Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En hurtig, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 neutralisering Assay for en multiplexed perle-baseret Flow Analysis System

Published: April 6, 2021 doi: 10.3791/62487
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

Et flowanalysesystem til perlebaserede multiplexed assays, som giver en to-reporter udlæsning blev brugt til udvikling af multiplex serologiske og antistofneutralisering assays, der samtidig kan måle neutraliserende IgG og IgM antistoffer for SARS-CoV-2.

Abstract

COVID-19-pandemien har understreget behovet for hurtige metoder med høj kapacitet til følsom og specifik serologisk påvisning af infektion med nye patogener, såsom SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testning kan være særlig nyttig, fordi den samtidig kan analysere antistoffer mod flere antigener, der optimerer patogendækningen og kontroller for variabilitet i organismen og den enkelte værtsrespons. Her beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende mikrosfære-baseret assay, der kan detektere både IgM og IgG antistoffer til tre store SARS-CoV-2 antigener-spike (S) protein, spike angiotensin-konvertering enzym-2 (ACE2) receptor-bindende domæne (RBD), og nucleocapsid (Nc). Analysen viste sig at have en sammenlignelig ydeevne med en SARS-CoV-2-referenceanalyse for IgG i serum, der blev fremstillet i ≥21 dage fra symptomdebut, men havde højere følsomhed med prøver indsamlet i ≤5 dage fra symptomdebut. Ved hjælp af opløseligt ACE2 i et neutraliseringsanalyseformat blev der påvist hæmning af antistofbinding for S og RBD.

Introduction

COVID-19-pandemien har understreget vigtigheden af hurtigt at kunne udvikle og implementere hurtige, højtydende serologiske tests, der kan bruges til diagnosticering og overvågning af nye patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologiske test kan være yderst nyttig i en pandemi, da den samtidig kan analysere antistoffer mod flere antigener, hvilket giver mulighed for bred patogendækning og kontrol for variabilitet i organismen og værtsresponsen på infektion. Udviklingen af en multiplex fluorescerende perle-baseret assay, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), der kan opdage antistoffer mod spike (S) protein, spike angiotensin-konvertering enzym-2 (ACE2) receptor-bindende domæne (RBD), og nucleocapsid (Nc) af SARS-CoV-2 blev for nylig rapporteret1. 3Flex viste sig at have en reference-SARS-CoV-2 IgG-analyse for serum, der var fremstillet i ≥21 dage fra symptomdebut, men havde større følsomhed med prøver indsamlet i ≤5 dage fra symptomdebut. Derudover blev hæmning af antistofbinding påvist for S- og RBD-antigener ved hjælp af opløselige ACE2 i et neutraliseringsanalyseformat. Multiplex perle-baseret teknologi er blevet bredt vedtaget som en gennemprøvet teknologi til multiplex serologisk test og har klare fordele for storstilet screening, herunder korte tid-til-resultater, små prøve krav, og reduceret arbejdskraft2,3,4.

For nylig er et nyt flowanalyseinstrument blevet tilgængeligt, der giver systemets samme højplex, high-throughput-kapacitet, der blev demonstreret i tidligere arbejde1, men med den ekstra fordel af to reporterkanaler. Evnen til at måle to fluorescerende reportersignaler i en enkelt reaktion gør det muligt at vurdere to resultater pr. analysand for hver prøve og er ideel til isotypingapplikationer, som typisk skal udføres i separate reaktions brønde5. Den dobbelte reporter kapacitet giver dobbelt så mange data for hver prøve i halvt så mange reaktion brønde med halvdelen af prøven volumen krav, og dermed har en klar fordel i forhold til enkelt reporter systemer. Denne undersøgelse beskriver standard serologisk assay protokol og beskriver tilpasningen til en neutralisering assay. Derudover beskriver denne rapport konverteringen af enkelt reporter assay til en dobbelt reporter serologisk analyse, og efterfølgende, en dobbelt reporter neutralisering assay, til samtidig at måle neutraliserende antistoffer af både IgG og IgM isotyper mod SARS-CoV-2 S, RBD, og Nc antigener. Der findes en visuel oversigt over analyseprotokollen i figur 1.

Protocol

Der blev anvendt restundersøgelser af humane serumprøver, der tidligere var testet til SARS-CoV-2-diagnostiske analyser, i denne undersøgelse, som blev godkendt af University of Rochester Institutional Review Board.

1. Reagenser og udstyr

  1. Få coronavirusantigener og humane IgG og IgM fra kommercielle kilder.
  2. Få assay control (AC) perle sæt (45 og 220) fra instrumentleverandøren. AC perle sæt 45 skærme Median Fluorescens Intensitet (MFI) indsamling på enkelt reporter kanal (RP1) instrumenter. AC perle sæt 220 overvåger MFI indsamling på den anden reporter kanal (RP2).
  3. Opnå påvisning antistoffer og antigen-specifikke kanin sera og antistoffer, der anvendes til kobling bekræftelse.
  4. Udfør påvisning med biotin-mærkede antistoffer med enten en streptavidin, R-phycoerythrin konjugat (SAPE) eller en streptavidin konjugat af fluorophor Super Bright 436 (SASB; excitation ved 405 nanometer (nm) og emission ved 436 nm).
  5. Human ACE2 protein (dvs. SARS Receptor). Før brug skal der rehydreres lyophiliseret ACE2-protein ved at opløses til en 1 mg/ml koncentration i nukleasefrit vand (ikke DEPC-behandlet, autoklavet og 0,2-μm sterilt filtreret) og opbevares ved 4 °C.
  6. Udfør alle reaktioner i 96-brønd nonbinding overflade (NBS) sorte fladbundede plader. Forsegl pladerne med 96 godt mikroplade aluminium tætningstape til assay inkubation trin. Brug en magnetisk pladeseparator til analysevasketrinene.

2. Antigen-koblet og antistof-koblet kontrol perler forberedelse

  1. Kovalent par magnetiske, polystyren, og farvekodede mikrosfære sæt (6,5-μm diameter) med S, RBD, og Nc antigener som beskrevet i Cameron et al.1. Coronavirus antigener er koblet på 10 pmol/106 perler (S) og 100 pmol/106 perler (RBD og Nc). Kontrolperler kombineret med human IgG eller IgM genereres som tidligere beskrevet1. IgG og IgM er koblet ved 5 μg/106 perler.
  2. Efter koblingen bestemmes perlekoncentrationerne og fortyndes hver bestand til 1 x 106 perler/mL ved hjælp af beskrevne procedurer6.
  3. Udfør bekræftelse af antigenkobling med antigenspecifikke antistoffer fra kanin eller med positiv human sera som beskrevet i Cameron et al.1.
    1. Bekræft human IgG kobling med analysens biotinylerede anti-humane IgG/ SAPE detektion reagenser, og IgM kobling med en phycoerythrin (PE)-mærket ged anti-human IgM.
      BEMÆRK: Koblingsbekræftelsen udføres ved hjælp af en titrering af proteinspecifikt serum eller antistof, fordi den optimale koncentration, der skal anvendes til disse reagenser, ikke er kendt. Til serum anvendes seriel foldfortyndinger, mens der for antistoffer, der leveres som mg/mL-lagre, anvendes seriel μg/mL fortyndingsserier.
  4. Fortyndet assay control (AC) perler, der overvåger MFI indsamling i de to reporter kanaler til en koncentration på 1 x 106 perler / mL før brug i multiplex perle blander.

3. Frisk multiplex perle mix forberedelse

  1. Forbered multiplex perler blander frisk hver dag fra den enkelte koblet perle og kontrol perle lagre på 1 x 106 perler / mL.
    BEMÆRK: Multiplex perleblandinger er forberedt til at levere 2.500 perler for hver perleregion i et 50 μL volumen. Beregninger for, hvordan man forbereder multiplex perleblandinger til et vilkårligt antal reaktioner, er beskrevet i bloggen udgivet af Angeloni (2020)6.

4. Prøvefortynding

  1. Der fremstilles en fortynding af en 1:100 serumprøve ved at blande 10 μL serum i 990 μL fosfatbufferet saltvand (PBS), der indeholder 0,05 % mellem 20, 0,02 % natriumhyrd og 1 % af kvægserumalbumin (BSA) (PBS-TBN-buffer).
  2. Fortynd prøver igen 10 gange ved at tilsætte 20 μL af fortyndingen på 1:100 til 180 μL PBS-TBN.
    BEMÆRK: Serumprøver består af negativ sera, fra prøver indsamlet i 2019 før COVID-19-pandemien, og positiv sera fra SARS-CoV-2 PCR-positive patienter, der repræsenterer lav og høj antistof titers. Der blev indsamlet positive prøver mellem ≈3 til >60 dage fra symptomdebut (DFSO). Alle serumprøver og IgG-strippet negativ kontrol sera fortyndes til 1:1000 som beskrevet nedenfor. Til neutraliseringsanalyser fortyndes sera 1:500 som beskrevet i neutraliseringsprotokollerne nedenfor (afsnit 6 og 8).

5. Enkelt reporter serologisk assay protokol

  1. Tilsæt 50 μL multiplex perle mix til hver tildelt brønd af en 96-godt ikke-bindende mikrotiter plade.
  2. Pipette 50 μL på 1:1000 serum eller PBS-TBN i de relevante brønde den endelige fortynding af serum i brønden er 1:2000.
  3. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  4. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
  5. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
  6. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  7. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (første inkubationsvask efter prøven).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og sted på pladen magnet i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
    5. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  8. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (anden inkubationsvask efter prøven).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og sted på pladen magnet i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
    5. Fjern pladen fra magneten.
  9. Der laves en frisk blanding af biotin-anti-human IgG med SAPE ved at fortynde antistoffet til 0,62 μg/mL og SAPE til 1 μg/mL. Tilsæt 100 μL til hver brønd.
  10. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  11. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
  12. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
  13. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  14. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (første postdetektering antistof inkubation vask).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og sted på pladen magnet i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
    5. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  15. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (anden antistofinkubation vask efter påvisning).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 minutter for at adskille perlerne fra reaktionsblandingen.
    4. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
    5. Fjern pladen fra magneten.
  16. Der tilsættes 100 μL PBS-TBN til hver brønd.
  17. Dæk med folieforsegling og ryst i 2 min ved 37 °C.
  18. Tag pladen ud af tallerken shakeren. Fjern derefter folieforseglingen og læs derefter 50 μL af hver brønd på flowanalysator i henhold til brugervejledningen. Nedenfor gives en kort beskrivelse.
    1. Vælg rullemenuen i øverste venstre hjørne af skærmen , og naviger til Pladekonfiguration.
    2. Vælg Kør plade.
    3. Vælg ikonet Skub ud for at skubbe pladeholderen ud.
    4. Læg pladen på pladeholderen, og vælg ikonet Træk tilbage for at trække pladeholderen tilbage.
    5. Vælg ikonet Kør for at køre pladen.

6. Enkelt reporter neutralisering assay protokol

  1. Forbered en frisk multiplex perle mix som beskrevet i afsnit 3 ovenfor.
  2. Fortynd patient og kontrol sera 1:500 som følger.
    1. Fortyndet serum 1:100 ved at blande 10 μL serum i 990 μL PBS-TBN.
    2. Fortyndet serum yderligere 5 gange ved at tilsætte 40 μL 1:100 serum i 160 μL PBS-TBN.
  3. Tilsæt 50 μL multiplex perle mix til hver tildelt brønd af en 96-godt ikke-bindende mikrotiter plade.
  4. Der tilsættes 25 μL på 2 μg/ml ACE2 fortynding til hver brønd.
  5. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 2 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  6. Fjern pladen fra plade shaker og fjern folieforseglingen.
  7. Der tilsættes 25 μL 1:500 serum eller PBS-TBN til de tildelte brønde.
  8. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  9. I den resterende del af analyseproceduren skal du følge trin 5.4 til 5.18.5 som beskrevet ovenfor.

7. Konvertering til en dobbelt reporter IgG og IgM serologisk analyse

  1. Forbered antigen-koblede perler som beskrevet i afsnit 2 ovenfor.
    BEMÆRK: Et ekstra perlesæt kombineret med human IgM er inkluderet til at overvåge tilsætning af anti-IgM-detektionsreagenser samt et ekstra AC perlesæt (220) til overvågning af indsamling af MFI til RP2. Alle perle bestande er på 1 x 106 perler / mL til optagelse i multiplex perle blander som beskrevet nedenfor.
  2. Forbered friske multiplex perleblandinger som beskrevet i afsnit 3 ovenfor.
  3. Fortyndede serumprøver og IgG-strippet negativ kontrol sera 1:1000 som beskrevet i afsnit 4 ovenfor.
  4. Tilsæt 50 μL multiplex perle mix til hver tildelt brønd af en 96-godt ikke-bindende mikrotiter plade.
  5. Pipette 50 μL på 1:1000 serum eller PBS-TBN til de relevante brønde. Den endelige fortynding af serum i brønden er 1:2000.
  6. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  7. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
  8. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
  9. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  10. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (første inkubationsvask efter prøven).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og sted på pladen magnet i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
    5. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  11. Reaktionsbøndene vaskes igen med PBS-TBN (anden inkubationsvask efter prøven), nøjagtigt som beskrevet ovenfor i trin 7.10.1-7.10.5.
  12. Fjern pladen fra magneten.
  13. Lav en frisk Detektion reagens blandes med den nødvendige kombination af reagenser og tilsæt 50 μL eller 100 μL til hver brønd.
    BEMÆRK: Detektionsgensblandinger, der indeholder anti-Human IgG konjugeret til Brilliant Violet 421 reporter dye (BV; excitation ved 405 nm og emission ved 421 nm) blev brugt ved 50 μL / brønd på grund af begrænsende mængder af de lager reagenser til rådighed. Alle andre detektionsgensblandinger anvendes ved 100 μL/brønd.
  14. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  15. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
  16. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
  17. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  18. Vask reaktionsbøvderne som beskrevet nedenfor med PBS-TBN (første vask efter påvisning af antistofinkubation).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Mens du bevarer pladen på magneten, skal du fjerne folieforseglingen, forsigtigt vende pladen over en affaldsbeholder og forsigtigt svirpe supernatanten ud af brøndene.
    5. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  19. Reaktionsbøndene vaskes igen med PBS-TBN (anden vask efter påvisning af antistofinkubation), nøjagtigt som beskrevet ovenfor i trin 7.17.1-7.17.5.
  20. Fjern pladen fra magneten.
  21. Der tilsættes 100 μL PBS-TBN til hver brønd.
  22. Dæk med folieforsegling og ryst i 2 min ved 37 °C.
  23. Tag pladen ud af tallerken shakeren. Fjern derefter folieforseglingen og læs 50 μL af hver brønd på flowanalysator som beskrevet ovenfor i trin 5.18.1-5.18-5.

8. Konvertering til dobbelt reporter neutralisering assay

  1. Brug de koblede perler som beskrevet i trin 7.1 ovenfor.
  2. Forbered en frisk multiplex perle mix som beskrevet i trin 7.2.
  3. Serumprøver og IgG-strippet negativ kontrol sera fortyndes 1:500 som følger.
    1. Der fremstilles en fortynding på 1:100 ved at blande 10 μL serum i 990 μL PBS-TBN.
    2. 1:100 prøverne fortyndes yderligere 5 gange ved at tilsætte 40 μL af 1:100 fortyndingerne til 160 μL PBS-TBN.
  4. Tilsæt 50 μL multiplex perle mix til hver tildelt brønd af en 96-godt ikke-bindende mikrotiter plade.
  5. Der tilsættes 25 μL på 2 μg/ml ACE2 fortynding til hver brønd.
  6. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 2 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  7. Fjern pladen fra plade shaker og fjern folieforseglingen.
  8. Der tilsættes 25 μL 1:500 serum eller PBS-TBN til de tildelte brønde.
  9. Pladen tildækkes med en folieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  10. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
  11. Med pladen bevaret på magneten, fjern folieforseglingen, vend forsigtigt pladen over en affaldsbeholder og svirp forsigtigt supernatanten ud af brøndene.
  12. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  13. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (første inkubationsvask efter prøve).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Med pladen bevaret på magneten, fjern folieforseglingen, vend forsigtigt pladen over en affaldsbeholder og svirp forsigtigt supernatanten ud af brøndene.
    5. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  14. Reaktionsbøndene vaskes igen med PBS-TBN (anden inkubationsvask efter prøven), nøjagtigt som beskrevet ovenfor i trin 8.13.1-8.13.5.
  15. Fjern pladen fra magneten.
  16. Lav en frisk Detektion reagens blandes med den nødvendige kombination af reagenser og tilsæt 50 μL eller 100 μL til hver brønd.
    BEMÆRK: Reagensblandinger, der indeholder de anti-menneskelige IgG, der er konjugeret til BV-reporterfarven, blev anvendt ved 50 μL/brønd på grund af begrænsning af mængden af de lagerreagenser, der var til rådighed (se Materialetabel). Alle andre detektionsgensblandinger anvendes ved 100 μL/brønd.
  17. Pladen tildækkes med en mikropladefolieforsegling, og inkuber på en opvarmet plade shaker ved 37 °C i 15 min med rystelser ved 600 omdrejninger.
  18. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
  19. Med pladen bevaret på magneten, fjern folieforseglingen, vend forsigtigt pladen over en affaldsbeholder og svirp forsigtigt supernatanten ud af brøndene.
  20. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  21. Vask reaktionsbøndene som beskrevet nedenfor (først var efter påvisning antistof inkubation).
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 min at adskille perlerne fra reaktionen blandingen.
    4. Med pladen bevaret på magneten, fjern folieforseglingen, vend forsigtigt pladen over en affaldsbeholder og svirp forsigtigt supernatanten ud af brøndene.
    5. Blot pladen på absorberende papir, mens du stadig holder pladen på magneten.
  22. Reaktionsbøndene vaskes igen med PBS-TBN (anden vask efter påvisning af antistofinkubation), præcis som beskrevet ovenfor i trin 8.21.1-8.21.5.
    1. Fjern pladen fra plademagneten og tilsæt 150 μL PBS-TBN til hver brønd.
    2. Pladen tilsættes med en frisk folieforsegling og ryst ved 37 °C i 2 min ved 600 omdrejninger.
    3. Fjern pladen fra plade shaker og placere på den magnetiske plade separator i 2 minutter for at adskille perlerne fra reaktionsblandingen.
    4. Med pladen bevaret på magneten, fjern folieforseglingen, vend forsigtigt pladen over en affaldsbeholder og svirp forsigtigt supernatanten ud af brøndene.
    5. Fjern pladen fra magneten.
  23. Der tilsættes 100 μL PBS-TBN til hver brønd.
  24. Dæk med folieforsegling og ryst i 2 min ved 37 °C.
  25. Tag pladen ud af tallerken shakeren. Fjern derefter folieforseglingen og læs 50 μL af hver brønd på flowanalysator som beskrevet ovenfor i trin 5.18.1-5.18-5.

Representative Results

Optimering af Single Reporter Serological Assay.
Koblingsstrategien for alle SARS-CoV-2 antigener er beskrevet i Cameron, et al., 20201 og i trin 2.1 ovenfor. Strategien for koblingsbekræftelse er beskrevet i trin 2.3 ovenfor. For en effektiv kobling skal median fluorescensintensiteten (MFI) være betydeligt højere end no serum/no antistof negativ kontrolreaktion(er) og bør påvise en dosisrespons af faldende MFI-signal med faldende mængder af detektionsreagens. MFI'er på ca. 1.000 MFI-enheder eller derover over baggrundS MFI indikerer generelt effektiv proteinkobling og er afhængige af koncentrationen og specificiteten af detekteringsreagens, der anvendes. Ved hjælp af denne metode blev bekræftelse af S, RBD og Nc antigenkobling testet for to partier perler (Figur 2). MFI-signalerne for alle antigener var signifikant højere end baggrunds-MFI'en og viste en dosisrespons med titrering af detektionsreagenserne. Dataene viste også god reproducerbarhed af MFI niveauer mellem de to forskellige partier af koblede perler.

Optimering af enkelt reporter assay blev gjort som beskrevet i Cameron, et al., 20201. Hvert antigen blev testet ved forskellige koblingskoncentrationer med forskellige fortyndinger af flere serumprøver, der repræsenterede høje, mellemstore, lave og negative prøver. Desuden, fordi analysen måler IgG titers, en IgG-strippet serum blev brugt som en ekstra negativ prøve. Resultaterne af en repræsentativ prøvefortyndingsserie med forskellige antigenkoblingsniveauer er vist i figur 3. Denne indledende fortyndingsserie blev testet med en fast koncentration af detektionsreagenser for at få et potentielt udvalg af repræsentative antigenspecifikke og baggrunds MFI-niveauer. Ud fra disse data blev yderligere fortyndingsområdeer og antigenkoblingsniveauer fastlagt og testet yderligere med yderligere prøver (data, der ikke er vist).

Dernæst blev koncentrationen af detektionsreagens optimeret til brug med de forskellige serumfortyndinger og antigenkoblingsniveauer. Repræsentative data med 6 positive og 2 negative prøver er vist i figur 4. Efter yderligere test med flere hundrede negative serumprøver før COVID-19 blev de endelige optimale antigenkoblingsniveauer og detektionsregentkoncentrationer udvalgt til den endelige analyseprotokol, som beskrevet i afsnit 5.

Konvertering til en enkelt reporter neutralisering assay
Konvertering af enkelt reporter serologisk analyse til en neutralisering assay blev opnået ved at tilføje en inkubation skridt ved hjælp af ACE2 (som en konkurrerende reagens) med perlerne forud for tilsætning af serum prøve. Ved at titrere mængden af ACE2 tilsat, hæmning af IgG binding til S og RBD antigener blev observeret, som vist i figur 5. Mens de 11 patient sera havde forskellige titere af IgG, hver viste et betydeligt fald i MFI signal med stigende ACE2 koncentration. Som forventet påvirker ACE2 kun MFI-signalerne fra S og RBD, men ikke Nc antigen.

Den procent resterende MFI-signal i forhold til 0 μg/ml ACE2 for alle prøver er vist i figur 6. For de fleste prøver blev der observeret et signaltab >30 % for S og RBD med stigende ACE2-koncentration. Som forventet var der ingen effekt af ACE2 på Nc-signalet.

Konvertering til en dobbelt reporter IgG og IgM serologisk analyse
For den dobbelte reporter IgG og IgM assay, standard enkelt reporter assay betingelser blev brugt til at teste forskellige antistof og reporter kombinationer for de to reporter kanaler. RP1-kanalen ligner tidligere flowanalyseinstrumenter med påvisning af "orange" fluorescens for reporterfarvestoffer som PE. Den anden kanal, RP2, anvender en violet excitation laser, der kan bruges til at opdage den "blå" fluorescens af farvestoffer ophidset ved 402 nm med emission spektre toppe i 421-441 nm rækkevidde.

Flere forskellige anti-humane IgG- og IgM-antistofkombinationer blev testet i forskellige koncentrationer med standard 2.000 gange prøvefortynding og inkubationsbetingelser, der er beskrevet i afsnit 6. En indledende test af anti-IgM konjugeret til DyLight 405 reporter farvestof (DL 405; excitation ved 400 nm og emission ved 420 nm) for RP2-kanalen blev udført ved hjælp af et sæt af 11 PCR-positive prøver med DFSO spænder fra 5 til >60 dage, og en IgG-strippet serum prøve. Dette reagens har ikke givet et højt signal i RP2-kanalen som vist i figur 7A, B, C. For prøver med den høje IgM RP2 MFI blev de højeste signaler set for RBD og Nc (Figur 7B, C). Mens IgM-titere på dette tidspunkt skulle forhøjes i nogle prøver, oversteg de observerede MFI-niveauer ikke 140 MFI-enheder med IgM-detektionsreagenset. Desuden manglede kontrolperler for IgM et betydeligt dynamikområde for MFI, når der anvendes DL 405 konjugeret til anti-IgM i forhold til en PE-mærket anti-IgM RP1 reporter anvendes i de samme koncentrationer (Figur 7D).

Da et egnet RP2-reporter-mærket detektionsreagens til IgM ikke var tilgængeligt, blev den originale biotin anti-IgG med SASB testet til brug i RP2-kanalen. Signalet til IgG i RP2-kanalen med SASB havde ikke det samme dynamiske område som med SAPE, men det havde stadig et passende interval til måling af IgG-titere til S, RBD og Nc (Figur 8). Disse data førte til test af forskellige RP1 IgM- og RP2 IgG-detektionsreagenskombinationer som beskrevet nedenfor.

Konvertering til dobbelt reporter neutralisering assay
Den dobbelte reporter serologiske assay blev konverteret til en neutralisering assay ved at tilføje en inkubation skridt med ACE2 og perler, før du tilføjer serum prøve. Der blev anvendt en 2-doblingserie af ACE2, der startede ved 16 μg/ml, og derefter blev testet med sæt på 11 prøver og strippet sera som beskrevet ovenfor. Derudover blev 3 forskellige kombinationer af RP1 IgM og RP2 IgG-påvisning antistofblandinger testet på et sæt af 11 prøver og strippet serum kontrol. De endelige kombinationer og reagenskoncentrationer, der vurderes at være optimale, er beskrevet i tabel 1.

Til IgG-påvisning blev den biotin anti-menneskelige IgG/SASB, der blev brugt i den oprindelige enkeltreporteranalyse, testet sammen med en anden anti-IgG, der blev konjugeret til BV-reporterfarven. Mens BV-konjugaten havde høje RP2 MFI-signaler, varierede MFI-signalintensiteten for IgG-titer på tværs af ACE2-titrerne (Figur 9A,C, E). Biotin anti-human IgG/SASB-kombinationen havde et mere ensartet MFI-signalfald på tværs af ACE2-titreringen sammenlignet med BV-konjugaten, hvilket viste en dosisrespons, selv om MFI-niveauerne var lavere. Signaludsvingene fra BV konjugerer på tværs af ACE2-koncentrationer forstyrrede også bestemmelse af den procenthæmning, som ACE2 havde på tværs af IgG-titerne i forhold til biotin-anti-human IgG/SASB-kombinationen (Figur 9B, D,F). Prøver med lave MFI-signaler, såsom DFSO 3-prøven, har ikke høj nok titere til at vurdere disse reagensers ydeevne eller måle IgG-neutraliserende kapacitet.

Til bestemmelse af IgM-titere i RP1-kanalen blev en PE-konjugeret anti-IgM sammenlignet med en anti-human IgM, der blev konjugeret til DyLight 549-reporterfarvestof (DL 549; excitation ved 562 nm og emission ved 576 nm) ved de koncentrationer, der er anført i tabel 1. Af disse to reagenser udviste PE anti-IgM højere MFI'er end dem, der blev genereret af DL 549 anti human IgM for de testede prøver (Figur 9A,C,E). IgM-kontrolperle, der måler tilsætning af disse reagenser, havde forskellige gennemsnitlige MFI'er på ≈ 17.000 for PE anti-IgM og 2.723 for DL 549-konjugaten. Selv med disse forskelle var virkningen af de forskellige ACE2-koncentrationer på MFI målbar med DL 549-konjugaten. Til bestemmelse af ACE2 procent hæmning af IgM-binding var der en lille, men ubetydelig forskel mellem de to IgM-detektionsreagenser (Figur 9B, D,F).

Kombination Reporter Endelig koncentration i brønd (μg/mL)
RP1 RP2
1 PE anti-IgM 2 -
Biotin-Ig - 0.62
SASB - 4
2 DyLight 549 Anti-Human IgM 1 -
Strålende Violet 421 Anti-Human IgG - 1
3 DyLight 549 Anti-Human IgM 1 -
Biotin-Ig - 0.62
SASB - 4

Tabel 1: Liste over RP1 og RP2 reporter farvestof kombinationer testet. Flere forskellige RP1 og RP2 reporter farvestoffer blev evalueret til måling af IgG og IgM titers. De tre kombinationer, der er vist ovenfor, blev testet ved forskellige RP1-detektionstilstande og til optimering af neutraliseringsanalysen. For RP2-kombinationer, der anvender SASB, vises koncentrationer for det biotinylerede detektionsantistof og SASB. * Endelig koncentration repræsenterer den endelige koncentration i reaktionen godt.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram, der fremhæver de vigtigste assayprotokoltrin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Bekræftelse af antigenkobling. Antigener blev koblet på 100, 10 og 1 pmol/106 perler. For S og RBD antigener blev kanin anti-S sera brugt og opdaget med PE anti-kanin IgG. For Nc, en Protein G-renset kanin polyklonale anti-Nc blev brugt. Titreringskurverne for perler kombineret med 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) og 100 pmol Nc (C) er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Optimering af serumfortynding med forskellige antigenkoblingsniveauer. Serumprøver, der repræsenterer høje, mellemstore, lave og negative prøver, blev testet med de forskellige pmolantigen/106 perlekoblinger. En 4-fold serum titrering blev testet med en multiplex blanding af antigen-koblede perler ved hjælp af analysen protokol beskrevet i afsnit 5. MFI-værdierne for titreringskurverne for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Bestemmelse af optimal serumfortynding og detektionsreagenskoncentration. Otte serumprøver, herunder negative patienter (2 prøver) og lav- til højpositive (6 prøver), blev testet ved yderligere serumfortyndinger med tre forskellige detektionsreagenskoncentrationer. MFI-resultaterne vises for S (A), RBD (B) og Nc (C). På grundlag af disse og andre data (ikke vist) blev der udvalgt en prøvefortynding på 1:2.000 og en antistofkoncentration på biotin på 0,62 μg/mL. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Optimering af enkelt reporter neutralisering assay. Ændring af enkelt reporter serologisk analyse til en neutraliserende antistof afsløring assay blev udført ved at tilføje en inkubation skridt med ACE2 som en konkurrent, som beskrevet i afsnit 6. Et sæt på 11 prøver, der spænder fra lav- til højpositiv titer sera, og en IgG-stribet serumprøve blev testet med en dobbelt fortyndingsserie af ACE2, der starter ved 4 μg/ml, ved hjælp af standard assay betingelser. På tværs af dette interval af ACE2-koncentrationer kan et fald i MFI ses med øget ACE2 for S (A) og RBD (B), men ikke for Nc (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Procent hæmning af signal med ACE2. Den procent resterende signaler for sættet af 11 prøver (fra figur 4) er vist. For hver prøve blev der, uanset dens IgG-titer, opnået et maksimalt fald på ≥30 % MFI-signal for S (A) og RBD (B) ved den højeste ACE2-koncentration. For Nc antigen (C) var der ingen signifikant hæmning af signal med nogen mængde ACE2 testet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Test af DyLight 405 anti-IgM som RP2 IgM-detektionsreagens. Et sæt på 11 prøver og IgG-strippet sera blev brugt til at teste DL 405-konjugeret anti-IgM som en RP2 detektion reagens. RP2 IgM MFI-signalerne for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Det højeste MFI-signal for et antigen med en prøve var ca. 140 MFI-enheder til RBD med prøve H (B). Selv signalet på IgM-kontrolperlesættet var mindre end 1.000 MFI i RP2-kanalen på tværs af hele antistofmelerområdet og viste ikke det øgede dynamikområde, der blev observeret med PE anti-IgM-detektionsantistofet i RP1-kanalen (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Optimering af SASB som RP2 reporter med Biotin anti-IgG. Et sæt på 11 prøver og IgG-strippet sera blev brugt til at teste en fortyndingsserie sasb med standard 0,62 μg/mL biotin anti-IgG. De resulterende IgG MFI'er i RP2-kanalen for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Sammenligning af tre forskellige kombinationer af RP1 IgM og RP1 IgG-detektionsblandinger. Tre forskellige detektion antistof blandinger blev testet på 11 prøver og IgG strippet sera. De anvendte kombinationer og endelige koncentrationer er beskrevet i tabel 1. Alle prøver blev testet med en 2-dobling af ACE2-fortyndinger, der startede ved 16 μg/ml. Data for prøver ved DFSO på 3, 12 og 30 dage vises. MFI-signalerne for RP1 IgM (orange) og RP2 IgG (blå) er vist i A (DFSO 3), C (DFSO 12) og E (DFSO 30). ACE2 procent resterende MFI'er er vist i B (DFSO 3), D (DFSO 12) og F (DFSO 30). Signaler, der repræsenterer et fald på >30 % sammenlignet med ingen ACE2-kontroller, fremhæves lysegrønt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne undersøgelse udvidede funktionaliteten af en multiplex fluorescerende mikrosfære assay, 3Flex, der kvalitativt vurderer IgG reaktion på infektion ved SARS-CoV-21. Mens mange serologiske analyser for COVID-19 registrerer et enkelt antigen, evaluerer denne analyse samtidig S, RBD og Nc antigener og omfatter en intern antistofisotypekontrol7. Derudover bruges ACE2 som en indikator til at opdage neutraliserende antistoftiter til SARS-CoV-2.

Multiantigenanalyser kan være særligt nyttige i fremtiden til diskriminerende immunrespons mellem inficerede og vaccinerede personer. Med SARS-CoV-2, hvis kun S- og RBD-antistoffer vurderes, ville det være umuligt at afgøre, om dette skyldtes en tidligere infektion eller et vaccinationsantistofrespons. Ingen af de vacciner, der i øjeblikket anvendes, er rettet mod Nc-antigen, så ved at evaluere S/RBD- og Nc-antigener er det muligt at skelne tidligere virusinfektion (Nc- og S/RBD-positiv) fra et vaccinationsrespons (kun S/RBD-positiv; Nc-negativ).

I den aktuelle undersøgelse blev 3Flex serologiske og neutraliseringsanalyser (afsnit 5 og 6) overført til et nyt dobbelt reporterflowanalyseinstrument (afsnit 7 og 8). Typiske immunoassay protokoller for perle-baserede multiplex assays ligner standard ELISA protokoller, efter sammenlignelige trin for prøve inkubation, detektion antistof / reporter inkubation, og analyse af resultater8. Tidligere undersøgelser har også vist, hvordan standard ELISA-analyser kan overføres til en perlebaseret multiplexingplatform9.

Analysen protokoller kunne problemfrit overføres fra forgængeren enkelt reporter instrument til den nye dobbelt reporter system, som det fremgår af de resultater, der er opnået for testprøver og kontrol (figur 4 og figur 5). I den serologiske analyse påviste alle positive serumprøver et karakteristisk dosisfølsomt fald i signal svarende til både en højere prøvefortynding og en lavere detektionsantistofkoncentration, mens signalerne til de negative prøver forblev på baggrundsniveau. Tilsvarende svarede faldende signaler for S og RBD, men ikke Nc, til stigende koncentrationer af ACE2-konkurrenten, mens IgG strippet serum var langt mindre påvirket af tilsætning af ACE2. Præinkubation af perlerne med ACE2 i 2 min før tilsætning af serumprøven (som beskrevet i afsnit 6 og 8) blev også sammenlignet med at kombinere perlerne med ACE2 og serum på samme tid og gav kun ringe forskel i resultaterne (data, der ikke blev vist). Men da de opnåede resultater med perlerne plus ACE2 pre-inkubation skridt var mere konsekvent, det var den endelige procedure vedtaget for neutralisering assay protokol (afsnit 6 og 8).

Fordi den dobbelte reporter system indeholder en anden fluorescerende reporter kanal, begge assays blev omdannet til isotyping assays til samtidig at måle både IgG og IgM svar. Den dobbelte reporter funktionalitet flow analysator tillader indsamling af fluorescerende signaler fra to reporter detektion reagenser for hver analysand i multiplex for hver prøve, effektivt fordoble de data, der genereres pr prøve i en analyse. Til udvikling og optimering af de dobbelte reporter assay protokoller, flere kommercielt tilgængelige reporter farvestoffer og detektion antistoffer blev evalueret for den nye RP2 kanal (Figur 7 og Figur 8) for at bestemme den bedste løsning (r) til rådighed. Anti-IgM-antistoffet, der blev konjugeret med DL 405-reporterfarven, klarede sig ikke godt i RP2-kanalen (figur 7), så biotin anti-IgG med SASB blev efterfølgende evalueret til påvisning i RP2-kanalen (Figur 8). Tre kombinationer af RP1- og RP2-detektionsreagenser blev sammenlignet i den dobbelte reporterneutraliseringsanalyse (tabel 1 og figur 9) for at bestemme de kombinationer, der klarer sig bedst, til samtidig påvisning af IgG- og IgM-neutraliserende antistoffer. Mens der var betydelige forskelle i signalintensiteten mellem RP1-kanalen ved hjælp af PE-anti IgM og RP2-kanalen ved hjælp af DL 549 anti-IgM, var der ingen signifikant forskel i målingen af den procent bindende hæmning af ACE2.

Flere begrænsninger i den nuværende metode, og denne undersøgelse er anerkendt. For det første var prøverne testet og anvendt i metodens udvikling og optimering begrænset til sæt af 8-11 prøver. Flere prøver vil blive testet i udvidede undersøgelser for at kontrollere, at metoden er fuldt optimeret. For det andet blev et begrænset antal reporter fluorophores og reporter par testet. Yderligere test af alle tilgængelige journalister i alle mulige kombinationer vil afgøre, hvilke reagenser der kan bruges med succes i denne metode. Anti-IgG antistof konjugeret til biotin var anderledes end anti-IgG antistof konjugeret til BV 421 reporter. Så selv om variabilitet i signalintensiteten for BV 421 anti-IgG eksisterede, kunne det skyldes specificiteten af antistoffet og ikke relateret til reporterfarven. Test af andre tilgængelige BV 421-konjugerede antistoffer kan identificere et andet antistof, der ville klare sig godt i RP2-kanalen. Fremtidige undersøgelser vil også evaluere kombinationen af PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG til påvisning i henholdsvis RP1 og RP2. Sidst, selv med den dobbelte reporter kapacitet af instrumentet, assays er begrænset til to isotyper (to parametre) pr reaktion. Hvis yderligere isotyper skal måles eller fuld isotyping ønskes, skal yderligere reaktioner ved hjælp af de samme to reporterkanaler køres i separate brønde.

Perlebaseret multiplexingteknologi giver mulighed for hurtigt og fleksibelt analysedesign med nem implementering i rutinemæssige laboratoriearbejdsgange3,4,10. Denne undersøgelse viste, at det er nemt at overføre de tidligere beskrevne 3Flex serologiske og neutraliseringsanalyser til SARS-CoV-2 til et flowanalysesystem til måling af IgG med en enkelt reporter eller med mindre modifikation, der samtidig måler både IgG- og IgM-respons ved hjælp af to journalister. Den dobbelte reporter mulighed har klare fordele i forhold til enkelt reporter platforme, fordi det kan give dobbelt så mange data pr prøve, ved hjælp af halvdelen af prøven volumen, og i halvdelen af antallet af reaktion brønde. Med de relevante reporter farvestoffer og detektion antistoffer, isotyping assays kan nemt udvikles og udføres på den dobbelte reporter flow analyse instrument.

Disclosures

Stephen Angeloni og Sherry Dunbar er ansatte i Luminex Corporation, der producerer nogle af de reagenser og instrumenter, der blev brugt i denne undersøgelse. Open Access offentliggørelse af denne artikel blev sponsoreret af Luminex Corporation

Acknowledgments

Denne rapport blev finansieret af Luminex Corporation (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) for videnskabelig redigering bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACE2 (human) (rec.) AdipoGen Life Sciences AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-065-098
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A7888 Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3650
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile Corning 6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-506-129 Discontinued but available from multiple vendors
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate ThermoFisher Scientific 62-4317-82
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker ThermoFisher Scientific 02-217-757 Fisher Scientific
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE ThermoFisher Scientific P-2771MP
Luminex Magnetic Plate Separator Luminex Corporation CN-0269-01
MagPlex beads Luminex Corporation MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-116-129
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma P3813 Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56683 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56049 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified
SARS Spike Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56047 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Spike Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56048 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb SinoBiological 40150-R007
Sodium Azide MilliporeSigma S2002 Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) ThermoFisher Scientific S21388 premium grade
Tube Revolver/ Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
TWEEN 20 MilliporeSigma P9416 Sigma-Aldrich
xMAP Antibody Couplng Kit Luminex Corporation 40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE Luminex Corporation INTELLIFLEX-DRSE-RUO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
  2. Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
  3. Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

Tags

Immunologi og infektion Udgave 170 multiplex mikrosfære perle SARS-CoV-2 serologisk analyse neutralisering assay
En hurtig, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 neutralisering Assay for en multiplexed perle-baseret Flow Analysis System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Angeloni, S., Cameron, A., Pecora,… More

Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System. J. Vis. Exp. (170), e62487, doi:10.3791/62487 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter