Summary
نحن نظهر طريقة لعزل الأعضاء الذين يصعب نموهم في رواية الفيلوم البكتيري ، Saccharibacteria ، من خلال تصفية لوحة الأسنان والزرع المشترك مع البكتيريا المضيفة.
Abstract
لا يمكن استزراع العديد من الأنواع البكتيرية في المختبر باستخدام أساليب قياسية ، مما يشكل حاجزا كبيرا أمام دراسة غالبية التنوع الميكروبي على الأرض. وهناك حاجة إلى نهج جديدة لزراعة هذه البكتيريا غير المستزرعة حتى يتمكن المحققون من دراسة فسيولوجيا ونمط حياتهم بشكل فعال باستخدام الأدوات القوية المتاحة في المختبر. تعد إشعاعات فيلة المرشحة (CPR) واحدة من أكبر مجموعات البكتيريا غير المزروعة ، والتي تشكل ~ 15٪ من التنوع الحي على الأرض. وكان أول عزل لهذه المجموعة عضوا في فيلوم Saccharibacteria،'Nanosynbacter lyticus'سلالة TM7x. TM7x هي بكتيريا صغيرة بشكل غير عادي التي تعيش كمدميون في اتصال مباشر مع مضيف بكتيري، شاليا odontolytica، سلالة XH001. الاستفادة من حجم الخلية الصغيرة بشكل غير عادي وأسلوب حياتها ككائن حي تكافلي، وضعنا بروتوكولا لثقافة بسرعة Saccharibacteria من لوحة الأسنان. هذا البروتوكول سوف تظهر كيفية تصفية تعليق لوحة الأسنان من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر، ثم تركيز خلايا Saccharibacteria التي تم جمعها وتصيب ثقافة الكائنات الحية المضيفة. ويمكن تمرير الزراعة المشتركة الناتجة عن ذلك كما يتم تأكيد أي ثقافة البكتيرية العادية والعدوى عن طريق PCR. ويمكن الحفاظ على الثقافة الثنائية الناتجة في المختبر واستخدامها للتجارب المستقبلية. في حين أن التلوث هو احتمال, يمكن تنقية الثقافة الثنائية إما عن طريق تصفية مزيد من وإعادة العدوى من المضيف, أو عن طريق طلاء الثقافة الثنائية وفحص المستعمرات المصابة. ونأمل أن يتم توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أنواع العينات والبيئات الأخرى، مما يؤدي إلى زراعة العديد من الأنواع الأخرى في الإنعاش القلبي الرئوي.
Introduction
زراعة أنواع جديدة من البكتيريا وجلبها إلى المختبر يسمح لتجارب قوية لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء والتفاعلات الأوسع داخل مجتمعهم الميكروبي. وفي حين أن هناك أساليب خالية من الثقافة لاستجواب هذه الأسئلة (مثل "الاقتصاد التلوي")، فإن التفاعلات المعقدة بين مجموعات الميكروبات المتنوعة تجعل من الصعب تفريق المتغيرات الفردية والتوصل إلى استنتاجات ذات مغزى. في حين أن زراعة البكتيريا لها فوائد عديدة ، هناك العديد من الحواجز المحتملة لعزل البكتيريا وزراعة في الثقافة النقية. وتشمل متطلبات النمو المحددة المحتملة الحموضة، والتوتر الأكسجين، والفيتامينات، وعوامل النمو، والجزيئات الإشارات أو حتى الاتصال المباشر الخلية للحصول على النمو1. ومع ذلك ، يعتقد أن auxotrophies محددة هي الرادع الرئيسي لزراعة أنواع جديدة من البكتيريا. تفتقر تركيبات الوسائط القياسية إلى العديد من العناصر الغذائية التي تتطلبها البكتيريا غير المزروعة، مثل الفيتامينات أو مصادر الكربون المحددة. هذه الجزيئات المفقودة يمكن أن تكون المفتاح لعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا غير المستزرعة وعادة ما يتم توفيرها من قبل كائن آخر في المجتمع الميكروبي أو كائن حي مضيف. على سبيل المثال، يمكن توفير الكربوهيدرات المعقدة مثل الموسين من قبل مضيفي الحيوانات. إضافة هذه إلى وسائل الإعلام سمحت زراعة العديد من البكتيريا من أحشاء الحيوانات، بما في ذلك أكرمانسيا muciniphila وMucinivorans hirudinis2،3،4. وقد تطورت العديد من البكتيريا المسببة للأمراض القدرة على استخدام الحديد ملزمة الهيمين في الخلايا الحيوانية، بما في ذلك الممرض الفموي بورفيرموناس gingivalis5. في المختبر ، يمكن تحفيز نمو البورفيرومونات والكائنات الحية الأخرى ، عن طريق إضافة الهيمين6.
في الآونة الأخيرة ، العديد من الاختراقات في زراعة عزلات جديدة من البكتيريا قد حان من خلال زراعة مشتركة ، وذلك باستخدام كائن حي "المغذية" لتوفير عوامل محددة للبكتيريا غير المستثناة اللازمة لنموها. أظهرت دراسة أنيقة أجراها فارتوكيان وزملاؤه أن الرانفور الجانبي، جزيئات ربط الحديد التي تنتجها البكتيريا، حفز نمو العديد من العزلات الفموية الجديدة. Pyoverdines، وهو نوع من siderophore التي تنتجها الأنواعالزائفة، وتبين أن تسهل بشكل كبير نمو نوع بريفوتيلا رواية7. في نفس الدراسة، تمت زراعة أول عزل عن طريق الفم لكلوروفليكسي فيلوم، وأيضا باستخدام نواة F. كمساعد لتوفير بعض المجمع غير معروف حتى الآن7. في الآونة الأخيرة ، تم عزل بكتيريا من جنس Ruminococcaceae باستخدام البكتيريا fragilis ككائن مساعد8. وتبين في وقت لاحق أن حمض غاما أمينوبوتيريك (GABA), ناقل عصبي مثبط, كان مطلوبا للنمو على وسائل الإعلام المختبرية. وقد ثبت أن استخدام الكائنات المغذية استراتيجية رئيسية لمحاكاة بيئة دقيقة محددة تنمو فيها البكتيريا غير المستزرعة، كونها أكثر كفاءة من إعادة صياغة وسائط النمو باستمرار مع إضافات مختلفة بتركيزات متفاوتة.
واحدة من أكبر مجموعات البكتيريا غير المستثناة هي في "مرشح فيلة الإشعاع" (CPR)، وهي مجموعة أحادية من عدة مرشح البكتيريا فيلا9،10. حتى كتابة هذه السطور، تم بنجاح استزراع أعضاء فيلوم Saccharibacteria داخل الإنعاش القلبي الرئوي بنجاح في المختبر. عزل الأول،'Nanosynbacter lyticus' سلالة TM7x، تم عزل باستخدام streptomycin المضادات الحيوية، والتي كان من المتوقع أن تثري ل TM7 غير مثقف11،12. وكان الاكتشاف الرئيسي لهذا العمل هو أن العزل الجديد نما كطفيلي ينمو في اتصال مباشر مع مضيف بكتيري ، Schaalia odontolytica، وأظهر المجهر أن هذه الطفيليات كانت بكتيريا فائقة النحافة.
باستخدام هذه القرائن، ابتكرنا طريقة لإنشاء بسرعة الثقافات الثنائية المشتركة من Saccharibacteria مع شركائها عن طريق تصفية لوحة الأسنان والعينات الفموية الأخرى من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر، وجمع الخلايا في الخيوط عن طريق الطرد المركزي واستخدامها لإصابة ثقافات البكتيريا المضيفة المرشحة. ولهذه الطريقة ميزة تجنب ثقافات الإثراء، التي يمكن أن تطغى عليها الكائنات الحية سريعة النمو. كما أنه يتجنب استخدام المضادات الحيوية، التي يمكن أن توقف نمو أنواع الساكاريكتيريا المستهدفة أو مضيفيهم. باستخدام الطريقة التي أظهرت هنا، قمنا بنجاح زراعة 32 عزلة من فيلوم Saccharibacteria.
Protocol
وعند وضع هذا البروتوكول، طلب الحصول على موافقة مجلس الهجرة والريبة وتمت الموافقة عليه (#14-10) وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المواضيع.
1. إعداد
- عند العمل مع الأشخاص، احصل على الموافقة اللازمة من مجلس الهجرة والريبة والموافقة المستنيرة.
- بدء ثقافات البكتيريا المضيفة مع ما يكفي من الوقت للنمو إلى مرحلة ثابتة في وقت مبكر. على سبيل المثال، تلقيح 2-5 مل من مرق الصويا المحاولة مع 0.1٪ استخراج الخميرة المضافة (TSBY) مع Arachnia بروبيونيكا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- تجميع أصحاب مرشح مع المسار المحفور 0.2 ميكرومتر غشاء التصفية. التفاف الجمعية في احباط وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي.
- تعقيم أنابيب الطرد المركزي وتجمعات الغطاء.
2. الحصول على عينة من البكتيريا الفموية
ملاحظة: في حين أن العديد من العينات عن طريق الفم تحتوي على Saccharibacteria (على سبيل المثال، اللعاب، مسحات من اللوزتين، كشط اللسان) لوحة الأسنان بشكل روتيني هو الأكثر نجاحا.
- خذ كشط البلاك باستخدام نقطة ورق معقمة ، غريسي كوريت ، أو ، إذا أخذ العينات الذاتية ، استخدم مسواك معقمة أو طرف ماصة. نقل البلاك إلى عازل مناسب، مثل مخفف الاسترداد الأقصى (MRD، 0.85٪ NaCl، 0.1٪ بيبتون) أو PBS. إذا لم تتم معالجتها على الفور، احتفظ بالعينة على الجليد حتى تصبح جاهزة للمضي قدما.
- إعادة إنفاق بقوة لوحة الأسنان في المخزن المؤقت MRD باستخدام مزيج من الدوامة والأنابيب مع طرف أنبوب صغير.
- إضافة عينة لوحة resuspended إلى 9 مل إضافية من المخزن المؤقت MRD.
3. إعداد filtrate من عينة عن طريق الفم
- باستخدام تقنية مطهرة، فك تجميع فلتر معقم. Untwist بدوره ربع و retighten حامل مرشح للتأكد من الخيوط وتشارك بشكل صحيح ويتم إغلاق الجهاز بشكل صحيح. باستخدام حقنة، وغسل الغشاء عن طريق تمرير 10 مل من العازلة MRD من خلال الجهاز. يتم الكشف عن التجميع غير السليم في هذه الخطوة عن طريق تسرب السوائل من حامل الفلتر. في حالة حدوث تسرب، احصل على مجموعة فلتر معقمة أخرى وكرر خطوة الغسيل.
- تطبيق العينة على عامل التصفية المغسول. إزالة المكبس من حقنة وإرفاقه بجهاز التصفية. صب عينة الأسنان مشتتة، والآن في 10 مل من العازلة MRD، في حقنة وتحميله على مرشح.
- ضع أنبوب طرد مركزي معقم تحت جهاز التصفية للقبض على الفيلترات، ثم قم بتطبيق ضغط الضوء على المكبس لدفع العينة من خلال الفلتر.
- كرر الإجراء مع آخر 10 مل من العازلة MRD لغسل الغشاء، وجمع تدفق من خلال في نفس أنبوب العينة المصفاة. غطاء أنبوب مطهر.
4. تركيز خلايا Saccharibacteria عن طريق الطرد المركزي
- وضع علامة اتجاه على الأنبوب والغطاء ووضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي عالي السرعة مع العلامة على الجانب العلوي. الكريات التي تشكلت من الطرد المركزي عادة ما تكون غير مرئية. ستساعد العلامات في تحديد مكان وجود بيليه خلايا Saccharibacteria عند إجراء الطرد المركزي وإزالة الأنبوب من جهاز الطرد المركزي.
- طرد العينات في 60،000 س ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه القوة والوقت كافية بيليه جميع خلايا Saccharibacteria. ومع ذلك، يمكن أن تكون خلايا Saccharibacteria على الأقل جزئيا بيليه عن طريق الطرد المركزي لأقل من 20 دقيقة في 20،000 × ز. - قم بإزالة الأنابيب بعناية من أجهزة الطرد المركزي. صب السائل من الأنبوب، والحفاظ على بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب.
- Resuspend بيليه غير مرئية عادة في 1-2 مل من العازلة MRD عن طريق دوامة قوية.
5. تصيب الثقافات المضيفة مع الفيلترات المخصب Saccharibacteria
- إعداد أنابيب الثقافة عن طريق aliquoting 2 مل من وسائل الإعلام المناسبة النمو (على سبيل المثال، TSBY، BHI، الخ) في أنابيب.
- إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها من الكائنات المضيفة لكل أنبوب. إضافة 100-200 ميكرولتر من عينة resuspended، تصفية إلى كل أنبوب.
- احتضان العينات المجمعة حسب الاقتضاء للكائن المضيف (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية، في جو هوائي ل A. propionica).
- مرور الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق نقل 200 ميكرولتر من الثقافة الثنائية إلى 2 مل من متوسط النمو الطازج في أنبوب جديد. إذا كان يبدو أن الثقافات الممرة لا تظهر أي نمو (أي أن العكر / الكثافة البصرية للثقافة لا تزيد بعد المرور إلى وسائل الإعلام الطازجة) يمكن أن تكون Saccharibacteria ساحقة أو تقتل جميع الكائن المضيف. لمعالجة هذا، إضافة 200 ميكرولتر من الثقافة المضيفة غير المصابة عند تمرير الخلايا. كرر لمدة 5 مقاطع على الأقل.
6. تأكيد العدوى عن طريق PCR
- بعد 5 مقاطع، تأكد من العدوى مع PCR. خمسة مقاطع ستضمن من أي خلايا Saccharibacteria غير المتنامية قد استنفدت خارج حدود الكشف باستخدام 25 دورة من PCR.
- إعداد mastermix PCR. وصفة المقترحة باستخدام هو على النحو التالي، لكل أنبوب اللازمة، وإعداد 12.5 ميكرولتر 2x PCR العازلة، 0.75 ميكرولتر 10 ميكرومتر التمهيدي الأمامي (580F12 - AYT GGG CGT GAG TTG C)، 0.75 ميكرولتر 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT TCC)، 1 ميكرولتر 25 مللي متر ملغل2 و 9 ميكرولتر ماء. تخلط عن طريق الدوامة.
- Aliquot 24 μL من mastermix في أنبوب PCR 0.2 مل. إضافة 1 ميكرولتر من الثقافة المصابة Saccharibacteria إلى تفاعل PCR. ضع الأنبوب في دراجة حرارية واجري البروتوكول التالي: التشبع الأولي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و25 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية، و60 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية، و72 درجة مئوية لمدة 30 جنوبا، والإطالة النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم الانتظار النهائي عند 4 درجات مئوية.
- تحميل وتشغيل منتجات PCR في هلام agarose 1٪. وهناك فرقة من ~ 600 قواعد تشير إلى وجود Saccharibacteria.
7. التحقق من النقاء وإزالة الكائنات الملوثة
- تأكيد نقاء الثقافات الإيجابية عن طريق طلاء الزراعة المشتركة للساكاريكتريا على أجار المغذيات كافية لنمو الكائن الحي المضيف. تنفيذ تخفيف المسلسل 10 أضعاف من الثقافة في العازلة العقيمة (على سبيل المثال، MRD أو PBS) ونشر 100 ميكرولتر على لوحة أجار. تنفيذ التخفيفات بحيث سيكون هناك ما يقرب من 20-200 المستعمرات المتنامية على لوحة أجار.
- احتضان الثقافة في ظروف النمو المناسبة ومراقبة الكائنات الحية الملوثة.
ملاحظة: لم تلاحظ مستعمرات Axenic Saccharibacteria أبدا ، لذلك لوحظ نمو الكائن الحي المضيف فقط على هذه الصفائح. أكثر من نوع مستعمرة واحدة عادة ما يشير إلى التلوث. وفي حالة حدوث تلوث، ينبغي إعادة تصفية الثقافة لإزالة الملوثات غير المرغوب فيها وإعادة تلقيحها على مضيف جديد. - في بعض الأحيان تحدث عدوى مزدوجة ، حيث يصيب نوعان من Saccharibacteria نفس المضيف. لفصل أنواع Saccharibacteria، resuspend المستعمرات الفردية في 20 ميكرولتر برنامج تلفزيوني معقم واستخدام 1 ميكرولتر من التعليق في رد فعل PCR للكشف عن المستعمرات مع عدوى Saccharibacteria.
- نقل تعليق التي أعطت نتيجة إيجابية لنمو المتوسطة لبدء ثقافة ثنائية. سيعتمد معدل النجاح على تأليه كل نوع من أنواع Saccharibacteria في الثقافة. قد يكون من الضروري فحص أكثر من 50 مستعمرة للعثور على مستعمرة مصابة للانتشار.
8. تخزين الثقافات
- تنمو ثقافة ثنائية من حجم كاف (10-50 مل) بين عشية وضحاها.
- خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي (4000 × غرام لمدة 10 دقائق).
ملاحظة: الطرد المركزي عالي السرعة ليس ضروريا هنا حيث سيتم إرفاق خلايا Saccharibacteria بالخلايا الأكبر والأثقل للمضيف وستطلق معها. - إعادة الخلايا في بروتين التبريد. وسائل الإعلام النمو تستكمل إما مع DMSO 5٪ أو 20٪ الجلسرين عادة ما تكون كافية. تأكد من أن الكائن المضيف متوافق مع الوسائط cryoprotectant (على سبيل المثال، يتم منع نمو A. propionica بواسطة الجلسرين والمخزونات المجمدة قد لا تنتعش). اختبر صلاحية ثقافة مضيفة غير مصابة مع بروتين التبريد لضمان بقاء المخزونات على قيد الحياة.
- بيليه خلية ريسوسبند في نفس حجم الثقافة (10-50 مل). Aliquot 0.5 مل في cryovials المسمى. تجميد ثقافات الخلايا عند -80 درجة مئوية.
Representative Results
قد يظهر PCR للكشف عن Saccharibacteria سلبيا (أي لا يوجد منتج شوهد) في ثقافات العدوى الأولية بسبب انخفاض عدد Saccharibacteria symbionts. ومع ذلك، بعد بضعة مقاطع يجب أن يظهر منتج PCR قوي يظهر أن عدوى مستقرة قد حدثت(الشكل 1A). وعلى العكس من ذلك، فإن بعض الإصابات تظهر في البداية إيجابية عن طريق PCR، ولكن تتضاءل إلى غير قابل للكشف بعد 1-4 مقاطع (غير مبين). وهذا يشير إلى أن كمية كبيرة من خلايا Saccharibacteria كانت موجودة في الفيلترات الأولية ولكن تم تخفيفها عن طريق المرور ولم يتمكن أي منها من الدخول في تكافل مستقر مع الثقافة المضيفة. اختبار العديد من الأنواع المضيفة مع نفس filtrate Saccharibacteria من تجويف الفم وعادة ما يكون معدل نجاح منخفض(الشكل 1B)كما التفاعل بين symbiont المضيف محددة جدا. قد يختبر الباحث أيضا نفس المضيف مع خيوط من عدة مواضيع مختلفة. إذا تم استخدام كائن مضيف جيد (مثل Arachnia propionica أو Schaalia odontolytica)، يمكن توقع معدل نجاح 50٪.
الاختبار بواسطة PCR أمر بالغ الأهمية. وقد حاول الباحثون من ذوي الخبرة لتأكيد العدوى عن طريق المجهر، إلا أن الإبلاغ عن إيجابيات كاذبة. خلايا Saccharibacteria صغيرة ويصعب التمييز بين الحويصلات أو انتفاخات مغلف الخلية غير النظامية. إشارة PCR مستقرة من خلال عدة ممرات هو المفتاح لتأكيد عدوى ناجحة.
ومع نمو الثقافات المصابة، ينبغي أن يظهر النمو العكر الطبيعي. كما التكافل يؤسس نفسه، سوف تظهر الثقافات المصابة أقل عكر من ثقافات الكائنات المضيفة غير المصابة(الشكل 2A). وفي بعض الحالات، قد يبدو أن الثقافات المصابة تتوقف عن النمو تماما ولا تصبح عكرة على الإطلاق. قد يكون هذا بسبب عدوى حيث خلايا Saccharibacteria الساحقة الكائن المضيف. إضافة مضيف "جديد" (غير مصاب) لهذه الثقافات يجب أن يوفر عددا كافيا من المضيفين لدعم النمو المستمر لطفيليات Saccharibacteria.
فرط النمو، أو الثقافات العكرة بشكل مفرط، قد يشير إلى التلوث إما عن طريق ملوث مختبري أو بكتيريا فموية صغيرة أخرى كانت قادرة على المرور عبر فلتر 0.2 ميكرومتر. Campylobacter وCapnocytophaga spp. هي الملوثات الفموية النموذجية لهذه التجارب. ويمكن تأكيد ذلك من خلال طلاء الثقافة والبحث عن المستعمرات غير نمطية للكائن الحي المضيف تليها تسلسل 16S rRNA. إذا شوهد التلوث، فإن تصفية هذه الثقافات من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر عادة ما يكون كافيا لإزالة الملوثات. يمكن تركيز خلايا Saccharibacteria في الفيلترات عن طريق الطرد المركزي واستخدامها لإعادة إصابة ثقافة المضيف النقي.
طريقة أخرى لتنقية ثقافة ملوثة هي عن طريق التقاط المستعمرات المصابة من طلاء ثقافة مصابة. يمكن أحيانا تحديد مستعمرات المضيفين المصابين عن طريق شكل مستعمرة غير منتظم مقارنة بالمستعمرات غير المصابة (الشكل 2B- D). هذه المستعمرات غير النظامية تعتمد على titer من Saccharibacteria في الثقافة الثنائية ونسبة أصغر من المستعمرات سوف تظهر غير منتظمة إذا كان titer منخفضة. وهذا يمكن أن يجعل من السهل تحديد المستعمرات المصابة، والتي يمكن انتقاؤها واستخدامها لبدء ثقافة ثنائية نقية. إذا لم تشاهد مستعمرات غير منتظمة على الطلاء من ثقافة Saccharibacteria المصابة ، فمن الممكن أن يكون السيمبيونت في نقطة منخفضة أو لا يسبب مستعمرات على شكل غير منتظم. في مثل هذه الحالة، يمكن أن تظهر مستعمرات فحص PCR ذات المظهر الطبيعي العدوى عن طريق Saccharibacteria، ولكن بمعدل منخفض (2-10٪ من جميع المستعمرات).
الشكل 1: قد لا تظهرنتائج PCR النموذجية لالتهابات Saccharibacteria في الثقافات المضيفة. (أ) منتج PCR يشير إلى وجود Saccharibacteria مع العدوى الأولية ولكن يمكن أن تظهر وتصبح أقوى في المقاطع اللاحقة كما تثبت الثقافة المشتركة نفسها. (ب)معظم المضيفين المصابين بفيترات Saccharibacteria المخصب لن يدعم نموهم بسبب خصوصية التكافل. في هذا المثال، أصيب فقط A. بروبيونيكا بنجاح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خصائص النمو للثقافات المصابة Saccharibacteria. (أ) منحنيات النمو من الثقافات المصابة وغير المصابة من A. propionica تظهر الثقافة المصابة لن تنمو إلى نفس الكثافة كما السيطرة غير المصابة وتظهر أقل عكر. (B-D) يمكن أن ينتج طلاء الثقافات المشتركة مستعمرات غير منتظمة ، بسبب عدوى Saccharibateria. سوف تنخفض المستعمرات غير النظامية في نسبة نسبة إلى تيتر Saccharibacteria في الزراعة المشتركة. (ب) يستضيف مع مستوى عال من Saccharibacteria. (ج) 10 أضعاف المخفف Saccharibacteria (D) الثقافة المضيفة غير المصابة. تشير الأسهم البيضاء إلى أمثلة على المستعمرات غير المنتظمة. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
ويستند أسلوبنا في تصفية البلاك وتطبيقه على الثقافات النقية للكائنات المضيفة إلى حد كبير على الملاحظات السابقة على أول Saccharibacteria المستزرعة ،'Nanosynbacter lyticus' سلالة TM7x11،14،15. وبالنظر إلى صغر حجم الخلية، استنتجنا أنه يمكن فصلها عن لوحة الأسنان باستخدام فلتر وتركيزها مع الطرد المركزي. ثانيا، بما أن هذه الكائنات الحية تعيش كطفيليات، فإن توفير هذه الخلايا ثقافات نقية للمضيفين سيسمح لها بالدخول في تكافل والنمو كثقافات ثنائية.
وإحدى مزايا هذه الطريقة هي أنها لا تتطلب ثقافة تخصيب أو ضغطا انتقائيا. 'Nanosynbacter lyticus' سلالة TM7x كانت مثقفة من ثقافة الإثراء باستخدام streptomycin كعامل انتقائي، والتي التسلسل قد اقترح أن تكون فعالة في إثراء لSaccharibacteria. ومن قبيل الصدفة، المضيف ل'نانوسنباكتر lyticus' Schaalia odontolytica، ومن المعروف أن تكون مقاومة لstreptomycin16. كما أن استخدام المضادات الحيوية كعامل انتقائي يمكن أن يمنع الكائن المضيف من النمو، الأمر الذي بدوره سيحول دون نمو البكتيريا الساكاريباكتيرية.
ومن القضايا الأكبر المتعلقة باستخدام ثقافات الإثراء أن الكائنات الحية سريعة النمو ستشرد بسرعة الكائنات الحية ذات الأهمية. في تجويف الفم ، على سبيل المثال ، يمكن أن تنمو أنواع المكورات العقدية بسرعة ، وإذا كان السكر موجودا في وسط النمو ، فإنها تنتج ما يكفي من الحمض لتحمض الوسط ، مما يزيد من الاختيار ضد الكائنات الحية ذات الاهتمام. من خلال تجنب ثقافة التخصيب والمضادات الحيوية الانتقائية ، توفر طريقتنا نهجا عاما يمكن تطبيقه على مجموعة أوسع من Saccharibacteria والمضيفين المحتملين دون مضاعفات هذه الطرق الأخرى.
هناك بعض العقبات التي تعترض الطريقة المعروضة هنا. أولا، تفترض هذه الطريقة أن Saccharibacteria يعيش في ثقافة ثنائية. لم نختبر مجموعات من الثقافات الثلاثية أو الترنية لقياس فعاليتها ، ولكن هناك على الأرجح Saccharibacteria التي تتطلب عوامل نمو لا يمكن للكائن المضيف الوحيد توفيرها. اختبار مجموعات واسعة من البكتيريا عن طريق الفم التي يمكن أن تدعم نمو Saccharibacteria سيكون مهمة شاقة. ثانيا، تفترض الطريقة أن جميع البكتيريا الساكارية صغيرة بما يكفي لتمريرها من خلال فلتر 0.2 ميكرومتر. يمكن أن يكون أن Saccharibacteria أخرى أكبر مما يعتقد والمرشح هو اختيار ضد هذه الكائنات الحية. يمكن استخدام فلتر بحجم مسام أكبر ، ولكن هذا ينطوي على خطر السماح بمزيد من البكتيريا الفموية غير المرغوب فيها في الثقافة المشتركة المصابة. وأخيرا، من الصعب جدا العثور على الأنواع المضيفة خارج تلك التي تم نشرها بالفعل. حتى الآن ، فإن المضيفين الناجحين الوحيدين هم الأنواع من جنس Actinomyces ، Schaalia ، Arachnia وSsيلوزيميروبيوم، وجميع أعضاء أكتينوباكتيرياphylum 15،17،18. ومع ذلك ، فإن هؤلاء المضيفين يدعمون فقط نمو Saccharibacteria محددة. زراعة المزيد من أنواع Saccharibacteria، يجب استكشاف العديد من المضيفين.
نأمل أن تساعد الطريقة المعروضة هنا في الأبحاث المستقبلية ل Saccharibacteria وغيرها من الكائنات الحية في الإنعاش القلبي الرئوي. التسلسل الميتاجنومي يشير إلى أن هذه الكائنات الحية لديها أيضا الجينوم الصغيرة ويشتبه في أن تكون symbionts أو الاعتماد على المجتمع الميكروبي المحلي لتوريد الأيض وغيرها من العوامل الحاسمة لبقائها19. ويمكن استخدام استراتيجية تصفية مماثلة لعزل هذه الكائنات، شريطة أن تكون صغيرة بما فيه الكفاية وأن الكائنات (الكائنات) المضيفة لها يمكن استزراعها. الطرق الموصوفة هنا هي خطوة أولى لجلب الأدوات القوية للثقافة المختبرية إلى هذه المجموعة الكبيرة والمتنوعة من البكتيريا.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا آن تانر وبروس باستر وهيكي بويسفيرت وشيويسونغ هي وباتبيليغ بور على المناقشات المفيدة وعلى توفير السلالات البكتيرية. نشكر سوزان يوست وجيسيكا وودز على المساعدة التقنية الميكروبية. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والوجه القحفي للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز R37 DE016937 (FED) وR01 DE024468 (FED) و T32 DE007327 (AJC). المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
| Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
| Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
| MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
| Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
| O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
| Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
| P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
| P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
| P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
| P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
| P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
| PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
| PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Pipette tips - 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
| Pipette tips - 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
| Pipette tips - 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
| Pipette tips - 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
| Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
| Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Swin-Lok Filter - 47mm | Whatman | 4200400 | |
| SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Syringes - 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
| Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
| Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
| Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |
References
- Stewart, E. J.
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), 00012 (2011).
- Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, Pt 5 1469-1476 (2004).
- Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, Pt 3 990-995 (2015).
- Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis. PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).
- Martin, B., et al. New growth media for oral bacteria. Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).
- Vartoukian, S. R., et al. In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores. Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).
- Strandwitz, P., et al. GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota. Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).
- Hug, L. A., et al. A new view of the tree of life. Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).
- Castelle, C. J., Banfield, J. F. Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life. Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).
- He, X., et al. Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).
- Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives. Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).
- Brinig, M., Lepp, P. Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease. Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).
- Bor, B., et al. Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts. Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).
- Bor, B., et al. Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces. Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).
- Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. Dental plaque development on defined streptococcal surfaces. Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).
- Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts. Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).
- Cross, K. L., et al. Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).
- Kantor, R., et al. Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla. MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).
