Summary
Bu protokol, farklı hemodinamiklere (güdük ve çatallanma takımyıldızı) sahip iki elastaz sindirilmiş anevrizmaya sahip bir tavşan modelinin oluşturulması için adımları açıklamaktadır. Bu, tek bir hayvan içinde farklı anjiyomimari ve hemodinamik koşullara sahip anevrizmalarda yeni endovasküler cihazların test edilmesini sağlar.
Abstract
İnsan intrakraniyal anevrizmalarına yakın hemodinamik, morfolojik ve histolojik özelliklere sahip preklinik hayvan modelleri, patofizyolojik süreçlerin anlaşılmasında ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde ve test edilmesinde anahtar rol oynamaktadır. Bu çalışma, aynı hayvan içinde farklı hemodinamik koşullara sahip iki elastaz sindirilmiş sakküler anevrizmanın oluşturulmasına izin veren yeni bir tavşan anevrizması modelini tanımlamayı amaçlamaktadır.
Ortalama ağırlığı 4.0 (± 0.3) kg ve yaş ortalaması 25 (±5) hafta olan beş dişi Yeni Zelanda beyaz tavşanına mikrocerrahi güdük ve bifurkasyon anevrizması oluşturuldu. Bir anevrizma (güdük), brakiyosefalik gövdedeki orijininde sağ ortak karotis arter (CCA) maruziyeti ile oluşturuldu. CCA orijinine ve 2 cm yukarıda geçici bir klips uygulandı. Bu segment 20 dakika boyunca lokal 100 U elastaz enjeksiyonu ile tedavi edildi. İkinci bir anevrizma (bifurkasyon), elastaz ile tedavi edilen bir arteriyel poşetin sağ CCA'dan sol CCA'ya uçtan yana anastomozuna dikilmesi ile oluşturuldu. Açıklık, oluşturulduktan hemen sonra floresan anjiyografi ile kontrol altına alındı.
Ortalama ameliyat süresi 221 dk idi. Aynı hayvanda iki anevrizmanın oluşturulması, komplikasyon olmaksızın tüm tavşanlarda başarılı olmuştur. Elastaz inkübasyonu ve acil intraluminal tromboz nedeniyle aşırı doku reaksiyonu gösteren bir bifurkasyon anevrizması dışında tüm anevrizmalar ameliyattan hemen sonra patentlendi. Ameliyat sırasında ve bir aya kadar takip sırasında mortalite gözlenmedi. Morbidite geçici vestibüler sendrom (bir tavşan) ile sınırlıydı ve bir gün içinde kendiliğinden düzeldi.
Burada ilk kez gösterilen, güdük ve bifurkasyon hemodinamik özelliklerine ve yüksek oranda dejenere olmuş duvar koşullarına sahip iki anevrizmalı bir tavşan modeli oluşturmanın fizibilitesidir. Bu model, farklı akış koşulları altında anevrizma biyolojisi temelinde doğal seyrin ve potansiyel tedavi stratejilerinin incelenmesine izin verir.
Introduction
İntrakraniyal anevrizma, rüptür sonrası mortalite oranı %50'ye ulaşan ve hastaların %10-20'sinde uzun süreli sakatlık gösteren ciddi bir durumdur1. Son on yılda endovasküler tedavi seçeneklerinde hızlı bir gelişme görülmekle birlikte, aynı zamanda2,3 sarmalından sonra anevrizmanın %33'üne kadar rekanalizasyon ile nüks oranı da artmaktadır. Anevrizma tıkanıklığı ve rekanalizasyonunun altında yatan patofizyolojinin daha iyi anlaşılması ve yeni endovasküler cihazların geliştirilmesi ve test edilmesi için, hemodinamik, morfolojik ve histolojik özellikleri insan intrakraniyal anevrizmalarınınkini taklit eden güvenilir preklinik modellere ihtiyaç vardır 4,5,6 . Bugün itibariyle, klinik öncesi araştırmalar için standart olarak tanımlanmış bir model yoktur ve araştırmacılar için çok çeşitli türler ve teknikler mevcuttur 7,8.
Bununla birlikte, tavşan, boyun arterleri ile insan beyin damarları arasındaki boyut ve hemodinamik benzerliklerin yanı sıra benzer pıhtılaşma ve tromboliz profilleri nedeniyle özel bir ilgi çekici türdür. Ortak karotis arterlerde (CCA) elastaz sindirilmiş sakküler anevrizmaları olan çeşitli modeller, akış koşulları, geometrik özellikler ve duvar özellikleri açısından insan intrakraniyal anevrizmaları ile kalitatif ve kantitatif benzerlikler göstermiştir 9,10,11,12. Bu çalışma, aynı hayvanda hem güdük hem de bifurkasyon elastaz sindirilmiş anevrizmaları ile yeni bir tavşan anevrizması modeli oluşturma tekniğini tanımlamayı amaçlamaktadır. Cerrahi teknikler, Hoh ve ark.13 ve Wanderer ve ark.14'ünkilerden esinlenerek, iyi bir standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlamak ve düşük mortalite ve morbidite sağlamak için hafif değişiklikler yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Deney, İsviçre'nin Bern Kantonu Hayvan Bakımı Yerel Komitesi (Uygulama Numarası BE108/16) tarafından onaylanmıştır ve tüm hayvan bakımı ve prosedürleri kurumsal kılavuzlara ve 3R ilkeleri15,16'ya uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Veriler ARRIVE yönergelerine göre raporlanır. Perioperatif yönetim, kurul onaylı veteriner anestezi uzmanı tarafından yürütüldü. Çalışma için, ortalama ağırlığı 4.0 (± 0.3) kg ve yaş ortalaması 25 (±5) hafta olan dişi Yeni Zelanda beyaz tavşanları, suya, peletlere ve samana serbest erişimi olan 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile 22-24 ° C'lik bir oda sıcaklığında barındırıldı.
1. Ameliyat öncesi aşama ve anestezi
- Veteriner Anestezistler Birliği ve Avrupa ve Amerikan Veteriner Anestezi ve Analjezi Koleji tarafından önerilen bir klinik muayene yaparak, her hayvanı tartarak, mukoza zarını değerlendirerek, kılcal dolum süresini ve nabız kalitesini belgeleyerek ve pulmoner ve kardiyak oskültasyonun yanı sıra abdominal palpasyon yaparak tavşanların sağlıklı olduğunu doğrulamak için.
- Klinik bulgulara dayanarak, her tavşana bir Amerikan Anesteziyologlar Derneği (ASA) sınıflandırması atfedin17. Sadece ASA I skoru olan hayvanlar üzerinde ameliyat yapın.
- Her iki dış kulağı da tıraş edin ve auriküler arterlere ve damarlara prilokain-lidokain kremi uygulayın. Ketamin 20 mg / kg, deksmedetomidin 0.1 mg / kg ve metadon 0.3 mg / kg kombinasyonu ile deri altından enjekte edilen (SC) ile derin sedasyon elde edin. Hayvanları 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Gevşemiş bir yüz maskesi aracılığıyla ek oksijenasyon (3 L / dak) verin ve bir nabız oksimetresi ile izleyin.
- Sol auriküler santral artere ve auriküler vene 22 G'lik bir kanül yerleştirin. Propofol 1-2 mg/kg intravenöz (IV) ile genel anesteziyi etki edene kadar (yutma refleksi kaybı) indükleyin. Bir silikon tüp (3 mm iç çap) aracılığıyla endo-trakeal entübasyona devam edin.
- Pediatrik elektroensefalografik (EEG) sensörleri yerleştirmek için alnınızı tıraş edin. Cerrahi alanı tıraş edin ve intradermal olarak ropivakain hidroklorür % 0.75 enjekte edin.
- Tavşanı ameliyat masasına dorsal yatışta yerleştirin, tam izleme kurun ve endo-trakeal tüpü düşük dirençli bir pediatrik daire sistemine bağlayın. Oksijende izofluran uygulaması ile anesteziyi sürdürün, maksimal son gelgit (Et) konsantrasyonunu % 1.3 hedefleyin.
- Venöz erişim yoluyla 5 mL/kg/h zil laktatının sürekli infüzyonunu sağlayın. Nabız oksimetresi, doppler ve invaziv kan basıncı, 3 derivasyonlu elektrokardiyogram, EEG, rektal sıcaklık ve solunan ve solunan gazlar ile ekstübasyona kadar klinik ve enstrümantal monitörizasyonu sağlayın.
- Cerrahi alanı manubrium sterni'den çene açılarına kadar povidon iyot ile dezenfekte edin ve steril örtüyü uygulayın. Ameliyat sırasında, lidokain (sabit hızlı infüzyon (CRI) 50 μg / kg / dak) ve fentanil (3-10 μg / kg / s CRI) ile analjezi sağlayın. Spontan veya yardımlı ventilasyon yapın. İzin verilen hiperkapniye izin verin.
- Ameliyat sırasında en az bir arteriyel kan gazı analizi yapın. Hipotansiyon durumunda (60 mmHg'nin altındaki ortalama arteriyel basınç), noradrenalin ile tedavi edin, etkiye kadar titre edin. Hipotermiyi önlemek için bir ısıtma yastığı veya ısıtmaya zorlanmış hava ısıtma sistemi kullanın (amaç: rektal sıcaklık 37.5-38.5 ° C).
NOT: İnvaziv arteriyel kan basıncı sol kulak arterinde ölçüldüğü için, sol CCA'nın kesilmesi kan akışını durduracak ve eğriyi baskılayacaktır. Daha sonra damar yeniden açılıncaya kadar Doppler tekniği ile kan basıncı ölçülmelidir.
2. Ameliyat
- Yaklaşmak
- Bir neşter ile manubrium sterni'ye hyoid kemikten 1.5 cm kaudal bir noktaya kadar medyan bir cilt kesisi yapın. Titiz hemostaz yaparken medial kesiden deri altı ve yağ dokusunu hazırlayın.
- Sternosefaliküs kasını yapışkan bağ dokusundan serbest bırakın ve miyoklonustan kaçınmak için lidokaini topikal olarak (2-4 mg / kg, lidokain tercihi% 1) uygulayın. Sternosefaliküs kasının sağ CCA'sını medial olarak ortaya çıkarın ve ıslak çubuklarla ıslak tutun.
- Şimdi sternosefaliküs kasının lateral ve proksimal kısımlarını hazırlayın ve CCA'yı açığa çıkarmak için bir damar halkası ile medial olarak geri çekin. Dış juguler damarı tanımlayın ve ıslak bir mikro çubukla koruyun.
- Arteri açığa çıkarmak için brakiyosefalik gövdenin çatallanmasına kadar bağ dokusunu proksimal CCA boyunca dikkatlice diseke edin. Arterden gelen küçük dalların varlığında, onları koterizör ile pıhtılaştırın.
NOT: Herhangi bir sinir hasarını önlemeye özen gösterin.
- Bifurkasyon anevrizması için güdük anevrizması oluşturma ve doku toplama
- Doğru CCA'yı kırpmadan önce, pıhtılaşma önleme süresini (ACT) ölçün ve tromboembolik olayları önlemek için kulak damarı (anestezi ekibi tarafından gerçekleştirilen) yoluyla sistematik olarak natriyum heparin (80 EI / kg) verin.
- Şimdi 2 geçici klip uygulayın: ilki CCA'nın kökeninde ve ikincisi ondan 2 cm uzakta (Şekil 1A). Kasenin altına bir lastik ped yerleştirin ve vazodilatasyon için papaverin HCL (40 mg / mL; 1: 1% 0.9 salin içinde çözülmüş) ile durulayın.
- Adventitia'yı mikromakas kullanarak dikkatlice çıkarın. Distal klipsin altına 22 G IV-kateter ile bir arteriyotomi uygulayın ve kateteri proksimal klipse kadar kaudal olarak yerleştirin (Şekil 1A, B).
- Segmenti intraluminal olarak heparinize NaCl (% 0.9 salinde 500 U / 100 mL) ile kan görünmeyene kadar yıkayın ve son olarak kateteri bir ligatür ile sabitleyin (4-0). Şimdi, kateter yoluyla, arter segmentine 0.1-0.2 mL elastaz (daha önce 5 mL Tris-Buffer içinde çözünmüş 100 IU) enjekte edin ve 20 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 1B).
- Sol CCA'yı ortaya çıkarmak için sol taraftaki diseksiyonla başlayın (bkz. bölüm 2.3). Elastaz ile 20 dakikalık inkübasyon süresinden sonra, elastaz çözeltisini temizleyin ve arter segmentini% 0.9 NaCl ile yaklaşık 10 kez durulamak için şırıngayı değiştirin.
- 2 ligatür (6-0) uygulayın: birincisi proksimal klipsin 5 mm distali ve ikincisi arteriyotominin altına sadece proksimal olarak (Şekil 1C). Damarı ilk ligatür ~3 mm yukarıda ve ikinci ligatür ile distal klips arasında bir kez daha kesin. Bu otolog grefti bifurkasyon anevrizması oluşana kadar heparinize bir solüsyonda (%0.9 salinde 500 U/100 mL) tutun (Şekil 1D). Son olarak, ilk proksimal klibi dikkatlice açın ve anevrizmayı (uzunluk, genişlik ve derinlik) ölçün.
- Bifurkasyon anevrizması oluşturma
- Sol CCA'nın ~ 2 cm'sini açığa çıkarmak için sternosefaliküs kasını medial olarak diseke ederek sol tarafı hazırlayın. Miyoklonusu önlemek için lidokaini kas üzerine topikal olarak uygulayın.
- Karotis arterin altına bir gazlı bez topu ve bir parça eldiven ile küçük bir çubukla yerleştirin. Biraz papaverin uygulayın. Topikal olarak HCl (40 mg / mL; 1: 1% 0.9 salin içinde çözülür). Mikroskobik görünüm altında çalışmaya devam edin: anevrizma torbasını hazırlayın ve adventitiyi çıkarın. Anevrizma torbasını ölçün (uzunluk, genişlik, derinlik).
- Sağ CCA'nın açık kısmını heparinize NaCl ile yıkayın ve gerekirse, dikiş için serbest manipülasyonlara izin vermek için klipsi ~ 1 cm olacak şekilde değiştirin. Adventitiyi dikkatlice çıkarın ve sağ CCA'nın kütüğünde yanal olarak ~ 2 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
- Şimdi ~ 1 cm'lik bir segmenti sınırlamak ve aradaki adventitia'yı kaldırmak için sol CCA'ya iki geçici klip uygulayın. 23 G iğne ile arteriyotomi yapın. Segmenti heparinize NaCl (%0,9 salinle 500 U/100 mL) ile yıkayın. Sağ CCA ve anevrizma poşetinin dikilmesine izin vermek için mikromakas kullanarak arteriyotomiyi ~ 4-5 mm'ye büyütün (Şekil 1E). Tüm dikiş prosedürü boyunca damarları sulayın ve ıslak mikro takaslarla koruyun.
- Anastomozu 9-0 emilemeyen dikiş ile gerçekleştirin.
- Sol CCA'daki arteriyotominin proksimal kenarından başlayarak sağ karotis küntünün proksimal arka duvarını 5 dikişle dikiş. Daha sonra, sol CCA'daki arteriyotominin distal kenarından başlayarak anevrizma kesesinin arka tarafını 4-5 dikişle dikin.
- Anevrizma greftinin dikey arka tarafı ile 3 dikişle dikiş atmak için balık ağzı kesisi seviyesinde distal arka taraf ile devam edin. Balık ağzı kesisinin ön tarafını 3 dikişle dikin, yukarı doğru başlayıp aşağı doğru hareket ettirin.
- Anevrizma greftinin sol CCA ve ön tarafı arasındaki ön dikiş ve ~ 6 dikişle sağ CCA ile bitirin. Anastomozu bitirmeden önce, damarları intraluminal olarak heparinize edilmiş% 0.9 salin çözeltisi ile durulayın.
- Kelepçeyi çıkarmadan önce, pıhtılaşma önleme süresini (ACT) bir kez daha ölçün ve sistematik olarak uyarlanmış bir heparin dozu uygulayın (hedef: başlangıç çizgisi ACT'nin 2-3 katı).
- Hemostaz için mikro çubuklarla anastomoza biraz baskı uygularken sağ CCA'daki klipsi çıkarın. Ardından, distal klipsi sol CCA'dan çıkararak devam edin. Majör kanama yoksa, kan akışına izin vermek için sol CCA'daki proksimal klipsi çıkarmaya devam edin. Anastomozdan bir miktar kanama varsa, gazlı bez topu ve çubukla biraz basınç uygulayın; birkaç dakika bekleyin. Devam ederse, klipleri değiştirin ve yeniden dikişler yapın.
NOT: 20-30 mL'den fazla kan kaybı, iyileşme aşamasını tehlikeye atabilir.
- Açıklık kontrolü ve dokümantasyon
- Tüm kapları açtıktan sonra, sonuçları fotoğrafik olarak belgeleyin ve ölçün (Şekil 1F ve Şekil 2A, B).
- Distal CCA'daki akışın, aynı zamanda normale dönmesi gereken invaziv arteriyel kan basıncı eğrisi (kulak arterinde ölçülen, dış karotidin doğrudan bir dalı) yoluyla restorasyonunu onaylayın.
- 2 bandpass filtresi, bir video kamera ve bir bisiklet spot ışığı kullanarak 1 mL floresein IV uygulayarak floresan anjiyografi yapın. Tüm prosedürün tanımı için önceki yayınlara bakınız18,19.
- Kapama
- Anastomoz üzerindeki yağ yastığını yeniden uyarlayın ve 4-0 emilebilir bir dikişle dikişleyin. Son olarak 4-0 emilebilir sütür kullanılarak subkutis ve tek dikişli cilt dikişlidir.
3. Ameliyat sonrası aşama
- Ameliyatın sonunda, analjezik etkiyi korumak için izofluran ve sistemik analjezi reversiyon olmadan kesilmelidir. Trakeal ekstübasyon yapmadan önce yutma refleksinin kontrolünün geri döndüğünden emin olun.
- Analjeziyi sağlamak için meloksikam 0.5 mg/kg IV, acil trombotik olayları önlemek için aspirin (ASS) 10 mg/kg IV, antibiyotik profilaksisi olarak vitamin B12 100 μg SC ve klaoksil 20 mg/kg IV uygulayın.
- Tavşan kendiliğinden sternal yassılığı geri kazanana kadar ek oksijenlenme ve ısınma sağlayın. Herhangi bir ağrı belirtisi gözlenirse metadon ile kurtarma analjezi yapın. Kemirgenlerde ve tavşanlarda ağrının değerlendirilmesi ve yönetimi için kılavuzlara uygun olarak ameliyat öncesi ilk 3 gün boyunca günde 4 kez postoperatif takip ve bakım yapın23,24.
- Dış kulağa uygulanan fentanil yama (12 μg / s), 3 gün boyunca meloksikam 1x / SC ve kurtarma tedavisi olarak metadon ile postoperatif analjezi ve ağrı değerlendirmesi için bir puan tablosu (Ek Dosya) sağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir güdük ve bifurkasyon anevrizmasının oluşturulması, intraoperatif komplikasyon olmaksızın 5 Yeni Zelanda beyaz tavşanının hepsinde başarılı oldu. Ameliyat sırasında veya 24 ± 2 günlük takip süresi boyunca mortalite gözlenmedi. Bir tavşan, vestibüler sendrom ve sağ tarafın körlüğü ile postoperatif komplikasyonlar yaşadı. Hayvan 24 saat sonra tamamen ve kendiliğinden iyileşti. Bu komplikasyon normal aktivitelerine (serbest hareketler, su ve yiyecek alımı, diğer hayvanlarla etkileşimler) müdahale etmedi ve herhangi bir spesifik tedavi gerektirmedi. Spontan anevrizma rüptürü yoktu.
Ortalama ameliyat süresi 221 dk (190-255 dk) idi. Tüm anevrizmalar, elastaz inkübasyonu ve acil tromboz nedeniyle aşırı doku reaksiyonu gösteren bir bifurkasyon anevrizması hariç, ameliyattan hemen sonra patentlendi. Takipte anevrizma açıklığı mıknatıs rezonans anjiyografi (Şekil 3) ve doku ekstraksiyonu sonrası makroskopik inceleme (Şekil 4) ile doğrulandı. Ameliyat sırasında zaten tromboze olmuş olan bifurkasyon anevrizması hariç, tüm anevrizmalar takip son noktasında hala patentliydi. Bu,% 90'lık bir açıklık oranıyla sonuçlandı (10 üzerinden 9).
Örneklemeden sonra anevrizmaların makroskopik muayenesi ve ölçümü, tüm anevrizmaların ortalama büyüklüğü 5.4 mm x 2.4 mm x 2.3 mm ± oluşturma sırasında 1 mm x 0.6 mm x 0.3 mm ve güdük anevrizması için hasatta 1.5 mm x 0.9 mm x 0.5 mm x 4.5 mm x 3.1 mm x 2.5 mm ± tüm anevrizmaların büyümesini göstermektedir; ve 3,4 mm x 2 mm x 2,1 mm ± oluşturma sırasında 0,6 mm x 1 mm x 0,4 mm ve bifurkasyon anevrizmaları için hasatta 3,8 mm x 2,8 mm x 2,6 mm x 2,6 mm x 1,2 mm x 0,3 mm x 0,6 mm ±. İlginçtir ki, bifurkasyon anevrizmaları, kütüklü versiyon için ekstraksiyonda 14.4 mm 3 ± 3.5 mm 3 ve ekstraksiyonda 28.6 mm 3 ± 16.4 mm 3 (oran 1.9) ile kütükleme anevrizmalarından daha fazla büyümüştür, buna karşılık 30.8 mm 3 ± 15 mm 3 ve 34.9 mm 3 ± ekstraksiyonda 24.1 mm 3 (oran 1.1) oluşturulduğunda hacim daha fazla büyümüştür.
Şekil 1: Ameliyatın adımları. (A) Sağ CCA'da 2 geçici klipsin uygulanması: ilki brakiyosefalik gövdeden kökeninde ve ikincisi birinciye ~ 2 cm distal. Yıldız işareti, arteriyotominin 22 G intravenöz kateter (IV-kateter) ile lokalizasyonunu gösterir. (B) IV-kateterin 4-0 ligatür ile yerleştirilmesinden ve sabitlenmesinden sonra, segmenti heparinize NaCl (500 U/100 mL% 0.9 salin) ile yıkayın ve 0.1-0.2 mL elastaz enjekte edin (100 U daha önce 5 mL TRIS tamponunda çözülmüştür). 20 dakika boyunca inkübe edin (C) 2 adet emilemeyen ligatür (6-0) uygulayın: ilki proksimal klibe 5 mm distal ve ikincisi arteriyotominin hemen altında. (D) Bifurkasyon anevrizması için güdük anevrizmasını ve otolog grefti oluşturmak için damarı ligatürlerin ~ 3 mm üzerinde kesin. (E) Bifurkasyon anevrizmasını oluşturmak için sağ CCA'nın anastomozu ve sol CCA'daki otolog greft. (F) Sağ tarafta güdük anevrizması ve sol tarafta bifurkasyon anevrizması ile nihai sonuç. Kısaltmalar: CCA = ortak karotis arter; IV = intravenöz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sonuçların intraoperatif fotoğraflı dokümantasyonu. Sarı noktalı çizgi, kraniyal ve kaudal yönleri gösteren orta çizgiyi temsil eder. (A) Boynun sağ tarafındaki güdük anevrizmasının görünümü. SCEM, bir damar döngüsü (mavi renkte) vasıtasıyla medial olarak geri çekilir. (B) Boynun sol tarafındaki bifurkasyon anevrizmasının görünümü. Kısaltmalar: SCEM = Sternocephalicus kası; SA = Güdük anevrizması; JV = juguler ven; rCCA: sağ ortak karotis arter; lCCA = sol ortak karotis arter; Tr = Trakea; * = Tekrarlayan veya laringeal dal; BA = Bifurkasyon anevrizması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Takipte manyetik rezonans anjiyografi sonuçları. 3 Tesla MRI ile elde edilen üç boyutlu TOF sekanslarından elde edilen görüntüler, boyun arterlerine odaklandı. (A) Sağ subklaviyen arterde güdük anevrizması (sarı ok). (B) Sol tarafta sağ CCA'nın anastomoz edilmesiyle oluşturulan bifurkasyon üzerinde bifurkasyon anevrizması (sarı ok). Kısaltmalar: TOF = uçuş süresi; MRG = manyetik rezonans görüntüleme; CCA = ortak karotis arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Doku ekstraksiyonundan sonra makroskopik fotoğraf dokümantasyonu. Klips üzerindeki majör oluklar (2 bölüm) 1 mm'yi ve aradaki minör oluklar (bir bölüm) 0,5 mm'yi gösterir. (A) Brakiyosefalik gövde ve sağ subklaviyen arterde güdük anevrizmasını gösterir. (B) Sol CCA'da sağ CCA'nın anastomoz edilmesiyle oluşturulan bifurkasyonda bifurkasyon anevrizması. Kısaltmalar: SA = Güdük anevrizması; BCT = brakiyosefalik gövde; rSC = sağ subklaviyen arter; BA = bifurkasyon anevrizması; CCA = ortak karotis arter; rCCA = sağ CCA; lCCA = sol CCA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Güdük ve bifurkasyon anevrizmalarının histolojik bulguları. Hematoksilin-eozin ile boyanmış örnek (2 kat büyütme). (A) Brakiyosefalik gövde (b) ve sağ subklaviyen arter (c) ile güdük anevrizmanın (a) mikroskobik görünümü. (*) kan akışının yönünü gösterir. (B) Proksimal sol CCA (b), distal sol CCA (c) ve distal sağ CCA (d) ile bifurkasyon anevrizmasına mikroskobik genel bakış. (*) kan akışının yönünü gösterir. (A) ve (B) içindeki girintilerde, I) anevrizma duvarının tunika intima'sını, II) tunika ortamını ve III) tunika eksternasını (20 kat büyütme) temsil eder. Kısaltmalar: CCA = ortak karotis arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anevrizma oluşumu için en yaygın teknik, açık veya endovasküler bir yöntemle sağ CCA'nın kökeninde bir güdük anevrizmasının oluşturulmasını içerir. Modelin,20,21 zamanı ile açık kalan stabil ve büyümeyen, büyümeyen bir anevrizma olduğu doğrulanmıştır. İkinci olası teknik, sol tarafta sağ CCA'yı anastomoz ederek ve bifurkasyon14,22,23 üzerinde bir anevrizma poşetini dikerek arteriyel bifurkasyon anevrizmasının mikrocerrahi olarak oluşturulmasını içerir. Her iki yöntem de endovasküler cihazların test edilmesi ve patofizyolojinin incelenmesi için uygunluk göstermiş olsa da, anevrizma morfolojileri ve dolayısıyla ilgili hemodinamik kuvvetler ve akış özellikleri önemli ölçüde farklıdır. Mevcut modellerin hayvan başına sadece bir anevrizma tipinin oluşturulmasına izin verdiği göz önüne alındığında, bifurkasyon tipinden anevrizmaların doğal seyri ile güdük tipinden olanlar arasında doğrudan bir karşılaştırma şu anda zordur.
Gerçekten de, hayvanlar arasındaki fizyolojik farklılıklar (kan basıncı veya damar duvarının tam kollajen içeriği gibi) deneysel bir ortamda her zaman tam olarak kontrol edilemez ve anevrizma biyolojisini ve doğal seyrini etkileyebilir. Bu çalışma, aynı hayvanda (veya tek bir hayvanda) hem güdük hem de çatallanma hemodinamik ve dejenere duvar koşullarına sahip bir tavşan modeli oluşturmanın fizibilitesini göstermektedir. Bu teknikte düşük morbidite ve mortalite, yüksek açıklık oranı (%90) ile tekrarlanabilir anevrizmalar ortaya çıktı. Bu yöntemin ana dezavantajı, klasik güdük veya çatallanma modellerinin kendilerinin yaratılmasıyla aynı kalır - sofistike laboratuvar ekipmanlarına ve özel mikrocerrahi becerilere duyulan ihtiyaç.
Bu ameliyat sırasında özellikle iki adımın kritik olduğu tespit edildi: Birincisi, brakiyosefalik gövdedeki kökenine kadar sağ CCA'nın diseksiyonu ve maruz kalmasıdır. Aşağıdaki hayati yapılar bu yaklaşım sırasında özellikle risk altında olabilir: trakea, juguler ven ve laringeal sinir. Trakea manipülasyonu solunumu bozabileceğinden, önceki entübasyon hava yollarının açıklığını sağlar. Ayrıca, ameliyatın uzun olması ve hayati yapıların yakınında olması, tam izlemenin herhangi bir fizyolojik sapmayı derhal tanıması için yararlıdır. Cerrah ayrıca trakeanın kendisinde doğrudan basınç veya aşırı traksiyondan kaçınmaya dikkat etmelidir. Juguler ven doğrudan karotisin yanından geçer ve bazı durumlarda ona yapışır. Herhangi bir lezyondan kaçınmak için aşırı özen gösterilmesi gerekir. Damarın korunmasını ve ıslak çubukla ıslak tutulmasını öneririz.
Son olarak, önceki çalışmalar laringeal sinirlerin korunmasının önemini zaten tanımlamıştır. Bu sinirlerdeki herhangi bir lezyon, postoperatif olarak, ardışık solunum bozukluğu ve hayvanın ölüm olasılığı yüksek olan bir stridor görünümüne yol açacaktır. Sinirlerin iyatrojenik lezyonunu önlemek için, CCA diseksiyonu arteri yuvarlayan dokuların traksiyonunu önlemelidir. Yapışan dokuları dikkatlerini dağıtmak yerine kesmek için makas kullanılmasını öneririz. Sinirler ayrıca ameliyat sırasında görsel kontrol altında tutmak için kas sisteminin retraksiyonundan sonra mümkün olan en kısa sürede tanımlanmalıdır. İkinci kritik adım, elastaz sindirilmiş anevrizma ile gerilimsiz bir mikro-anastomozun oluşturulmasıdır. Bu anevrizma, dokuların manipülasyonunu engelleyen, duvar yapısının yüksek bir dejenerasyonunu sunar. İyi mikrocerrahi beceriler gerektirir ve bir öğrenme eğrisi beklenir.
Ayrıca, boyun damarlarının doğru boyutunu garanti etmek için en az 4,0 kg ağırlığındaki (ortalama yaş 25 (±5) hafta) tavşanları seçmenizi öneririz. Klasik tek güdüklü anevrizma modelinde literatürde bildirilen başlıca komplikasyon, sağ CCA'dan kaynaklanan trakeoözofageal arterlere bağlı elastaz uygulamasını takiben trakea nekrozu olmuştur. Sorunu önlemek için tekniklerin çeşitli modifikasyonları zaten önerilmiştir 13,24,25,26. Bu yaklaşım, elastaz çözeltisinin herhangi bir çıkışından ve benzer komplikasyonları önlemek için elastaz uygulamasından önce bu dalların ve pıhtılaşmalarının kolay tanımlanmasını sağlar.
Ameliyat sırasında uygulanan antikoagülasyon rejimi, sağ CCA'da ilk klips uygulamasından önce ve klipsin çıkarılmasından önce heparin uygulamasının yanı sıra sol CCA'ya dolaşımın geri kazandırılmasından oluşur. Bu, geçici akış kesintisi ve damar manipülasyonu nedeniyle trombüs oluşumunu etkili bir şekilde önleyebilir. Ek olarak, sütür materyalinin ve elastazın trombojenik etkisine bağlı trombüs oluşumunu önlemek için ameliyatın bitiminden hemen sonra benzersiz bir aspirin dozu (10 mg / kg IV) verilir. Bu protokol, trombojenik olayların kontrol altına alınmasını ve kanama komplikasyonlarını arttırmadan anevrizma açıklığının sağlanmasını sağlar.
Güdük modeli en yaygın sakküler anevrizma tavşan modelidir ve endovasküler tedavilerin translasyonel çalışmaları için birkaç kez kullanılmıştır. Bifurkasyon modeli literatürde de iyi tanımlanmıştır ve anevrizma patofizyolojisinin incelenmesi ve yeni terapötik stratejilerin test edilmesi için uygundur. Bununla birlikte, her iki model de farklı hemodinamik özellikleri gösteren farklı morfolojiler göstermektedir. Anevrizmaların tercihen bifurkasyonda ortaya çıktığı ve büyümenin duvar kesme stresine bağlı olduğu bilinmektedir27,28. Önceki yayınlarda ayrıca cerrahi olarak oluşturulan yanak anevrizmalarında bifurkasyon olanlara kıyasla daha yüksek spontan tromboz29 ve diğer daha karmaşık modellere kıyasla akım saptırma sonrası güdük anevrizmasının daha yüksek oklüzyon oranıgösterilmiştir 8; ancak, karşılaştırma her zaman iki farklı hayvan arasındaydı.
Bu çalışmada, daha önce tarif edildiği gibi 2-4 mm çapında standart anevrizmalar oluşturuldu 14,22,29,30,31,32,33,34,35,36. Karşılaştırma için bifurkasyon anevrizmaları ile benzer boyutta bir güdük anevrizması oluşturmayı amaçladık. Bu nedenle, mevcut hacim bildirildiği gibi biraz daha küçüktür 5,8,10,11,13,21. Bununla birlikte, her iki anevrizma da 1 aylık takipte büyüme eğilimi gösterdi. Bu nedenle, daha uzun bir takip süresi, insanlarda anevrizmalarla daha iyi uzun vadeli karşılaştırmaya izin verecek şekilde daha büyük hacimli anevrizma oluşumunu indükleyebilir. Ek olarak, hematoksilin-eozin boyamasına dayanan bu histolojik bulgular, hücresel bir anevrizma duvarı ve doğrusal veya düzensiz bir paternde düz kas hücrelerinin varlığının yanı sıra elastik liflerin dağınıklığını göstermektedir (Şekil 5). Bu sonuçlar, insanlarda tavşan elastaz kaynaklı anevrizmalar ile intrakraniyal anevrizmalar arasında histolojik benzerlikler gösteren mevcut bulgularla korelasyon göstermektedir 11,32,37,38,39,40,41.
Sonuçlar, aynı cerrahi yaklaşımı kullanarak hem güdük hem de bifurkasyon anevrizmaları oluşturmanın teknik fizibilitesini göstermektedir. Bu çalışmanın sınırlaması, istatistiksel analize veya güdük ve bifurkasyon anevrizmaları arasındaki histolojik farklılıkların gerçek bir karşılaştırmasına izin vermeyen küçük örneklem büyüklüğüdür. Bununla birlikte, bu model, her iki anevrizma tipinin avantajlarını ve özelliklerini kesin olarak belirlemek için, artan örnek boyutları ve farklı takip süreleri ile gelecekteki deneylerde büyüme, rüptür, spontan oklüzyon ve histolojik değişiklikler açısından her iki anevrizma arasındaki farkları araştırma imkanı sunmaktadır. Ek olarak, bu yeni cerrahi model, endovasküler cihazların bir hayvanda ve ayrıca benzersiz bir prosedür sırasında iki farklı konfigürasyonda ve akış koşullarında uygulanmasına izin verir. Bu, ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır ve potansiyel olarak klinik öncesi çalışmaların verimliliğini arttırır.
Sonuç olarak, bu çalışma, tek bir hayvan içinde farklı akış koşullarına ve yüksek oranda dejenere duvarlara sahip 2 anevrizma oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Önerilen model, sakküler anevrizmaların endovasküler tedavilerinin doğal seyrinin ve etkilerinin hemodinamiğin rolü açısından doğrudan karşılaştırılmasına izin vermektedir. Son olarak, kullanılan hayvanların ve genel deney maliyetlerinin azaltılmasına katkıda bulunan verimli bir model sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Prof. Hans Rudolf Widmer, Dr. Luca Remonda ve Prof. Javier Fandino'ya bu çalışmaya bilimsel destekleri ve teknik katkıları için teşekkür eder. Prosedürler sırasındaki tavsiyeleri için Olgica Beslac'a ve yardımı için Kay Nettelbeck'e özel bir teşekkür. Ayrıca, Daniela Casoni DVM, PhD ve tıp veterinerine teşekkür ederiz. Luisana Garcia, PD Dr. Alessandra Bergadano ve Dr. Carlotta Detotto özel veteriner destekleri için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP292ZH | |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP304H | |
| 6-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | any generic |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | any generic |
| Anesthesia machine | Dräger | any other | |
| Aspirin | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | any generic |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | any generic |
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Biemer vessel clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FD560R | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bispectral index (neonatal) | any other | ||
| Blood pressure cuff (neonatal) | any other | ||
| Bycilces spotlight | any other | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | any generic |
| Dexmedetomidine | Ever Pharma | 136740-1 | any generic |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Electrocardiogram electrodes | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanyl (intravenous use) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanyl (transdermal) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Heating pad or heating forced-air warming system | |||
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamine | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| lid retractor | Approach | ||
| Lidocaine | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medication |
| Methadone | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micro-forceps curved | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-015-15 | |
| Micro-forceps straight 2x | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-010-15 | |
| Microscissors | Ulrich Swiss , Switzerland | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Needle 23 G | arteriotomy | ||
| Needle holder | |||
| O2-Face mask | |||
| Operation microscope | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | topical application | |
| Povidone iodine | Mundipharma Medical Company | any generic | |
| Prilocaine-lidocaine creme | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Switzerland | General anesthesia | |
| Pulse oxymeter | |||
| Rectal temperature probe (neonatal) | |||
| Ringer Lactate | Bioren Sintetica SA | Infusion | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Local anesthesia |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Small animal shaver | |||
| Soft tissue forceps | |||
| Soft tissue spreader | |||
| Stainless steel sponge bowls | |||
| Sterile micro swabs | |||
| Stethoscope | |||
| Surgery drape | |||
| Surgical scissors | |||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Elastase solution |
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Vein and arterial catheter 22 G | |||
| vessel loop | Approach | ||
| video camera or smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T |
References
- Grasso, G., Alafaci, C., Macdonald, R. L. Management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: State of the art and future perspectives. Surgical Neurology International. 8, 11 (2017).
- Raymond, J., et al. Long-term angiographic recurrences after selective endovascular treatment of aneurysms with detachable coils. Stroke. 34 (6), 1398-1403 (2003).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 20 (2019).
- Bouzeghrane, F., et al. In vivo experimental intracranial aneurysm models: a systematic review. American Journal of Neuroradiology. 31 (3), 418-423 (2010).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical intracranial aneurysm models: a systematic review. Brain Sciences. 10 (3), 134 (2020).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Fahed, R., et al. Testing flow diversion in animal models: a systematic review. Neuroradiology. 58 (4), 375-382 (2016).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 32 (3), 595-601 (2011).
- Ding, Y. H., et al. Long-term patency of elastase-induced aneurysm model in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 27 (1), 139-141 (2006).
- Short, J. G., et al. Elastase-induced saccular aneurysms in rabbits: comparison of geometric features with those of human aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 22 (10), 1833-1837 (2001).
- Andereggen, L., et al. Three-dimensional visualization of aneurysm wall calcification by cerebral angiography: Technical case report. Journal of Clinical Neuroscience. 73, 290-293 (2020).
- Hoh, B. L., Rabinov, J. D., Pryor, J. C., Ogilvy, C. S. A modified technique for using elastase to create saccular aneurysms in animals that histologically and hemodynamically resemble aneurysms in human. Acta Neurochirurgica. 146 (7), 705-711 (2004).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
- Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Portier, K., Ida, K. K. The ASA Physical Status Classification: What is the evidence for recommending its use in veterinary anesthesia?-A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 5, 204 (2018).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Strange, F., et al. Fluorescence angiography for evaluation of aneurysm perfusion and parent artery patency in rat and rabbit aneurysm models. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59782 (2019).
- Altes, T. A., et al. 1999 ARRS Executive Council Award. Creation of saccular aneurysms in the rabbit: a model suitable for testing endovascular devices. American Journal of Roentgenology. 174 (2), 349-354 (2000).
- Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. Journal of NeuroInterventional Surgery. 8 (5), 521-525 (2016).
- Sherif, C., Marbacher, S., Erhardt, S., Fandino, J. Improved microsurgical creation of venous pouch arterial bifurcation aneurysms in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 32 (1), 165-169 (2011).
- Bavinzski, G., et al. Experimental bifurcation aneurysm: a model for in vivo evaluation of endovascular techniques. Minimally Invasive Neurosurgery. 41 (3), 129-132 (1998).
- Lewis, D. A., et al. Morbidity and mortality associated with creation of elastase-induced saccular aneurysms in a rabbit model. American Journal of Neuroradiology. 30 (1), 91-94 (2009).
- Wang, K., et al. Neck injury is critical to elastase-induced aneurysm model. American Journal of Neuroradiology. 30 (9), 1685-1687 (2009).
- Cesar, L., et al. Neurological deficits associated with the elastase-induced aneurysm model in rabbits. Neurological Research. 31 (4), 414-419 (2009).
- Aoki, T., Nishimura, M. The development and the use of experimental animal models to study the underlying mechanisms of CA formation. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 535921 (2011).
- Frosen, J., Cebral, J., Robertson, A. M., Aoki, T. Flow-induced, inflammation-mediated arterial wall remodeling in the formation and progression of intracranial aneurysms. Neurosurgical Focus. 47 (1), 21 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Comparison of aneurysm patency and mural inflammation in an arterial rabbit sidewall and bifurcation aneurysm model under consideration of different wall conditions. Brain Sciences. 10 (4), 197 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Marbacher, S., et al. Complex bilobular, bisaccular, and broad-neck microsurgical aneurysm formation in the rabbit bifurcation model for the study of upcoming endovascular techniques. American Journal of Neuroradiology. 32 (4), 772-777 (2011).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rat model - Introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of NeuroInterventional Surgery. , (2021).
- Lyu, Y., et al. An effective and simple way to establish eastase-induced middle carotid artery fusiform aneurysms in rabbits. Biomed Research International. 2020 (10), 1-12 (2020).
- Wang, S., et al. Rabbit aneurysm models mimic histologic wall types identified in human intracranial aneurysms. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (4), 411-415 (2018).
- Kang, W., et al. A modified technique improved histology similarity to human intracranial aneurysm in rabbit aneurysm model. Neuroradiology Journal. 23 (5), 616-621 (2010).
- Frosen, J., et al. Remodeling of saccular cerebral artery aneurysm wall is associated with rupture: histological analysis of 24 unruptured and 42 ruptured cases. Stroke. 35 (10), 2287-2293 (2004).
- Frosen, J., et al. Growth factor receptor expression and remodeling of saccular cerebral artery aneurysm walls: implications for biological therapy preventing rupture. Neurosurgery. 58 (3), 534-541 (2006).
