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Biochemistry

dNTPase SAMHD1 के साथ छोटे अणु इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट एंजाइम-युग्मित गतिविधि परख

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62503
Automatic Translation
1, 1
1Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet

Summary

SAMHD1 मानव स्वास्थ्य और रोग में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ एक डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट ट्राइफॉस्फोहाइड्रोलेज़ है। यहाँ हम एक बहुमुखी एंजाइम युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख प्रस्तुत करते हैं, एक 384 अच्छी तरह से microplate प्रारूप में तैनात, कि SAMHD1 substrates, सक्रियकर्ता, और inhibitors के रूप में छोटे अणुओं और nucleotide analogues के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है.

Abstract

बाँझ अल्फा आकृति और एचडी डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएएमएचडी 1) इंट्रासेल्युलर डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी) पूल का एक महत्वपूर्ण नियामक है, क्योंकि यह एंजाइम डीएनटीपी को उनके संबंधित न्यूक्लियोसाइड और अकार्बनिक ट्राइफॉस्फेट में हाइड्रोलाइज कर सकता है। न्यूक्लियोटाइड चयापचय में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, कई विकृति के साथ इसका जुड़ाव, और चिकित्सा प्रतिरोध में इसकी भूमिका, वर्तमान में इस एंजाइम के विनियमन और सेलुलर फ़ंक्शन दोनों की बेहतर समझ के लिए गहन शोध किया जा रहा है। इस कारण से, SAMHD1 के साथ छोटे अणु इंटरैक्शन की जांच करने के लिए सरल और सस्ती उच्च-थ्रूपुट उत्तरदायी विधियों का विकास, जैसे कि एलोस्टेरिक नियामकों, सब्सट्रेट या अवरोधकों के लिए महत्वपूर्ण है। इस उद्देश्य के लिए, एंजाइम-युग्मित मैलाकाइट ग्रीन परख एक सरल और मजबूत वर्णमिति परख है जिसे 384-माइक्रोवेल प्लेट प्रारूप में तैनात किया जा सकता है जो एसएएमएचडी 1 गतिविधि के अप्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है। जैसा कि SAMHD1 न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट से ट्राइफॉस्फेट समूह को जारी करता है, हम इस प्रतिक्रिया के लिए एक पायरोफॉस्फेट गतिविधि को जोड़ सकते हैं, जिससे अकार्बनिक फॉस्फेट का उत्पादन होता है, जिसे फॉस्फोमोलीब्डेट मैलाकाइट ग्रीन कॉम्प्लेक्स के गठन के माध्यम से मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। यहां, हम SAMHD1 के ज्ञात अवरोधकों को चिह्नित करने और गैर-विहित सब्सट्रेट के SAMHD1 उत्प्रेरण में शामिल तंत्र को समझने और एलोस्टेरिक एक्टिवेटर्स द्वारा विनियमन को समझने के लिए इस पद्धति के अनुप्रयोग को दिखाते हैं, जिसका उदाहरण न्यूक्लियोसाइड-आधारित एंटीकैंसर दवाओं द्वारा दिया जाता है। इस प्रकार, एंजाइम-युग्मित मैलाकाइट ग्रीन परख एसएएमएचडी 1 का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और इसके अलावा, फॉस्फेट प्रजातियों को छोड़ने वाले कई एंजाइमों के अध्ययन में भी उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

बाँझ अल्फा आकृति और हिस्टिडाइन-एस्पार्टेट डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएएमएचडी 1) मानव स्वास्थ्य और रोग2 में कई भूमिकाओं के साथ स्तनधारी कोशिकाओं1 में न्यूक्लियोटाइड होमियोस्टेसिस का एक केंद्रीय नियामक है। यह एंजाइम डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी) को उनके कॉग्नेट डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड और अकार्बनिक ट्राइफॉस्फेटअणुओं 3,4 में हाइड्रोलाइजिंग करने में सक्षम है, इस गतिविधि को (डी) एनटीपी बहुतायत (संदर्भ5 में समीक्षा) द्वारा एलोस्टेरिक रूप से विनियमित किया जा रहा है। प्रत्येक SAMHD1 मोनोमर में दो एलोस्टेरिक साइट (AS1 और AS2) और एक उत्प्रेरक साइट होती है, और सक्रिय एंजाइम के गठन के लिए (d) NTP बाइंडिंग पर एक होमोटेट्रामर की आदेशित असेंबली की आवश्यकता होती है। SAMHD1 मोनोमर्स का डिमराइजेशन पहले एक गुआनिन ट्राइफॉस्फेट (GTP या dGTP) के AS1 के बंधन के माध्यम से ट्रिगर किया जाता है, और बाद में टेट्रामेराइजेशन तब प्राप्त होता है जब एक अतिरिक्त dNTP अणु AS2 से बांधता है, जिससे उत्प्रेरक साइट और बाद में हाइड्रोलिसिस तक सब्सट्रेट पहुंच सक्षम होती है।

SAMHD1 सब्सट्रेट में चार विहित dNTPs 3,4 शामिल हैं, साथ में कुछ आधार और चीनी संशोधित न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं, जिसमें वायरल संक्रमण और कैंसर के उपचार में उपयोग की जाने वाली कई न्यूक्लियोसाइड-आधारित दवाओं के ट्राइफॉस्फेट मेटाबोलाइट्स शामिल हैं, जिनमें से कई एलोस्टेरिक एक्टिवेटर 6,7,8,9,10,11 के रूप में भी काम कर सकते हैं. परिणाम में SAMHD1 रोग मॉडल 7,8,9,10,11,12,13,14,15 में इन यौगिकों में से कई की प्रभावकारिता को नियंत्रित करता है, और इसके अलावा, डीऑक्सीसाइटिडाइन एनालॉग साइटाराबाइन (एआर-सी) के मामले में, जो दशकों से तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) के लिए मानक-देखभाल चिकित्सा बनी हुई है, वास्तव में हुक्म देती है इस रोग में उपचार प्रभावकारिता 7,8,16. SAMHD1 इस प्रकार एक संभावित बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य न्यूक्लियोसाइड आधारित चिकित्सा17 की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए है, और तदनुसार, हम और दूसरों कोशिकाओं में SAMHD1 को निष्क्रिय करने के लिए रणनीतियों की पहचान करने की मांग की है. हमने कैंसर कोशिकाओं7 के अंदर गिरावट के लिए SAMHD1 को लक्षित करने के लिए जैविक अवरोधक के रूप में वायरल प्रोटीन X (Vpx) के उपयोग का प्रस्ताव दिया, हालांकि, इस दृष्टिकोण की कई सीमाएँ हैं (संदर्भ12 में चर्चा की गई है), और हमने हाल ही में SAMHD1 गतिविधि को दबाने के लिए एक अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण की सूचना दी है राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस के निषेध के माध्यम से गतिविधि जिसे हमने एएमएल18 के विभिन्न मॉडलों में प्रदर्शित किया था. कई अध्ययनों ने एसएएमएचडी 1 को सीधे बाधित करने में सक्षम छोटे अणुओं की पहचान करने की मांग की है, और आज तक, ऐसे कई अणुओं की सूचना दी गई है, हालांकि, केवल इन विट्रो 6,9,19,20,21,22 में निषेध का दस्तावेजीकरण किया गया है। परिणामस्वरूप, छोटे अणुओं की कमी जो न्यूक्लियोसाइड-आधारित चिकित्सीय के SAMHD1 उत्प्रेरण के जटिल तंत्र के साथ युग्मित कोशिकाओं में SAMHD1 गतिविधि को संभावित रूप से रोकती है, आगे की जांच की आवश्यकता को रेखांकित करती है। इस प्रकार SAMHD1 के साथ छोटे अणु बातचीत की जांच के लिए मजबूत और आदर्श रूप से उच्च-थ्रूपुट उत्तरदायी तरीके इस नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंजाइम के सब्सट्रेट, एलोस्टेरिक नियामकों और अवरोधकों की पहचान करने के लिए आदर्श हैं।

कई पद्धतियां उपलब्ध हैं जो सीधे SAMHD1 की dNTPase गतिविधि को मापती हैं, जैसे कि पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी)9,20,23 और उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी)9,21, लेकिन ये उच्च-थ्रूपुट सेटअप के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं हैं। एक अपवाद मौनी एट अल द्वारा रिपोर्ट की गई परख है, जो एसएएमएचडी 1 की क्षमता को बीआईएस (4-नाइट्रोफेनिल) फॉस्फेट (बी 4 एनपीपी) को पी-नाइट्रोफेनॉल और पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट को हाइड्रोलाइज करने के लिए शोषण करता है जब एमएन2+ को सक्रिय करने वाले केशन के रूप में उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक वर्णमिति परिवर्तन होता है जिसे माइक्रोवेल प्लेट21 में आसानी से मापा जा सकता है। इस परख को SAMHD1 अवरोधकों की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हाइड्रोलिसिस (डी) एनटीपी एक्टिवेटर्स की अनुपस्थिति में और संभावित गैर-शारीरिक सक्रियण केशन की उपस्थिति में होता है, दोनों महत्वपूर्ण चेतावनी हैं विचार करने के लिए। यह भी इस परख अध्ययन और SAMHD1 के allosteric नियामकों की पहचान के लिए लागू कम renders.

इस संदर्भ में, मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक के साथ संयुक्त एक एंजाइम-युग्मित दृष्टिकोण, जैसा कि इस रिपोर्ट में विस्तृत है, अप्रत्यक्ष रूप से SAMHD1 की dNTPase गतिविधि को मापने के लिए एक बहुमुखी तरीका हो सकता है और इसके अलावा, इस पर विभिन्न छोटे अणुओं के प्रभाव से पूछताछ करता है। मैलाकाइट ग्रीन परख मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट (पीआई) का पता लगाने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय वर्णमिति तकनीक है, जो एक मोलिब्डोफॉस्फोरिक एसिड कॉम्प्लेक्स के गठन पर आधारित है जो 620 एनएम24 पर मापा गया वर्णमिति परिवर्तन की ओर जाता है। चूंकि एसएएमएचडी 1 हाइड्रोलिसिस न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट से ट्राइफॉस्फेट समूह को जारी करता है, इसलिए इस प्रतिक्रिया को एक (पायरो) फॉस्फेट गतिविधि के साथ जोड़ना आवश्यक है, जो मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक के अतिरिक्त से पहले मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट उत्पन्न करेगा। मैलाकाइट ग्रीन परख संवेदनशील और लागत प्रभावी है और एंजाइमों के लिए अवरोधकों और सब्सट्रेट की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है जो अकार्बनिक फॉस्फेट समूहों को या तो उनकी प्रतिक्रियाओं में या युग्मन एंजाइम की उपस्थिति में छोड़ते हैं। यह व्यापक रूप से हेलकेस 25,26,27, या CD73 एंजाइमेटिक गतिविधि के अध्ययन के ATPase गतिविधियों के लक्षण वर्णन में लागू किया गया है, जो एडेनोसिन और अकार्बनिक फॉस्फेट28 के लिए एएमपी के क्षरण की मध्यस्थता करता है। इसके अतिरिक्त, युग्मित होने पर, यह UDP-2,3-diacylglucosamine pyrophosphatase LpxH, अधिकांश ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों29 में एक आवश्यक एंजाइम को लक्षित एंटीबायोटिक दवाओं की खोज में नियोजित किया गया है। कैंसर अनुसंधान के संबंध में, एंजाइम युग्मित दृष्टिकोण बड़े पैमाने पर NUDIX hydrolases, न्यूक्लियोटाइड metabolizing एंजाइमों के एक परिवार के खिलाफ तैनात किया गया है, दोनों substrates30,31,32 के लक्षण वर्णन में और पहचान और दवाओं और रासायनिक जांच के विकास में 33,34,35,36.

dNTPase SAMHD1 के संबंध में, इस दृष्टिकोण का उपयोग कई रिपोर्टों में किया गया है। युग्मन एंजाइम के रूप में Saccharomyces cerevisiae से exopolyphosphatase Ppx1 का उपयोग करते हुए, इस परख का उपयोग कई न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स का परीक्षण करने के लिए किया गया था जैसे कि सब्सट्रेट, एक्टिवेटर, या SAMHD1 के अवरोधक, और इसके परिणामस्वरूप एंटी-ल्यूकेमिक ड्रग क्लोफराबाइन के ट्राइफॉस्फेट मेटाबोलाइट की पहचान एक उत्प्रेरक औरसब्सट्रेट 6 के रूप में हुई। इसके अतिरिक्त, युग्मन एंजाइम के रूप में एस्चेरिचिया कोलाई से अकार्बनिक पायरोफॉस्फेट के साथ, इसे अवरोधकों20 की पहचान करने के लिए SAMHD1 के खिलाफ नैदानिक रूप से अनुमोदित यौगिकों की एक लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग में नियोजित किया गया है। हमारे शोध में, हमने यह दिखाने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया कि आरा-सीटीपी, आरा-सी का सक्रिय मेटाबोलाइट, एक एसएएमएचडी 1 सब्सट्रेट है, लेकिन एलोस्टेरिक एक्टिवेटर7 नहीं है और बाद में इस परख का उपयोग यह दिखाने के लिए किया कि कई छोटे अणु जो एएमएल मॉडल को संवेदनशील बना सकते हैं एक एसएएमएचडी 1-निर्भर तरीके से एआरए-सी, वास्तव में सीधे एसएएमएचडी 118 को बाधित नहीं करता था। इस रिपोर्ट में, हम इस बहुमुखी विधि का विस्तार करेंगे और SAMHD1 के अवरोधकों, सक्रियकर्ताओं और सब्सट्रेट की पहचान के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट उत्तरदायी सेटअप में इसकी प्रयोज्यता का प्रदर्शन करेंगे।

Protocol

नीचे दिए गए तरीकों का एक योजनाबद्ध अवलोकन चित्रा 1 में दर्शाया गया है और सामग्री और अभिकर्मकों की एक विस्तृत सूची सामग्री की तालिका में उपलब्ध है।

1. परख बफ़र्स की तैयारी।

  1. स्टॉक बफ़र्स की तैयारी।
    नोट: चूंकि परख फॉस्फेट का पता लगाने के प्रति संवेदनशील है, जो आम हो सकता है, संदूषण से बचने के लिए अल्ट्राप्योर या डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ कांच के बने पदार्थ को तीन बार कुल्ला। सभी बफ़र्स को कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. पीएच 8 और अंतिम मात्रा को समायोजित करने से पहले लगभग 800 एमएल पानी में 4.5 ग्राम ट्रिस एसीटेट, 2.3 ग्राम एनएसीएल, और 0.2 ग्राम एमजीसीएलको भंग करके एसएएमएचडी 1 प्रतिक्रिया बफर (आरबी) स्टॉक समाधान (25 एमएम ट्रिस-एसीटेट पीएच 8, 40 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2) के 1 एल तैयार करें।
    2. 0.5 एम टीसीईपी के 1 एमएल को 4 एमएल पानी में पतला करके 0.1 एम टीसीईपी स्टॉक समाधान के 5 एमएल तैयार करें।
    3. 44.5 एमएल पानी में 100% ट्वीन -20 के 5 एमएल को पतला करके 11% ट्वीन -20 स्टॉक समाधान के 50 एमएल तैयार करें।
      नोट: ट्वीन -20 प्रकाश संवेदनशील है।
    4. पीएच 8 और अंतिम मात्रा में समायोजित करने से पहले लगभग 40 एमएल पानी में 9.3 ग्राम ईडीटीए को भंग करके 0.5 एम ईडीटीए स्टॉप समाधान के 50 एमएल तैयार करें।
    5. एक भूरे रंग की कांच की बोतल में 300 एमएल पानी में धीरे-धीरे 60 एमएल केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड जोड़कर मैलाकाइट ग्रीन (एमजी) स्टॉक समाधान (एच2एसओ4 में 3.2 मिमी मैलाकाइट हरा) तैयार करें। आरटी के समाधान को ठंडा करें और 0.44 ग्राम मैलाकाइट हरे रंग को भंग करें।
      सावधानी: पानी के साथ सल्फ्यूरिक एसिड की प्रतिक्रिया एक्सोथर्मिक है और इसलिए बोतल गर्म हो सकती है जिससे दबाव का निर्माण हो सकता है; सुनिश्चित करें कि यह दबाव बार-बार जारी किया जाता है।
      नोट: परिणामस्वरूप नारंगी समाधान प्रकाश संवेदनशील (इसलिए भूरे रंग की बोतल) और आरटी पर कम से कम 1 वर्ष के लिए स्थिर है।
    6. 50 एमएल पानी में 3.75 ग्राम अमोनियम मोलिब्डेट को भंग करके 7% अमोनियम मोलिब्डेट स्टॉक समाधान के 50 एमएल तैयार करें।
      नोट: वेग समय के साथ बन सकता है, सुनिश्चित करें कि केवल सतह पर तैरनेवाला का उपयोग किया जाता है।
  2. पूर्ण परख बफ़र्स की तैयारी
    नोट: यह प्रयोग के दिन किया जाना चाहिए
    1. पूर्ण SAMHD1 आरबी (25 मिमी Tris-एसीटेट पीएच 8, 40 मिमी NaCl, 1 मिमी MgCl2, 0.3 मिमी TCEP, 0.005% ट्वीन-20) तैयार करें। पहले से तैयार 11% ट्वीन-20 और 0.1 एम टीसीईपी स्टॉक का उपयोग इन घटकों को ट्वीन-20 के लिए 0.005% और टीसीईपी के लिए 0.3 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर एसएएमएचडी 1 आरबी स्टॉक में जोड़ने के लिए करें।
    2. EDTA रोक समाधान (25 मिमी Tris-एसीटेट पीएच 8, 40 मिमी NaCl, 1 मिमी MgCl2, 0.3 मिमी TCEP, 0.005% ट्वीन-20, 7.9 मिमी EDTA) तैयार करें। SAMHD1 RB को पूरा करने के लिए, EDTA को 7.9 मिमी की अंतिम एकाग्रता में जोड़ने के लिए 0.5 M EDTA स्टॉक समाधान का उपयोग करें।
    3. एमजी स्टॉक समाधान के 10 भागों को 7% अमोनियम मोलिब्डेट के 2.5 भागों और 11% ट्वीन -20 के 0.2 भागों के साथ मिलाकर एमजी कार्यशील समाधान (2.5 मिमी मैलाकाइट ग्रीन, 1.4% अमोनियम मोलिब्डेट, 0.18% ट्वीन -20) तैयार करें।

2. SAMHD1 अवरोध परख और यौगिक IC50 का निर्धारण

नोट: अंतिम परख की स्थिति तालिका 1 में दिखाई गई है।

  1. परख प्लेट में यौगिकों की तैयारी
    नोट: छोटे आणविक भार यौगिकों को आमतौर पर पानी में 100% डीएमएसओ और न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स में भंग कर दिया जाता है। स्टॉक एकाग्रता 10 से 100 मिमी तक होती है और परख के डीएमएसओ सहिष्णुता के साथ-साथ यौगिकों की शक्ति और घुलनशीलता से प्रभावित होती है। जांचें कि प्रतिक्रिया में अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता 1% से अधिक नहीं है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एंजाइम गतिविधियां इस विलायक से प्रभावित नहीं हैं। प्रयोग से पहले विलायक को परख की सहनशीलता का परीक्षण करना अच्छा अभ्यास है।
    1. प्रासंगिक विलायक में 100x अंतिम एकाग्रता पर क्रमिक रूप से पतला परीक्षण यौगिकों को तैयार करें (उदाहरण के लिए, छोटे अणुओं के लिए 100% डीएमएसओ या न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स के लिए पानी) एक स्पष्ट गोल-तल वाले पॉलीप्रोपाइलीन 96-वेल प्लेट में या तो एक मल्टीचैनल पिपेट या स्वचालित तरल हैंडलिंग उपकरण का उपयोग करके।
      नोट: यौगिक स्थिरता के आधार पर, कमजोर पड़ने प्लेटों को अग्रिम में तैयार किया जा सकता है, सील किया जा सकता है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्लेटों प्रोटोकॉल जारी रखने से पहले आरटी को संतुलित करने के लिए अनुमति दें.
    2. पूर्ण SAMHD1 आरबी का उपयोग करना, यौगिकों को 25x अंतिम एकाग्रता (1% से नीचे अंतिम विलायक एकाग्रता बनाए रखने के लिए) को पतला करें और एक स्पष्ट 384-अच्छी तरह से फ्लैट-तल परख प्लेट के उपयुक्त कुओं में 5 माइक्रोन स्थानांतरित करें। विलायक-केवल नियंत्रण नमूनों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।
  2. प्रतिक्रिया घटकों की तैयारी
    नोट: यह परख के दिन किया जाना चाहिए। पुनः संयोजक मानव SAMHD1 और ई. कोलाई pyrophosphatase (PPase) aliquots भंडारण बफर में क्रमशः 9.1 mg/mL और 23.0 mg/mL पर पतला -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत कर रहे हैं (20 मिमी HEPES पीएच 7.5, 300 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 2 मिमी TCEP). एक बार पिघलने के बाद, विभाज्य -20 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक संग्रहीत किए जाते हैं।
    1. पुनः संयोजक मानव SAMHD1 प्रोटीन और पुनः संयोजक PPase को पूर्ण SAMHD1 RB में 4x वांछित अंतिम एकाग्रता में पतला करके एंजाइम (SAMHD1/PPase) मास्टर मिक्स तैयार करें, इस प्रकार 1.4 माइक्रोन SAMHD1 और 50 U/mL PPase करें।
    2. पूर्ण SAMHD1 RB से 2x अंतिम एकाग्रता में dGTP स्टॉक (आमतौर पर पानी में 10 या 100 मिमी) को पतला करके एक्टिवेटर/सब्सट्रेट dGTP तैयार करें, इस प्रकार 50 माइक्रोन dGTP।
  3. परख करें
    नोट: सभी परख घटकों को आरटी के बराबर किया जाना चाहिए। तरल परिवर्धन या तो एक मल्टीचैनल विंदुक या एक थोक अभिकर्मक तरल मशीन के साथ किया जा सकता है।
    1. 384-अच्छी तरह से परख प्लेट में यौगिक कमजोर पड़ने और विलायक केवल नियंत्रण होता है, एसएएमएचडी 1 / पीपीसे मास्टर मिश्रण के 5 माइक्रोन वितरित करें। कोई एंजाइम नियंत्रण कुओं के लिए, पूर्ण SAMHD1 आरबी के 5 माइक्रोन बांटना। आरटी पर 10 मिनट के लिए पूर्व-इनक्यूबेट एंजाइम और यौगिक।
    2. सभी कुओं के लिए, प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए 2x डीजीटीपी समाधान के 10 माइक्रोन वितरित करें।
    3. आरटी पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं.
    4. सभी कुओं के लिए 20 μL EDTA स्टॉप समाधान देकर प्रतिक्रिया बंद करो।
      नोट: प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है अगर वांछित.
    5. सभी कुओं के लिए 10 माइक्रोन एमजी काम कर रहे समाधान जोड़ें।
      सावधानी: एमजी वर्किंग सॉल्यूशन में सल्फ्यूरिक एसिड होता है।
    6. 1 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर एक कक्षीय माइक्रोवेल प्लेट शेकर और सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अच्छी तरह से सामग्री का मिश्रण सुनिश्चित करें।
    7. आरटी पर 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
    8. एक माइक्रोवेल प्लेट रीडर में 630 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण पढ़ें।
  4. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण
    1. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं के औसत और मानक विचलन की गणना करें (विलायक के साथ सकारात्मक, पूर्ण प्रतिक्रिया; नकारात्मक, विलायक के साथ अकेले डीजीटीपी)। परख गुणवत्ता के संकेतक के रूप में जेड-फैक्टर37 की गणना करें।
    2. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के औसत मूल्यों के लिए प्रत्येक अवशोषण मूल्य को सामान्य करें, सकारात्मक नियंत्रण को 100% SAMHD1 गतिविधि और नकारात्मक नियंत्रण को 0% SAMHD1 गतिविधि के रूप में सेट करें।
    3. यौगिक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में SAMHD1 गतिविधि (%) प्लॉट करें और चार-पैरामीटर चर ढलान खुराक-प्रतिक्रिया वक्र फिट करें, जिससे यौगिक आईसी50 का निर्धारण हो सके।

3. SAMHD1 उत्प्रेरक और सब्सट्रेट स्क्रीन

नोट: अंतिम परख की स्थिति तालिका 2में दिखाई गई है। पुनः संयोजक SAMHD1 और PPase aliquots -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण बफर में क्रमशः 9.1 मिलीग्राम / एमएल और 23.0 मिलीग्राम / एमएल पर पतला -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के लिए भंडारित कर रहे हैं (20 मिमी HEPES पीएच 7.5, 300 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 2 मिमी TCEP) -80 डिग्री सेल्सियस पर. एक बार पिघलने के बाद, विभाज्य -20 डिग्री सेल्सियस पर अल्पावधि संग्रहीत किए जाते हैं।

  1. परख प्लेट में न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स की तैयारी
    1. न्यूक्लियोटाइड एनालॉग स्टॉक (आमतौर पर पानी में 10 या 100 मिमी) को पूर्ण एसएएमएचडी 1 आरबी में 4x अंतिम एकाग्रता के लिए, हमारे मामले में 800 माइक्रोन न्यूक्लियोटाइड एनालॉग, और 384-अच्छी परख प्लेट के उपयुक्त कुओं में 5 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
  2. प्रतिक्रिया घटकों की तैयारी
    नोट: यह परख के दिन किया जाना चाहिए
    1. पुनः संयोजक मानव SAMHD1 प्रोटीन और पुनः संयोजक ई कोलाई PPase को पूर्ण SAMHD1 RB में 2x वांछित अंतिम एकाग्रता में पतला करके एंजाइम (SAMHD1/PPase) मास्टर मिक्स तैयार करें, इस प्रकार 0.7 माइक्रोन SAMHD1 और 25 U/mL PPase ।
    2. पूर्ण SAMHD1 RB में पुनः संयोजक E. coli PPase को 2x वांछित अंतिम एकाग्रता में पतला करके अकेले PPase समाधान तैयार करें, इस प्रकार 25 U/mL PPase करें।
    3. एक्टिवेटर GTP (AS1) और dGTPαS (AS1 और AS2) को पतला करने वाले स्टॉक (आमतौर पर पानी में 10 या 100 मिमी) को पूर्ण SAMHD1 RB से 4x अंतिम एकाग्रता में तैयार करें, इस प्रकार 50 माइक्रोन GTP या dGTPαS।
  3. परख करें
    नोट: सभी परख घटकों को आरटी के बराबर किया जाना चाहिए। तरल परिवर्धन या तो एक मल्टीचैनल विंदुक या एक थोक अभिकर्मक तरल मशीन के साथ किया जा सकता है।
    1. न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स युक्त 384-अच्छी परख प्लेट के लिए, एक्टिवेटर (या तो जीटीपी या डीजीटीपीαएस) के 5 माइक्रोन वितरित करें या उपयुक्त कुओं को एसएएमएचडी 1 आरबी पूरा करें।
    2. SAMHD1/PPase मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोन, अकेले PPase, या उपयुक्त कुओं को SAMHD1 RB पूरा करके प्रतिक्रिया शुरू करें।
    3. आरटी पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं.
    4. सभी कुओं के लिए 20 μL EDTA स्टॉप समाधान देकर प्रतिक्रिया को रोकें।
      नोट: प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है अगर वांछित.
    5. सभी कुओं के लिए 10 माइक्रोन एमजी काम कर रहे समाधान जोड़ें।
      सावधानी: एमजी वर्किंग सॉल्यूशन में सल्फ्यूरिक एसिड होता है।
    6. 1 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर एक कक्षीय माइक्रोवेल प्लेट शेकर और सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अच्छी तरह से सामग्री का मिश्रण सुनिश्चित करें।
    7. आरटी पर 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
    8. एक माइक्रोवेल प्लेट रीडर में 630 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण पढ़ें।
  4. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण
    1. PPase केवल प्रतिक्रिया कुओं (नकारात्मक नियंत्रण या पृष्ठभूमि संकेत) के लिए औसत अवशोषण मूल्यों की गणना.
      नोट: SAMHD1 एलोस्टेरिक एक्टिवेटर और सब्सट्रेट के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, dGTP को प्लेट में शामिल किया जा सकता है। इस मामले में, आप परख गुणवत्ता के संकेतक के रूप में जेड-फैक्टर की गणना करने के लिए इस स्थिति का उपयोग कर सकते हैं।
    2. SAMHD1/PPase प्रतिक्रियाओं में संबंधित कुओं से पृष्ठभूमि मान घटाएं।
    3. प्लॉट ने बफर, GTP और dGTPαS स्थितियों के साथ प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एनालॉग के लिए सही अवशोषण मूल्यों को सही किया।

Representative Results

चित्रा 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल dNTPase SAMHD1 के साथ छोटे अणुओं की बातचीत की जांच करने के लिए एंजाइम-युग्मित मैलाकाइट ग्रीन परख का उपयोग करने के लिए बुनियादी वर्कफ़्लो का वर्णन करता है और विभिन्न जैव रासायनिक प्रश्नों से पूछताछ करने के कई तरीकों से अनुकूलित किया जा सकता है। नीचे पैराग्राफ में चर्चा किए गए प्रतिनिधि परिणामों में, हम एसएएमएचडी 1 की ओर छोटे अणुओं के निरोधात्मक गुणों को निर्धारित करने के लिए इस परख का उपयोग करने के उदाहरणों का वर्णन करते हैं और यह जांचने के लिए कि क्या विभिन्न न्यूक्लियोटाइड एनालॉग इस एंजाइम के सब्सट्रेट और / या सक्रियकर्ता हैं।

चित्रा 2 में दिखाए गए परिणाम इस परख के कई मूल सिद्धांतों को दर्शाते हैं। मैलाकाइट ग्रीन रिएजेंट एक फॉस्फोमोलिब्डेट मैलाकाइट ग्रीन कॉम्प्लेक्स के गठन के माध्यम से अकार्बनिक फॉस्फेट के वर्णमिति का पता लगाने की अनुमति देता है, और तदनुसार, इस दृष्टिकोण को एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है जिसका उत्पाद फॉस्फेट है। मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट का पता लगाने के लिए इस विधि की संवेदनशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, चित्रा 2 ए मैलाकाइट हरे अभिकर्मक के साथ 20 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद ना3पीओ4 की बढ़ती सांद्रता के साथ प्राप्त अवशोषण मूल्यों को दर्शाता है। जबकि संकेत 0.25 एमएम एनए3पीओ4 पर संतृप्ति तक पहुंचता है, फॉस्फेट की रैखिक पहचान सीमा 0.004 से 0.03 मिमी(चित्रा 2ए, दाएं पैनल) तक दिखाई देती है, अन्य अध्ययनों के साथ समझौते में जो फॉस्फेट रैखिक सीमा तक की सूचना दी गई है मैलाकाइट हरी परख38 का उपयोग करके 10-20 माइक्रोन।

SAMHD1 एक dNTPase है जो एक dNTP अणु को हाइड्रोलाइज़ करते समय अकार्बनिक ट्राइफॉस्फेट छोड़ता है, और इस प्रकार मैलाकाइट ग्रीन द्वारा पता लगाने के लिए मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट उत्पन्न करने के लिए, एक युग्मन एंजाइम की आवश्यकता होती है। ई कोलाई से अकार्बनिक पायरोफॉस्फेट (पीपीएएसई) को इस उद्देश्य के लिए उपयोगी दिखाया गया है, दोनों एसएएमएचडी 1 7,20 के संबंध में, लेकिन अन्य न्यूक्लियोटाइड चयापचय एंजाइम30,33,35 भी। इसके अतिरिक्त, SAMHD1 एक सक्रिय dNTPase है जब एक होमोटेट्रामर के रूप में, और इसके लिए (d) NTPs द्वारा एलोस्टेरिक सक्रियण की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से AS1 पर एक ग्वानिन ट्राइफॉस्फेट (GTP या dGTP) और AS2 पर कोई dNTP। इसके बाद, उत्प्रेरक साइट सब्सट्रेट बाइंडिंग के लिए सुलभ हो जाती है और एंजाइमी प्रतिक्रिया होती है। चूंकि dGTP AS1 और AS2 के लिए बाध्यकारी आवश्यकताओं को पूरा करता है, और एक सब्सट्रेट है, निषेध परख में इस न्यूक्लियोटाइड का उपयोग वर्कफ़्लो को बहुत सरल करता है। चित्रा 2 बी 630 एनएम पर अवशोषण में वृद्धि से संकेत औसत दर्जे का SAMHD1 गतिविधि को प्राप्त करने के लिए विभिन्न परख घटकों की आवश्यकता को दर्शाता है। न तो SAMHD1 और न ही PPase अकेले dGTP की उपस्थिति में अकार्बनिक फॉस्फेट उत्पन्न करने में सक्षम हैं, इन एंजाइमों की प्रलेखित गतिविधियों के अनुरूप। हालांकि, जिस स्थिति में सभी परख घटक मौजूद हैं (SAMHD1, PPase, और dGTP एक्टिवेटर/सब्सट्रेट) हम सिग्नल में वृद्धि देखते हैं। यहां दिखाए गए उदाहरण का Z कारक37 (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई एंजाइम + dGTP और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में SAMHD1/PPase + dGTP लेना) 0.74 था, जो एक मजबूत परख का संकेत देता है।

एंजाइम-युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख के संभावित अनुप्रयोगों में से एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (HTS) के माध्यम से अवरोधकों की पहचान है। इस प्रकार, इस रिपोर्ट में, हम पहले से ही साहित्य में वर्णित यौगिकों की एक विविध सेट का उपयोग कर इस परख में SAMHD1 निषेध का पता लगाने की सत्यापित. सीमोन एट अल ने एसएएमएचडी 1 की ओर विहित न्यूक्लियोसाइड्स के खुराक पर निर्भर निषेध का मूल्यांकन किया, जैसा कि यहां दिखाया गया है, और पाया कि डीऑक्सीगुआनोसिन (डीजीयूओ) एकमात्र विहित न्यूक्लियोसाइड था जो एसएएमएचडी 1 को काफी बाधित करने में सक्षम था, जिसमें आईसी50 मूल्य 488 माइक्रोन20 था। प्रत्यक्ष b4NPP परख के साथ प्रदर्शन की गई FDA-अनुमोदित दवाओं के एक HTS ने कई हिट का खुलासा किया जो माइक्रोमोलर सांद्रता में SAMHD1 गतिविधि को रोकते थे, जिसमें से लोमोफुंगिन अणु था जो इन विट्रो में SAMHD1 dNTPase गतिविधि को सबसे अधिक शक्तिशाली रूप से रोकता था, सब्सट्रेट21 के रूप में dGTP की उपस्थिति में निर्धारित होने पर 20.1 माइक्रोन का IC50 प्रदर्शित करता है. इसके अतिरिक्त, चार α,β-imido-dNTP एनालॉग्स को MDCC-PBP सेंसर और SAMHD1 का उपयोग करके SAMHD1 के प्रतिस्पर्धी अवरोधकों के रूप में भी पहचाना गया है, जो Ppx गतिविधि के लिए युग्मित है, जिससे पता चला है कि dNMPNPP एनालॉग्स के निरोधात्मक स्थिरांक कम माइक्रोमोलर / उच्च नैनोमोलर रेंज 6,22 में थे। इस प्रकार, यह प्रदर्शित करने के लिए कि एंजाइम-युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख का उपयोग SAMHD1 अवरोधकों, dGuo, lomofungin और 2'-deoxythymidine-5'- [(α,β)-imido] ट्राइफॉस्फेट (dTMPNPP) की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, तकनीक को मान्य करने के लिए उपयोग किया गया था। चित्रा 3 ए इन यौगिकों के लिए प्राप्त खुराक-प्रतिक्रिया घटता दिखाता है, यह दर्शाता है कि बढ़ती सांद्रता एसएएमएचडी 1 गतिविधि को प्रभावी ढंग से रोकती है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों (± मानक विचलन) से इन अणुओं के लिए प्राप्त औसत आईसी50 मान निम्नानुसार थे: डीजीयूओ = 361.9 ± 72.8 माइक्रोन, लोमोफुंगिन 6.78 ± 3.9 माइक्रोन, और डीटीएमपीएनपीपी = 2.10 ± 0.9 माइक्रोन। नकारात्मक परिणाम के एक उदाहरण के रूप में, एसएएमएचडी 1 गतिविधि पर हाइड्रोक्सीयूरिया (एचयू) का प्रभाव भी निर्धारित किया गया था। एचयू राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस का अवरोधक है, और, हालांकि यह विभिन्न एएमएल मॉडल में एसएएमएचडी 1 एआर-सीटीपीस गतिविधि को सीमित करता है, एसएएमएचडी 1 पर एचयू के प्रभाव अप्रत्यक्ष दिखाए गए थे और एसएएमएचडी 118 के एलोस्टेरिक विनियमन को परेशान करने पर भरोसा करते हैं। एचयू की खुराक प्रतिक्रिया वक्र चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, और एचयू खुराक बढ़ाने के साथ एसएएमएचडी 1 गतिविधि में कोई बदलाव नहीं देखा गया था, यह दर्शाता है कि एचयू इन विट्रो में एसएएमएचडी 1 गतिविधि को बाधित नहीं करता है।

एंजाइम युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख का एक अन्य उपयोग यह पूछताछ करना है कि क्या न्यूक्लियोटाइड और उनके एनालॉग इस एंजाइम के सब्सट्रेट और/या एलोस्टेरिक एक्टिवेटर हैं, जो चित्र 4में सचित्र है। इस प्रयोग में, विहित न्यूक्लियोटाइड्स, साथ ही कई एंटी-कैंसर न्यूक्लियोसाइड एनालॉग्स के सक्रिय चयापचयों, जैसे कि साइटाराबाइन (आरा-सीटीपी), क्लोफराबाइन (सीएल-एफ-आरा-एटीपी), और जेमिसिटाबाइन (डीएफ-डीसीटीपी), को एसएएमएचडी 1 सब्सट्रेट और एक्टिवेटर के रूप में परीक्षण किया गया था। SAMHD1 के जटिल एलोस्टेरिक विनियमन के कारण, प्रतिक्रिया GTP की उपस्थिति में AS1 उत्प्रेरक या गैर-हाइड्रोलिसिबल dGTP एनालॉग 2'-deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) के रूप में की जाती है, जो AS1 और AS2 पर कब्जा कर सकती है। परीक्षण किए गए न्यूक्लियोटाइड एनालॉग और जीटीपी की उपस्थिति में एसएएमएचडी 1 गतिविधि इंगित करती है कि न्यूक्लियोटाइड माध्यमिक एलोस्टेरिक साइट और उत्प्रेरक साइट (यानी, एएस 2 उत्प्रेरक और सब्सट्रेट) को बांधने में सक्षम है, जबकि न्यूक्लियोटाइड एनालॉग और डीजीटीपी के साथ एसएएमएचडी 1 गतिविधि इंगित करती है कि न्यूक्लियोटाइड केवल उत्प्रेरक साइट (यानी, केवल एक सब्सट्रेट) पर कब्जा कर सकता है। यदि न्यूक्लियोटाइड AS1 और AS2 दोनों एलोस्टेरिक साइटों और उत्प्रेरक साइट से बांधने में सक्षम है, तो SAMHD1 अकेले न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति में सक्रिय होगा, जैसा कि dGTP के मामले में दिखाया गया है। परिणाम बताते हैं कि सभी विहित dNTPs AS2 साइट और उत्प्रेरक साइट से जुड़ने में सक्षम हैं। न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स के मामले में, क्लोफराबाइन ट्राइफॉस्फेट एक AS2 एक्टिवेटर और एक सब्सट्रेट है, जबकि साइटाराबाइन ट्राइफॉस्फेट केवल उत्प्रेरक साइट पर कब्जा करने में सक्षम है। दूसरी ओर, जेमिसिटाबाइन ट्राइफॉस्फेट के साथ कोई गतिविधि नहीं देखी गई थी, यह सुझाव देते हुए कि परीक्षण की गई शर्तों के तहत जेमिसिटाबाइन ट्राइफॉस्फेट एलोस्टेरिक प्रभावक और न ही सब्सट्रेट के रूप में कार्य करने में सक्षम है। हालांकि यह परिणाम पिछले भविष्यवाणियों9 के अनुरूप है, बाद में क्रिस्टलीकरण और गतिज अध्ययन10 से पता चला है कि जेमसिटाबाइन ट्राइफॉस्फेट एसएएमएचडी 1 उत्प्रेरक जेब को बांधने में सक्षम है, और यह वास्तव में एंजाइम का सब्सट्रेट है। हालांकि, बाद के अध्ययन10 में, लेखक बताते हैं कि हाइड्रोलिसिस दर अन्य रिपोर्ट किए गए सब्सट्रेट, जैसे कि साइटाराबाइन ट्राइफॉस्फेट की तुलना में काफी कम है, इस प्रकार यह समझाते हुए कि हम इस स्क्रीनिंग सेटअप के साथ इसका निरीक्षण क्यों नहीं कर पाए।

कुल मिलाकर, ये प्रतिनिधि परिणाम SAMHD1 अवरोधकों, एलोस्टेरिक नियामकों और सब्सट्रेट की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एक मजबूत तकनीक के रूप में एंजाइम युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख के उपयोग को मान्य करते हैं। हालांकि, सभी प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के समान, इस विधि में इसकी चेतावनी है, और इसलिए ऑर्थोगोनल परख (उदाहरण के लिए, एक अलग परख तकनीक का उपयोग करके) का उपयोग निष्कर्षों को और अधिक मान्य करने के लिए किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एंजाइम युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख. (ए) मैलाकाइट हरे परख में ना3पीओ4 मानक वक्र। ना3पीओ4 सीरियल कमजोर पड़ने (2 गुना) तीन प्रतियों में 1 मिमी से 0.004 मिमी तक तैयार किया गया था और 20 मिनट के लिए मैलाकाइट हरे अभिकर्मक के साथ ऊष्मायन किया गया था। परीक्षण किए गए सांद्रता की पूरी श्रृंखला पर कच्चे अवशोषण मान बाएं पैनल में और दाएं पैनल में रैखिक सीमा में दिखाए जाते हैं। दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि दिखाए गए। (बी) एंजाइम युग्मित गतिविधि परख का सत्यापन। SAMHD1 (0.35 माइक्रोन) और/या PPase (12.5 U/mL) एक्टिवेटर/सब्सट्रेट dGTP (25 माइक्रोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एंजाइम-युग्मित गतिविधि परख में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किए गए थे। प्लॉट किए गए कच्चे अवशोषण मूल्यों के साथ दिखाए गए दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि से चौगुनी, सलाखों, और त्रुटि सलाखों का मतलब और एसडी इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एंजाइम युग्मित गतिविधि परख में SAMHD1 निषेध के लिए यौगिकों का मूल्यांकन. लोमोफंगिन (0.78-100 माइक्रोन), 2'-डीऑक्सीथाइमिडीन -5'- [(α,β)-इमिडो] ट्राइफॉस्फेट (डीटीएमपीएनपीपी, 0.01-100 माइक्रोन) और डीऑक्सीगुआनोसिन (डीजीयूओ, 10-1,500 माइक्रोन) (ए) या हाइड्रोक्सीयूरिया (एचयू) (0.78-100 माइक्रोन) (बी) की खुराक प्रतिक्रिया एंजाइम-युग्मित एसएएमएचडी 1 गतिविधि परख में डीटीटीपी (25 माइक्रोन) के साथ एक्टिवेटर/सब्सट्रेट के रूप में। दिखाए गए तीन प्रयोगों के प्रतिनिधि के साथ प्लॉट किए गए व्यक्तिगत प्रतिकृति (DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100% गतिविधि, DMSO + dGTP = 0% गतिविधि) से प्रतिक्रिया नियंत्रण के सापेक्ष प्रतिशत गतिविधि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एंजाइम युग्मित गतिविधि परख में SAMHD1 allosteric सक्रियकर्ताओं और substrates के रूप में न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स का मूल्यांकन. एंटीकैंसर ड्रग्स साइटाराबाइन (आरा-सीटीपी), क्लोफराबाइन (सीएल-एफ-एआरए-एटीपी), और जेमिसिटाबाइन (डीएफ-डीसीटीपी) के कैनोनिकल न्यूक्लियोटाइड्स और चयनित ट्राइफॉस्फेट मेटाबोलाइट्स का परीक्षण एंजाइम-युग्मित एसएएमएचडी 1 गतिविधि परख में 200 माइक्रोन पर जीटीपी या गैर-हाइड्रोलिसिबल डीजीटीपी एनालॉग डीजीटीपी (12.5 माइक्रोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया गया था। व्यक्तिगत प्रयोगात्मक प्रतिकृति प्लॉटेड, मतलब और एसडी से सामान्यीकृत अवशोषण मूल्यों का संकेत दिया जाता है। दिखाए गए दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि, हमारे पिछले अध्ययनसे अनुकूलित 7. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कहीं जाना अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम डिस्पेंस्ड (μL) अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा (μL) एकाग्रता तिरस्कृत प्रतिक्रिया में मोड़ो कमजोर पड़ने प्रतिक्रिया में अंतिम एकाग्रता
1 अवरोधक 5 20 0.4 मिमी 4 0.1 मिमी
2 SAMHD1 + PPase मिश्रण 5 1.4 माइक्रोन एसएएमएचडी 1, 50 यू / एमएल पीपीसे 4 0.35 माइक्रोन एसएएमएचडी 1, 12.5 यू / एमएल पेसे
3 डीजीटीपी 10 50 माइक्रोन 2 25 माइक्रोन
4 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन
5 EDTA समाधान 20 40 7.9 मिमी 2 3.95 मिमी
6 एमजी अभिकर्मक 10 50 2.5 मिमी मैलाकाइट हरा, 64.4 मिमी अमोनियम मोलिब्डेट, 0.18% ट्वीन-20 5 0.5 मिमी मैलाकाइट हरा, 12.9 मिमी अमोनियम मोलिब्डेट, 0.036% ट्वीन-20
7 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन
8 पढ़ें @ 630 एनएम

तालिका 1: अवरोधक स्क्रीनिंग के लिए एंजाइम-युग्मित परख में अंतिम स्थितियों का सारांश।

कहीं जाना अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम डिस्पेंस्ड (μL) अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा (μL) एकाग्रता तिरस्कृत प्रतिक्रिया में मोड़ो कमजोर पड़ने प्रतिक्रिया में अंतिम एकाग्रता
1 एलोस्टेरिक नियामक 5 20 800 माइक्रोन 4 200 माइक्रोन
2 GTP या dGTPαS 5 50 माइक्रोन 4 12.5 माइक्रोन
3 SAMHD1 और/या PPase 10 0.7 माइक्रोन एसएएमएचडी 1, 25 यू / एमएल पीपीसे 2 0.35 माइक्रोन एसएएमएचडी 1, 12.5 यू / एमएल पीपीसे
4 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन
5 EDTA समाधान 20 40 7.9 मिमी 2 3.95 मिमी
6 एमजी अभिकर्मक 10 50 2.5 मिमी मैलाकाइट हरा, 64.4 मिमी अमोनियम मोलिब्डेट, 0.18% ट्वीन-20 5 0.5 मिमी मैलाकाइट हरा, 12.9 मिमी अमोनियम मोलिब्डेट, 0.036% ट्वीन-20
7 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन
8 पढ़ें @ 630 एनएम

तालिका 2: एलोस्टेरिक नियामकों स्क्रीनिंग के लिए एंजाइम-युग्मित परख में अंतिम स्थितियों का सारांश

Discussion

यहां विस्तृत एंजाइम-युग्मित गतिविधि परख एक उच्च-थ्रूपुट-एमेबल वर्णमिति परख है जो एसएएमएचडी 1 द्वारा डीएनटीपी हाइड्रोलिसिस के अप्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है। यह विधि ई कोलाई से अकार्बनिक पीपीए की क्षमता का शोषण करती है, जो प्रतिक्रिया मिश्रण में अधिक मात्रा में शामिल होने पर, एसएएमएचडी 1 द्वारा उत्पन्न प्रत्येक अकार्बनिक ट्राइफॉस्फेट को तीन व्यक्तिगत मुक्त फॉस्फेट में परिवर्तित करती है जिसे सरल और किफायती मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जा सकती है। हम इस परख को 384 माइक्रोवेल प्लेट प्रारूप में प्रदान करते हैं, जो यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है, और SAMHD1 अवरोधकों, सक्रियकर्ताओं और सब्सट्रेट की पहचान और लक्षण वर्णन में इस तकनीक की प्रयोज्यता और बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करता है।

इन विट्रो जैव रासायनिक स्क्रीनिंग परख में सभी के साथ के रूप में, महत्वपूर्ण कदम और महत्वपूर्ण विचार के एक नंबर रहे हैं, और इनमें से कई स्वतंत्र रूप से उपलब्ध परख मार्गदर्शन मैनुअल39 में गहराई से चर्चा कर रहे हैं. शुद्ध पुनः संयोजक एंजाइमों की अखंडता, दोनों SAMHD1 और युग्मित एंजाइम अकार्बनिक PPase, अत्यंत महत्वपूर्ण है, और परख स्थापित करने से पहले पुष्टि की जानी चाहिए। और तदनुसार, इन एंजाइमों के प्रत्येक नए शुद्धिकरण बैच परीक्षण के कुछ स्तर के अधीन होना चाहिए, क्योंकि बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता परिणामों में विसंगतियों का परिचय दे सकती है। आदर्श रूप से, एचपीएलसी जैसे ऑर्थोगोनल प्रत्यक्ष परख का उपयोग, जो सब्सट्रेट और प्रतिक्रिया उत्पाद दोनों का पता लगाने की अनुमति देता है, का उपयोग शुद्ध पुनः संयोजक एसएएमएचडी 1 की डीएनटीपी ट्राइफॉस्फोहाइड्रोलेज़ गतिविधि को सत्यापित करने के लिए किया जाना चाहिए।

इस परख की सीमाओं के संबंध में, सिद्धांत यह है कि यह SAMHD1 की dNTPase गतिविधि को अप्रत्यक्ष तरीके से मापता है, अकार्बनिक PPase की गतिविधि का शोषण करता है, जिसके कई निहितार्थ हैं। यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि परख में उपयोग किए जाने वाले न्यूक्लियोटाइड्स की ओर पीपीएएस के पास बहुत कम या कोई गतिविधि नहीं है, और इसी तरह, पहचाने गए निरोधात्मक छोटे अणुओं में पीपीएज की ओर कोई गतिविधि नहीं है। इस प्रकार, स्क्रीनिंग के संबंध में, पीपीएएसई के खिलाफ एक काउंटर-स्क्रीन एक महत्वपूर्ण विचार हो सकता है। प्रतिक्रिया में PPase की उपस्थिति भी निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए एक ऑर्थोगोनल परख का उपयोग करना महत्वपूर्ण बनाती है। प्रत्यक्ष गतिविधि परख के संबंध में, उनमें से कई को आज तक सूचित किया गया है, जिसमें टीएलसी 9,20,23 और एचपीएलसी 9,21 शामिल हैं, जो सब्सट्रेट थकावट और उत्पाद गठन का सटीक पता लगाते हैं। इसके अतिरिक्त, b4NPP परख21, जो उच्च-थ्रूपुट भी है, का उपयोग संभावित अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, सब्सट्रेट या एलोस्टेरिक एक्टिवेटर का परीक्षण करना आदर्श नहीं है। बायोफिजिकल परख, जैसे कि डिफरेंशियल स्कैनिंग फ्लोरिमेट्री (डीएसएफ), जिसे हमने पहले एसएएमएचडी 118 के साथ रिपोर्ट किया है, लिगेंड की पहचान करने और उन्हें चिह्नित करने में विशेष रूप से शक्तिशाली हो सकता है। परख की एक और सीमा, विशेष रूप से जैसा कि सबस्ट्रेट्स और एक्टिवेटर की पहचान करने के लिए यहां सेटअप में दिखाया गया है, गैर-हाइड्रोलिसिबल dGTP एनालॉग dGTPαS का उपयोग AS1 और AS2 एक्टिवेटर के रूप में है। हालांकि यह परख में कोई अवलोकन योग्य गतिविधि के साथ SAMHD1 के सक्रियण की अनुमति देता है, dGTPαS SAMHD1 का एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक है, और इस प्रकार उच्च सांद्रता का उपयोग एंजाइम को निष्क्रिय कर देगा। जैसा कि SAMHD1 की हमारी समझ प्रगति करती है, भविष्य के अध्ययन अणुओं का उपयोग कर सकते हैं जो विशेष रूप से SAMHD1 की प्रत्येक साइट पर कब्जा करते हैं, इस प्रकार इस संभावित मुद्दे को नकारते हैं।

जैसा कि हमने यहां दिखाया है, यह विधि बहुमुखी है और इसका उपयोग कई जैव रासायनिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। हमने इस परख के दो रूपों का वर्णन किया है, एक एलोस्टेरिक नियामकों और SAMHD1 के सब्सट्रेट की पहचान के लिए, और दूसरा अवरोधकों के लक्षण वर्णन के लिए, लेकिन आगे अनुकूलन किया जा सकता है। संभावित अवरोधकों के संबंध में, इस परख, माइक्रोवेल प्लेट आधारित किया जा रहा है, यह अच्छी तरह से कार्रवाई अध्ययन39,40 के बहाव तंत्र के लिए अनुकूल बनाता है. इसी तरह, सब्सट्रेट और एलोस्टेरिक नियामकों के आगे लक्षण वर्णन के लिए, इस तकनीक का उपयोग उत्प्रेरण के गतिज मापदंडों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि हमने साइटाराबाइन और क्लोफराबाइन7 के सक्रिय मेटाबोलाइट के लिए किया था। हालांकि, एक दोष यह है कि यहां रिपोर्ट किए गए एंजाइम-युग्मित परख एक समापन बिंदु परख है, और इसलिए, हालांकि स्क्रीनिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, एक निरंतर परख कुछ यंत्रवत अध्ययनों के लिए बेहतर अनुकूल होगा। अर्नोल्ड एट अल ने एक निरंतर एंजाइम-युग्मित परख की सूचना दी जो बायोसेंसर एमडीसीसी-पीबीपी6 का उपयोग करता है, जो कि क्यूमारिन मैलीमाइड (एमडीसीसी) फ्लोरोफोर के साथ लेबल किए गए पेरिप्लाज्मिक फॉस्फेट बाइंडिंग प्रोटीन (पीबीपी) के उपयोग पर निर्भर करता है जो एक मुक्त फॉस्फेट समूह से बंध सकता है। एमडीसीसी-पीबीपी बहुत संवेदनशील है और बहुत कम फॉस्फेट सांद्रता की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है, सेंसर की प्रतिक्रिया का समय मिलीसेकंड से दूसरे टाइमस्केल में होता है।

SAMHD1 मानव स्वास्थ्य और रोग2 में कई महत्वपूर्ण कार्य करता है, जिनमें से कई इंट्रासेल्युलर dNTPस्तरों के रखरखाव में इसकी केंद्रीय भूमिका से जुड़े हो सकते हैं। इस प्रकार, SAMHD1 की dNTPase गतिविधि की ओर एक उच्च गुणवत्ता वाली रासायनिक जांच की पहचान इन लिंक को परिभाषित करने में एक शक्तिशाली उपकरण होगा, और यहां रिपोर्ट किए गए एंजाइम-युग्मित परख को ऐसी जांच की पहचान करने के लिए आसानी से नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूक्लियोसाइड-आधारित दवाओं के रूप में, जिनमें से कई एसएएमएचडी 1 द्वारा संशोधित हैं, चिकित्सीय41 का एक विविध और महत्वपूर्ण समूह हैं; इन उपचारों की प्रभावकारिता बढ़ाने के उद्देश्य से नैदानिक सेटिंग में SAMHD1 को लक्षित करने के लिए रासायनिक जांच को दवाओं में और विकसित किया जा सकता है। एसएएमएचडी 1 के साथ इन न्यूक्लियोसाइड-आधारित यौगिकों की बातचीत की पूरी सीमा को समझना भी महत्वपूर्ण है, एक प्रश्न जिसे इस एंजाइम-युग्मित परख का उपयोग करके भी संबोधित किया जा सकता है। एक साथ लिया, एंजाइम युग्मित SAMHD1 गतिविधि परख के रूप में यहाँ रिपोर्ट की, एक कम लागत वाली, बहुमुखी, उच्च throughput परख है कि इस महत्वपूर्ण एंजाइम की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम सलाह और समर्थन के लिए थॉमस लुंडबैक और थॉमस हेलेडे की प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम का एक हिस्सा करोलिंस्का इंस्टीट्यूट / साइलाइफलैब (http://ki.se/psf) में प्रोटीन साइंस फैसिलिटी द्वारा सुगम बनाया गया था, और हम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनसीआई), कैंसर उपचार और निदान विभाग (डीसीटीडी), और विकासात्मक चिकित्सीय कार्यक्रम (डीटीपी) (http://dtp.cancer.gov) को स्वीकार करते हैं। स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (2018-02114), स्वीडिश कैंसर सोसाइटी (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), स्वीडिश चाइल्डहुड कैंसर फंड (PR2019-0014), और करोलिंस्का इंस्टीट्यूट से SGR को दिए गए अनुदान द्वारा फंडिंग प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) Jena bioscience NU-1001 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) Jena bioscience NU-1002 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) Jena bioscience NU-424 Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay
2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) GE Healthcare 27-1870-04 SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay
2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) Jena bioscience NU-907-1 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) Jena bioscience NU-1004 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) Sigma-Aldrich D0901 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
384 well clear flat-bottom  microplate Thermo Fisher Scientific 262160 Assay plate
96 well clear U-bottom polypropylene  microplate Thermo Fisher Scientific 267245 Compound dilution plate
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Sigma-Aldrich A1343 Reagent required for malachite green working reagent
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) Jena bioscience NU-1170 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) Jena bioscience NU-874 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
Dimethyl sulphoxide (DMSO) VWR 23486.297 Solvent
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E5134 EDTA stop solution component
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) Jena bioscience NU-1607 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Data analysis and visualisation
Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay
His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase  (PPase) Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet - Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green
His-tagged human SAMHD1 Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet - Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate
Hydroxyurea Sigma-Aldrich H8627 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
Lomofungin National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) NSC106995 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670 SAMHD1 reaction buffer component
Malachite green Carbinol hydrochloride Sigma-Aldrich 213020 Malachite green stock component
Microplate Reader Hidex Hidex Sense Microplate reader Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 31434 SAMHD1 reaction buffer component
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 567530 SAMHD1 reaction buffer component
Sodium phosphate (Na3PO4) Sigma-Aldrich 342483 Required for phosphate standard curve
Sulphuric acid 95-97% Sigma-Aldrich 84720 Malachite green stock component
Tris-Acetate salt Sigma-Aldrich T1258 SAMHD1 reaction buffer component
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich C4706 SAMHD1 reaction buffer component
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component

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References

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उच्च-थ्रूपुट एंजाइम-युग्मित गतिविधि परख छोटे अणु इंटरैक्शन DNTPase SAMHD1 न्यूक्लियोटाइड चयापचय विकृति चिकित्सा प्रतिरोध विनियमन सेलुलर फ़ंक्शन एलोस्टेरिक नियामक सब्सट्रेट अवरोधक मैलाकाइट ग्रीन परख वर्णमितीय परख 384-माइक्रोवेल प्लेट प्रारूप SAMHD1 गतिविधि पायरोफॉस्फेट गतिविधि अकार्बनिक फॉस्फेट मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक फॉस्फोमोलिब्डेट मैलाकाइट ग्रीन कॉम्प्लेक्स ज्ञात अवरोधक SAMHD1 कटैलिसीस
dNTPase SAMHD1 के साथ छोटे अणु इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट एंजाइम-युग्मित गतिविधि परख
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Yagüe-Capilla, M., Rudd, S. G. A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1. J. Vis. Exp. (170), e62503, doi:10.3791/62503 (2021).

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