Summary
Aspergillus fumigatus conidia'nın (3 μm boyutunda) farelerin hava yollarında dağılımının nicel analizi için yöntemi açıklıyoruz. Yöntem ayrıca çeşitli patolojik durum modellerinde hava yollarındaki mikropartiküllerin ve nanopartikül aglomera dağılımının analizi için de kullanılabilir.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia, insan hava yollarına nüfuz edelim diye hava yoluyla bulaşan patojenlerdir. Alerjisi olmayan bağışıklık sistemi yetersiz kişiler direnç ve immünolojik tolerans sergilerken, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda konidia hava yollarını kolonize edebilir ve ciddi invaziv solunum bozukluklarına neden olabilir. Farklı hava yolu bölmelerindeki çeşitli hücreler, mantar istilasını önleyen bağışıklık tepkisine dahil edilir; bununla birlikte, patojen eliminasyonunun mekansal-zamansal yönleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Optik olarak temizlenmiş tüm montajlı organların, özellikle deneysel farelerin akciğerlerinin üç boyutlu (3D) görüntülenmesi, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında floresan etiketli patojenlerin hava yollarında tespit edilmesine izin veriyor. Bu çalışmada, hava yollarındaki A. fumigatus conidia dağılımının nicel bir analizini yapmak için deneysel bir kurulum tarif ediyoruz. Floresan konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullanarak, farelere orofarengeal uygulamadan 6 saat sonra bronş dallarında ve alveolar bölmede floresan etiketli konidianın yerini takip ettik. Burada açıklanan yaklaşım daha önce kesin patojen yerinin tespiti ve patojenle etkileşime giren hücrelerin bağışıklık yanıtının farklı aşamalarında tanımlanması için kullanılmıştır. Deneysel kurulum, patojen eliminasyonunun kinetiğini farklı patolojik koşullarda tahmin etmek için kullanılabilir.
Introduction
Günlük olarak, insanlar solunum yollarına nüfuz ürebilen fırsatçı mantarlar Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) sporları da dahil olmak üzere havadaki patojenleri solurlar1. Memelilerin solunum yolu, hava yolu duvarlarının farklı yapıları ile karakterize edilen farklı nesillerin hava yolları sistemidir2,3,4. Trakeobronşiyal duvarlar, mukozitary boşluğu sağlayan siliated hücreler olan çeşitli hücre tiplerinden oluşur5. Alveollerde, siliated hücre yoktur ve nüfuz eden alveolar uzay patojenleri mukozir boşluk6ile ortadan kaldırılamaz. Ayrıca, her hava yolu üretimi birden fazla bağışıklık hücresi popülasyonu için bir niştir ve bu popülasyonların alt kümeleri belirli hava yolu bölmeleri için benzersizdir. Bu nedenle, alveolar makrofajlar alveolar bölmelerde bulunurken, hem trakea hem de iletken hava yolları intraepithelial dendritik hücreler7,8ile kaplıdır.
A. fumigatus conidia'nın yaklaşık büyüklüğü 2-3,5 μm9'dur. İnsanlarda ve hatta farelerde küçük hava yollarının çapı 3,5 μm'yi aştığından, conidia'nın alveolar alana2, 10,11nüfuz edebileceği öne sürüldü. Aslında, histolojik muayene aspergillosis muzdarip hastaların alveollerinde mantar büyümesini gösterdi12. Conidia ayrıca kalın akciğer dilimlerinin canlı görüntülemesi kullanılarak enfekte farelerin alveollerinde tespit edildi13. Aynı zamanda, farelerin bronş epitelinin aydınlık tarafında konidia tespit edildi14.
Optik olarak temizlenmiş tam mount fare akciğerlerinin üç boyutlu (3D) görüntülenmesi, hava yollarının morfometrik analizine izin sağlar15. Özellikle, viseral plevral sinir dağılımının nicel analizi optik olarak temizlenmiş fare akciğer örnekleri kullanılarak gerçekleştirildi15. Son zamanlarda, Amich ve ark.16, optik olarak temizlenmiş fare akciğer örneklerinin ışık tabakası floresan mikroskopisi kullanılarak immün sistemi baskılanmış farelere konidia intranazal uygulamasından sonra mantar büyümesini araştırdı. Enfeksiyondan sonra solunum yollarındaki istirahat konidiasının farklı zaman noktalarında kesin konumu, iltihabın belirli aşamalarında yeterli antifungal savunma sağlayabilen hücre popülasyonlarının tanımlanması için önemlidir. Bununla birlikte, nispeten küçük boyut nedeniyle, hava yollarındaki A. fumigatus conidia dağılımının mekansal-zamansal yönleri kötü karakterizedir.
Burada, enfekte farelerin hava yollarında A. fumigatus conidia dağılımının nicel analizi için deneysel bir kurulum sunuyoruz. Floresan etiketli A. fumigatus conidia'nın orofarengeal uygulamasını alan farelerin optik olarak temizlenmiş akciğerlerinin floresan konfokal lazer tarama mikroskopisini (CLSM) kullanarak 3D görüntüler elde ediyor ve görüntü işlemeyi gerçekleştiriyoruz. Tüm monte akciğer lobunun 3D görüntülemesini kullanarak, daha önce conidia uygulamasından 72 saat sonra farelerin iletken hava yolunda A. fumigatus conidia dağılımını gösterdik8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan laboratuvar hayvanlarıyla ilgili tüm yöntemler, Rusya Bilimler Akademisi Shemyakin ve Ovchinnikov Biyoorganik Kimya Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 226/2017).
1. A. fumigatus conidia uygulaması
- Floresan etiketli A. fumigatus conidia elde etmek için, conidia peletine 1 mL% 3 paraformaldehit ekleyerek 5 × 108 conidia'yı sabitle. Oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca 50 mL test tüpünde kuluçkaya yatırın.
- Conidia'yı 20 mL fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın: 15 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin, üst kısmı hafifçe çıkarın ve 20 mL'lik bir hacimde taze PBS ekleyin. Yinelemek.
- Konidiayı 900 μL 0,1 M NaHCO3'teçözün.
- 594 nm floresan boyanın süksinimidyl esterini 100 μL dimetil süloksit içinde çözün ve konidiye ekleyin.
- Konidiayı oda sıcaklığında 150 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca boya ile kuluçkaya yatırın.
- Conidia'yı 20 mL PBS ile santrifüjde 1.000 x g'da 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Konidiayı PBS'de 1 × 108 konidia/mL konsantrasyonuna seyreltin ve 4 °C'de saklayın.
- Fareyi% 0.5-3 izofluran buharı ile uyuşturun. Fareyi tutucuya koyun, dili pürüzsüz askılarla sabitleyin ve nares'i tutun. Tek kanallı pipet alın ve fare farenksine 50 μL conidia süspansiyon uygulayın. Süspansiyon soluyana kadar bekleyin.
2. Numune hazırlama
- 50 mL test tüpünü hazırlayın ve 15 mL taze% 2 paraformaldehit ile doldurun. Tıbbi aletleri (15 cm dişli diseksiyon forseps, 8 cm ince uçlu forseps ve künt uçlu 10 cm makas) % 70 etanol çözeltisine yerleştirin.
- Fareyi IACUC protokolüne uygun olarak ötenazi edin. Sonra fareyi sırt pozisyonuna yerleştirin ve fare pençelerini iğnelerle sabitleyin.
NOT: Ötanazi için servikal çıkık kullanıyorsanız, trakeanın bütünlüğünü sağlayın.- Fareyi bir püskürtücü kullanarak% 70 etanol ile tedavi edin.
- Ventral deride arka pençelerden ön testerelere ve çeneye kadar ortanca uzunlamasına bir kesim yapın.
- Dişli kürsler ve kapalı makas kullanarak cildi deri altı dokusundan ayırın. Cildin üst uçlarını iğnelerle sabitle.
- Karın duvarında bir kesi yapın ve karaciğeri diyaframdan ayırın. Diyaframı kapalı makasla dikkatlice seçin ve ardından diyaframı kesin.
- Trakea görünene kadar toraks ve boyun bağ dokularının medial bir kesimini yapın.
- Nefes borusunun altında ipek bir iplik çalıştırın ve iki asa kullanarak cerrahi bir düğüm yapın.
NOT: Alternatif olarak ipek iplik yerine diş ipi kullanın.- İpliği dikkatlice çekin ve akciğerleri makasla bağ dokusundan kesin. Makası masaya dik tutun.
- Akciğerleri %2 paraformaldehit ile 50 mL test tüpüne koyun. İplik uçlarını tüpün dışında bırakın, kapağı sıkıca koyun ve akciğerleri paraformaldehitle örtmek için tüpü ters çevirin. Akciğerleri 4 °C'de gece boyunca tutun.
- Akciğer loblarını kalpten ve birbirinden neşterle parçalara ayrıştırın.
- Akciğer loblarını her lob ayrı bir kuyuda olmak üzere 24 kuyu plakasına koyun. Akciğer loblarını 1 mL Tris tamponlu salin (TBS) pH 7.4'te yıkayın, 150 rpm'de bir çalkalayıcıda her biri 1 saat boyunca 5 kez yıkayın.
- 1 mL TBS'yi 1 mL blokaj tamponu (%1 Triton X 100, TBS'de %5 toz süt) ile değiştirin ve numuneyi bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında gece boyunca bırakın.
- Engelleme tamponu 1 mL streptavidin-488- nm florrom konjuge ile 1:30 TBS'de seyreltilmiş olarak değiştirin.
- Numuneyi oda sıcaklığında (150 rpm) oda sıcaklığında her biri 1 mL TBS'de 1 saat boyunca 5 kez yıkayın. Numuneyi yeni kuyulara aktarın ve sabitleme sonrası için 4 °C'de gece boyunca% 2 paraformaldehit ile örtün.
3. Fare akciğer lob optik temizleme
- Numuneyi% 50 metanol suyu çözeltisinin 3 mL'si ile doldurulmuş 5 mL cam şişeye yerleştirin ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında numune karıştırıcısına yerleştirin.
- % 50 metanol 3 mL% 100 metanol 3 mL ile değiştirin ve 2 saat boyunca örnek karıştırıcıya koyun. Toplam 1 mL hacimde benzil alkol ve benzil benzoat (BABB) 1:2 v/v karışımını hazırlayın.
- Numuneyi 24 kuyu plakasına aktarın ve en az 30 dakika boyunca 1 mL BABB karışımı ile örtün. Numuneyi BABB'de uzun süre bırakmayın; BABB plastik plakaya zarar verebilir ve numuneyi çok sert hale getirebilir.
- Numuneyi hücre görüntüleme kapak alt odasına koyun. Örnek görüntüleme için hazır.
4. CLSM ile fare akciğer lobu görüntüleme
- Mikroskop sistemini açın. Mikroskop yazılımını açın. Bul sekmesinde iletim ışığını açın. 10x hedefini seçin.
NOT: Daha ayrıntılı analiz için 20x hedefini kullanın, ancak deneme süresini ve görüntü dosyası boyutunu artırır. - Numunenin olduğu odayı kapak kaydıranı tutucusuna koyun. Tutucuyu hedefin üzerine XY sahnesine koyun. Numuneyi, sahnenin XY kontrollerini kullanarak hedefin üzerine ortala. Numune Z düzlemini manuel olarak bulmak için iletim ışığını ve göz merceği kullanın.
- Yazılımı Edinme sekmesine geçirin. CLSM φ-mode'u seçin. 488 nm ve 561 nm lazerleri açın. 488/561 nm dikroik aynayı seçin. Dedektörün spektral aralığını 490-695 nm olarak değiştirin. Lazer gücünü uygun aralığa (10-50 μW) ayarlayın. Dedektör Kazancını 750-900 aralığı arasında ayarlayın.
NOT: Gürültü nedeniyle daha yüksek kazanç ayarları istenmez. - 1 AU düğmesine tıklayarak iğne deliğini 1 Airy birimine daraltın. Piksel çözünürlüğünü 512 × 512 piksel olarak ayarlayın.
- Z yığını modunu aç. Canlı GörüntülemeyeBaşlayın. Her iki boyanın da görünür olduğu odak düzlemini seçin.
NOT: Gerekirse, iki floresan boyanın parlaklığını normalleştirmek için lazer gücünü ayarlayın. Kırpmayı önlemek ve floresan yoğunluğunu tam olarak eşleştirmek için Galeri ve Tek kanal modunu kullanın. - Görünen Z yığını bölmesini genişletin. Odaklama tekerleğini kullanın ve numunenin en düşük düzlemini bulun. Z yığını bölmesindeki İlk düğmesini kullanın. Numunenin üst sınırını bulmak için odak düzlemini yukarı doğru hareket ettirin ve Son düğmesini kullanarak konumu kaydedin. Z yığını bölmesinde örnek derinliğin gösterimini denetleyin.
NOT: İlk ve Son konumlar seçildikten sonra Z yığını bölmesinde örnek derinliğin bir gösterimi görünecektir. - Z yığını bölmesine bakarak, odaklama tekerleğini numunenin altına yakın bir yerde kullanarak hedefi konumlandırın. Bu, numunenin dibinden yaklaşık 20 μm uzaklıktadır.
- Z yığını modunu kapatın ve Döşeme Tarama modunu açın. Numunenin boyutu için uygun sayıda fayans ile görüntüyü elde edin. 5 × 5 fayans iyi bir başlangıç noktasıdır.
- Tüm akciğer karo görüntüsüne sığana kadar fayans sayısını ve numune XY konumunu ayarlayın. Numunenin merkezinin yeni elde edilen XY konumuyla Z yığını konumlarının doğruluğunu yeniden kontrol edin.
- Hem Z yığını hem de Döşeme Tarama modlarını açın. Z adımlarını (Z yığını bölmesinde) 5 μm olarak ayarlayın. Tarama Hızını 6 olarak ayarlayın. Otomatik Kaydetme işlevini açın. Ayrı Döşemeleri Kaydetme seçeneğini açın. Dosyayı adlandırın. Denemeyi Başlat düğmesine basın.
- Denemenin mikroskopta ayrılan süreyi aşmadığını doğrulayın; öyleyse - hızı ayarlayın.
NOT: Yaklaşık dosya boyutu 10 Gb'den fazladır; sabit sürücüde yeterli alan olduğundan emin olun.
5. Spektral karıştırma ve dikiş
- İlk görüntü işleme için yazılımı kullanın. Spektral karıştırma için Karıştırmayı Çöz seçeneğini belirleyin. Görüntüden spektrum elde etmek için streptavidin/hava yollarına ve conidia'ya karşılık gelen iki bölge seçin. Karıştırmayı Başlat 'ıtıklatın.
NOT: Alternatif olarak, 488 ve 594 nm florokromlar için mevcut spektrumları kullanın. - Görüntü işleme dosyasını açın ve İşleme sekmesini seçin. Yöntemler bölümünde Geometrik ve Dikiş'i seçin. Parametre bölümünde, Yeni Çıktı'yı seçin ve Gövde Kutucukları seçeneğini işaretleyin. Referans modunu hava yolu floresansına karşılık gelen seçili kanalla kullanın. Uygula 'yı tıklatarak Dikiş'i uygulayın.
6. Görüntü işleme: yüzey işleme
- Görüntüyü 3D Görünümü Aşolarak açın. Hava yolu görselleştirmesi için kullanılan kanal için Yüzey seçeneğini kullanarak bir hava yolu yüzeyi oluşturun. 10 μm'lik Yumuşatma parametresini seçin.
NOT: Otomatik eşik değerini de seçin. - Yüzeyi görsel olarak inceleyin. Giden sinyali azaltmak için eşikleri seçin. Plevra ve kapların yüzeylerini çıkarın.
- Tümünü Düzenle ve Maskeleseçeneklerini kullanarak hava yolu yüzeyi için bir maske oluşturun. Hava yolu kanalını seçin ve yüzey dışındaki Voxel'leri 0.001 olarak ayarlayın.
- Hava yolu maskesi olan dosyayı klasöre TIFF serisi olarak kaydedin. Conidia kanalıyla birlikte dosyayı ayrı klasöre TIFF serisi olarak kaydedin.
7. Görüntü işleme: maske düzeltme
- 8 bit görüntü olarak biyolojik görüntü analizi17 için açık kaynaklı bir platformda hava yolu maskesi ile dosyayı açın. İşlem |'ni tıklatarak görüntüyü ikili hale getirme İkili | İkili Yap.
NOT: Gerekirse maskeyi düzeltin: Çokgen seçimini ve Sil sekmesini kullanarak aşırı yüzeyleri çıkarın. Alternatif olarak, Taşkın Doldurma Aracı'nı kullanın. - Birkaç kez Genişlet (3D)kullanarak eksik yüzeyleri çizin: Eklentiler | İşlem | Genişleme (3D). İşlem |'na tıklayarak delikleri doldurun İkili | Delikleri Doldurun. Maskedeki artık delikleri manuel olarak doldurmak için seçim ve yatırım getirisi yöneticisi enterpolasyonunu kullanın. Birkaç Aşındır (3D) seçeneği uygulama (Eklentiler | İşlem | Maskekalınlığını yeniden örneklemek için aşındırın (3D).
NOT: Eklentiler | kullanarak makro oluşturma Birden çok Genişleme (3D) ve Aşındır (3D) tekrarları için makro seçenekleri.
Aşındır (3D) sayısının Dilat (3D) uygulamalarının sayısına eşit olduğundan emin olun. - Maskeyi yeni bir klasöre TIFF serisi olarak kaydedin.
8. Conidia nicel analizi
- Uygulamayı programlama ve sayısal bilgi işlem platformunda açın: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Dosya ekle düğmesine basın. Hava yolu maskesi klasörünü ve conidia klasörünü seçin.
- 0 ile 1 arasında özel bir eşik ayarlayın. Tamam düğmesine basın.
- Çıktı tablosunu özel .xls dosyasına kaydedin.
- İstatistiksel analiz için verileri yazılımla analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokole uyarak, bir farenin akciğer lobunda hava yollarını ve A. fumigatus conidia'yı gösteren 3D görüntü elde edildi (Şekil 1A). Streptavidin (hava yolu görselleştirme için kullanıldı) etiketli bronşlar ve bronşioller15. Ek olarak, morfolojileri ile hava yollarından kolayca ayırt edilebilen büyük damarlar ve plevra hava yolu kanalında görselleştirilir (Şekil 1A-C). Hava yolu yüzeyinin oluşturulması ve maskenin geminin çıkarılmasına izin vermesi ve hava yolu kanalındaki plevra projeksiyonları; bununla birlikte, hava yolu yüzeyinin bütünlüğü, birkaç bronş dalında streptavidin zayıf sinyali nedeniyle tahrip olur (Şekil 1B-C). Hava yolu maskesinin daha fazla işlenmesi, eksik parçaların onarılmasına izin eder (Şekil 1D).
Farelerin akciğerlerinde A. fumigatus conidia dağılımı, konidia uygulamasından sonra farklı zaman noktalarında sol veya sağ üst akciğer lobları kullanılarak tahmin edildi. Sağ üst akciğer lobu için, görüntü yaklaşık 30 karo ve yaklaşık 250 Z-yığınından oluşur. Dikiş attıktan sonra, 512 × 512 çözünürlükle elde edilen görüntünün görüntü boyutu 2360 × 2815 pikseldi ve bir pikselin boyutu 2,77 μm × 2,77 μm dir, bu da 2-3,5 μm9olan A. fumigatus conidia boyutuyla karşılaştırılabilir.
Distal hava yolu bölgesinin genişlemiş görüntüsü, görüntünün karmaşıklığı ve hava yollarının büyüklüğüne göre konidianın küçük boyutu nedeniyle konidianın (bronş dallarının içinde veya dışında) kesin konumunun tespitinin oldukça zor olduğunu göstermektedir (Şekil 2A). Kesin inceleme, konidianın bronş dallarının içinde ve dışında bulunduğunu ortaya koydu (Şekil 2B-C).
Conidia kanalının eşik ayarları, ortaya çıkan konidia sayısını büyük ölçüde etkiler (Şekil 2B-C). Tarafsız nicel analizi yapmak için programlama ve sayısal bilgi işlem platformunda, hava yolu maskesinin içindeki ve dışındaki konidia sayısını tahmin etmeyi sağlayan ve manuel eşik ayarından kaçınan bir uygulama geliştirdik. Uygulama aşağıdaki algoritmaya göre hareket eder. İlk olarak, conidia kanalı en uygun eşik değeri kullanılarak ikili bir 3B görüntü yığınına bölünır. Yukarıda açıklandığı gibi, seçilen görüntüleme çözünürlüğü bir kontidiyumun bir piksel olarak tanımlanmasına izin veriyor. Hava yolu etiketlemesi için streptavidin kullanımı bronşların görselleştirilmesine izin veriyor, ancak alveoli15. Bu nedenle, bronşlarda bulunan conidia, hava yolları maskesinin içindeki conidia pikselleri olarak tanımlanırken, alveollerde bulunan conidia, hava yolu maskesinin dışındaki conidia pikselleri olarak tanımlanır. Bunu göz önünde bulundurarak, algoritmanın bir sonraki adımında, bronşlarda bulunan conidia piksellerini ayıklamak için hava yolu maskesi görüntüsü ve conidia görüntüsü için bir ikili AND işlemi gerçekleştirilir. Benzer şekilde, kalan conidia pikselleri alveollerdeki konidia sayısını elde etmek için ayıklanır. Akciğerdeki toplam konidia miktarına göre bronşlarda ve alveollerde ortaya çıkan konidia yüzdesi çubuk grafikte ve uygulama kullanıcı arayüzünün çıktı tablosunda sunulmuştur.
Bu yaklaşım kullanılarak, farelerin hava yollarındaki konidia dağılımının nicel analizi, konidia uygulamasından sonraki 6 saatlik zaman noktası için gerçekleştirildi (Şekil 2D). Veriler, orofarengeal uygulama sırasında, konidia'nın çoğunluğunun alveolar alana nüfuz ettiğini ve enflamatuar immün yanıtın başlangıcında bulunduğunu göstermektedir.
Şekil 1. Hava yolu görüntü işleme prensibi. (A) Bir farenin sağ üst akciğer lobunun 3D görüntüsü, biyotin bakımından zengin yapıları (streptavidin, beyaz) ve A. fumigatus conidia'yı (macenta) gösteren konidia uygulamasından 24 saat sonra. Steptavidin pozitif büyük damarlar ince oklarla gösterilir. (B,C) Hava yolları için yüzey (yeşil) ve maske (turuncu). Yüzeydeki eksik hava yolu parçaları ve maske oklarla gösterilir; ok uçlu aşırı yapılar. Ölçek çubuğu 1000 μm'dir. (D) Düzeltmelerden sonra hava yolu maskesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Conidia görüntü işleme ve nicel analiz. (A) Şekil 1A'dasunulan distal hava yollarının (Streptavidin, gri tonları) ve A. fumigatus conidia'nın (macenta) genişlemiş görüntüsü. Ölçek çubuğu 300 μm B,C'dir. (A)üzerinde rasgele kutulanmış büyütülen görüntü, yüksek eşik (B) ve düşük eşik değeri (C) olan bir Z dilimi olarak temsil edilir. Hava yolunun içindeki Conidia oklarla, dışarıda ise ok uçlarıyla gösterilir. Ölçek çubuğu 150 μm. (D) Bronş dallarında ve alveolar alanda konidianın nicel analizidir. Veriler, A. fumigatus conidia aldıktan sonra 6 saat olmak üzere 4 fare için ortanca ve interquartile aralığı olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm organ 3D görüntüleme, patojenin organizmadaki anatomik dağılımının mekansal yönlerini araştırmak için büyük önem taşıyan numunenin diseksiyonu olmadan verilerin eldeine izin veriyor. Lazer ışık saçılımının üstesinden gelmeye yardımcı olan ve tüm organ görüntülemeye izin veren doku optik temizlemenin çeşitli teknikleri ve modifikasyonları vardır15,16,18,19. Özel doku temizleme yaklaşımlarından biri metanol bazlı doku dehidratasyonu ve delipidasyon ve ardından BABB ile optik temizlemeden oluşur. Yaklaşım 100 yıldan daha uzun bir süre önce geliştirilmiştir ve çeşitli değişikliklere sahiptir. Çalışmalarımızda, Scott ve arkadaşları tarafından açıklanan en basit modifikasyonu kullanıyoruz. 15 Böyle bir yaklaşım floresan etiketli patojenlerle kullanım için en uygunudur. Ayrıca, uzun süreli görüntüleme için yüksek fotostanz kabiliyetine sahip florokromlar tercih edilir. Ne yazık ki, transgenik TdTomato A. fumigatus conidia'nın görselleştirilmesi, TdTomato'nun BABB'ye yüksek duyarlılığı nedeniyle bu yöntem kullanılarak mümkün değildir (veriler gösterilmez). Bu nedenle, burada tarif ettiğimiz yaklaşım, dinlenme veya sabit patojenlerin başarılı bir şekilde tespit edilmesine izin veriyor, ancak büyüyen A. fumigatus conidia veya hyphae'nin görüntülenmesi için kullanılamaz. Ek olarak, numunenin yüksek benzeşimli bağlayıcı maddelerle immünohistokimyasal lekelendirilmesi tercih edilir. Bu nedenle, floresan etiketli antikorları tüm monte akciğer lob örneklerinde damarları ve lenfatikleri görselleştirmek için uygulamaya çalışırken de sorunla karşılaştık. Ancak, Scott ve ark. PGP 9.5'e karşı antikorlarla iki aşamalı boyama kullanarak 15 adet görselleştirilmiş sinir lifi. Bu, BABB kullanılarak aşağıdaki optik temizleme ile boyama için bazı antikorların kullanılabileceğini gösterir. Babb temizlemeden sonra 0.1 μm floresan lateks parçacıklarından gelen floresan sinyalini de kaybettik, temizleme ile geliştirilmiş 3D (Ce3D) temizleme çözeltisi18'in kullanımı parçacıkların floresan sinyalini etkilemedi.
Mevcut yaklaşımda, hava yollarını etiketlemek için streptavidin kullanıyoruz. Streptavidin, Clara hücrelerinde (ve alveolar tip II epitel hücrelerinde daha az ölçüde) ifade edildiği düşünülen endojen biyotin bağlar20. Clara hücreleri (Kulüp hücreleri olarak da bilinir) iltihap yokluğunda bronşlarda ve bronşiollerde bulunur, ancak alveolar bölmede bulunmaz, streptavidin lekeleme sadece bronş dallarını görselleştirir. Bu nedenle, mevcut yaklaşımda, streptavidin etiketli hava yollarının dışındaki tüm konidia alveolar alanda bulunduğu belirlenmiştir. Conidia konumunun daha hassas tespiti için, SOX9 gibi diğer bazı hava yolu belirteçlerikullanılmalıdır 3. Antikor kullanımının gerekli olması durumunda solventle temizlenmiş organların Ce3D veya üç boyutlu görüntülenmesi (3DISCO)19 teknikleri BAAB tabanlı optik temizlemeye göre daha uygundur. Bununla birlikte, BABB optik temizleme en basit ve zaman alıcı yaklaşımdır ve bu nedenle streptavidin hava yolları ile işaretlenmiş önceden floresan etiketli konidia tespiti için en avantajlı olanıdır.
Fare akciğerlerinin 3D görüntülemesi optik projeksiyon tomografi entegre mikroskopisi kullanılarak da yapılabilir3. Bununla birlikte, tomografinin çözünürlüğündeki sınırlama nedeniyle CLSM, hava yollarının eşzamanlı görüntülenmesi ve 3 μm konidia için daha uygundur. Bizim durumumuzda, tek bir konidiyum bir piksel olarak görülür. Bu tür görüntülerin işlenmesi, bronş dallarının içinde ve dışında konidianın ölçülmesine izin verildi. Yöntem ayrıca immün yetimsiz ve immün sistemi baskılanmış farelerde anatomik konidia dağılımını karşılaştırmak için de uygulanabilir. Yaklaşım, farelerin hava yollarından konidia eliminasyonunun kinetiğini tahmin etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, Scott ve arkadaşları tarafından geliştirilen tüm hava yolu morfometrisinin yaklaşımının kombinasyonu. 15 tarafsız konidia nicel analiz algoritması ile A. fumigatus conidia ve bronş ağacının farklı nesillerinde karşılaştırılabilir boyuttaki diğer parçacıkların hassas konumunda yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu eserde çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.
Acknowledgments
Yazarlar, Aspergillus fumigatus conidia strain AfS150'yi sağladığı için Prof. Sven Krappmann'a (Erlangen Üniversite Hastanesi ve FUA Erlangen-Nürnberg, Almanya) teşekkür ediyor. Yazarlar MIPT Basın Bürosu'na teşekkür eder. V.B. Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı'nı kabul eder (#075-00337-20-03, FSMG-2020-0003 projesi). A. fumigatus conidia görüntüleme ve niceleme ile ilgili çalışma RSF No 19-75-00082 tarafından desteklendi. Hava yolu görüntüleme ile ilgili çalışma RFBR No 20-04-60311 tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
