头固定皮肤的上端。
- 在腹壁上切开一个切口，将肝脏与隔膜分离。用闭合的剪刀小心地挑选隔膜，然后切开隔膜。
- 将胸腔和颈部结缔组织的内切切，直到气管可见。
- 在气管下运行一条丝线，用两个钳子做手术结。
注意：或者，使用牙线代替丝线。- 小心地拉线，用剪刀切断结缔组织的肺。拿着垂直于桌子的剪刀。
- 将肺部放入50 mL试管中，含2%的副甲醛。将螺纹放在管外，将盖子紧紧，然后将管子翻过来，用副甲醛覆盖肺部。在 4 °C 下将肺部保持过夜。
- 用手术刀将肺叶从心脏和彼此分离。
- 将肺叶放在24井盘中，每个叶放在一个单独的井中。在 1 mL 的 Tris 缓冲盐水 （TBS） pH 7.4 中清洗肺叶，在 150 rpm 时在摇床上分别洗涤 5 次 1 小时。
- 用 1 mL 的阻塞缓冲器（TBS 中的 1% Triton X 100，5% 奶粉）替换 1 mL 的 TBS，并在室温下将样品放在摇床上过夜。
- 在 TBS 中用 1 mL 的链球菌素-488-nm 氟铬结合稀释 1：30 代替阻塞缓冲器。在室温下将标本留在摇床（150 rpm）上至少 72 小时。"
- 在室温下（150 转频）在 1 mL TBS 中将标本清洗 5 次，每次 1 小时。将标本转移到新井中，并在 4 °C 下过夜用 2% 的甲醛覆盖，以便固定后。
3. 鼠标肺叶光学清除
- 将样品放入装有 3 毫升 50% 甲醇水溶液的 5 毫升玻璃瓶中，并在室温下放入样品搅拌机中 1 小时。
- 用 3 mL 的 100% 甲醇替换 3 mL 的 50% 甲醇，并将其放入样品搅拌机 2 小时。准备总体积为 1 mL 的苯甲酸苯甲酸酯和苯甲酸苯甲酸苯甲酸酯 （BABB） 的 1：2 v/v 混合物。
- 将标本转移到 24 井板，并盖上 1 mL 的 BABB 混合物，至少 30 分钟。不要将标本长时间留在BABB中：BABB 会损坏塑料板，使标本过于刚性。
- 将标本放入细胞成像盖玻璃底室。样品已准备好成像。
4. 使用 CLSM 进行小鼠肺叶成像
- 打开显微镜系统。打开显微镜软件。打开 定位 选项卡中的传输灯。选择 10 倍目标。
注：要进行更详细的分析，请使用 20 倍的目标，但它增加了实验时间和图像文件大小。 - 将带标本的腔室放在盖滑梯中。将支架放在 XY 舞台上，以超越目标。使用目标顶部舞台的 XY 控件将标本集中。使用传输光和目镜手动查找标本 Z 平面。
- 将软件切换到 "获取 "选项卡。选择 CLSM +模式。打开 488 nm 和 561 nm 激光器。选择 488/561 nm 二色镜。将探测器的光谱范围更改为 490-695 nm。将激光功率调整到适当的范围（10-50 μW）。调整 探测器增益 在 750-900 范围之间。
注意：由于噪音，较高的增益设置不可取。 - 单击 1 个 AU 按钮，将针孔缩小到 1 个 Airy 单元。将像素分辨率设置为 512 × 512 像素。
- 打开 Z 堆栈 模式。开始 实时成像。选择两种染料都可见的焦点平面。
注意：如有必要，调整激光功率，使两种荧光染料的亮度正常化。使用 图库 和 单通道 模式，避免剪裁，并精确匹配荧光强度。 - 扩展出现的 Z 堆栈窗格。使用聚焦轮，找到样品的最低平面。使用Z 堆栈窗格中的第一个按钮。向上移动焦点平面以查找标本的顶部边界，并使用"最后"按钮保存位置。检查Z 堆栈窗格中样本深度的表示。
注：在第一个和最后一个位置选择后，Z 堆栈窗格中将显示样本深度的表示。 - 通过查看 Z 堆栈 窗格，使用标本底部附近的聚焦轮定位目标。这距离标本底部大约 20 μm。
- 关闭 Z 堆栈 模式并打开 磁贴扫描 模式。获取图像与适当数量的瓷砖的标本的大小。5 × 5 瓷砖是一个很好的起点。
- 调整瓷砖的数量和标本XY位置，直到整个肺适合瓷砖图像。用样本中心新获得的 XY 位置重新检查 Z 堆栈 位置的正确性。
- 打开 Z 堆栈 和 磁贴扫描 模式。将 Z 步骤（Z 堆栈 窗格中）设置为 5 μm。将 扫描速度 设置为 6。打开 自动保存 功能。打开 "保存单独的磁贴" 选项。命名文件。按 下开始实验 按钮。
- 验证实验时间不超过显微镜上的分配时间：如果是这样 - 调整速度。
注：近似文件大小大于 10 Gb：请确保硬盘上有足够的空间。
5. 光谱未混合和缝合
- 使用该软件进行初始图像处理。对于光谱未混合，请选择 未混合 选项。选择两个与链球菌/气道和针叶对应的区域，从图像中获取光谱。单击 "开始取消混合"。
注意：或者，使用现有的光谱为 488 和 594 nm 荧光度。 - 打开用于图像处理的文件并选择 处理 选项卡。在 方法 部分，选择 几何 和 拼接。在 参数 部分，选择 新输出 并标记 保险丝瓷砖 选项。使用与气道荧光对应的选定通道的参考模式。单击 "应用"以应用"应用"以应用"应用"
6. 图像处理：表面渲染
- 将图像打开为 超越 3D 视图。使用用于气道可视化的通道的选项 Surface 创建气道表面。选择 10 μm 的 平滑 参数。
注：也选择自动阈值。 - 目视检查表面。选择阈值以减少外围信号。移除普鲁拉和容器的表面。
- 使用 选项"编辑 和 掩蔽所有"为气道表面创建一个掩码。选择气道通道，将 表面外的 Voxels 设置为 0.001。
- 将带有气道掩码的文件保存为 TIFF 系列到文件夹。将文件保存与conidia通道作为 TIFF 系列到单独的文件夹。
7. 图像处理：面罩校正
- 在开源平台中打开带有气道面罩的文件，进行生物图像分析17， 作为 8 位图像。通过单击过程|使图像二进制 二元|使二进制。
注：如有必要，请更正面罩：使用 Polygon 选择 和 删除 选项卡删除过多的表面。或者，使用 洪水填充工具。 - 使用多次 Dilate （3D）绘制缺失的表面：单击 插件|过程|Dilate （3D）。通过单击过程|来填充孔 二元|填充孔。使用选择和 投资回报率管理器插值 手动填充面膜中的剩余孔。应用多个 侵蚀 （3D） 选项 （插件|过程|侵蚀 （3D）以补充面膜厚度。
注：使用 插件|创建宏 多个 Dilate （3D） 和侵蚀 （3D） 重复的宏选项。
确保 侵蚀 （3D） 的数量等于 Dilate （3D） 应用程序的数量。 - 将面罩保存在新的文件夹中，作为 TIFF 系列。
8. 科尼迪亚定量分析
- 打开编程和数字计算平台中的应用程序：https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter。
- 按 "添加"文件 按钮。选择气道面罩文件夹和针叶文件夹。
- 设置 0 到 1 之间的 自定义阈值 。按 下"确定" 按钮。
- 将输出表保存到自定义.xls文件。
- 用软件分析数据以进行统计分析。
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Representative Results
按照上述协议，获得了显示小鼠肺叶气道和A.富米加图斯针叶的3D图像（图1A）。斯特雷普塔维丁（用于气道可视化）标记支气管和支气管15。此外，大型船只，很容易从气道的形态区分，和普鲁拉可视化在气道通道（图1A-C）。气道表面和面罩的创建允许在气道通道中移除容器和普鲁拉投影;然而，气道表面的完整性由于几个支气管分支（图1B-C）的链球菌素信号微弱而遭到破坏。气道面膜的进一步处理允许修复丢失的碎片（图1D）。
在小鼠应用针叶后，在不同时间点使用左或右上部肺叶估计小鼠肺部的A.fumigatusconidia的分布。对于右上部肺叶，图像由大约 30 块瓷砖和大约 250 个 Z 堆栈组成。拼接后，通过第 512 号决议× 512 获得的图像尺寸为 2360 × 2815 像素，一个像素的大小为 2.77 μm × 2.77 μm，可与 2-3.5 μm9的A. fumigatus针锥形尺寸相媲美。
远气道区域的放大图像表明，由于图像的复杂性和与气道大小相比针叶的较小尺寸（图 2A），很难检测针叶的精确位置（支气管分支内外）。精确检查发现，针叶位于支气管分支内外（图2B-C）。
针叶通道的阈值设置极大地影响了由此产生的针叶数量（图 2B-C）。为了进行公正的定量分析，我们在编程和数值计算平台中开发了一个应用程序，允许估计气道面罩内外的conidia数量，避免手动阈值设置。该应用基于以下算法工作。首先，使用最佳阈值将conidia 通道细分为二进制 3D 图像堆栈。如上所述，选定的成像分辨率允许将一个锥体识别为一个像素。使用链球菌素的气道标签允许肉郎的可视化，但不是阿尔韦奥利15。因此，居住在支气管中的针叶被定义为气道面膜内的针叶像素，而居住在阿尔韦奥利的针叶被定义为气道面膜外的针叶像素。考虑到这一点，在算法的下一步，对气道掩膜图像和针叶图像执行二进制操作，以提取位于支气管中的孔雀像素。同样，提取剩余的针叶像素以获取阿尔韦奥利的针叶数。在条形图和应用用户界面的输出表中显示支气管和肺泡中针叶和肺藻的产生百分比相对于肺部的针叶总量。
采用这种方法，对小鼠气道的锥度分布进行定量分析，时间点为针叶应用后6小时（图2D）。数据表明，在咽喉应用后，大多数针叶穿透肺素空间，并在炎症免疫反应开始时定位在那里。
图1。气道图像处理原理。（A） 小鼠右上部肺叶的3D图像，在针叶应用24小时后显示富含生物素的结构（链球菌素，白色）和A.富米加图斯针叶（品红色）。步进维丁阳性大型船只用细箭头表示。（B，C）气道的表面（绿色）和面罩（橙色）。表面和面罩中缺失的气道碎片用箭头表示：带箭头的过度结构。秤杆是1000μm.（D）气道面膜后更正。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。科尼迪亚图像处理和定量分析。（A） 在图1A中呈现的基座气道（斯特雷普塔维丁，灰色色调）和A.富米加图斯针叶（品红色）的放大图像。秤杆是 300 μm B， C.放大的图像任意框（A） 表示为具有高阈值（B） 和低阈值（C）的 Z 切片。气道内的孔尼迪亚用箭头表示，外面用箭头表示。量表条为 150μm.（D）支气管分支和藻类空间中的针叶定量分析。数据显示为4只小鼠的中位数和四分位间范围，在接受A.fumigatus针叶后6小时。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
全器官三维成像允许在不解剖标本的情况下获取数据，这对研究生物体中病原体解剖分布的空间方面具有重要意义。组织光学清除有几种技术和修改，有助于克服激光散射，并允许全器官成像15，16，18，19。其中一种定制组织清除方法包括甲醇组织脱水和脱皮，然后是与BABB的光学清除。这种方法是在100多年前开发的，并进行了多次修改。在我们的工作中，我们使用了斯科特等人描述的最简单的修改。15这种方法最适合使用荧光标记的病原体。此外，具有高光静止性的荧光仪更适合长期成像。不幸的是，由于TdTomato对BABB的高灵敏度（数据未显示），转基因TdTomato A. fumigatusconidia的可视化无法使用这种方法。因此，我们在这里描述的方法允许成功检测休息或固定病原体，但不能用于成像生长的A.富米加图斯针叶或催眠。此外，标本具有高亲和力结合物质的免疫化学染色更可取。因此，我们也面临着尝试应用荧光标记抗体，在全安装肺叶标本中可视化血管和淋巴的困难。然而，斯科特等人。15可视化神经纤维，使用两步染色与抗体对 PGP 9.5。这表明，一些抗体可用于染色与以下光学清除使用BABB。BABB 清除后，我们还从 0.1 μm 荧光乳胶颗粒中丢失了荧光信号，而使用清除增强型 3D （Ce3D） 清除溶液18并不影响颗粒的荧光信号。
在目前的方法中，我们使用链球菌素标记气道。链球菌素结合内源性生物素，被认为是在克拉拉细胞（和藻类II型上皮细胞在较小程度上表达）20。由于克拉拉细胞（也称为俱乐部细胞）在没有炎症时存在于支气管和支气管，但不是在肺泡室中，链球菌染色只可视化支气管分支。因此，在目前的方法中，链球菌标记气道外的所有锥形被确定为位于藻类空间。为了更精确地检测conidia的位置，其他一些气道标记，如SOX9，应使用3。万一，当抗体使用是必要的Ce3D或溶剂清除器官的三维成像（3DISCO）19技术比BAAB为基础的光学清除更合适。然而，BABB光学清除是最简单和耗时的方法，因此是最有利的提前荧光标记的针叶检测在标记与链球菌气道。
小鼠肺部的3D成像也可以使用光学投影断层扫描综合显微镜3进行。然而，由于断层扫描分辨率的限制，CLSM 更适合同时成像气道和 3 μm 针叶。在我们的例子中，一个单一的锥体被视为一个像素。处理这些图像允许对支气管分支内外的针叶进行量化。该方法还可用于比较免疫能力和免疫功能低下的小鼠的解剖锥体分布。该方法还可用于估计从小鼠气道中消除针叶的动能。此外，由Sco scott等人开发的整个气道形态学方法 的组合。15 与算法的公正针叶定量分析可以帮助精确定位 A. fumigatus 针叶和其他大小相当的颗粒在支气管树的不同代。
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Disclosures
作者报告在这项工作中没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢斯文·克拉普曼教授（埃尔兰根大学医院和德国富阿·埃尔兰根-纽恩伯格大学医院）提供了 阿斯珀吉卢斯·富米加图斯 针叶菌株AFS150。作者感谢MIPT新闻办公室。五.B承认俄罗斯联邦科学和高等教育部（#075-00337-20-03项目，FSMG-2020-0003项目）。关于 A.富米加图斯 针叶成像和量化的工作得到了RSF第19-75-00082号的支持。气道成像工作由RFBR No 20-04-60311支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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