Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering av effekterna av hemodynamisk stress på cirkulerande tumörceller med en spruta och nål

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62478
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1, 1,2,4,5,6
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 3MD program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Department of Pathology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Department of Urology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 6Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

Här demonstrerar vi en metod för att applicera vätskesjuvningsstress på cancerceller i suspension för att modellera effekterna av hemodynamisk stress på cirkulerande tumörceller.

Abstract

Under metastasering får cancerceller från fasta vävnader, inklusive epitel, tillgång till lymfatisk och hematogen cirkulation där de utsätts för mekanisk stress på grund av hemodynamiskt flöde. En av dessa påfrestningar som cirkulerande tumörceller (CTCs) erfarenhet är vätskesjuvning stress (FSS). Medan cancerceller kan uppleva låga nivåer av FSS inom tumör på grund av interstitiellt flöde, ctcs exponeras, utan extracellulära matrisfäste, för mycket högre nivåer av FSS. Fysiologiskt sträcker sig FSS över 3-4 storleksordningar, med låga nivåer i lymfatisk (<1 dyne/cm2)och de högsta nivåerna som förekommer kort när celler passerar genom hjärtat och runt hjärtklaffar (>500 dyner/cm2). Det finns några in vitro-modeller utformade för att modellera olika intervall av fysiologisk savstress under olika tidsramar. Detta dokument beskriver en modell för att undersöka konsekvenserna av korta (millisekunder) pulser av hög nivå FSS på cancercellsbiologi med hjälp av en enkel spruta och nålsystem.

Introduction

Metastasering, eller spridning av cancer bortom den ursprungliga tumörplatsen, är en viktig faktor bakom cancerdödlighet1. Under metastasering använder cancerceller cirkulationssystemet som en motorväg för att sprida sig till avlägsna platser i hela kroppen2,3. Medan på väg till dessa platser finns cirkulerande tumörceller (CTC) i en dynamisk flytande mikromiljö till skillnad från deras ursprungliga primära tumör3,4,5. Det har föreslagits att denna flytande mikromiljö är ett av många hinder för metastasering4. Det råder bred enighet i begreppet metastaserad ineffektivitet,dvs. Varför metastasering är ineffektivt ur ett individuellt CTC-perspektiv är dock mindre säkert och förblir ett aktivt undersökningsområde. CTCs är fristående från extracellulär matris, berövas löslig tillväxt och överlevnad faktorer som kan finnas i den primära tumören, och utsätts för immunsystemet och hemodynamic krafter på ett mycket annorlunda sätt än i den primära tumör4. Var och en av dessa faktorer kan bidra till ctc:s dåliga överlevnad, men deras relativa bidrag är oklara. Detta dokument tar upp frågan om hur hemodynamiska krafter påverkar CTC.

Att studera effekterna av hemodynamiska krafter på CTC är ganska utmanande. För närvarande finns det inga konstruerade in vitro-system som kan replikera hela spatiotemporal dynamiken (hjärta till kapillärer) och reologiska egenskaper hos det mänskliga kärlsystemet. Dessutom är det inte helt klart hur CTC upplever cirkulationssystemet. Experimentella bevis tyder på att de flesta cancerceller inte cirkulerar kontinuerligt som blodkroppar. Snarare, på grund av deras relativt stora storlek (10-20 μm i diameter), blir de flesta CTC fastspända i kapillärbäddar (6-8 μm i diameter) under varierande tidslängder (s till dagar) där de kan dö, extravasera eller förskjutas till nästa kapillärbädd8,9,10,11. Det finns dock vissa bevis för att CTC-storleken kan vara mer heterogen in vivo och att mindre CTC är detekterbara12. Därför, baserat på avstånd och blodflödeshastighet, får CTC endast cirkulera fritt i några sekunder mellan dessa perioder av entrapment, även om en kvantitativ beskrivning av detta beteendesaknas 13.

Beroende på var CTC:er kommer ut i cirkulationen kan de dessutom passera genom flera kapillärbäddar i lungan och andra perifera platser och genom både höger och vänster hjärta innan de når sin slutdestination. Längs vägen utsätts CTC: er för olika hemodynamiska påfrestningar inklusive vätskesjuvspänning (FSS), tryckkrafter under deras indragning i mikrocirkulationen och potentiellt dragkrafter under omständigheter där de kan uppvisa leukocytliknande rullning längs blodkärlsväggarna14. Således är både förmågan att modellera cirkulationen och förståelsen av CTC-beteendet som ska modelleras begränsad. På grund av denna osäkerhet bör eventuella resultat från in vitro-modellsystem valideras hos en experimentell ryggradsdjursorganism och i slutändan hos cancerpatienter.

Med de ovannämnda förbehållen visar detta dokument en relativt enkel modell för att tillämpa FSS på celler i suspension för att undersöka effekterna av FSS på CTC som först beskrevs 201215. FSS är resultatet av friktion av blodflödet mot kärlväggen, vilket ger en parabol hastighetsgradient under förhållanden med laminärt flöde i större kärl. Celler upplever högre nivåer av FSS nära kärlväggar och lägre nivåer nära blodkärlets centrum. Vätskeviskositet, flödeshastighet och dimensioner av röret genom vilka flödet uppstår påverkar FSS, enligt beskrivningen i ekvationen Hagen-Poiseuille. Detta gäller blodflöden som beter sig som newtonska vätskor, men håller inte för mikrocirkulationen. Fysiologisk FSS sträcker sig över flera storleksordningar med de lägsta nivåerna i lymfatiska medel (<1 dyn/cm2) och den högsta vid regioner runt hjärtklaffar och aterosklerotiska plack (>500 dyn/cm2)5. Genomsnittlig väggsjuvspänning i artärer är 10-70 dyn/cm2 och 1-6 dyn/cm2 i vener16,17.

I hjärtat kan celler utsättas för turbulenta flöden runt ventilbroschyrer där mycket hög nivå, men mycket kortvarig FSS kanupplevas 18,19. Även om biobearbetningsfältet länge har studerat effekterna av FSS på däggdjursceller i suspension, kan denna information vara av begränsat värde för att förstå effekterna av FSS på CTC eftersom den i allmänhet fokuserar på mycket lägre nivåer av FSS som tillämpas under en lång varaktighet20. Som beskrivits nedan, med hjälp av en spruta och nål, kan man applicera relativt hög (tiotusentals dyn / cm2) FSS under en relativt kort (millisekunder) varaktighet på en cellupphängning. Sedan den första beskrivningen av denna modell15, andra har använt den för att studera effekterna av FSS på cancerceller21,22,23. Flera "pulser" av FSS kan appliceras på cellupphängningar på kort tid för att underlätta experimentella analyser nedströms. Denna modell kan till exempel användas för att mäta cellernas förmåga att motstå mekanisk destruktion av FSS genom att mäta cellens livskraft som en funktion av antalet pulser som appliceras. Alternativt kan effekterna av FSS-exponering på cancercellernas biologi utforskas genom att samla celler för en mängd olika nedströmsanalyser. Viktigt är att en del av cellfjädringen reserveras som en statisk kontroll för att jämföra effekterna av FSS från de som kan vara associerade med cellavlossning och tid som hålls i suspension.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellberedning

  1. Frigör celler från vävnadskulturrätt när 70-90% sammanflöde genom att följa de rekommenderade riktlinjerna för den cellinje som används.
    1. Aspirera till exempel tillväxtmediet för PC-3-celler och tvätta cellernas 10 cm skål med 5 ml kalcium- och magnesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. Aspirera PBS innan du lägger till 1 ml 0,25% trypsin med tillverkarens protokoll.
    3. Efter att ha observerat avlossningen av cellerna under ett inverterat mikroskop, tillsätt 5 ml DMEM:F12 medium som innehåller 10% fetala nötkreatursserum för att hämma trypsin.
  2. Placera cellupphängningen i ett koniskt rör.
  3. Bestäm cellkoncentrationen och det totala cellnumret.
  4. Pelletsceller genom centrifugering (300 × g i 3 min), aspirera supernatanten och återanvända celler i serumfri vävnadskultur medium till 5 × 105 celler/ml.
    OBS: Det är viktigt att analysmediet innehåller minst 1,17 mM Ca++ eftersom extracellulär Ca++ har visat sig krävas för cellulär resistens mot FSS15.

2. Exponering för vätskesjuvspänning

  1. Innan du exponerar celler för FSS, skär ett rundbottnat 14 ml polystyrenrör vid 7 ml-linjen. Blanda cellfjädringen, placera 5 ml av suspensionen i det skurna röret och samla statiska kontrollprover.
    OBS: Den volym som behövs för att samla in för det statiska provet beror på vilken livsduglighetsanalys som används (se steg 3).
  2. Dra cellupphängningen i en 5 ml spruta och fäst en 30 G 1/2" nål. Packa upp nålen, placera sprutan på en sprutpump, säkra sprutan och ställ in flödeshastigheten för att uppnå önskad nivå av FSS.
    OBS: Tabell 1 visar den maximala väggsjuvspänningen för olika nålar och flödeshastigheter, liksom miniminivån för FSS beroende på cellstorlek (10, 15 och 20 μm). Inspektera nålen före användning för att säkerställa att den inte är böjd; Om det är osäkert, byt ut nålen mot en ny. Nålintegritet kan ha betydande inverkan på nivån på FSS som tillämpas.
  3. Kör sprutpumpen och samla det saxade provet i det skurna röret i ungefär 45° vinkel för att minska skumbildningen. Samla in ett prov beroende på typen av lönsamhetsanalys eller analysbehov i efterföljande led.
    1. Ta försiktigt bort sprutan och nålen från sprutpumpen och använd tång för att ta bort nålen från sprutan, var noga med att inte röra nålen.
      OBS: Icke-fasade nålar kan användas omväxlande med avfasade nålar som en extra säkerhetsåtgärd.
  4. Dra tillbaka den savslutna suspensionen i sprutan, sätt försiktigt tillbaka nålen med hjälp av tång och placera tillbaka den i sprutpumpen.
  5. Upprepa steg 2.3 och 2.4 tills cellfjädringen har utsatts för önskat antal pulser av FSS.
    OBS: För att bedöma cellernas förmåga att motstå mekanisk destruktion från FSS-exponering utsätts cellupphängningen vanligtvis för 10 pulser av FSS. Det har dock visat sig att celler börjar genomgå biologiska anpassningar som svar på FSS efter 2 pulser24.

3. Lönsamhetsmätning

OBS: Livskraften kan bedömas med hjälp av enzymatiska analyser (luciferas, återzurin och WST-1), med användning av intakta celler, flödescytometri eller clonogenic analyser.

  1. För alla mått på livskraft, samla in ett prov innan du exponerar celler för FSS.
    1. För enzymatiska analyser, ta dubbla 100 μL alikvoter och placera dem i en 96-brunnsplatta.
    2. För flödescytometri, ta en 500 μL alikvot och placera den i ett 1,5 ml-rör.
    3. För klomigen analys, samla in en 100 μL alikvot.
  2. Enzymatisk analys
    1. Samla in 100 μL-prover efter 1, 2, 4, 6, 8 och 10 pulser av FSS-exponering och placera dem i en 96-brunnsplatta.
    2. Lägg till önskat substrat och följ protokollet för den analys som används:
      1. För återförsäljningzurin, tillsätt 20 μL av en 0,15 mg/ml lösning till varje brunn. Tillsätt 20 μL 0,15 mg/ml återzurinlösning till brunnar som innehåller 100 μL medium ensamt. Inkubera i 2 h i en 37 °C vävnadskulturinkubator. Mät absorbansen med hjälp av en plåtläsare som kan avläsa fluorescens (579 excitation/ 584 emission).
      2. För luciferas-uttryckande celler, tillsätt 100 μL 15 mg/ml D-luciferin till 5 ml medium. Tillsätt 100 μL av den lösningen till varje brunn som innehåller celler. Vänta i 5 min och läs sedan plattan med en läsare som är kompatibel med luminiscens.
      3. För WST-1, tillsätt 10 μL WST-1 till varje brunn, inklusive brunnar som endast innehåller medium. Inkubera i 4 timmar och läs sedan absorbansen mellan 420 och 480 nm med hjälp av en plåtläsare.
    3. Jämför den genomsnittliga signalen från vart och ett av de FSS-exponerade proverna med det genomsnittliga statiska kontrollprovet för att erhålla procentandelen livskraftiga celler.
  3. Flödescytometri24
    1. Samla in 500 μL-prover och placera dem i 1,5 ml centrifuger efter 1, 2, 5 och 10 pulser av FSS.
    2. Centrifugprover (500 × g i 3 min) och kassera supernatanterna.
    3. Återanvänd pelletsen med 1 ml kalcium- och magnesiumfri PBS och centrifugera proverna (300 × g i 3 min).
    4. Suspendera pelletsen med 500 μL fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (PBS med 0,5% bovint serumalbumin och 0,1% natriumazid) med räknande pärlor och membrangenomträngliga eller livsdugliga färgämnen som propidiumideid (1,75 μg/ml).
    5. Bestäm livskraften genom att jämföra förhållandet mellan livskraftiga celler, normaliserade till att räkna pärlor, i saxade prover med det statiska provet.
  4. Clonogenic analys
    1. Ta 100 μL av det statiska provet och tillsätt 900 μL tillväxtmedium för att göra en utspädning på 1:10.
    2. Ta 100 μL av det utspädda provet på 1:10 och tillsätt 900 μL tillväxtmedium för att göra en slutlig utspädning på 1:100.
    3. Tillsätt 100 μL av utspädningsprovet på 1:100 i var och en av 3 brunnar i en 6-brunnsform som innehåller 2 ml tillväxtmedium.
    4. Upprepa steg 3.4.1-3.4.3 med prover som har utsatts för 10 pulser av FSS.
    5. Låt cellerna växa i 7-10 dagar utan att ändra mediet och kontrollera om kolonibildningen är. När kolonier av ≥50 celler har bildats, aspirera tillväxtmediet, skölj varje brunn med 1 ml PBS, aspirera PBS och fixera i 5 min med 1 ml iskall 70% etanol (EtOH). Viktigt är att fixa både saxade och statiska prover samtidigt
    6. Efter fixering av proverna, aspirera EtOH och tillsätt 1 till 2 ml kristallviolett lösning (0,1% kristallviolett i 90% H2O, 10% EtOH) i 5 min.
    7. Skölj med ett överskott av vatten och låt plattan torka
    8. Räkna kolonierna (kluster av ≥50 celler) för både de statiska och saxade exemplen. Jämför förhållandet mellan det genomsnittliga antalet kolonier från det saxade provet och det genomsnittliga antalet kolonier från det statiska provet för att bestämma livskraften.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Förhöjd resistens mot FSS-inducerad mekanisk förstörelse har tidigare visat sig vara en bevarad fenotyp över flera cancercelllinjer och cancerceller som nyligen isolerats från tumörer i förhållande till icke-omvandlade epitelcellsjämförelse15,24. Här testades ytterligare cancercelllinjer från en mängd olika vävnads ursprung (tabell 2) för att visa att majoriteten av dessa celler visar livskraft ≥ 20% efter 10 pulser av FSS vid 250 μL/s. Det enda undantaget är MiaPaCa2-celler, som var relativt känsliga för mekanisk destruktion från FSS (≤ 10%). För att på ett adekvat sätt beskriva FSS-resistensprofilen för en cellinje rekommenderas ≥ 3 biologiska replikat.

Som jämförelse har alla icke-omvandlade epitelceller som undersökts livskraft < 10% under dessa förhållanden15,24. Således, medan det finns ett intervall i FSS-resistens observeras, uppvisar majoriteten av de testade cancercellslinjerna större FSS-resistens än icke-omvandlade celler. Cancercellslinjer kan härledas från både primära tumörvävnader och metastaser. Man kan postulera att celler som härrör från metastaser kan uppvisa större FSS-resistens eftersom denna fenotyp kan ha valts under metastaserad spridning. FSS-resistensnivån visade sig dock inte bero på om celler härleddes från primära tumörer eller metastaser15,24. Dessutom korrelerade nivåerna av FSS-resistens inte med metastaserad potential i en serie mänskliga prostatacancer cellinjer15.

För att testa detta ytterligare användes BALB/c bröst epitelceller med varierande ögonbevarande potential (4T1 = mycket ögonbevarande, 4T07 = svag till måttlig ögonbevarande potential, 67NR = nej till låg metastaserad potential25,26). Detta experiment visade att FSS-resistens inte är korrelerat med metastaserad potential (figur 1). Dessutom uppvisar både 4T1- och 4T07-celler en bifasisk förlust av cellens livskraft- en större förlust av livskraft i pulser 1-2 än vad som observerats i efterföljande pulser. Detta är typiskt för de flesta cancercelllinjer som undersökts av denna grupp. Däremot uppvisar 67NR en mer linjär förlust av cellens livskraft som en funktion av FSS. Sammantaget visar data från tabell 2 och figur 1 att FSS-resistens är en egenskap hos omvandlade celler.

Figure 1
Figur 1:Vätskesjuvspänningsresistens hos syngeneiska BALB/c mammary epitelcancerceller. Cellerna exponerades för FSS (30 G nål, 10 pulses@250 ml/s) och livskraften mättes med hjälp av återzurinkonvertering (n = 4/cellinje). Medan FSS-exponeringen minskade antalet livskraftiga celler (p < 0,0001, 2-vägs ANOVA) och varje cellinje visade olika resistansprofiler (p = 0,0446, 2-vägs ANOVA), fanns det ingen signifikant skillnad mellan cellinjer efter 10 pulser av FSS-exponering (p = 0,2833, 2-vägs ANOVA). Förkortningar: FSS = vätskesjuvspänning; ANOVA = variansanalys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Sax (τ): vägg (maximalt) minimum
Celldiameter: Ej tillämpligt 10 μm 15 μm 20 μm
Nålmätare: 30 27 25 30 27 25 30 27 25 30 27 25
Flödeshastighet (μL/s) 20 507 220 116 32 10 4 48 16 7 64 21 9
50 1267 550 290 80 26 11 120 39 17 159 52 22
100 2534 1100 580 159 52 22 239 79 33 319 105 45
150 3801 1650 869 239 79 33 359 118 50 478 157 67
200 5068 2200 1159 319 105 45 478 157 67 637 210 89
250 6335 2750 1449 398 131 56 598 196 84 797 262 111

Tabell 1: Maximal saxspänning (τvägg)nivåer. Tabellen listar de maximala FSS-nivåerna i dyn/cm2 för 30 G, 27 G och 25 G nålar vid flödeshastigheterna 20, 50, 100, 150, 200 och 250 μL/s. Shear stressnivåer beräknades med hjälp av Poiseuille ekvationen ( Equation 1 ), tillgänglig information för innerdiametern för varje nålmätare, liksom antagandet att μ = 0,01 dyn·s/cm2. Minsta FSS-nivåer för varje storlek beräknades med Equation 2 hjälp av var i r är cellradien, och R är nålens radie. Förkortning: FSS = vätskesjuvspänning; τ = sax; τvägg = maximal sax; μ = viskositet; Q = volymetriskt flöde.

Celllinje Källa till vävnad Art Genomsnittlig livskraft (%) efter 10 pulser
TRAMPC1 (spårvagnslinje 1) Prostata Mus 40
4T01 (på 4501) Bröst Mus 32
4T7 (på 4T7) Bröst Mus 43
67NR (67NR) Bröst Mus 46
66CL4 (på 66CL4) Bröst Mus 28
RT4 (på andra) Blåsa Mänsklig 62
W17-266-4 Melanom Mänsklig 46
HS852 (på andra) Melanom Mänsklig 41
HS695 (på andra) Melanom Mänsklig 41
A2058 Melanom Mänsklig 37
A375 (på 5000) Melanom Mänsklig 37
RPMI-7951 Melanom Mänsklig 35
SKMEL2 (på 1999) Melanom Mänsklig 29
A101D (på 101D) Melanom Mänsklig 28
MiaPaCa (miapaca) Bukspottskörteln Mänsklig 7

Tabell 2: Vätskesjuvspänningsresistens hos olika cancercellslinjer. Varje cancercellslinje utsattes för vätskesjuvspänning från sprutan och nålmodellen (30 G nål, 10 pulses@250 ml/s) (n ≥ 3/cellinje), och livskraften mättes antingen genom luciferasaktivitet eller omkonvertering av återgerzurin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument visar tillämpningen av FSS på cancerceller i suspension med hjälp av en spruta och nål. Med hjälp av denna modell har cancerceller visat sig vara mer resistenta mot korta pulser av högnivå FSS i förhållande till icke-omvandlade epitelceller15,22,24. Dessutom resulterar exponering för FSS med denna modell i en snabb ökning av cellstelhet, aktivering av RhoA och ökad när F-aktin och myosin II-baserad kontraktilitet24,27. Snabb mekano-anpassning (CTC: s förmåga att bli mer eller mindre styv beroende på omständigheterna) kan förhindra mekanisk destruktion av CTC och underlätta andra aspekter av metastaserad kolonisering24,28. Faktum är att fynd som gjorts med hjälp av denna in vitro-modell har bekräftats med hjälp av experimentella CTC i djurmodeller24. Denna snabba mekano-anpassning förklarar sannolikt den bifasiska förlusten av cellens livskraft som vanligtvis observeras i denna modell (figur 1), dvs. FSS-naiva celler är mer mottagliga för förstörelse än celler som har utsatts för en enda puls av FSS. Sammantaget indikerar detta att FSS inducerar snabb cellstyvhet i cancerceller som skyddar dem från efterföljande pulser av FSS.

Även om RhoA-aktomyosinaxeln är en viktig drivkraft för FSS-motstånd15,21,24, finns det sannolikt andra mekanismer involverade29. Ytterligare bevis för att cellstelhet är en viktig determinant för FSS-resistens är att störningar av lamin A, som styr den strukturella integriteten hos kärnan - den styvaste komponenten i cellen, minskar FSS-resistensen i cancerceller med denna modell22. Vi använder denna modell för att undersöka mekanismerna för FSS-resistens i cancerceller ytterligare. Här har denna modell använts för att mäta kapaciteten hos olika cancercelllinjer för att motstå mekanisk förstörelse genom att utsätta celler för korta pulser av höga nivåer av FSS. Även om detta är en relativt billig, enkel modell att utveckla i laboratoriet, med det dyraste elementet är sprutpumpen, måste man vara noga med att följa protokollet troget för att få reproducerbara resultat. Flera pulser av FSS kan appliceras på celler på mycket kort tid, <10min. Den totala förflutna tiden för experimentet beror på suspensionsvolymen, flödeshastigheten, pulsnumret och fingerfärdigheten hos användaren som överför suspensionen mellan pulserna. Med erfarenhet kan en 5 ml suspension som utsätts för FSS med en 30 G nål i 10 pulses@250 μL/s bearbetas på ~ 10 min. För de flesta cellinjer finns det minimal förlust av livskraft på grund av att hållas i suspension under denna tid.

Eftersom exponeringen för FSS sker relativt snabbt tillämpas FSS vanligtvis på cellupphängningar i serumfritt medium för att minska skumbildningen av proverna. Skillnaden i viskositet mellan 0-10% fetala nötkreatur serum är försumbar i denna analys. Det är dock viktigt att säkerställa fysiologiska nivåer av kalcium i det medium där cellerna är uppsvjuta. När det gäller metoderna för celldifferens före FSS- exponering upptäcktes dessutom ingen skillnad i FSS-resistens i PC-3-cellsupphängningar som framställdes genom trypsinisering eller behandling med icke-enzymatiska dissociationsmedel15. Cellkoncentrationen kan vara större eller mindre än 5 × 105 celler/ml beroende på applikationsbehov nedströms. Svaret från PC-3 prostatacancerceller är liknande i ett intervall från 5 × 104 till 5 × 105,15. Cellkoncentrationens effekter på livskraften efter FSS-exponering bör dock bestämmas empiriskt.

För de flesta applikationer som föreställs med odlade celler bör celltätheten inte signifikant påverka viskositeten och därför bör mängden FSS tillämpas. Variabler, t.ex. Som nämnts ovan är nålintegritet också avgörande. Partivariationer har noterats i nålar med avseende på denna analys över tid. Hypodermiska nålar utformades för klinisk användning, inte för de flödeshastigheter som används här. I sällsynta fall kan nålens nav delvis ockluuderas, vilket under efterföljande pulser occludes passagen av suspension genom nålen och slutligen återflöde runt sprutkolven. Vidare är det mycket viktigt att förstå att döda / döende celler är exceptionellt känsliga för FSS, som tidigarevisats 24. Därför, om en viss cellinje har en hög nivå av döende celler, antingen som en rutinmässig egenskap eller experimentella manipuleringar (t.ex. läkemedelsbehandlingar), kommer detta att resultera i en mycket brant förlust av cellens livskraft som kanske inte är helt normaliserad i jämförelse med den statiska kontrollen.

Tillämpningen av FSS kan paras ihop med andra analyser, såsom immunofluorescens, pulldown-analyser och western blotting, för att studera effekten av FSS på cancercellsbiologi 24. I princip kan denna modell också användas för att utforska effekterna av hög nivå, kortvarig FSS på andra celltyper inklusive blodkroppar. Normala röda blodkroppar och leukocyter är mycket mer resistenta mot FSS tillämpas på detta sätt än till och med cancerceller, vilket står att resonerafysiologiskt 15. Faktum är att nivån på FSS appliceras, med hjälp av en 30 G 1/2" nål med en flödeshastighet på 250 ml/ s, fäster det intervall som krävs för störning av det röda cellmembranet (baserat på millisekskond användning av kraft)30,31. En begränsning av denna modell, eller någon som innebär att överföra vätska genom en ledning, är att den exakta nivån av FSS som celler upplever inom intervallet från maximal väggsjuvspänning och minimum i mitten av röret inte är känd. Vid varje puls upplever alltså inte alla celler samma nivå av FSS, och över upprepade pulser förväntas enskilda celler uppleva olika nivåer av FSS vid varje puls inom det angivna intervallet.

Hydrodynamisk fokusering under de förhållanden som används i denna modell resulterar dock i att celler riktas mot mitten av flödet, bort från väggen och därmed mot lägre FSS-exponering32. Andra modeller, såsom kon- och plåtvisirometrar eller Couette-kammare, är bättre lämpade för applicering av FSS vid konstanta nivåer på en cellupphängning. Som nämnts ovan är det fortfarande utmanande att modellera FSS-exponering av CTC in vitro. Denna modell är bäst lämpad för att testa effekterna av hög, men kort, exponering för FSS som kan hända genom hjärtat. Flöde genom artärer och vener resulterar i längre exponering för lägre nivåer av FSS. Som nämnts är det dock oklart hur länge CTC:er förblir i kontinuerligt flöde i cirkulationen, och de flesta experimentella bevis hittills överensstämmer med korta perioder (sekunder) av fritt flöde som punkteras av längre perioder av insprängning i mikrocirkulationen.

Modeller som exponerar cancerceller i suspension för lägre nivåer av FSS (0,5-60 dyn/ cm2) under längre varaktigheter (minuter till dagar) inkluderar kon- och plattviscometer, Couette-kammare, kontinuerliga flödesöglor, spruta med en rörförlängning och mikrofluidiskaenheter 33,34,35,36,37. Dessa har också använts för att få insikter om hur FSS kan påverka CTC och har lett till att exponering för FSS ökar oxidativ stress, cellproliferation och invasion och stamcellsliknande egenskaper i olika cancercellslinjer. Det ska bli intressant att jämföra resultat som härleds från dessa modeller med den som beskrivs här. Xin et al. fann till exempel att ROCK-aktomyosinaxeln främjade en förlust av cell livskraft i cancercelllinjer som exponerades för FSS (20 dyn/cm2) i 2-12h i skarp kontrast till de data som beskrivsovan 38. Således är biologiskt sammanhang mycket sannolikt att spela roll för alla dessa in vitro-modeller, vilket förstärker behovet av att översätta resultaten om CTC till in vivo-modeller och i slutändan cancerpatienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MDH är medgrundare, VD och aktieägare i SynderBio, Inc. DLM är konsult för SynderBio, Inc.

Acknowledgments

Utvecklingen av den modell som demonstrerades här stöddes av DOD-bidraget W81XWH-12-1-0163, NIH-bidrag R21 CA179981 och R21 CA196202 och Sato Metastasis Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Gibco 25200-056
14 mL round bottom tubes Falcon - Corning 352059
30 G 1/2" Needle BD 305106
5 mL syringe BD 309646
96-well black bottom plate Costar - Corning 3915
Bioluminescence detector AMI AMI HTX
BSA, Fraction V Sigma 10735086001
Cell Titer Blue Promega G8081
crystal violet Sigma C0775
D-luciferin GoldBio D-LUCK
DMEM Gibco 11965-092
FBS Atlanta Biologicals S11150
PBS Gibco 10010023
Plate Reader BioTek Synergy HT
Sodium Azide (NaN3) Sigma S2002
Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
  4. Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
  5. Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
  6. Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
  7. Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).
  8. Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
  9. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  10. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
  11. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  12. Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
  13. Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
  16. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  17. Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
  18. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
  19. Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).
  20. Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
  21. Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
  22. Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
  23. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
  24. Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
  25. Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
  26. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).
  27. Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
  28. Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
  29. O'Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
  30. Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
  31. Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
  32. Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
  33. Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
  34. Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
  35. Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
  36. Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
  37. Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
  38. Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).

Tags

Cancerforskning nummer 170
Modellering av effekterna av hemodynamisk stress på cirkulerande tumörceller med en spruta och nål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moose, D. L., Williams-Perez, S.,… More

Moose, D. L., Williams-Perez, S., Cafun, R., Krog, B. L., Henry, M. D. Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle. J. Vis. Exp. (170), e62478, doi:10.3791/62478 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter