Summary
概説されたプロトコルは、HiBiT受容体結合ドメインタンパク質複合体を産生するための手順と、SARS-CoV-2抗体の迅速かつ感度的な検出のためのその応用について説明する。
Abstract
COVID-19パンデミックの出現は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)の疫学的影響を決定するためのより良い血清学的検出方法の必要性を高めている。SARS-CoV-2感染の増加は、より良い抗体検出アッセイの必要性を高める。現在の抗体検出方法は、速度に対する感度を損なうか、感度は高いが時間がかかります。SARS-CoV-2中和抗体の大部分は、SARS-CoV-2の一次免疫原性コンパートメントの1つである受容体結合ドメイン(RBD)を標的とする。我々は最近、SARS-CoV-2抗体を検出するために、高感度な生物発光タグ付きRBD(NanoLuc HiBiT-RBD)を設計し、開発しました。以下のテキストは、このツールを用いてRBD標的抗体の存在を評価するHiBiT-RBD複合体および高速アッセイを製造する手順を説明する。HiBiT-RBDタンパク質製品の耐久性が広い温度で、1時間以内に完了できる短い実験手順のために、このプロトコルは患者血清サンプル中のSARS-CoV-2抗体を検出するより効率的な代替手段として考えることができます。
Introduction
最近の新しいコロナウイルスSARS-CoV21の出現により、2012年3月30日時点で2,800,000人以上の死亡者と1億2,800万人の感染が発生しました。SARS-CoV-2臨床療法のための信頼でき、確立された処置の欠如のために、より重要な効果的で強い処置またはワクチン3を開発するために、さらなるウイルス伝達を制限するために多くの努力がなされてきた。現在までに、世界保健機関(WHO4)が報告した試験には、50人以上のCOVID-19ワクチン候補があります。SARS-CoV-2に対する抗体の検出は、COVID-195の回復された患者において、ワクチンの投与時の液性応答の長期安定性を決定するために最も重要である。いくつかの研究は、回復したSARS-CoV-2患者が1年後にRBD結合抗体のほとんどを失う可能性があることを実証した5、6、7、8、9。永続的な免疫をよりよく理解するためにさらなる調査が必要であり、より敏感な抗体検出プラットフォームは、そのような作業をさらに助けることができます。長期抗体応答を示唆する軽度のSARS-CoV-2感染の持続的免疫の報告も興味深く、価値のある研究分野である。迅速かつ正確な検出方法は、集団の免疫に関するより多くの情報を提供するために、個人のセラの抗体を監視するために不可欠です。
他のコロナウイルスと同様に、SARS-CoV-2は突出したスパイク糖タンパク質を使用してアンジオテンシン変換酵素-2(ACE2)に結合し、ウイルス膜と細胞膜の融合につながるイベントのカスケードを開始する6,7。いくつかの研究は最近、スパイクタンパク質のRBDがSARS-CoV28,9,10,11に対する強力かつ特異的な抗体応答を引き出す上で重要な役割を果たすことを証明した。特に、RbD結合抗体の力価と患者の血漿中性SARS-CoV-2中和力との間にPremkumarらによって観察される相関は、RBDがウイルス構造の免疫原性コンパートメントであることと一致する。そのことを念頭に置いて、SARS-CoV-2抗体検出に利用可能な多くの診断テストは、時間とコストを要する、インキュベーションおよび洗浄(酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA])、または感度と精度(横流免疫測定[LFIA])12の長い手順を必要とする。したがって、高感度、高速応答、および比較的低コストのCOVID-19由来抗体検出の定量的かつ迅速な相補血清学的方法は、SARS-CoV-2疫学的サーベイランスのための信頼性の高い血清学的検査の必要性に役立ちます。
総称して、現在の血清学的アッセイの限界は、将来の血清調査における潜在的な診断薬としての生物発光報告システムの調査を促した。生物発光は、自然に発生する酵素/基質反応であり、発光を伴います。ナノルクルシメラーゼは最も小さい(19kDa)でありながら、レニラとホタルルシファーゼ(それぞれ36kDaと61kDa)に比べて最も明るいシステムです13,14。さらに、Nanolucは前述のシステムの中で最も高い信号対雑音比および安定性を有する。ナノルクの高い信号強度は、レポーター融合15の非常に少量の検出をサポートしています。ナノルクバイナリテクノロジー(NanoBiT)は、2つのセグメントで構成されているNanolucシステムの分割版です: 小さなBiT (11アミノ酸;SmBiT)および比較的低親和性相互作用を有する大型BiT(LgBiT)(KD = 190 μM)を有し、発光複合体16を形成する。NanoBiTは、タンパク質相互作用の同定15、17、18、19および細胞シグナル伝達経路11,20,21の様々な研究で広く使用されています。
最近、LgBiT(KD = 0.7 nM)に対する明らかに高い親和性を有する別の小さなペプチド、すなわち、SmBiTの代わりにHiBiTナノグロ系が導入された。Nano-Gloの「付加ミックス読み取り」アッセイの高い親和性と強いシグナルは、HiBiTを適切な定量的で発光性ペプチドタグにします。このアプローチでは、HiBiTタグは、最小限の構造干渉を課す構造を開発することによって標的タンパク質に付加される。HiBiTタンパク質融合は、LgBiTの対応物に積極的に結合し、検出試薬の存在下で検出可能な生物発光を生成する高活性ルシファーゼ酵素を産生する(図1)。同様に、SARS-CoV-2回収された個体のセラ中の中和抗体力素を容易に測定するHiBiT Nano-Gloベースのシステムを開発し、最近HiBiTタグ付きSARS-CoV-2 RBDを開発しました。本論文では、標準的な実験手順と装置を用いてHiBiT-RBDバイオレポーターを製造するためのプロトコルについて述べ、このバイオレポーターをSARS-CoV-2 RBD標的抗体を検出するための迅速かつ効率的なアッセイで使用する方法を示す。
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Protocol
注: 以下に説明するプロトコルは、プロトコル コード 20200371-01H に従ってすべての倫理ガイドラインに準拠しています。
1. HiBiT-RBDバイオレポーターの製造と評価
- 十分な量のHiBiT-RBDバイオレポーターを生産する
- 細胞培養の準備
- 10%のウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む完全なDulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)を準備します。その後、37°Cの水浴で媒体を温めます。
- 生物学的安全キャビネット(BSC)をオンにし、キャビネット表面を殺菌するために70%v/vエタノールを使用してください。
- 細胞株を培養する。
- -80°Cまたは液体窒素から細胞株を取り出し、37°Cの水浴で解凍します。
注意:適切な細胞株は培養で維持しやすく、トランスフェクション効率が高く、外因性タンパク質の生産に適しています。ヒト胚性腎臓、HEK293細胞はこのプロトコルに使用した。 - 解凍した細胞を完全な培地の少なくとも10 mLと混合し、10cmのペトリ皿に細胞懸濁液をピペットし、プレートを旋回して皿の中の細胞を均一に分配する。37°C、5%CO2、湿度85~95%の細胞培養インキュベーターに皿を入れます。
- 合流レベルが80-90%に達するまで顕微鏡下で細胞を観察してください。高い合流度で、培地を取り出し、温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、0.25%トリプシンエチレン酢酸の1mLを加えて細胞を表面から取り外します。
注: HEK293 セルは、かなり簡単に切り離されます。したがって、洗浄ステップは、偶発的な剥離や細胞の損失を防ぐために非常に穏やかに行われるべきです。 - 約5分後、顕微鏡下で細胞を見てください。すべての細胞が浮遊している場合は、少なくとも4 mLの培地を加え、細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに移します。血球計を使用して細胞を数え、トランスフェクションのために6ウェルプレートの各ウェルに1×106 個の細胞を加えます。
注:24時間後、細胞は80%以上のコンフルエントである必要があります。
- -80°Cまたは液体窒素から細胞株を取り出し、37°Cの水浴で解凍します。
- ヒビト-RBDプラスミドのトランスフェクション
- 適切なトランスフェクション試薬を用いて、1 μgのHiBiT-RBD発現プラスミドを使用してください。室温で10〜15分間インキュベートし、プレートの各ウェルに総体積を加え、滴下します。
メモ:メーカーのトランスフェクションプロトコルに従ってください。この場合、DMEMを用いたトランスフェクション試薬の混合物(指定量)をDMEM中の希釈プラスミド(1μg)に添加した( 材料表参照)。トランスフェクション効率をモニタリングするコントロールとして、プラスミド(例えば緑色蛍光タンパク質[GFP])を含むマーカーを使用する。 - 翌日、トランスフェクション混合物を含む培地を完全な培地に交換します。トランスフェクション後48時間のトランスフェクション制御をよく観察します。
注:トランスフェクションが陽性で効率的(80%以上のGFP陽性)であれば、細胞はHiBiT-RBDバイオレポーターを収穫する準備ができているはずです。この構成体には、全上清の代わりに精製タンパク質を得るために使用することができるHis-tagも含まれています。 - 1.5 mLマイクロチューブで上清を収集します。500 μL の 1x 受動リシス バッファー (PLB) をセルに追加します。インキュベートし、細胞のリシスのための室温で15分間プレートを振ります。
注:上清および溶解液は、少なくとも6ヶ月間、完全性のわずかな損失と-20°Cで保存することができます。Azadら 22によれば、レポーターはpH(4-12)および温度(4-42°C)の広い範囲で安定している。
- 適切なトランスフェクション試薬を用いて、1 μgのHiBiT-RBD発現プラスミドを使用してください。室温で10〜15分間インキュベートし、プレートの各ウェルに総体積を加え、滴下します。
- 細胞培養の準備
- ルシファーゼアッセイによる生体レポーターからの発光シグナルの評価
- 反応成分の準備
- バイオレポーターの供給源として上清を使用します。
注:上清とライセートの両方がHiBiT-RBDバイオレポーターを含み、アッセイに使用することができます。ただし、上清は以下の注意事項で説明する理由からソースとして推奨されます。 - LgBiTと基板を使用前に1倍に希釈します(ストック濃度は100倍)。
注: LgBiT の詳細については、 資料一覧 を参照してください。
- バイオレポーターの供給源として上清を使用します。
- ルシファーゼアッセイ
- 上清の50 μLを各ウェルまたはチューブから96ウェルプレートに移し、各ウェルに50 μLの1x LgBiTを加えます。室温で5分間インキュベートします。
- ルミノメーターソフトウェアを開き、1x基板(furimazine)を各ウェルに50 μL追加し、プレートをルミノメーターに入れ、ソフトウェアを実行します。
注:プレートを読み取る直前に基質を追加して、シグナル測定前に活性酵素による基質の消費を防ぎます。
- 反応成分の準備
2. 迅速かつ感度の高いアッセイによる抗RBD抗体の検出
- HiBiT-RBD抗体検出アッセイ
- プロトコルのセクション1.1に記載されているように、HiBiT-RBDバイオレポーターを準備します。
注 : タンパク質の成熟した糖化バージョンを含む、収集が簡単で、次のアッセイに上澄み物を使用することをお勧めします。さらに、ライセートには、HiBiT-RBD抗体相互作用を妨げる可能性のある他のいくつかのタンパク質があります。 - 1.5 mLマイクロチューブで、HiBiT-RBD含有上清の50 μLを1μgの市販SARS-CoV-2-RBD抗体と組み合わせます。20 μLの免疫グロブリン結合タンパク質(プロテインG)を溶液に加えます。PBSを追加して、総体積を300 μLに引き上げる。
注:混合物の総体積は150 μLに減少させることができます。 - チューブシェーカーまたはローテーター上のチューブを30分間インキュベートします。遠心分離機は30× g で、上清を捨て、PBSで洗浄する。このプロセスを3回繰り返して、無料のHiBiT-RBDを削除します。50 μLのPBSで再中断し、96ウェルプレートに移します。
- 1x LgBiTの50 μLを加え、5分待ちます。その後、1x NanoLuc基板の50μLを加えます。すぐにルミネス信号をルミノメーターで読み取ります。
- プロトコルのセクション1.1に記載されているように、HiBiT-RBDバイオレポーターを準備します。
3. 患者血清サンプルからのSARS-CoV-2特異的抗体のハイスループット検出
- プロトコルのセクション1.1でハイスループットアッセイのためにHiBiT-RBDバイオレポーターの量を多く準備します。
- 20 μL の磁気プロテイン G と HiBiT-RBD 上清の 50 μL を各サンプルに 96 ウェル プレートのウェルに組み合わせます。各ウェルに血清サンプル10μLを加え、PBSを加えて合計体積を150μLに引き上げます。
注:ステップ2.1.2で説明したように、非特異的IgG(陰性対照)とSARS-CoV-2抗体(陽性対照)を1μg/mL濃度で中和する両方を使用してください。さらに、ワクチン接種されたマウスからの血清サンプルも、抗体について評価することができる。この試験では、承認された手順の下で、個人からのインフォームド・コンセントを得て、オタワ病院総合キャンパスから血清サンプルを得た。 - 室温でシェーカーで30分間インキュベートします。磁気ワッシャーの上にプレートを置き、タンパク質G抗体複合体を沈殿させます。
注:磁気ワッシャーの特定の構造は、各ウェルの側壁に複合体を沈殿します。 - 各ウェルの中央部に溶液を捨て、洗浄用にPBSを加えます。過剰なHiBiT-RBDを除去するために、洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。1x PBS 50 μL と 1x LgBiT の 50 μL を加えます。室温で少なくとも5分間インキュベートする。
- ルミノメーターソフトウェアを準備し、1x基板の50 μLを追加します。プレートをマシンに置き、ソフトウェアを実行し、信号を記録します。血清サンプル、コントロールサンプル、バックグラウンド(空の井戸)からの信号を比較します。
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Representative Results
このトランスフェクト細胞のHiBit-RBD含有細胞ライセートと上清の両方からのシグナルを記録し(図2)、適切なタンパク源を評価した。HiBiT-RBDとLgBitはコントロールとして別々に使用され、データは両方の部分を組み合わせたときに強い信号と比較して低い背景を示しました。したがって、LgBiTとのHiBiT-RBD相互作用は、基質消化および生物発光活性のための活性酵素を生成するために必要である(図1)。
タンパク質Gの添加は、抗体沈殿を助ける(図3)。このアッセイは、市販のSARS-CoV-2中和抗体からのシグナルをコントロールIgGと比較するために使用した。特異的抗体シグナルは堅牢であり、対照抗体は発光バックグラウンドレベルに近い(図4A)。Mタンパク質の51位に変異を有する組換え腫瘍溶血性小胞炎ウイルス(VSV) を発現する外因性RBDを、マウスのワクチン接種に使用した。ワクチン接種されたマウスから採取した血清は、コントロールVSVを注射したマウスのシグナルがないのと比較して、強いシグナルを生み出した(図4B)。
図1:RBDに接続されたHiBiTとのLgBiT相互作用。 ナノルシメラーゼの小部分の相互作用に際して、HiBiTは、酵素の大きなサブユニットと共に、LgBiT、活性酵素複合体は、基質消費後に発光シグナルを生成することができる。RBD はこのプロセスに干渉しません。略語: RBD = 受容体結合ドメイン. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:トランスフェクト細胞のリセートと上清の両方からの堅牢なレポーター活性。 タンパク質は上清とライセートの両方に存在し、強いシグナルを生成します。制御群の発光信号は背景に近かった。誤差範囲は標準偏差(SD)を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タンパク質Gに結合した抗体とのHiBiT-RBD相互作用の概略図。 この回路図は、タンパク質Gによる抗体沈殿とHiBiT-RBDとの相互作用を示しています。抗体がRBDに特異的である場合、混合物にLgBitを添加すると、強いシグナルが生成されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:HiBiT-RBDバイオレポーターは、精製中和抗体、ワクチン接種マウス血清、および患者血清サンプルを用いて強力な生物発光を生成します。 (A) HiBiT-RBDはRBD特異的中和抗体と相互作用し、非特異的IgGの無視できるシグナルと比較して有意に高いシグナルを生成する。(B)バイオレポーターは、ワクチン接種されたマウス血清中のSARS-CoV-2抗体を検出することができる。略語: RBD = 受容体結合ドメイン;IgG = 免疫グロブリン G;Ab = 抗体;VSV = 静脈性口内炎ウイルス;Fluc = ホタルルシメラーゼ。(C)患者血清サンプル中のSARS-CoV-2抗体の検出は、Azadらら22から再現した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
SARS-CoV-2に感染する人が増え、世界的なワクチン接種に取り組むには、大規模な血清調査で使用できる敏感で速い血清学的検査が必要です。最近の研究では、分割ナノルシメラーゼベースのバイオレポーターを使用してアッセイを開発できることが示されています。最近、HiBiT-RBDバイオレポーターを開発し、患者血清中のSARS-CoV-2特異的抗体を迅速かつ信頼性の高い方法で検出するためのテストを設計しました(図4C)。
このアッセイには、いくつかの重要なステップがあります。システムの効率はRBDタンパク質発現に依存するため、タンパク質レベルはウェスタンブロッティングによって検証されるべきである。また、RBDに対する市販の抗体や、陰性対照抗体などのポジティブコントロールを用いることが必要である。ナノルシメラーゼタンパク質の添加は、生物発光検出のための陽性制御として使用することが推奨されます。タンパク質製品にはHisタグも含まれており、多数の血清サンプルの精製に使用できます。
このバイオレポーターを他の競合する方法と比較して使用することにはいくつかの利点があります。まず、経験豊富なユーザーは、ELISAなどの既存のテストよりもかなり速い1時間以内に完全なアッセイ手順を実行することができます。第 2 に、準備とテストの最小要件により、このテストは、低コストで大規模な生産に対して非常に価値が高くなります。また、アッセイの検出限界は、Azad et al.22で記載されているSARS-CoV-2中和抗体の1ngと低い。このアプローチの欠点は、異なる抗体アイソタイプを区別できないことです。今後、テストの感度は、他の日常的に使用される血清学的検査と比較する必要があります。
アザドら22 は、アッセイの適用性を評価するために患者由来の血清サンプルを使用していた。また、患者からの血液サンプル中の抗体検出についてシステムをテストすることも不可欠です。このツールは、COVID-19の重症度とSARS-CoV-2特異的抗体の存在との間の相関関係の評価にも非常に影響を与える可能性があります。全体として、このような血清学的検査は、SARS-CoV-2の疫学的影響を推定する上で大きな影響を及ぼす可能性があり、時間がかかり、感度の低い検出方法の代わりに便利です。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
シャオホン・ヘ、リカルド・マリウス、ジュリア・ペトリク、ブラッドリー・オースティン、クリスティアーノ・タネーゼ・デ・ソウザの技術支援に感謝し、感謝します。また、グラフィックデザインのためにミナ・ガーレマニに感謝します。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。DWCは、uOttawaの教員と医学部によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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