Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse af levermikromiljø under tidlig progression af ikke-alkoholisk fedtleversygdom-associeret hepatocellulært karcinom i zebrafisk

Published: April 1, 2021 doi: 10.3791/62457
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Hepatology), Albert Einstein College of Medicine, 3Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Marion Bessin Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Her præsenterer vi, hvordan man genererer en ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) -associeret Hepatocellulært Carcinom (HCC) zebrafiskmodel for at studere virkningen af kolesteroloverskud på levermikromiljø og immuncellelandskab.

Abstract

Leverkræft er i øjeblikket den tredje førende årsag til kræftrelateret død på verdensplan, og hepatocellulært karcinom (HCC) tegner sig for 75-90% af alle leverkræfttilfælde. Med indførelsen af effektive behandlinger til forebyggelse og behandling af hepatitis B / C, ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) og den mere aggressive form kendt som ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) bliver hurtigt de største risikofaktorer for at udvikle HCC i moderne samfund. For bedre at forstå den rolle, NASH har på udviklingen af HCC, designede vi en NASH-associeret HCC-zebrafisk. Zebrafisklarvernes optiske klarhed og genetiske trækkraft gør dem til en tiltalende og kraftfuld model til at studere levermikromiljøet og immuncellesammensætningen ved hjælp af ikke-invasiv fluorescerende levende billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan man bruger en NASH-associeret HCC-zebrafiskmodel til at undersøge effekten af kolesteroloverskud i levermikromiljøet og dets indvirkning på immuncellesammensætningen i tidlige stadier af sygdommen. Først fodrer vi HCC-larver (s704Tg), som udtrykker hepatocytspecifik aktiveret beta-catenin, med en 10% højt kolesteroltal diæt i 8 dage for at udvikle en NASH-associeret HCC-model. Her beskriver vi, hvordan man kan bruge forskellige transgene linjer til at evaluere flere tidlige malignitetsfunktioner i leveren ved ikke-invasiv konfokal mikroskopi, såsom leverareal, celle og nuklear morfologi (hepatocytområde, nukleart område, nukleart: cytoplasmatisk forhold (N: C-forhold), nuklear cirkularitet, mikronuklei / nuklear brokulationsscore) og angiogenese. Derefter viser vi ved hjælp af transgene linjer med mærkede immunceller (neutrofiler, makrofager og T-celler), hvordan man analyserer leverimmuncellesammensætning i NASH-associerede HCC-larver. De beskrevne teknikker er nyttige til at evaluere levermikromiljø og immuncellesammensætning ved tidlige hepatocarcinogenesestadier, men de kan også ændres til at studere sådanne funktioner i andre leversygdomsmodeller.

Introduction

Hepatocellulært karcinom (HCC) er en aggressiv kræft med begrænsede terapeutiske muligheder. Det har vist sig, at op mod 30% af alle patienter med HCC er overvægtige og har NASH, en aggressiv form for NAFLD 1,2,3,4. Forbrug af kalorierige kostvaner øger tilgængeligheden af fedtsyrer drastisk, der forårsager lokale og systemiske metaboliske skift og udløser steatose, hepatocytskade, betændelse og fibrose - alle nøglefunktioner i NASH. NASH-progression til HCC involverer ophobning af lipider i leveren, hvilket udløser betændelse og ændret immuncellesammensætning 5,6,7. Det er af særlig interesse og betydning at forstå, hvordan levermikromiljøet og immuncellelandskabet ændres under leversygdomsprogression, og hvordan det ændrer sig på grund af visse etiologiske faktorer. For bedre at identificere den indvirkning, som kolesteroloverskud har på levermikromiljø og immuncellelandskab, har vi udviklet en unik zebrafiskmodel af NASH-associeret HCC. Brugen af denne model har givet os en bedre forståelse af virkningen af kost og overernæring på levermikromiljø og leversygdomsprogression.

Pattedyrmodeller, såsom mus og humane vævsprøver, har været afgørende for at forstå patogenesen af steatohepatitis og steatose8. Mus er den foretrukne model for leversygdom og kræft, men de mangler optisk klarhed på celleniveau, mens humane vævsprøver ofte mangler det 3D-miljø, som dyremodeller er i stand til at efterligne. Disse forhindringer har gjort Zebrafish til en stærk model i forskningsmiljøet. Zebrafisk har bemærkelsesværdige ligheder med mennesker, med mindst 70% genbevarelse. De opretholder levermikromiljø, levercellulær sammensætning, funktion, signalering og respons på skader 9,10. Ved hjælp af en diæt med højt kolesteroltal (HCD) i kombination med en etableret transgen zebrafiskmodel af HCC har vi udviklet en zebrafiskmodel af NASH-associeret HCC.

Her præsenterer vi en protokol, der forklarer, hvordan man genererer en NASH-associeret HCC-zebrafiskmodel, og hvordan man studerer levermikromiljø og adresserer tidlige malignitetsfunktioner in vivo. Ved hjælp af ikke-invasiv konfokal mikroskopi i kombination med zebrafisktransgene linjer med fluorescerende mærket hepatocytmembran og kerne kan vi adressere tidlige malignitetsfunktioner ved at analysere levermorfologi (areal, volumen og overfladeareal), celle- og nuklear morfologi (hepatocytområde, nukleart område, N: C-forhold, nuklear cirkularitet, mikrokerner / nuklear herniationsscore) og angiogenese (kartæthed). Immuncellemikromiljø er også et vigtigt træk ved hepatocarcinogenese11,12,13,14, derfor viser vi også, hvordan man analyserer leverimmuncellesammensætning i NASH-associerede HCC-larver ved hjælp af transgene zebrafisklinjer med mærkede immunceller (neutrofiler, makrofager og T-celler). De beskrevne teknikker er unikke for modellen og yderst nyttige til at evaluere levermikromiljø og immuncellesammensætning i leversygdomsprogression.

Protocol

Dyreforsøg udføres efter procedurer, der er godkendt af det institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg (IACUC) ved Albert Einstein College of Medicine. For opskrifter på buffere og opløsninger, der anvendes i protokollen, henvises til supplerende tabel 1.

1. Tilberedning af 10% kolesterolberiget kost til akut kolesteroloverskud.

  1. Vej 2 x 4 g Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) i to 25 ml glasbægre - en til normal diæt (ND) og den anden til 10% højt kolesteroltal diæt (HCD).
    BEMÆRK: Enhver kommerciel tørfoderdiæt til zebrafisklarver kan bruges.
  2. Der vejes 0,4 g kolesterol i et 10 ml glasbægerglas. Bægerglasset dækkes med lidt folie.
  3. Mål 5 ml diethylether ved hjælp af en 10 ml sprøjte med en 20 G nål. Tilsæt derefter diethyletheren til ND-bægerglasset og bland det straks med tørfoderet ved hjælp af en spatel.
    FORSIGTIG: Diethylether forårsager øjen-, hud- og luftvejsirritation. Brug kun i en kemisk røghætte.
  4. Mål igen 5 ml diethylether med en 10 ml sprøjte med en 20 G nål og tilsæt det til 10 ml bægerglasset med kolesterol, bland straks op og ned med sprøjten.
  5. Tilsæt hurtigt kolesterolopløsningen til HCD-bægerglasset, og bland det straks med en spatel, indtil opløsningen er ensartet.
  6. Lad bægerglassene stå i emhætten i op til 24 timer for at fordampe diethyletheren fuldstændigt. Næste dag skal du male GPAS-diæter til fine partikler ved hjælp af en pistil og mørtel.
    BEMÆRK: Slibning af kostvanerne er et afgørende skridt, larver vil ikke være i stand til at spise partikler større end 50 nm.
  7. Overfør hver diæt til en lille, mærket plastpose eller til et 50 ml centrifugerør og opbevar ved -20 ° C.

2. NASH-induktion med kortvarige larver, der fodrer med kolesterolberiget kost - statiske tilstande.

  1. Opret transgene fiskelinjer på dag -1 (tabel 1). Næste morgen (dag 0), efter at fisk har gydet, samles æg i en maskesi.
  2. Brug en vaskeflaske med embryovand (E3) til at skylle æg grundigt og forsigtigt overføre æggene til en 10 cm petriskål med E3-medium.
  3. Rengør pladerne for alt affald, der kan have samlet sig i avlskasserne, herunder eventuelle døde eller ubefrugtede æg.
    BEMÆRK: Skylning af æg og rengøring af pladerne er afgørende for at undgå ukontrolleret dyrkning af mikroorganismer og deraf følgende defekter på larvernes udvikling.
  4. Opdel æg i en tæthed på 70/80 pr. 10 cm petriskåle (i 25 ml E3). På dag 1, under et dissektionsomfang udstyret med en transilluminationsbase, skal du kontrollere og rense døde embryoner eller embryoner med udviklingsfejl.
    BEMÆRK: Brug transillumination base darkfield-tilstand til at identificere embryoner med udviklingseffekter og til at kontrollere væksten af mikroorganismer i pladerne. Forskellige faciliteter har forskellige mikroorganismer udbytte i deres systemer. Skift E3-medium og / eller retter om nødvendigt for at undgå negative virkninger.
  5. På dag 5 kombineres larver fra alle retterne i en 15 cm petriskål, tilsæt E3 uden methylenblåt. Del derefter larverne i foderkasserne som følger (tabel 2).
    BEMÆRK: Under kontrolforhold, for at generere sunde larver uden at udløse systemisk kronisk inflammation, skal larver fodres med ca. 0,1 mg mad pr. larver pr. Dag. Bemærk, at den samlede mængde mad (tabel 2) er fordelt ligeligt i to foderstoffer pr. Dag.
  6. Larverne opbevares i en inkubator ved 28 °C i en mørk lyscyklus (f.eks. 14 timers lys/10 timers mørk cyklus), og foderlarverne fodres to gange dagligt fra dag 5 til dag 12.
  7. Aspirer dagligt madrester samt 90-95% af mediet ved hjælp af et vakuumsystem fastgjort til en 1 ml pipettespids. Hæld derefter forsigtigt ny E3 uden methylenblåt i det ene hjørne af foderkassen for at undgå at beskadige larverne.
    BEMÆRK: Daglig rengøring af foderkasserne er afgørende for at undgå ukontrolleret vækst af mikroorganismer.

3. Indsamling af 13 dage efter befrugtning larver fra foderkasser.

  1. På dag 13 skal du forberede indsamlingsretter i overensstemmelse med antallet af eksperimentelle forhold, der blev oprettet. Med en permanent markørpen skal du markere på siden af opvasken (låg og bund) for at undgå at skifte prøver, for eksempel en sort stribe til normal kost (ND) og to sorte striber til HCD.
  2. Hæld nok E3 uden methylenblåt til at dække bunden af hver skål. Brug forsigtigt vakuumsystemet til at opsuge vandet fra foderkasserne, prøv at aspirere snavs eller døde larver fra bunden for at undgå at overføre disse materialer til opsamlingsskålene.
  3. Når vandstanden begynder at blive lav, skal du langsomt løfte foderkassen for at få larver til at svømme til et af hjørnerne og derefter aspirere i den modsatte retning.
    BEMÆRK: Brug 1 ml pipette med afskårne spidser i forskellige højder for at give mulighed for forskellige diametre, når vandet suges op. Skift mellem de forskellige størrelser, start med en større diameter, og skift til en mindre, efterhånden som vandmængden reduceres, og larvernes tæthed øges.
  4. Når der kun er ca. 20-30 ml væske, dekanteres larver forsigtigt i samlingen petriskål tilberedt i trin 1. Placer det mærkede bånd fra foderboksen på låget af fadet.
  5. Gentag trin 3.2-3.4 for alle foderkasser.

4. Kontrolanalyse for diætinduceret leversteatose - Oil Red O (ORO) farvning, billeddannelse og scoring.

  1. Brug en glas Pasteur pipette til at overføre 15-20 larver til et 2 ml rundt bundrør og læg dem på is i ca. 15-30 min. Fjern de fleste medier fra røret.
  2. Tilsæt 2 ml 4% paraformaldehyd (PFA) for at fiksere larver og inkuberes ved 4 °C natten over.
  3. Næste morgen fjernes 4% PFA-opløsning og vaskes larver tre gange med 2 ml 1x PBS.
  4. Forbered en 12 brøndplade (figur 2A) pr. tilstand med en maskebrøndindsats.
  5. Brug en glaspipette til at overføre larve fra 2 ml røret til indsatsen, der tidligere er placeret i brønden, tilsæt 5 ml 1x PBS. Gem 2 ml rørene til prøveopbevaring efter farvning.
    FORSIGTIG: Larver er ekstremt klæbrige på dette tidspunkt, brug ikke plastpipetter.
  6. Overfør indsats med larver til en anden brønd med 5 ml 60% isopropanolopløsning. Inkuber larver til 30 minutters stuetemperatur (RT).
  7. I mellemtiden skal du forberede en 0,3% olierød O i 60% isopropanolopløsning. Den 0,3 % olierøde opløsning filtreres to gange ved hjælp af et sprøjtefilter på 0,45 μm.
    BEMÆRK: Forbered 5 ml opløsning pr. brønd ved at blande 3 ml 0,5% Oil Red O i Isopropanol med 2 ml destilleret vand. 0,3% Oil Red O i 60% Isopropanolopløsning skal være frisklavet.
  8. Overfør derefter maskeindsatsen med larver til en anden brønd med 5 ml frisklavet 0,3% Oil Red O i 60% Isopropanolopløsning. Inkuberede larver i 3 timer ved RT med blid gyngning.
  9. Efter OR-farvning skylles larver ved at overføre indsats til en anden brønd med 60% Isopropanol. Vask larver to gange i 60% Isopropanol i 30 min hver gang ved at overføre indsats sekventielt til brønde med 60% Isopropanol.
  10. Vask larver tre gange i 5 minutter i 1x PBS-0,1% Tween ved at overføre skær sekventielt til brønde med 1x PBS-0,1% Tween.
  11. Overfør larver til 2 ml rørene. Fjern PBST, tilsæt 1 ml 80% glycerol, og opbevar ved 4 °C indtil billeddannelse.
  12. For bedre billeddannelse skal du overføre larver til 1x PBS-0,1% Tween og under et dissektionsomfang dissekere lever ved omhyggeligt at trække væv ved hjælp af to # 55 tang.
    BEMÆRK: Hvis du bruger en Casper baggrundsbilleddannelse kan udføres ved hjælp af hele larverne.
  13. Brug en glaspipette til forsigtigt at overføre lever til en brønd i en porcelænspletteplade med 50% glycerol. Placer lever ved hjælp af et lille værktøj til at manipulere larver (f.eks. Øjenvippeværktøj - figur 2B). Billedlever i et stereomikroskop udstyret med et farvekamera.
  14. Score hepatisk steatose (ingen OR-farvning = ingen; lys rød ORO-farvning = mild; rød-mørkerød OR-farvning = moderat/svær).

5. Ikke-invasiv konfokal billeddannelse ved hjælp af zebrafiskens sår- og indfangningsenhed til vækst og billeddannelse (zWEDGI).

  1. Forbered en 10 cm petriskål med 15-20 ml 1x Tricaine-E3, lige nok til at dække bunden.
    BEMÆRK: En 1x Tricaine-E3 arbejdsløsning (0,16 mg/ml) kan opnås ved fortynding af 2 ml af en 25x Tricaine stamopløsning (4 mg/ml) i 48 ml E3. Trikainkoncentrationen må ikke overstige 0,16 mg/ml, da larver er ekstremt følsomme over for anæstesien på dette udviklingsstadium.
  2. Overfør 15-20 larver med en pasteurpipette af plast til petriskålen indeholdende 1x Tricaine-E3 og bedøve larver i 5 min.
  3. Forbered en 6 brøndplade med 2-3 ml E3 uden methylenblåt pr. Brønd.
  4. På et fluorescerende stereomikroskop screenes de bedøvede larver for ønskede fluorescerende markører (tabel 1). Overfør screenede larver i den mindste mængde Tricaine i E3 og lad dem komme sig i 6 brøndpladen, indtil det er tid til at afbilde.
    BEMÆRK: Screening af dobbelt-, tredobbelt og firdobbelt transgene larver tager tid, placer larver i E3 og skift medier fra 6-brøndpladen ofte for at mindske unødvendig eksponering for Tricaine. Larver på dette udviklingsstadium flyder også, så brug et øjenvippeværktøj til at placere larver til screening uden at fremkalde vævsskade.
  5. Efter screening skal du forberede en 10 cm petriskål med 25 ml 1x Tricaine-E3. Overfør 15-20 larver med en pasteurpipette af plast til petriskålen indeholdende 1x Tricaine-E3 og bedøve larver i 5 min.
  6. I mellemtiden tilføjes 1x Tricaine-E3 under stereomikroskopet i kamrene i sår- og indfangningsanordningen (f.eks. zWEDGI)15,16. Fjern luftbobler fra kamrene og fastholdelsestunnelen ved hjælp af en P200 mikropipette. Fjern alt overskydende 1x Tricaine-E3, så der kun er nok volumen til at fylde kamrene.
  7. Overfør en bedøvet larve ind i zWEDGI's lastekammer, og placer den ved hjælp af et øjenvippeværktøj under stereomikroskopet. Bank forsigtigt larvernes hoved og skub det, så halen kommer ind i fastholdelsestunnelen. Derudover fjernes 1x Tricaine-E3 ved hjælp af mikropipetten fra sårkammeret for at hjælpe larven med at komme ind i tunnelen. Sørg for, at larven er placeret korrekt til billeddannelse af venstre lobe - Omvendt mikroskop: venstre side nedad; Opretstående mikroskop: venstre side opad.
    BEMÆRK: Hvis en zWEDGI ikke er tilgængelig, kan fisk monteres og placeres i 1% lavt smeltepunkt agarose i 1x Tricaine-E3, men agarosenedsænkning kan kun bruges til hurtig billeddannelse (op til 15 min).
  8. Til hepatocyt- og nuklear morfologianalyse har billedet lever med et konfokalt mikroskop ved hjælp af et 40x luftmål og z-stakke med 2 μm optiske sektioner. Til levermorfologi, angiogenese og immuncellerekrutteringsanalyser billedlever ved hjælp af et 20x luftmål og z-stakke på 5 μm optiske sektioner. For larver med store lever skal der tages 2 x 2 flisebilleder for at sikre billeddannelse af al lever og omgivende område på 75 μm.
  9. Efter billeddannelse skal du bruge en pasteur-pipette af plast med 1x Tricaine-E3 til at trække larver fra fastholdelsestunnelen og overføre til en petriskål med E3 uden methylenblåt.

6. Analyse af levermorfologiske variationer.

BEMÆRK: Nedenstående trin udføres for leveroverfladeareal og volumenkvantificering:

  1. Åbn billedbehandlingssoftware. Tilføj mappe, der indeholder billedfiler, der skal analyseres, til Arena ved at vælge Observer-mappeikonet . Vælg derefter Konverter til oprindeligt Imaris-filformat ved at højreklikke på miniaturer for at konvertere filer til formatet (.ims).
  2. I undermenuen Overpass skal du justere lysstyrke og kontrast for hver kanal. Opret derefter en overflade fra leveren ved at klikke på den blå knap Tilføj nye overflader .
  3. Vælg derefter Segmenter kun et område af interesse på panelet Oprettelse af overfladen for manuelt at oprette en overflade af leveren.
  4. Klik på Spring automatisk oprettelse over | Rediger manuelt mulighed. Vælg Kontur , og fravælg "Volume" i scenepanelet.
    BEMÆRK: Indstillingen Volumenvisning skal fravælges, ellers kan valg af interesseområde i forskellige z-stakke ikke være i stand.
  5. Naviger gennem z-stakke, og tegn interesseområde i hvert plan ved at vælge Tilstand, vælg den tegnetilstand, du foretrækker. For at begynde at tegne ændringsmarkør til Vælg tilstand og ikke Navigate, skal du derefter klikke på Tegn og begynde at trække markøren gennem leveren for at tegne et investeringsafkast.
  6. Når du har valgt et investeringsafkast i de forskellige fokusplaner, skal du vælge Opret en overflade for at flette alle de valgte investeringsafkast og oprette leveroverflade.
  7. Dernæst ved hjælp af den nyoprettede overflade oprettes en maske af hepatocytsignalet. Klik på overfladen, og vælg Maske alle under fanen Rediger (blyanten). I det vindue, der vises, skal du vælge den kanal, du vil maskere, der skal bruges til at kvantificere levervolumen og overfladeareal. Vælg derefter indstil voxels uden for overfladen til 0, og marker indstillingen Dupliker kanal, før du anvender maske.
  8. Brug leveroverfladeareal og levervolumenværdier fra statistisk analysemenu til analyse.

BEMÆRK: Udfør følgende trin til kvantificering af leverareal.

  1. Åbn Fiji-software. I menuen Plugins skal du vælge Bio-formater efterfulgt af Bio-formater Importer, markere indstillingen Opdel kanaler for at åbne billedfil.
  2. I menuen Billede skal du vælge Egenskaber for at kontrollere, at billedet har den korrekte pixelstørrelse og voxeldybde, hvis ikke korrekte værdier. Gå derefter til menuen Billeder, klik på Juster efterfulgt af Lysstyrke og kontrast, juster billedets lysstyrke og kontrast.
  3. Dernæst skaber brug af hepatocytkanal en maksimal intensitetsprojektion af leveren. Gå til menuen Billeder, klik på Stakke efterfulgt af Z-projekt. Vælg Maksimal intensitetsprojektion.
  4. Brug frihåndsudvælgelsesværktøjet til manuelt at oprette et område af interesseret (ROI) omkring larvelever. Klik derefter på Analyser menu klik på Mål for at få leverområdet. Gem resultater som regneark til yderligere analyse.

7. Hepatocyt og nuklear morfologisk analyse.

  1. Åbn Fiji-software. I menuen Plugins skal du vælge Bio-formater efterfulgt af Bio-formater Importør markere på Split kanaler mulighed for at åbne billedfil.
  2. I menuen Billede skal du vælge Egenskaber for at kontrollere, at billedet har den korrekte pixelstørrelse og voxeldybde, hvis ikke korrekte værdier. Gå derefter til menuen Billeder, klik på Juster efterfulgt af Lysstyrke og kontrast, juster billedets lysstyrke og kontrast.
  3. I menuen Analysér skal du vælge Angiv målinger og markere alle de parametre, du vil analysere (f.eks. område-, omkreds- og formbeskrivelser). Vælg hepatocytmembran fluorescerende kanal. Når du navigerer gennem Z, skal du bruge frihåndsvalgsværktøjet til at tegne perfekt ROI omkring en hepatocyt. Klik derefter på Analyser menu for at beregne hepatocytter område.
  4. Gentag trin 7.3 for 15-30 hepatocytter. Gem resultater som regneark til yderligere analyse.
  5. Vælg derefter kernefluorescerende kanal. Når du navigerer gennem Z, skal du bruge frihåndsvalgsværktøjet til at tegne perfekt ROI omkring hepatocytkernen. Klik derefter på Analyser menu klik på Mål for at beregne nukleart areal og cirkularitet.
  6. Gentag trin 7,5 for 15-30 hepatocytter. Gem resultater som et regneark til yderligere analyse, herunder kvantificering af nukleare: cytoplasmatiske forhold.
  7. Score prøver for tilstedeværelse af mikronuklei og diskusprolaps som følger (tabel 3).

8. Angiogenese analyse.

  1. Opret manuelt en overflade til leveren som beskrevet i afsnit 6 i denne protokol. Navngiv denne overflade som "Liver Surface".
  2. Opret en maske til endotelcellernes signal inde i leveren. Klik på overfladen, og vælg Maske alle under fanen Rediger (blyanten). I vinduet, der vises, skal du vælge endotelcellekanalen for at isolere karsignaler lige fra leveren. Vælg indstil voxels udvendig overflade til 0, og marker indstillingen Dupliker kanal , før du anvender Maske.
  3. Omdøb nye endotelceller maskeret kanal som levervaskulatur.
  4. For at måle fartøjets volumen og overfladeareal oprettes en anden overflade. Klik på den blå knap Tilføj nye overflader . I det første trin af oprettelsen af overfladen skal du sørge for, at alle indstillinger ikke er markeret for automatisk at oprette en overflade.
  5. I det andet trin skal du vælge Levervaskulaturkanal for at skabe en overflade over. Fravælg udjævningsindstilling for at registrere så mange detaljer fra fartøjer som muligt og aktivere baggrundssubtraktion i tærskelindstillingen.
  6. Juster tærskelværdien, så du sikrer, at den detekterede overflade er colokaliserende med levervaskulatursignalet. Brug overfladeareal og volumenværdier fra menuen statistisk analyse. Beregn fartøjstæthedsindeks ved hjælp af følgende ligninger:
    Fartøjstæthedsindeks (efter lever μm 2) = (fartøjets overfladeareal (μm 2)) / (leveroverfladeareal (μm2))
    Fartøjstæthedsindeks (efter lever μm 3) = (karvolumen (μm 3)) / (levervolumen (μm3))

9. Immuncellerekrutteringsanalyse.

  1. Åbn Fiji-software. I menuen Plugins skal du vælge Bio-formater efterfulgt af Bio-formater Importør markere på Split kanaler mulighed for at åbne billedfil.
  2. I menuen Billede skal du vælge Egenskaber for at kontrollere, at billedet har den korrekte pixelstørrelse og voxeldybde, hvis ikke korrekte værdier. Gå derefter til menuen Billeder , klik på Juster efterfulgt af Lysstyrke og kontrast, juster billedets lysstyrke og kontrast (f.eks. Makrofager - mCherry eller dTomato; neutrofiler - BFP; T-celler - EGFP; hepatocytter - EGFP eller mCherry).
  3. Opret derefter maksimale intensitetsfremskrivninger til hver kanal.
  4. Som beskrevet i afsnit 6 (trin 6.9-6.12) skal du oprette et investeringsafkast omkring larveleveren og måle leverarealet. Opret et andet investeringsafkast inklusive leverområde og 75 μm omgivende område ("Rekrutteringsområde").
  5. Vælg derefter Valgindstilling i menuen Rediger efterfulgt af Føj til manager. Hvis du vælger en medfødt immuncellekanal Maksimal intensitetsprojektion, skal du klikke på leverens ROI fra ROI Manager-vinduet for at indstille rekrutteringsområdet.
  6. I menuen Plugins skal du vælge Analyser mulighed efterfulgt af Cell Counter og tælle immunceller inde i rekrutteringsområdet. Rekordmange rekrutterede immunceller til leverområdet på et regneark.
  7. Beregn neutrofil-, makrofag- og T-celletætheder ved at normalisere antallet af immunceller pr. Leverareal.

Representative Results

Ved at indføre en kortvarig diæt med højt kolesteroltal i en hepatocellulært carcinom (HCC) zebrafiskmodel, som overudtrykker en hepatocytspecifik konstitutivt aktiv form af beta-catenin (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, vi er i stand til at skabe en ikke-pattedyrs hvirveldyrsmodel af NASH-associeret HCC. Leversygdomsprogression kan overvåges tidligt ved at måle hepatisk steatose, leverstørrelse, hepatocyt, nuklear morfologi, angiogenese og immuncelleinfiltration (figur 1).

HCC-larver fodret med en normal diæt viser ingen til mild leversteatose målt ved olierød O-farvning. HCC-larver fodret med en diæt med højt kolesteroltal viser imidlertid en signifikant stigning i leversteatose (figur 2).

En velkendt markør for leversygdom er hepatomegali17. For at evaluere leverstørrelse kan HCC-larver krydses med en transgen linje, der specifikt udtrykker en fluorescerende markør på hepatocytter, såsom Tg (fabp10a: H2BmCherry). For at vurdere hepatomegali udføres evaluering af leverområdet (2D), leveroverfladeareal og levervolumen (3D). Efter 8 dages eksponering for kolesteroloverskud blev der observeret leverforstørrelse hos HCC-larver (figur 3).

Ved hjælp af ikke-invasiv levende billeddannelse kan transgene fiskelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner i hepatocytmembraner (såsom Tg (fabp10a: Life-actin-EGFPP) og i hepatocytkerner (såsom Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) bruges til at vurdere cellulære og nukleare morfologiændringer forbundet med malignitet i hepatocytter. Hepatocytområdet blev øget i NASH-associeret HCC (figur 4A, B, D) såvel som nukleart område (figur 4C, E) og nukleart / cytoplasmatisk forhold (figur 4F). Der blev også observeret et signifikant fald i nuklear cirkularitet i HCD+HCC-gruppen (figur 4G). Lipotoksicitet udløser DNA-skade, et træk ved carcinogenese i nærvær af mikronukler. Ved hjælp af H2B-mCherry-markøren observerede vi en større forekomst af mikrokerner i HCC-larverne fodret med en diæt med højt kolesteroltal (figur 4H).

Hepatisk vaskulatur kan let evalueres i zebrafiskmodeller ved hjælp af en transgen mærket linje, såsom Tg (kdrl: mCherry eller Tg (fli: EGFP), som mærker vaskulatur. En signifikant stigning i kardensitet blev observeret i HCC + HCD larver (figur 5).

For at observere det inflammatoriske respons, der blev udløst tidligt i NASH-associeret HCC, blev en transgen fiskelinje, der udtrykker fluorescerende proteiner i makrofager og neutrofiler, såsom Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), krydset med HCC transgene linje. Infiltration af neutrofiler og makrofager forekommer i både HCC og HCC fodret med HCD, som blev vurderet ved kvantificering af antal og tæthed af neutrofiler / makrofager i leveren og nærheden (omgivende område op til 75 μm) (figur 6A-H). Ikke desto mindre udviste HCC + HCD en signifikant stigning i neutrofilantal og densitet (figur 6F-H). 13 dage efter befrugtning er det adaptive immunsystem allerede funktionelt. Brug af en transgen fiskelinje, der udtrykker fluorescerende protein i T-celler, såsom Tg (lck: EGFP), og i kombination med HCC transgene linje; vi evaluerede virkningen af kolesteroloverskud på rekruttering af T-celler til leveren. Et signifikant fald i T-celletæthed og samlet antal blev observeret i HCC-larver fodret med HCD (figur 6I-K).

Transgene zebrafisklinjer ZFIN-henvisning Undersøgelse
Casper RoyA9; MitfaW2 Hepatisk steatosis
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry) s704Tg / uwm41Tg Levermorfologi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP) s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg Hepatocytter og nuklear morfologi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP) s704Tg / y1Tg Angiogenese
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomat-CAAX; lyzC:BFP) s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg Makrofag og neutrofil rekruttering
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP) s704Tg / cz1Tg T-celler rekruttering

Tabel 1: Transgene zebrafiskelinjer til brug i forskellige assays.

Antal larver Foderkasse størrelse Mængde mad pr. dag (mg) E3 volumen (ml)
30-40 Lille avlskasse 3-4 200
60-80 Lille/stor avlskasse 6-8 400
100-150 Stor avlskasse 10-15 500

Tabel 2: Opsæt betingelser for fodringskasser.

Fænotype Scoring metode
Ingen Normale kerner, ingen mikrokerner eller diskusprolaps
Mild Lavt antal mikrokerner (mindre end 5 pr. synsfelt) og/eller diskusprolaps
Moderat/ svær Moderat til højt antal mikrokerner (mere end 5 pr. synsfelt) og/eller diskusprolaps

Tabel 3: Mikronuklei og nuklear diskusprolaps.

Figure 1
Figur 1: Protokoldiagram, der opsummerer de vigtigste eksperimentelle trin og analysemetode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kontrolanalyse for leversteatose - ORO-farvning. HCC larver blev fodret med normal eller højt kolesteroltal kost og Oil Red O (ORO) farvning blev udført for at vurdere hepatisk steatose. (A) Diagram over 12-brøndpladen til udførelse af sekventiel ORO-farvning ved hjælp af maskebrøndindsatserne. (B) Billede af øjenvippeværktøj, der bruges til at manipulere larver. (C) Repræsentative billeder af lever farvet med olierød; HCC- og HCC+HCD-larver. (D) Chi-kvadratisk graf, der viser procentdelen af larver med forskellig score for leversteatose. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder fra leverstørrelse. Transgene HCC-larver, der udtrykker en levermarkør (Tg(fabp10a: H2B-mCherry)) blev afbildet levende og ikke-invasivt på et omvendt roterende diskkonfokalmikroskop ved hjælp af en zWEDGI. (A) Repræsentative 3D-rekonstruktioner af lever i HCC- og HCC+HCD-larver. (B-D) Graf, der viser levermorfologiske ændringer, herunder leverareal (B) leveroverfladeareal (C) og levervolumen (D) i HCC- og HCC + HCD-larver. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative billeder fra hepatocytter og kernemorfologi. Transgene HCC-linjer, der udtrykker fluorescerende proteiner i hepatocytmembraner (Tg(fabp10a: Life-actin-EGFP) og i hepatocytkerner (Tg(fabp10a: H2B-mCherry) blev afbildet. (A-C) Repræsentative 3D-rekonstruktioner af F-actin- og hepatocytkerner af HCC- og HCC+HCD-larver. Åbne pilespidser viser forstørrede kerner; hvide pilespidser viser kerne med ændret form; og røde pile viser mikrokerner og nuklear herniation. (D-G) Grafer, der viser gennemsnit af celle- og nukleare parametre i HCC og HCC + HCD 13 dage gamle larver. (D) Hepatocytter område. e) Nukleart område. (F) Nukleart:Cytoplasma-forhold. g) Nuklear cirkularitet. Hver prik repræsenterer gennemsnit pr. larve. Prikplotter viser gennemsnitlige ±SEM (H) Chi-kvadratgrafer, der viser procentdel af larver med forskellig score af mikronuklei og nuklear herniation. Skala bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative billeder fra levervaskulaturen. Transgene HCC-linjer, der udtrykker fluorescerende proteiner i hepatocytkerner (Tg(Fabp10a: H2B-mCherry) og i endotelceller (Tg) fli: EGFP)). (A) Repræsentative 3D-rekonstruktioner af levervaskulatur i HCC- og HCC + HCD-larver. (B-C) Graf, der viser fartøjstæthedsindeks efter leveroverfladeareal (B) volumen (C) i HCC- og HCC + HFCD-larver. Prikdiagrammer viser middelværdi ±SEM. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative billeder fra leverimmuncellelandskab. Transgen HCC-linje, der udtrykker fluorescerende proteiner i makrofager og neutrofiler (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) eller i T-celler (Tg(lck-EGFP). (A, C, F) Repræsentative 3D-rekonstruktioner af lever- og leukocytrekruttering til leverområdet i 13 dage gamle HCC- og HCC+HCD-larver. (B) Diagram over afbildet leverområde. (D-E) Graf, der viser makrofagtæthed (D) og tal (E) i leverområdet i HCC- og HCC+HCD-larver. (G-H) Graf, der viser neutrofiltæthed (G) og tal (H) i leverområdet i HCC- og HCC + HCD-larver. (G) Repræsentative 3D-rekonstruktioner af T-cellerekruttering til leverområdet i HCC- og HCC + HCD-larver. (H-I) Graf, der viser T-celletæthed (H) og tal (I) i leverområdet i HCC- og HCC + HCD-larver. Prikdiagrammer viser middelværdi ±SEM. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Tabel over buffere og løsninger Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Med en øget forekomst af HCC, specifikt NASH-induceret HCC, er det af stor betydning at have mere effektive modeller til at studere de cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret i NASH-associeret HCC. Dekonvolution af celle-celle interaktioner i leveren er afgørende for bedre at forstå leversygdom progression og hepatocarcinogenese. Den tilgang, der er beskrevet i denne protokol, tilbyder en unik måde at analysere leversygdomsprogression in vivo og ikke-invasivt.

Forberedelse af kost er afgørende for succesen med at etablere en NASH-associeret HCC-model. Det er vigtigt at lade diethylether fordampe fuldstændigt inde i røghætten for at undgå skadelige virkninger, mens du forbereder diæter til zebrafisk. For at bruge disse kostvaner med larver (5-12 dage efter befrugtning) er det ekstremt vigtigt at male kosten op i fine partikler for at sikre larvernes fødeindtag. Anvendelsen af fluorescerende mærkede fedtsyreanaloger kan bruges til at evaluere fødeindtagelse i larver.

Før larverne placeres i avlskasserne og påbegyndes fodringsproceduren, er det afgørende at sikre, at eksperimentel prøveudtagning ensartes ved at blande larver fra forskellige plader. Dette trin er vigtigt, da forskellige mikromiljøer, der begynder på dag 0, fremmes i hver af pladerne og kan påvirke inflammatorisk respons.

Et andet vigtigt skridt er at tælle larverne for at vide, hvor meget mad der er behov for til hver foderkasse. Hvis mængden af mad ikke er tilstrækkelig til antallet af larver, der er til stede i hver kasse, vil et af de to scenarier forekomme: 1) larver vil blive underfodret; 2) larver vil blive overfødt. Unøjagtig fodring vil føre til usunde forhold forbundet med underernæring eller overernæring, såsom betændelse, hvilket drastisk vil påvirke levermikromiljøet. Hvis der opstår unøjagtig fodring, vil larver vise bevægelsesproblemer. På dette udviklingsstadium bør larver svømme intensivt, derfor hvis der opdages bevægelsesproblemer, blev larver opdrættet under usunde forhold (underernæring eller udsættelse for giftige doser kolesterol på grund af overfeeding). Af denne grund skal fodringsprocedurer kontrolleres tæt for både kostvaner, normal og kolesterolberiget. Nogle assays kan udføres for hurtigt at behandle nøjagtigheden af fodring og sundhed af larver, herunder tilstedeværelse af hepatomegali (leverstørrelse) og betændelse i væv og organer, især lever og tarm (synlig øget infiltration af neutrofiler og makrofager).

Daglig rengøring og udskiftning af 95% af E3 er afgørende for at reducere væksten af mikroorganismer i foderkasserne og forbedre larvernes sundhed og overlevelse. Alternativt kan larver placeres i et enkeltstående racksystem. For de bedste resultater skal du placere 60-80 larver i en 3-liters tank. Hold vandstrømmen på minimumsniveauet ved at justere strømmen til en hurtigt dryppende tilstand og fodre larver 3-4 mg to gange om dagen (AM og PM). Vandstrømmen skal kontrolleres regelmæssigt for at sikre korrekt strømning i hver tank. I vores laboratorium giver denne metode os 95-100% overlevelse med kortvarig fodring af 10% HCD. Desuden reducerede denne metode i høj grad arbejdsbyrden forbundet med den daglige rengøring og vandudveksling, der er nødvendig i den beskrevne statiske fodringsprotokol.

Mens vi brugte en 10% kolesterolberiget diæt til at inducere NASH i en kortvarig eksponering (5 dage er nok til at inducere steatohepatitis), kan diætændringer udføres og udvides til at bruge fructose 18, fedtsyrer (såsom palmitinsyre)19 eller fodringsprotokoller, der kan udvides ved hjælp af en 4% kolesterolberiget diæt20. I øjeblikket er der få vellykkede terapeutiske mål for HCC og ingen for NASH. Brugen af zebrafiskmodeller giver en unik mulighed for at udvide vores viden om hepatocarcinogenese, men også et uovertruffent hvirveldyrsystem til at udføre store gennemstrømningslægemiddelscreeninger. De teknikker, der er beskrevet i denne protokol, vil lette fremtidige fund og terapeutiske mål for leversygdom og hepatocarcinogenese.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatteren vil gerne anerkende Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility teknikere Clinton DePaolo og Spartak Kalinin for hjælp og vedligeholdelse af vores zebrafisklinjer. FJMN er støttet af Cancer Research Institute og Fibrolamellar Cancer Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholesterol Sigma C8667-25G Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm Fisher 07-200-223
Corning Netwells inserts Fisher 07-200-212
Diethyl ether Fisher 60-046-380 Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar Fisher NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in Fisher 22-183624
4% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres Brine Shrimp Direct - Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets Fisher 22-170-404
Isopropanol Fisher BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack Crystalgen 221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM Fisher 08-747D
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol Sigma O1391-500ML
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Vactrap VWR 76207-630 Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope Leica M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope Nikon Nikon CSU-W1
Stereomicroscope Leica S9i with transilluminated base
Software
Fiji Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6 Bitplane; Oxford Instruments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
  2. El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
  3. Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
  4. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  5. Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177 (2014).
  6. Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193 (2015).
  7. Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
  8. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  9. Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
  10. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
  11. Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509 (2019).
  12. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  13. Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204 (2013).
  14. de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
  15. Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
  16. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  17. Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
  18. Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
  19. Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
  20. Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864 (2014).

Tags

Kræftforskning nummer 170
Analyse af levermikromiljø under tidlig progression af ikke-alkoholisk fedtleversygdom-associeret hepatocellulært karcinom i zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michael, C., Martínez-Navarro,… More

Michael, C., Martínez-Navarro, F. J., de Oliveira, S. Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62457, doi:10.3791/62457 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter